葛根素介孔硅納米粒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種葛根素介孔硅納米粒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 葛根素 （Puerar in，PUE)是一種提取于中藥野葛（Puerarialobata)或甘葛藤 (Puerarin thomsoni)根莖的異黃酮苷，臨床上主要用于心腦血管疾病的治療，如心律失 常、心肌梗死、冠心病、高血壓等，同時(shí)有增加腦血流量、改善腦循環(huán)作用。但是PUE親脂性 強(qiáng)、溶解度低、口服吸收差、生物利用度低，國(guó)內(nèi)批準(zhǔn)的PUE劑型只有注射液和滴眼液，而PUE 注射液易出現(xiàn)急性血管內(nèi)溶血等不良反應(yīng)，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局多次發(fā)文公告慎用 PUE注射液，這極大限制了PUE臨床應(yīng)用，因此亟待開發(fā)新型PUE 口服制劑。
[0003] 納米粒(Nanoparticles，NPs)作為一種新型的遞藥載體，將藥物包載于NPs中，一 方面可以提高水難溶性藥物穩(wěn)定性和溶解性，達(dá)到緩控釋的目的；另一方面還能夠促進(jìn)藥 物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、改善藥物代謝分布、提高生物利用度等。其中，介孔娃納米粒(Mesoporous Silica Nanoparticles，MSN)是一類呈球形蜂窩狀的介孔材料(表面孔徑介于0, 2~5A )，其 粒子具備巨大比表面積和孔容積可有效載入藥物，提高載藥量;可控制的介孔大小和孔徑 結(jié)構(gòu)能夠調(diào)節(jié)藥物釋放特性;豐富的表面硅羥基極易修飾或改性，可作為靶向遞藥載體;此 外MSN具備良好的生物相容性，使其在納米載體領(lǐng)域具有極佳的開發(fā)前景。研究表明NPs經(jīng) 過氨基修飾后，賦予其荷正電的特性，可以與胃腸道表面的荷負(fù)電的上皮細(xì)胞和粘膜蛋白 相互粘附，促進(jìn)NPs的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，提高藥物生物利用度。然而氨基修飾后的陽(yáng)離子介孔硅納 米粒（Cationic Mesoporous Silica Nanoparticles，CMSN) 口服制劑的研究少有報(bào)道，因 此本課題以CMSN為載體，研制口服葛根素陽(yáng)離子介孔硅納米粒(CMSN-PUE )，并對(duì)其體外特 性進(jìn)行初步研究，為下一步體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為PUE 口服納米制劑的 研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)參考。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供一種具有良好的生物相容性和緩控釋特性的葛根素介孔硅納米粒。
[0005] -種葛根素介孔娃納米粒，所述介孔娃納米粒為氨基修飾的陽(yáng)離子介孔娃納米 粒，粒徑為98.4±2.8nm，Zeta電位13.2±1.8mv;葛根素的載藥量為18·25±4· 17%。
[0006] 其中，所述氨基修飾通過APTES修飾。
[0007] 另外本發(fā)明還提供了一種葛根素介孔硅納米粒的制備方法。
[0008] 葛根素介孔硅納米粒的制備方法，包括如下步驟：
[0009] 1)制備CMSN:將CTAB溶解于超純水中，加入NaOH溶液，80°C恒溫?cái)嚢?h，然后快速 加入TEOS，30min后緩慢恒速滴入APTES，控制5min滴畢，恒溫繼續(xù)反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束后靜置 熟化24h，經(jīng)0.45μηι濾膜抽濾或15000rpm離心25min得到的白色滑膩固體；
[0010] 2)制備CMSN-PUE:將CMSN分散到HJE飽和乙醇溶液中，常溫25°C避光攪拌，每隔 30min短時(shí)超聲3min，攪拌2h使CMSN充分吸附PUE飽和乙醇溶液，然后15000r · min-1離心 30min，將離心得到的白色固體35 °C減壓干燥后稱重，然后重復(fù)分散、吸附、離心、干燥、稱 重，反復(fù)吸附7次，載藥量為18.25 ± 4.17 %。
[0011]優(yōu)選的，葛根素介孔硅納米粒的制備方法，其特征在于:包括如下步驟：
[0012] 1)制備CMSN:1.0g CTAB溶解于480mL超純水中，加入3.5mL 2M NaOH溶液，80°C恒 溫?cái)嚢?h，然后快速加入3mL TEOS，30min后緩慢恒速滴入2mL APTES，控制5min滴畢，恒溫 繼續(xù)反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束后靜置熟化24h，經(jīng)0.45μπι濾膜抽濾或15000rpm離心25min得到的白 色滑膩固體。將得到的白色固體分散于200mL酸性乙醇溶液中80°C回流4h，其中乙醇:濃鹽 酸=9: l(v/v)，離心再分散，經(jīng)過6次反復(fù)操作去除模板劑CTAB，最后一次離心后真空干燥， 得到白色粉末CMSN;
