球形芽孢桿菌2317-2胞外代謝產(chǎn)物的提取方法及抗腫瘤應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，具體設及一種球形芽抱桿菌2317-2胞外代謝產(chǎn)物的提 取方法及抗腫瘤應用。
【背景技術】
[0002] 球形芽抱桿菌(Bacillus S地ae;ricus，Bs)，革蘭氏染色呈陽性，是一種末端有膨 大的內(nèi)生抱子囊的好氧細菌，其菌落為圓形，表面光滑，邊緣整齊，并且閃著油脂樣的光，菌 落為白色或淡黃色。球形芽抱桿菌的培養(yǎng)體有營養(yǎng)體期和芽抱期兩個發(fā)育階段，其中二元 毒素蛋白在其芽抱期產(chǎn)生。球形芽抱桿菌的細胞形態(tài)在不同發(fā)育階段的形態(tài)有所不同。營 養(yǎng)體期細胞形態(tài)為桿狀，周圍有鞭毛，并且活動活躍。在芽抱期時，由于芽抱的形成使菌體 的末端膨大，呈鼓植狀突起，待芽抱成熟，伴胞晶體被包在芽胞外膜內(nèi)。不同的球形芽抱桿 菌的芽抱其形態(tài)和大小都不同。在球形芽抱桿菌生長時期，有些菌株會產(chǎn)生伴胞晶體，有些 不產(chǎn)生。伴胞晶體與殺蚊活性相關。所有的球形芽抱桿菌，由于缺乏=簇酸循環(huán)的中間酶導 致其不能代謝糖類物質(zhì)，但是可W利用其它碳化合物作為碳源。球形芽抱桿菌在40°C生長， 生物素、硫胺素等生長因子能促進其生長。
[0003] 在芽抱形成時期兩個蛋白相互作用折疊組成晶體，單獨表達的BinA和BinB不能形 成伴胞晶體，只能形成無定形包含物。只有BinA蛋白對蚊蟲有毒，但是毒力比較小。單獨的 BinB對蚊蟲無毒，但是能夠增強BinA蛋白的毒力。只有它們同時存在，才能對蚊蟲有較高的 毒性。Western-Blot實驗表明BinA和BinB蛋白間沒有交叉反應，說明運兩個蛋白之間沒有 同源性。一般認為，BinA決定毒素蛋白的殺蚊活性和特異性，而BinB主要與蚊幼蟲的腸敏感 位點特異性結(jié)合。二者同時存在，才能發(fā)揮毒素蛋白的殺蚊毒性。
[0004] 生物毒素是由生物體產(chǎn)生并使其他生物體受到傷害或者致死的物質(zhì)。生物毒素不 僅具有毒理作用，還具有藥理作用。生物毒素也稱為天然毒素，包括植物、動物、微生物所產(chǎn) 生的有毒物質(zhì)。根據(jù)作用機理，運些毒素分為:細胞溶解霉素、直接作用于細胞、抑制蛋白質(zhì) 合成、作用于離子通道、作用于細胞骨架、溶血或凝血的毒素等。生物毒素一般均有抗癌活 性，有些生物毒素對腫瘤細胞具有直接殺傷作用，有些生物毒素抑制腫瘤的血管再生，從而 抑制腫瘤生長。
[0005] 微生物代謝產(chǎn)物包括毒素，在治療和/或抑制腫瘤或在腫瘤輔助診斷、預后中有廣 泛應用，包含球形芽抱桿菌2317-2的基因重組或組合物及其抗癌作用等生物活性，及其應 用上的基因重組或組合物、相關代謝產(chǎn)物、生物毒素的抑制/殺滅真菌、細菌、蚊蟲、腫瘤細 胞等生物活性及其應用。然而，目前關于球形芽抱桿菌2317-2的胞外代謝產(chǎn)物的相關抗腫 瘤方面的研究未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種球形芽抱桿菌2317-2胞外代謝產(chǎn)物的提取方法及抗 腫瘤應用，經(jīng)該提取方法分離純化得到了球形芽抱桿菌2317-2胞外代謝產(chǎn)物二元毒素晶體 蛋白，經(jīng)證實該二元毒素晶體蛋白能夠有效應用于抗腫瘤藥物的制備中。
[0007] 本發(fā)明是通過W下技術方案來實現(xiàn)：
[0008] 本發(fā)明公開了一種球形芽抱桿菌2317-2胞外代謝產(chǎn)物在制備抗腫瘤藥物中的應 用，所述球形芽抱桿菌2317-2胞外代謝產(chǎn)物為二元毒素晶體蛋白。
[0009] 所述二元毒素晶體蛋白是由等量的41.9kDa BinA和51.4kDa BinB組成。
[0010] 所述的藥物為抗肝癌7721、肝癌7402、肺癌A549、乳腺癌MCF7或乳腺癌皿LA的藥 物。
[0011] 所述的藥物為促進腫瘤細胞調(diào)亡、抑制腫瘤細胞增殖或抑制腫瘤細胞遷移的藥 物。
[0012] 本發(fā)明還公開了上述的球形芽抱桿菌2317-2胞外代謝產(chǎn)物的提取方法，包括W下 步驟：
