神經(jīng)生長因子緩釋微球制劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及神經(jīng)生長因子緩釋微球制劑及其制備方法，屬于藥物制劑領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 神經(jīng)生長因子(Nerve Growth Factor,NGF)是一種具有神經(jīng)元營養(yǎng)和促進(jìn)突起生 長雙重生物學(xué)功能的小分子多膚類神經(jīng)營養(yǎng)因子，具有較強(qiáng)的促細(xì)胞分裂功能，對中樞及 周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分化、生長、再生和功能特性的表達(dá)均具有重要的調(diào)控作用。
[0003] 目前，神經(jīng)生長因子可用于視神經(jīng)損傷、腦、脊髓損傷、脊髓移植、骨科四肢神經(jīng)損 傷、坐骨神經(jīng)損傷、多發(fā)性神經(jīng)炎、椎間盤痛、神經(jīng)斷裂及退行性病變。但在實際應(yīng)用中，由 于神經(jīng)生長因子的半衰期較短，在水溶液中易失活，且易受濕度、酸堿度等多種因素的影 響，在神經(jīng)再生及治療疾病的漫長過程中，神經(jīng)生長因子不能長時間持續(xù)發(fā)揮促再生作用， 需要頻繁給藥才能實現(xiàn)良好的治療效果，制備神經(jīng)生長因子的長效緩釋微球制劑是改善上 述問題的有效途徑?，F(xiàn)有常用的制備微球方法是復(fù)乳法(W/0/W)，雖然操作簡單，但針對制 備神經(jīng)生長因子的緩釋微球制劑還存在如下的問題：
[0004] 一、研究報道，神經(jīng)生長因子主要是W二聚體的形式發(fā)揮藥效，而單體的形式雖然 活性沒有完全喪失，但藥效顯著降低?，F(xiàn)有制備微球的方法中，采用了添加藥物穩(wěn)定劑的方 法保護(hù)藥物的活性，但微球在凍干、儲存和釋放時，特別是凍干與存儲過程中，由于蛋白藥 物受到強(qiáng)烈的外界應(yīng)力作用(包括低溫應(yīng)力，抑的改變，離子強(qiáng)度增加等），蛋白藥物的結(jié)構(gòu) 和活性遭到破壞。蛋白二聚體容易發(fā)生解聚，影響蛋白活性。
[0005] 二、藥物穩(wěn)定劑的含量不僅影響藥物活性也會影響藥物釋放，而現(xiàn)有方法常常為 了保護(hù)藥物活性加入濃度過大、含量較高的藥物穩(wěn)定劑(大部分在內(nèi)水相的濃度超過0.1 g/ ml)。雖然藥物的活性得到一定的保護(hù)，但較高的內(nèi)水相滲透壓，會進(jìn)一步影響藥物釋放行 為，可能引起高突釋（突釋率大于15%)、釋放過快或過慢、釋放不完全(在理論釋放期內(nèi)積 累釋放率低于80%)等，降低藥物的治療效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種突釋率低、緩釋性好、蛋白活性持久 的神經(jīng)生長因子長效緩釋微球制劑。
[0007] 本發(fā)明要解決的第二個技術(shù)問題是提供上述神經(jīng)生長因子長效緩釋微球制劑的 制備方法。
[000引為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案：
[0009] 神經(jīng)生長因子緩釋微球制劑，由W下重量百分比含量的成份組成：神經(jīng)生長因子 0.01~2.00%，兩嵌段兩親性聚合物40.00~99.88%，穩(wěn)定劑0~40.00%，凍干保護(hù)劑0.10 ~50.00%;穩(wěn)定劑選自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、簇甲基葡聚糖、環(huán)糊精或聚乙二醇中 的一種或多種;凍干保護(hù)劑選自薦糖、甘露醇、海藻糖、泊洛沙姆或乳糖中的一種或多種。