[0013] 2)制備CMSN-PUE:稱取IOOmg CMSN分散到PUE飽和乙醇溶液20mL中，常溫25°C避光 攪拌，每隔30min短時(shí)超聲3min，攪拌2h使CMSN充分吸附PUE飽和乙醇溶液，然后15000r · min-1離心30min，將離心得到的白色固體35 °C減壓干燥后稱重，然后重復(fù)分散、吸附、離心、 干燥、稱重，反復(fù)吸附7次，載藥量為18.25±4.17%。
[0014] 本發(fā)明還提供了葛根素介孔硅納米粒用于制備心腦血管疾病藥物的應(yīng)用。
[0015] 優(yōu)選的，所述藥物為口服用藥。
[0016] 優(yōu)選的，所述藥物為0~20yg · mL-1 口服液。
[0017] 本發(fā)明成功制備了 口服葛根素陽(yáng)離子介孔硅納米粒，具有粒徑均一、載藥量高、良 好的緩控釋特性和生物相容性等特點(diǎn)，并且顯著提高了葛根素的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)率。
[0018] 說明書附圖
[0019] 圖I CMSN的TEM(A放大倍數(shù)10k，a放大倍數(shù)80k觀察精細(xì)介孔結(jié)構(gòu))和SEM(B放大倍 數(shù)20k)。
[0020] 圖2納米粒的粒徑分布圖（A · MSN，B · CMSN)。
[0021] 圖3納米粒的Zeta電位分布圖（A.MSN，B.CMSN)。
[0022] 圖4 .MSN和CMSN紅外光譜圖。
[0023]圖5.飽和吸附次數(shù)-重量變化曲線(η = 3)[(CMSN-PUE) i為載體吸附藥物飽和溶液 的吸附次數(shù)-載體重量變化曲線，（CMSN)i為載體吸附空白溶液的吸附次數(shù)-載體重量變化 曲線，（CMSN-PUE)i -（CMSN)i為載入載體的藥物吸附次數(shù)-重量變化曲線，（CMSN)i - (CMSN) i-Ι為載體吸附次數(shù)-重量損失變化曲線]。
[0024] 圖6 .MSN和CMSN的細(xì)胞毒性。
[0025] 圖7.體外累計(jì)釋藥百分率-時(shí)間變化曲線(n = 3)。
[0026] 圖8.?現(xiàn)制劑跨0&(：〇-2腸壁單層細(xì)胞模型的轉(zhuǎn)運(yùn)藥物濃度-時(shí)間曲線以.4?481^ B.BL-AP)(n = 6)。
[0027] 圖9. CMSN-PUE在Caco-2腸壁單層模型的轉(zhuǎn)運(yùn)通道(a電荷粘附促進(jìn)納米粒介導(dǎo)的 跨膜轉(zhuǎn)運(yùn);b電荷粘附促進(jìn)藥物被動(dòng)擴(kuò)散轉(zhuǎn)運(yùn);c電荷粘附促進(jìn)旁路轉(zhuǎn)運(yùn);d電荷粘附促進(jìn)載 體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn);e電荷粘附促進(jìn)藥物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn);f納米粒介導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)細(xì)胞外排轉(zhuǎn)運(yùn)）。
【具體實(shí)施方式】
[0028]下面通過一個(gè)具體實(shí)例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但是，應(yīng)當(dāng)理解為，這些實(shí)例僅僅是用 于更詳細(xì)具體地說明之用，而不應(yīng)理解為用于任何形式限制本發(fā)明。
[0029] 1儀器與材料
[0030] 1.1儀器
[0031] 安捷倫1200型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司）；JEM-1200EX透射電鏡（日本電 子株式會(huì)社）；SU-70場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（日本日立公司）；Vector 22傅立葉紅外光譜儀(德國(guó) 布魯克公司）；Nan〇-ZS 90激光粒度分析儀(英國(guó)馬爾文儀器有限公司）；0ptima MAX超速離 心機(jī)(美國(guó)貝克曼有限公司）;Mi 11-Q超純水儀(美國(guó)密理博公司）;PH酸度計(jì)(瑞士梅特勒托 利多公司），等。
[0032] 1.2藥品與試劑
