核素標(biāo)記mAb109單抗藥物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及核醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種核素標(biāo)記mAbl09單抗藥物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]惡性腫瘤已成為威脅人類生命健康的最重要因素。腫瘤的發(fā)生與周?chē)h(huán)境有密不可分的關(guān)系，在有氧條件下，電離輻射/生物體的代謝反應(yīng)都會(huì)使細(xì)胞中的水分子發(fā)生電離后，產(chǎn)生大量活性氧族(Reactive Oxygen Species，R0S)，包括H2O2、超氧陰離子等?；钚匝踝逶隗w內(nèi)積累可以作用于細(xì)胞核DNA，破壞生物大分子，使脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)和核酸的氧化、DNA雙鍵斷裂等，進(jìn)而產(chǎn)生嚴(yán)重的生物學(xué)效應(yīng)，以至于促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。為了更好地適應(yīng)環(huán)境，生物體在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)展形成各種抗氧化系統(tǒng)，包括過(guò)氧化物酶(Cat)、超氧化物歧化酶(SOD)以及過(guò)氧化物還原酶(Peroxire-doxin，Prxs)等。Prxs蛋白是新近發(fā)現(xiàn)的一類過(guò)氧化物酶，屬于抗氧化蛋白超家族，廣泛存在于原核生物和真核生物中，其催化活性和蛋白序列與其他抗氧化劑完全不同。大量的研究表明，Prxs蛋白具有多種生物學(xué)功能:它通過(guò)硫氧還蛋白還原過(guò)氧化物和超氧化物，具有強(qiáng)大的抗氧化和清除自由基的作用。此外Prxs還具有參與細(xì)胞增殖、分化，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell,NK)細(xì)胞活性，保護(hù)自由基敏感蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫濃度參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控細(xì)胞凋亡等功能。前期已通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備出對(duì)Prxs具有革El向性的單克隆抗體mAbl09，并針對(duì)該抗體的抗原性質(zhì)進(jìn)行了長(zhǎng)時(shí)間的深入研究。通過(guò)生物質(zhì)譜分析，可以基本確定該抗體針對(duì)的抗原為Prx I型硫氧過(guò)氧化物酶，通過(guò)免疫組化分析證實(shí)了該抗原主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種新型的核素標(biāo)記mAbl09單抗藥物。
[0004]本發(fā)明的另一目的是提供所述單抗藥物的制備方法。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的核素標(biāo)記mAbl09單抗藥物，所述單抗藥物是將單克隆抗體mAbl09與雙功能螯合劑NCS-Bz-DOTA或NCS-Bz-NOTA偶聯(lián)后進(jìn)行放射性核素標(biāo)記得到的藥物;其中所述放射性核素包括所有能與DOTA或NOTA結(jié)構(gòu)配位的放射性金屬核素，比如正電子診斷核素和負(fù)電子治療核素。所述正電子診斷核素包括64Cu、68Ga、89Zr等中的至少一種，所述負(fù)電子治療核素包括和/或mLu等。
[0006]本發(fā)明還提供所述單抗藥物在制備PET/CT分子診斷顯像劑中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明還提供所述單抗藥物在制備腫瘤靶向藥物中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的核素標(biāo)記mAb109單抗藥物的制備方法，包括以下步驟:
[0009]I)向濃度為2-5mg/ml的mAbl09單抗溶液中加入相當(dāng)于單抗2-10倍(優(yōu)選3倍)摩爾當(dāng)量的NCS-Bz-DOTA或NCS-Bz-NOTA，用去離子化處理的0.1M碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值至8.0-9.0，在4-37 °C (優(yōu)選4°C )條件下反應(yīng)4_24h(優(yōu)選24h)，得到標(biāo)記前體DOTA-mAbl09SN0TA-mAbl09;
[0010]2)當(dāng)放射性核素為正電子診斷核素時(shí)，向10_50yg標(biāo)記前體中加入400_740MBq新鮮配制的64Ciu68Ga或89Zr淋洗液，然后用0.1醋酸鈉溶液調(diào)至?財(cái).0-5.5，22°090°(:反應(yīng)10-50min，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液經(jīng)I3D-1O柱分離純化，即得；
[0011]3)當(dāng)放射性核素為負(fù)電子治療核素時(shí)，向10-50yg標(biāo)記前體中依次加入0.1MPH5.5的醋酸鈉溶液0.2-1.0mL，400-4000MBq新鮮配制的90YSmLu淋洗液，22°C_90°C反應(yīng)10-50min，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液經(jīng)I3D-1O柱分離純化，即得。
[0012]前述的方法，步驟I)中用去離子化處理的，0.0lM pH 7.4的磷酸鹽緩沖液配制mAb 109單抗溶液。
[0013]前述的方法，所得單抗藥物經(jīng)Rad1-HPLC分析，放化純度>98%。