[0013] 1)將球形芽抱桿菌2317-2在LB固體培養(yǎng)基上活化后，接種于LB液體培養(yǎng)基中，在 30°C下震蕩培養(yǎng)過夜；
[0014] 2) Wl: 100的比例，將培養(yǎng)過夜的菌液轉(zhuǎn)接入MBS培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)至芽抱晶體 從菌株中完全釋放，收集發(fā)酵液，離屯、取沉淀，將沉淀洗涂后重懸處理，然后在超聲波處理， 直至晶體、芽抱及細胞碎片充分分散，震蕩混勻，除去泡沫，離屯、，取沉淀；
[0015] 3)向沉淀中加水制成懸液，再加入溶菌酶，使懸液中溶菌酶的終濃度為0.1~ 0.2mg/ml，然后再37°C處理2~化，期間每30min取出輕柔混勻數(shù)次，然后離屯、收集沉淀；
[0016] 4)向沉淀中加入雙蒸水制成懸液，然后加入50mM DTT充分混勻后，于27°C下靜置 化，離屯、收集沉淀；
[0017] 5)將沉淀在-20°C下凍融，加入復方泛影葡胺溶液，混勻后離屯、，收集上清液，在無 菌水中透析后，低溫真空冷凍制得凍干粉，得到球形芽抱桿菌伴胞晶體蛋白，4°C保存。
[001引步驟2)所述洗涂采用0.5mol/L的NaCl;所述超聲波處理是在4°C，20曲z，200W的條 件下處理25min，期間每破碎5s，停頓5s。
[0019 ]步驟4)是按Iml雙蒸水中含有70mg沉淀的量向沉淀中加入雙蒸水。
[0020]步驟5)中，加入質(zhì)量濃度為42 %~44 %的復方泛影葡胺溶液，透析時間為24~ 4化。
[0021 ] 步驟2)、3)、4)及5)中所述的離屯、均是在8000~lOOOOr/min下，離屯、10~20min。
[0022] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有W下有益的技術效果：
[0023] 本發(fā)明公開了球形芽抱桿菌2317-2胞外代謝產(chǎn)物一一二元毒素晶體蛋白在制備 抗腫瘤藥物中的應用，通過球形芽抱桿菌2317-2菌株胞外代謝產(chǎn)物對人腫瘤細胞增殖的抑 制實驗、對人腫瘤細胞調(diào)亡影響的實驗W及對人腫瘤細胞遷移的影響實驗，證實了該二元 毒素晶體蛋白具有特異性抑制腫瘤細胞生長的作用，因而能夠有效應用于抗腫瘤藥物的制 備中。實驗結(jié)果顯示:該球形芽抱桿菌2317-2提取的胞外代謝產(chǎn)物對肝癌細胞7721、肝癌細 胞7402、肺癌細胞A549、乳腺癌細胞MC巧及乳腺癌細胞皿LA等腫瘤細胞均顯示較好的抑制 作用，抑制率分別為:95%、75%、72%、64%、57%。本發(fā)明為尋找和發(fā)現(xiàn)新型的抗腫瘤藥物 提供依據(jù)，拓展尋求發(fā)現(xiàn)抗腫瘤藥物的范圍，提出新的研究思路及新的研究領域。
[0024] 本發(fā)明還公開了球形芽抱桿菌2317-2胞外代謝產(chǎn)物的提取分離方法，通過對該球 形芽抱桿菌2317-2的分批發(fā)酵，對其細胞進行裂解離屯、等處理，獲得芽抱桿菌代謝產(chǎn) 物一-二元毒素晶體蛋白。該提取方法操作簡單、對設備及環(huán)境要求低，經(jīng)該方法提取分離 的晶體蛋白純度局。該晶體蛋白是由二兀毒素組成的，由等量的41.9kDa BinA和51.4kDa BinB蛋白多膚組成，二者的同時存在才能形成伴胞晶體，缺一不可。
【附圖說明】
[0025] 圖1為球形芽抱桿菌2317-2胞外代謝產(chǎn)物提取物作用不同時間對SMMC7721細胞的 抑制作用；
[0026] 圖2流式細胞術檢測球形芽抱桿胞外代謝產(chǎn)物對腫瘤細胞調(diào)亡的影響結(jié)果;其中， (a)為陰性對照組；（b)為0.167mg/mL組；（C)為0.25mg/mL組；（d)為0.375mg/mL組;Ql為壞死 細胞;Q2為晚調(diào)細胞;Q3為正常細胞;Q4為早調(diào)細胞；
[0027] 圖始田胞劃痕實驗檢測球形芽抱桿菌胞外代謝產(chǎn)物對腫瘤細胞遷移的抑制作用
[0028] 圖4球形芽抱桿菌胞外代謝產(chǎn)物的不同濃度、不同作用時間對SMMC7721細胞遷移 的影響。