[0010] 所述兩嵌段兩親性聚合物選自聚乳酸、聚乳酸-徑基乙酸共聚物、聚乳酸-聚乙二 醇共聚物中的一種或多種，分子量為5，OOO~80，OOO道爾頓；
[0011] 神經(jīng)生長因子是W二聚體形式起藥效，因此二聚體的解聚降低了藥物的活性。本 發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)凍干保護(hù)劑能夠單獨或與穩(wěn)定劑協(xié)同保護(hù)NGF二聚體，抵抗其在凍干過程中 受到的應(yīng)力作用(包括低溫應(yīng)力，pH的改變，離子強(qiáng)度增加等），保護(hù)神經(jīng)生長因子在凍干和 儲存過程中的結(jié)構(gòu)和活性。而且協(xié)同作用使得穩(wěn)定劑在極低含量條件下，提高了神經(jīng)生長 因子在釋放過程中的穩(wěn)定性。本發(fā)明中神經(jīng)生長因子在凍干、儲存和釋放過程中二聚體形 式得到很好的保護(hù)，極大的提高藥物的活性。
[0012] 本發(fā)明所用的兩嵌段兩親性聚合物的種類及分子量的選擇，綜合考慮了聚合物的 降解率、物理性質(zhì)、神經(jīng)生長因子的釋放周期等多種因素。
[0013] 優(yōu)選的神經(jīng)生長因子緩釋微球制劑，由W下重量百分比含量的成份組成：
[0014] 神經(jīng)生長因子0.01~1.26%，兩嵌段兩親性聚合物70.00~99.00%，穩(wěn)定劑0.005 ~3.14%，凍干保護(hù)劑0.23~42.73% ;兩嵌段兩親性聚合物的分子量為10，000~40，000道 爾頓。
[0015] 所述聚乳酸-徑基乙酸共聚物中聚乳酸和徑基乙酸的比例為50:50~85:15,聚乳 酸-聚乙二醇共聚物中，聚乳酸和聚乙二醇的比例為5:1~20:1。
[0016] 所述穩(wěn)定劑聚乙二醇為聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇800、聚乙二醇1000、 聚乙二醇2000或聚乙二醇4000。
[0017] 更優(yōu)選的神經(jīng)生長因子緩釋微球制劑，由W下重量百分比含量的成份組成：
[001引神經(jīng)生長因子0.02~1.26%，兩嵌段兩親性聚合物90.00~98.00%，穩(wěn)定劑0.015 ~3.14%，凍干保護(hù)劑1.21~9.05%。
[0019] 本發(fā)明所述神經(jīng)生長因子包括但不限于鼠源性神經(jīng)生長因子(mNGF)、人源性神經(jīng) 生長因子化NG巧或重組人神經(jīng)生長因子(riiNG巧。
[0020] 所述神經(jīng)生長因子緩釋微球制劑的平均粒徑為1~100微米，優(yōu)選20~80微米。
[0021] 神經(jīng)生長因子緩釋微球制劑的制備方法，包括W下步驟：
[0022] 1)將含神經(jīng)生長因子和穩(wěn)定劑的水相作為內(nèi)水相Wi,將兩嵌段兩親性聚合物材料 溶于有機(jī)溶劑中，形成油相0;將運(yùn)兩相混合均質(zhì)乳化制備Wi/0初乳液；
[0023] 2)將步驟1)所得Wi/0初乳液加入到含有表面活性劑的外水相化中，再用一定的轉(zhuǎn) 速均質(zhì)體系形成Wi/0/恥復(fù)乳液；
[0024] 3)將步驟2)所得W1/0/W2復(fù)乳液通過室溫攬拌揮發(fā)或?qū)⑵涞谷牒谢疌l的萃取液 去除有機(jī)溶劑，再將微球離屯、、洗涂；
[0025] 4)將步驟3)所得的微球懸浮于含有凍干保護(hù)劑的水溶液中，經(jīng)過冷凍干燥后，得 到神經(jīng)生長因子緩釋微球制劑。
[0026] 所述步驟1)中的內(nèi)水相選自去離子水、巧樣酸緩沖液、醋酸緩沖液、憐酸緩沖液中 的一種，有機(jī)溶劑選自二氯甲燒、=氯甲燒、二甲苯、甲苯、乙酸乙醋、丙酬中的任意一種或 至少巧巾的混合物，有機(jī)溶劑中含有的兩嵌段兩親性聚合物的濃度為0.010~0.500g/ml，兩 嵌段兩親性聚合物與神經(jīng)生長因子的重量含量比為4500: 1~50: 1，穩(wěn)定劑濃度為0~ 0.200g/ml，內(nèi)水相Wi與油相0的體積比為1:1~1:15;步驟2)中的表面活性劑選自聚乙締醇 (PVA)、聚山梨醋(Tween 80)、聚山梨醋(Tween 20)、或十二烷基橫酸鋼(SDS)，表面活性劑 濃度為0.0 Ol~0. lOOg/ml，油相0與外水相化的體積比1:2~1:25;步驟4)中凍干保護(hù)劑濃 度為 0.001 ~0.150g/ml。
