小分子抑制劑mln4924在制備抑制博來霉素誘導的肺纖維化的藥物中的應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種NEDD8活化酶的小分子抑制劑MLN4924 在制備抑制博來霉素誘導的肺纖維化的藥物中的應用、以及MLN4924在制備抑制炎癥反應 中NF- κ B和MPK信號通路激活的藥物中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺纖維化是一種嚴重危害人類健康的疾病，通常是由于嚴重的外部創(chuàng)傷，感染，自 發(fā)免疫反應，藥物不良副反應等因素，引起肺的永久性損傷，導致肺泡外基質(zhì)反復破壞，過 度修復重建并沉積，最終導致正常肺組織結(jié)構(gòu)改變、功能喪失。肺纖維化是一種以肺部永久 性損傷為特征的、伴隨著高死亡率的嚴重疾病，目前仍缺少有效的治療方法。肺纖維化發(fā)病 過程是一個復雜的病理過程，每個過程有多種細胞及細胞因子參與其中，目前其發(fā)病機理 尚未完全闡釋清楚，并且缺乏有效的治療藥物。
[0003] 以往人們對于肺纖維化治療和發(fā)病機制研究大多主要集中于纖維化形成過程中 起主要作用的成肌纖維細胞的增殖，凋亡和活化等方面，近年來大量的臨床與實驗研究證 實在肺纖維化的形成過程中支氣管肺泡灌洗液（BALF)中的炎癥細胞、細胞因子、蛋白和酶 異常增多，它們與肺組織細胞之間的相互作用在肺纖維化形成過程中具有重要作用，提示 我們抑制早期炎癥反應可能也是預防纖維化形成的一種有效手段。
[0004] MLN4924是最近報道的一種選擇性NEDD8活化酶（NAE)的小分子抑制劑，它是 AMP類似物，主要通過與形成NAE-MLN4924復合物抑制NAE活性，從而抑制了部分依賴于 Cullin-Ring E31igase (CRL)酶的蛋白質(zhì)泛素化降解途徑，由此導致了此類蛋白質(zhì)的積聚， CRL的底物蛋白包括DNA復制剪切蛋白CDT1，0RC1，細胞周期抑制因子如p21，p27, Weel。 此前，關(guān)于MLN4924的研究報道多集中于其通過阻滯癌細胞周期或者引起細胞凋亡而發(fā)揮 其抗腫瘤特性，而關(guān)于其在炎癥反應中的作用知之甚少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明首次提出了小分子化合物MLN4924即NEDD8活化酶的小分子抑制劑 MLN4924在有效抑制博來霉素誘導的肺纖維化中的應用。本發(fā)明為肺纖維化的治療提供了 一條新的途徑和選擇。
[0006] 本發(fā)明提出了小分子抑制劑MLN4924在制備抑制博來霉素（Bleomycin)誘導的肺 纖維化的藥物中的應用。
[0007] MLN4924,其結(jié)構(gòu)式如下所示，分子式為C21H25N5O 4S,分子量為443. 52,是 NEDD8活化酶（NAE)的小分子抑制劑，主要通過與NAE形成NAE-MLN4924復合物抑 制NAE活性，抑制了部分依賴于Cul I in-Ring E31 igase (CRL)介導的一類蛋白質(zhì)的泛 素化降解。MLN4924已被發(fā)現(xiàn)可作為一種潛在的新型抗癌藥物（Teresa A. Soucy, et al. Nature. 2009(458):732-736)。
[0008]
[0009] 本發(fā)明中，所述博來霉素誘導的肺纖維化包括博來霉素誘導的肺纖維化病變及肺 纖維化早期急性肺損傷，具體包括但不限于因肺間質(zhì)組織（如膠原蛋白等）過量積累而導 致的肺組織纖維樣病變、肺泡上皮細胞受損、羥脯氨酸含量升高、肺部炎癥細胞浸潤增多、 肺部細胞因子和趨化因子過度表達等，從而導致肺部漸漸失去正常生理功能。目前研究人 員已建立多種動物模型模擬肺纖維化的過程，包括藥物誘導（如博來霉素）、顆粒物誘導 (如石棉）、輻射誘導等。本發(fā)明中所用的博來霉素誘導肺纖維化的方法是一種可以有效模 擬該疾病的方法。在具體實施方案中，在用博來霉素誘導肺纖維化的小鼠體內(nèi)注射MLN4924 后，小鼠肺纖維化的病理組織學評分、組織學病變、羥脯氨酸含量和膠原蛋白含量等都有明 顯減少或減輕。
[0010] 本發(fā)明中，所述博來霉素誘導的肺纖維化包括小鼠或人或其他哺乳動物的博來霉 素誘導的肺纖維化。