[0033] PUE(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，含量>95%，批號(hào)20110722) ;PUE對(duì)照品（中國(guó) 食品藥品檢定研究院，含量>99%，批號(hào)110752-200912); 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、 N，N，N-3-甲基-十六烷基溴化銨(CTAB)、正硅酸四乙酯(TEOS)(美國(guó)Sigma-Aldricl^g); DMEM培養(yǎng)基(含有4.5g · L-1葡萄糖、3.7g · L-1碳酸氫鈉、10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、 1%谷氨酰胺、IOOu · mL-1青霉素和IOOu · mL-1鏈霉素）、0.25%胰蛋白酶加 EDTA(美國(guó)Gibco 公司）；甲醇(美國(guó)霍尼韋爾公司）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
[0034] 1.3實(shí)驗(yàn)細(xì)胞
[0035] Caco-2細(xì)胞系(浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，源于上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞研 究所)。
[0036] 2 方法
[0037] 2 .IMSN的制備
[0038] 依據(jù)StobeHiw制備CMSN:1.0g CTAB溶解于480mL超純水中，加入3.5mL 2M NaOH 溶液，80°C恒溫?cái)嚢?h，然后快速加入3mL TEOS，30min后緩慢恒速滴入2mL APTES(3-氨丙 基三乙氧基硅烷；（3_aminopropyl)triethoxysilane)，控制5min滴畢，恒溫繼續(xù)反應(yīng)2h，反 應(yīng)結(jié)束后靜置熟化24h，經(jīng)0.45μπι濾膜抽濾或15000rpm離心25min得到的白色滑膩固體。將 得到的白色固體分散于200mL酸性乙醇溶液（乙醇:濃鹽酸=9:1，v/v)中80 °C回流4h，離心 再分散，經(jīng)過6次反復(fù)操作去除模板劑CTAB，最后一次離心后真空干燥，得到白色粉末CMSN。 不加入APTES，同法制備MSN。采用TEM和SEM分別對(duì)MSN、CMSN進(jìn)行觀察，粒徑儀測(cè)定粒徑及 Zeta電位，F(xiàn)TIR表征CMSN上修飾的氨基。
[0039] 2.2CMSN-PUE 的制備
[0040] 采用飽和溶液吸附法制備CMSN-PUE:稱取IOOmg CMSN(記為Waq)分散到HJE飽和乙 醇溶液20mL中，常溫25°C避光攪拌，每隔30min短時(shí)超聲3min，攪拌2h使CMSN充分吸附PUE飽 和乙醇溶液，然后15000r · HiirT1離心30min，將離心得到的白色固體35°C減壓干燥后稱重 (記為Wai )，然后重復(fù)分散、吸附、離心、干燥、稱重，每重復(fù)一次的稱重分別記為Wa2、Was、 Wa4……。同樣，稱取IOOmg CMSN分散到乙醇溶液20mL中，除了不加入PUE外，其他同法操作， 每次稱重分別記為WB1、W B2、WB3、WB4……，按照相同的方法制備對(duì)照組MSN-PUE。
[0041] 載藥量i( % ) = CffAl-WBl)/WAl X 100%i = l、2、3、4……
[0042] 2.3CMSN-PUE體外釋藥考察
[0043] 分別稱取PUE、MSN-PUE、CMSN-PUE適量（折合PUE量 I Omg)分散于 I OmL 的 PBS (pH7 · 4) 緩沖液，倒入透析袋(MWC0 = 3500)后，用透析夾密封置于體積為1000 mL的釋放介質(zhì)I3BS中， 恒溫水浴振蕩（37°C、50rpm)，平行操作 3 份。分別于15、30、45、6〇11^11、2、4、6、8、12、24、4811取 ImL透析介質(zhì)，并補(bǔ)充相應(yīng)的PBS。取出的透析介質(zhì)用0.45μπι微孔濾膜過濾，續(xù)濾液經(jīng)HPLC測(cè) 定PUE濃度，計(jì)算累計(jì)釋藥百分率(Q)。
[0044] 2.4HPLC 色譜條件
[0045]色譜柱:依利特Hypersil BDS &8柱(250\4.6!11111，5以111);流動(dòng)相：甲醇:0.1%檸檬 酸(5:75);檢測(cè)波長(zhǎng):250nm;柱溫:30 °C ;流速:1.0 mL · min-1;進(jìn)樣量:20yL。配制不同梯度的 PUE標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積（A)為縱坐標(biāo)，濃度（C)為橫坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，PUE在0.2~ 56mg · I/1范圍內(nèi)濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程:A=101.63C+43.160，r = 0.9996(n = 6)?？疾炱涓咧械?種濃度溶液的日內(nèi)精密度RSD小于2%，日間精密度RSD小于 3%〇
[0046] 2.5CMSN