[0027] 優(yōu)選的，所述步驟I)中有機(jī)溶劑中含有的兩嵌段兩親性聚合物的濃度0.050~ 0.300g/ml，聚合物與NGF重量含量比為4500:1~50:1，穩(wěn)定劑濃度為0.0005~0.050g/ml， 所述內(nèi)水相Wi和油相0的體積比為1:2~1:10;步驟2)中表面活性劑的濃度為0.002~ 0.050g/ml，油相0與外水相W2的體積比1: 5~1: 20 ;步驟4)中凍干保護(hù)劑濃度為0.005~ 0.030g/ml〇
[0028] 對本發(fā)明產(chǎn)品進(jìn)行包埋率、載藥量、二聚體含量、NG巧舌性測定的方法如下：
[0029] 1、包埋率，按照W下方式計算：
[0030] 包埋率（％)=微球中藥物的測得載藥量/微球中藥物的理論載藥量(iig/mg)X 100%;
[0031] 2、載藥量=[微球中藥物量/(微球中藥物量+聚合物量)]X 100%。
[0032] 3、二聚體含量，采用SEC-HPLC方法檢測，色譜柱選用TSK G3000SWXL，流動相為含 有15%乙臘的憐酸鹽緩沖液，流速為0.6ml/min，并按W下公式計算：
[0033] 二聚體含量（％ )=二聚體峰面積/所有峰面積總和。
[0034] 4、NGF活性，采用細(xì)胞法測定，測定方法如下：（具體見CN103376248A中所述方法）
[0035] 選擇表達(dá)NGF高親和力受體化kA的TF-I細(xì)胞，利用NGF能夠劑量依賴性地促進(jìn)TF-I 細(xì)胞增殖的特點，在一定范圍內(nèi)，用一系列濃度的NGF溶液作用TF-I細(xì)胞，一段時間后用MTT 法測定TF-I細(xì)胞增殖情況。對NGF濃度和其對應(yīng)的細(xì)胞增殖情況測定值進(jìn)行四參數(shù)擬合，確 定NGF對TF-I細(xì)胞增殖作用為最大值一半時的稀釋倍數(shù)。然后根據(jù)供試品和標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋 倍數(shù)W及標(biāo)準(zhǔn)品的活性值計算得到供試品的活性值。
[0036] 本發(fā)明具有如下有益效果：
[0037] 1、本發(fā)明針對神經(jīng)生長因子緩釋微球中蛋白藥物活性易受影響的缺陷，采用凍干 保護(hù)劑單獨或與穩(wěn)定劑協(xié)同作用，保持凍干、儲存和釋放過程中神經(jīng)生長因子的二聚體形 式，并進(jìn)一步增強(qiáng)神經(jīng)生長因子在凍干、儲存和釋放過程中的穩(wěn)定性。本發(fā)明使蛋白二聚體 含量在凍干、儲存12個月后一直維持在99% W上;釋放完全后，二聚體含量維持在90% W 上，活性保持在80 % W上。
[0038] 2、本發(fā)明顯著降低了穩(wěn)定劑的含量，避免穩(wěn)定劑過多對藥物釋放產(chǎn)生的不利影 響，降低了突釋，使釋放更穩(wěn)定，特別在釋放后期極大提高了藥物的活性:微球包埋率高于 85% ;24小時突釋率低于13%，在相應(yīng)釋放周期內(nèi)，釋放穩(wěn)定。同時在凍干和釋放過程中，藥 物的二聚體形式得W維持，極大保持了藥物的活性。
[0039] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步描述，但本發(fā)明不限制于實施例中，凡依照本 發(fā)明公開內(nèi)容所做的本領(lǐng)域等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【附圖說明】
[0040] 圖1為實施例1制備的神經(jīng)生長因子緩釋微