[0011] 本發(fā)明中，所述藥物可以通過抑制早期炎癥過程來抑制博來霉素誘導的肺纖維 化。所述"早期炎癥過程"是包括肺泡上皮細胞受損、肺泡結(jié)構(gòu)和功能異常、細胞因子及趨 化因子的過度表達、炎癥細胞向肺部的過度浸潤等。在具體實施方案中，在以LPS誘導急性 肺損傷的小鼠體內(nèi)注射MLN4924后，小鼠的肺損傷指標，如肺的濕干比、組織學病變、肺部 細胞因子的表達量及炎性細胞（如中性粒細胞、巨噬細胞）向肺部的迀移數(shù)量等都有明顯 減少或減輕。
[0012] 本發(fā)明還公開了小分子抑制劑MLN4924在制備抑制博來霉素誘導的肺纖維化早 期炎癥過程的藥物中的應用。
[0013] 本發(fā)明還提出了一種新的小分子抑制劑MLN4924在制備抑制炎癥反應中NF- κ B 和MPK信號通路的激活的藥物中的應用。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)CRL的底物包括NF- κ B抑制因 子I κ B- α，實驗結(jié)果表明MLN4924可有效抑制炎癥反應。小分子抑制劑MLN4924可抑制 NF- κ B負調(diào)控因子I κ B- α的降解從而阻斷NF- κ B信號通路的激活；另一方面，小分子抑 制劑MLN4924還可抑制Ρ38、Erk、Jnk的磷酸化，從而抑制MAPK信號通路的激活。
[0014] 本發(fā)明中，所述"炎癥反應"是包括炎癥細胞大量浸潤受損肺組織、細胞因子和趨 化因子在受損肺組織細胞和浸潤的炎癥細胞中大量表達、肺泡灌洗液中總蛋白量顯著上 升、肺組織濕干比上升等。
[0015] 本發(fā)明中，在所述炎癥反應中，小分子抑制劑MLN4924可抑制上皮細胞中IL-8、 CXCL5、KC等趨化因子的表達。
[0016] 在一個具體實施方案中，本發(fā)明研究表明MLN4924可有效抑制博來霉素誘導的小 鼠肺纖維化病變，明顯改善博來霉素引起的小鼠肺泡炎及肺纖維化癥狀。在一個具體實施 方案中，本發(fā)明研究表明MLN4924可有效抑制博來霉素誘導的小鼠肺纖維化早期急性肺 損傷，有效減輕LPS(脂多糖）誘導的小鼠急性肺損傷。在一個具體實施方案中，本發(fā)明 研究表明MLN4924有效抑制小鼠急性肺損傷的分子機制，MLN4924可以顯著抑制炎癥反應 中NF- κ B和MAPK信號通路的激活，抑制炎癥的發(fā)生，MLN4924可通過抑制早期炎癥過程 來抑制博來霉素誘導的肺纖維化的分子機制。本發(fā)明研究表明，小分子抑制劑MLN4924對 EMT (上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化）過程沒有明顯的影響。小分子抑制劑MLN4924在其可發(fā)揮抑制炎癥的 濃度（0.5 μM)時，對中性粒細胞的凋亡沒有明顯的影響。
【附圖說明】
[0017] 圖1表示MLN4924顯著抑制博來霉素誘導的肺纖維化
[0018] 圖I(A)表示，用博來霉素和MLN4924共同處理小鼠，只用博來霉素處理小鼠或不 做任何處理后，對小鼠肺組織切片進行HE (蘇木精-伊紅）染色和MASSON染色的結(jié)果。
[0019] 圖I(B)表示，用圖UA)所述方法處理小鼠后，對小鼠肺纖維化程度的組織學評 分。
[0020] 圖I(C)表示，用圖UA)所述方法處理小鼠后，小鼠肺泡灌洗液中羥脯氨酸的含 量。
[0021] 圖I(D)表示，用圖1⑷所述方法處理小鼠后，小鼠肺組織中Collagenl和 Collagen3的表達量。
[0022] 圖2表示MLN4924對EMT過程沒有顯著影響。
[0023] 圖3表示MLN4924可以顯著抑制LPS (脂多糖）誘導的急性肺損傷。
[0024] 圖3(A)表示，用LPS和MLN4924共同處理小鼠，只用博來霉素處理小鼠或不做任 何處理后，對小鼠肺組織切片進行HE和MASSON染色的結(jié)果。
[0025] 圖3(B)表示，用圖3㈧所述方法處理小鼠后，小鼠肺組織濕干比的變化。
[0026] 圖3(C)表示，用圖3㈧所述方法處理小鼠后，小鼠肺泡灌洗液中的總蛋白量的變 化。
[0027] 圖3(D，E，F(xiàn))分別表示，用圖3㈧所述方法處理小鼠后，小鼠肺組織中細胞因子 IL-I β (白介素-1 β )