【具體實施方式】
[0029] 下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而 不是限定。
[0030] 本發(fā)明所設及的球形芽抱桿菌2317-2菌株由中國科學院武漢病毒研究所饋贈，該 菌株為已知菌株，如在文獻"Bei 化n,Haizhou Liu,et al.Mole州Iar Qiaracterization of a Glucokinase with Broad Hexose Specificity from Bacillus sphaericus S化ain C3-41[J]APPLI邸 AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGYJune2007，p.3581-3586。" 存在報道。
[0031] I、球形芽抱桿菌2317-2胞外代謝產(chǎn)物一一二元毒素晶體蛋白的提取
[0032] 球形芽抱桿菌胞外代謝產(chǎn)物包括二元毒素晶體蛋白分離純化的方法為：
[0033] 首先在LB固體培養(yǎng)基上活化菌株后，接種于LB液體培養(yǎng)基中，3(TC震蕩培養(yǎng)過夜； 第二天Wl: 100比例轉(zhuǎn)接入MBS培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)使芽抱晶體從菌株中完全釋放;此時收 集發(fā)酵液，1000 Og離屯、IOmin;沉淀用0.5mol/L的NaCl離屯、洗涂一次后，重懸，超聲波處理(4 °C，20k化，200W，破碎5sec，停5sec，共處理25min)，待晶體、芽抱和細胞碎片充分分散后，震 蕩混勻，除去泡沫，離屯、，取沉淀;將沉淀加水制成懸液，按終濃度0 . Img/ml加入溶菌酶，37 °C處理化，每30min拿出來輕柔混勻數(shù)次，離屯、收集沉淀；按70mg沉淀/ml雙蒸水制成懸液， 加入50mM DTT充分混勻后，靜置于27°C處理化;離屯、收集沉淀;-20°C凍融一次，加入42%復 方泛影葡胺(泛影酸鋼和泛影葡胺Wl :6.6比例配制），混勻后離屯、，使芽抱晶體純度提高。 100(K)rpm離屯、20min，收集上清，并在無菌水中透析4她，檢測可溶性晶體蛋白的濃度;低溫 真空冷凍條件下制成凍干粉，4°C保存。
[0034] 獲得芽抱桿菌代謝產(chǎn)物一一二元毒素晶體蛋白，該晶體蛋白是由二元毒素組成 的，由等量的41.9kDa BinA和51.4kDa BinB蛋白多膚組成，二者的同時存在才能形成伴胞 晶體，缺一不可。
[0035] 2、腫瘤細胞培養(yǎng)及抑制率檢測
[0036] 1)肝癌7721、肝癌7402、肺癌A549、乳腺癌MCF7、乳腺癌皿LA等細胞均購自美國 ATCC細胞庫，于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，置于37°C、5%C0播養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0037] 2)接種:0.25%膜蛋白酶消化細胞，計數(shù)板計數(shù)后用相應的培養(yǎng)基(含10%胎牛血 清）制備細胞懸液，并W-定密度接種于96孔板中（乳腺癌細胞系MCF7,2X IO4個/孔、肺癌 細胞系A549，1.5 X IO4個/孔、宮頸癌細胞系化La，1.5 X IO4個/孔、肝癌細胞系肥L7402，3 X 1 〇4個/孔、肝癌細胞系SMMC7721，3 X 1 〇4個/孔、VSMC，2 X 1 〇5個/孔、皿VEC，3 X 1 〇4個/孔），體 積為18化L/孔。每組設5個平行孔?？瞻讓φ湛字患?8化L/孔的培養(yǎng)基，不加細胞懸液。
[0038] 3)貼壁:培養(yǎng)板放在細胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2地，使細胞貼壁。
[0039] 4)給藥:實驗組加入待測藥物20化，陰性對照組加入20化含溶劑的培養(yǎng)基，細胞培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)作用4她。
[0040] 5)呈色：小屯、吸