[0014]前述的方法，步驟2)和3)中所述淋洗液用去離子化處理的0.0lMpH7.4的磷酸鹽緩沖液配制。
[0015]本發(fā)明中所述去離子化處理的0.1M碳酸氫鈉溶液的制備方法為:向0.1M碳酸氫鈉溶液中加入Chelex 100樹(shù)脂，料液比按g:mL計(jì)為1:100，樹(shù)脂加入24h后，即得去離子化處理的0.1M碳酸氫鈉溶液。
[0016]前述的方法，步驟2)和3)中PD-10柱使用前用磷酸鹽緩沖液淋洗，然后將所得反應(yīng)液加入到PD-10柱中，先以2.5mL磷酸鹽緩沖液淋洗除雜，然后以2.0mL磷酸鹽緩沖液洗脫，收集洗脫液。其中，所述磷酸鹽緩沖液為去離子化處理的，0.0lM pH7.4的磷酸鹽緩沖液。
[0017]本發(fā)明中所述去離子化處理的，0.0lMpH7.4的磷酸鹽緩沖液的制備方法為:向
0.0lM pH7.4的磷酸鹽緩沖液中加入Chelex 100樹(shù)脂，料液比按g:mL計(jì)為I: 100，樹(shù)脂加入24h后，即得。
[0018]WmLu-D0TA-mAbl09單抗藥物為例，制備方法如下:
[0019](1)將標(biāo)記前體0(^4-11^13109配制成2-1011^/11^溶液，以％保護(hù)后密封，分裝
0.005mL/支，于-20°C下靜置。
[0020](2)向標(biāo)記前體中依次加入0.1M NaAc溶液(5_10yL)、185MBq新鮮配制的mLuCl3淋洗液，室溫反應(yīng)20-30min，即得mLu-D0TA-mAbl09。測(cè)定標(biāo)記率及放射化學(xué)純度，當(dāng)標(biāo)記率小于90%，需用ro-ΙΟ柱分離，所得mLu-D0TA-mAbl09的放射化學(xué)純度大于95%。
[0021](3)PD-10柱使用前用磷酸鹽緩沖液淋洗，然后將所得反應(yīng)液加入到ro-1o柱中，先以2.5mL磷酸鹽緩沖液淋洗除雜，然后以磷酸鹽緩沖液洗脫，收集洗脫液，SPmLu-DOTA-mAb 109注射液。主要放射性雜質(zhì)mLu3+將殘留于H)-10柱中。
[0022]上述制備的mLu-D0TA-mAbl09經(jīng)SPECT顯像結(jié)果表明，mLu-D0TA-mAbl09能夠準(zhǔn)確定位Prxl受體陽(yáng)性腫瘤，并在6-96h內(nèi)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞種植的裸鼠中清晰可見(jiàn)J77Lu-D0TA-mAbl09的紅外顯像顯示，111In-NIRF-CCPM-R⑶能夠準(zhǔn)確定位Prxl受體陽(yáng)性腫瘤，并在6-96h內(nèi)種植的胰腺癌(PANC-1)裸鼠中清晰可見(jiàn)。以上結(jié)果表明，mLu-DOTA-HiAb109可作為一種特異性對(duì)Prxl受體高表達(dá)腫瘤分子顯像劑。
[0023]本發(fā)明以具有較強(qiáng)的Prxl受體親和力的且具有較好研究基礎(chǔ)的單克隆抗體mAb 109為母體，與雙功能螯合劑進(jìn)行偶聯(lián)，獲得可用于Prx I受體革E向的標(biāo)記前體DOTA-mAb 109或NOTA-mAb 109。并分別以不同性質(zhì)的放射性核素進(jìn)行標(biāo)記，進(jìn)行Prx I受體高表達(dá)腫瘤的診斷與治療。本發(fā)明核素標(biāo)記的mAbl09單抗藥物能夠特異性地與廣泛表達(dá)在實(shí)體瘤患者體內(nèi)的Prxl結(jié)合。并通過(guò)各種核素的性質(zhì)，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)靶向分子診療的目的，以達(dá)到實(shí)體腫瘤早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療的目標(biāo)。
【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中制備的1771^1-0(/^-11^13109單抗藥物的Rad1-HPLC分析結(jié)果O
[0025]圖2為本發(fā)明實(shí)施例2ψ1'ιι-00ΤΑιΑ?3?09在模型動(dòng)物體內(nèi)的SPECT顯像情況;其中4表示模型動(dòng)物的橫斷面，Β表示模型動(dòng)物的冠狀位，C表示模型動(dòng)物的矢狀位。
【具體實(shí)施方式】
[0026]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0027]以下實(shí)施例中單抗mAbl09的制備方法如下:1)通過(guò)向Balb/C小鼠腹腔注射0.5mlsigma不完全佐劑，6天后腹腔注射約I X 16個(gè)可產(chǎn)生單抗mAbl09的109細(xì)胞(109細(xì)胞由北京腫瘤醫(yī)院細(xì)胞庫(kù)提供，細(xì)胞編號(hào)BCH-60H09，參考朱華，李囡，張宏，林新峰，李振甫，楊志。111111-0(^\-11^13109單克隆抗體探針的制備及其分子顯像的研究?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2015，73
(I):36-40);2) 109細(xì)胞在脾臟(肝臟)中產(chǎn)生腹水后于7-10日進(jìn)行收集，而后以飽和硫酸銨沉淀腹水，通過(guò)進(jìn)一步的純化，通過(guò)SDS-PAGE驗(yàn)證得到單一的單抗mAbl09。mAbl09單抗在使用前過(guò)PD-10柱進(jìn)行純化，以去離子化處理的，0.0lM pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗脫，通過(guò)紫外分光光度計(jì)法測(cè)定純化后其濃度為2_5mg/ml (相當(dāng)于13.3-33.3nmol/L)，并通過(guò)MALD1-T0F確定其分子量為147kDa。
[0028]以下實(shí)施例中使用的試劑及其制備如下:
[0029]去離子化處理的0.1M碳酸氫鈉溶液，其制備方法為:向0.1M碳酸氫鈉溶液中加入Chelex 100樹(shù)脂，料液