一種非小細(xì)胞肺癌放療相關(guān)的HIF-1α的抑制劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)藥物領(lǐng)域，具體涉及一種miRNA-21抑制劑在制備用于降低非小細(xì) 胞肺癌中HIF-la水平的藥物的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] miRNAs是功能性非編碼RNAs，20-24個(gè)核苷酸，在控制目的miRNAs的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄 效率中起重要作用。成熟的miRNA通過(guò)對(duì)包括目的基因互補(bǔ)序列及包括3'端非轉(zhuǎn)錄區(qū)域在 內(nèi)誘導(dǎo)已轉(zhuǎn)錄的基因不表達(dá)。因此，miRNA異常表達(dá)可能影響目的基因的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)進(jìn)一步 影響與癌癥相關(guān)的信號(hào)通路，涉及到細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡、變異、迀移和新陳代謝。腫瘤 組織通常表現(xiàn)出功能性miRNA量減少;然而，已有文獻(xiàn)顯示miRNA-21在癌癥發(fā)生中發(fā)揮作用 (oncomiR)，其高度表達(dá)與多種癌癥相關(guān)，包括胰腺癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、肝癌、胃癌、 卵巢癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、顱腦腫瘤、食管癌和前列腺癌。此外，一項(xiàng)早期研究顯示:miRNA-21 在卵巢癌細(xì)胞中可以調(diào)節(jié)紫杉醇的敏感性，表明miRNA-21在藥物耐受性中起著重要作用。
[0003] 放射治療廣泛用于各種癌癥的治療。盡管放射治療廣泛應(yīng)用，使許多腫瘤得以緩 解，但放射治療失敗的突出表現(xiàn)是腫瘤復(fù)發(fā)，腫瘤復(fù)發(fā)大多與腫瘤細(xì)胞獲得了輻射耐受有 關(guān)。目前，人類癌細(xì)胞放療抵抗性的詳細(xì)機(jī)制仍不清楚。有報(bào)道說(shuō)磷脂酰肌醇3-激酶/AKT升 高可能代表人類肝癌和宮頸癌出現(xiàn)放療抵抗的發(fā)生。此外，一個(gè)早期報(bào)道顯示miRNA-21高 表達(dá)可能導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞放療抵抗性，因此建議目標(biāo)基因miRNA-21可以作為攻克放療抵抗 的一種治療策略。
[0004]大多數(shù)癌細(xì)胞通過(guò)無(wú)氧糖酵解進(jìn)行能量供應(yīng)，這被稱為"瓦博格效應(yīng)"，然而，與線 粒體呼吸相比無(wú)氧糖酵解產(chǎn)生ATP是低效率的。結(jié)果，癌細(xì)胞吸收過(guò)量的葡萄糖并形成大量 的乳酸，這是一個(gè)公認(rèn)的糖降解異常的表現(xiàn)。早期的研究已經(jīng)表明代謝途徑與藥物耐藥相 關(guān)，顯示癌細(xì)胞的代謝失衡可能是開發(fā)一種腫瘤治療的新途徑。
[0005] 缺氧誘導(dǎo)因子-l(HIF-l)是廣泛存在于哺乳動(dòng)物及人體內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子，由a和 β兩個(gè)亞基構(gòu)成的異二聚體蛋白聚合物，通常情況下，HIF-Ιβ為結(jié)構(gòu)性表達(dá)，其水平基本穩(wěn) 定，而HIF-la受氧濃度的調(diào)節(jié)并在整個(gè)轉(zhuǎn)錄過(guò)程中起關(guān)鍵作用。缺氧是實(shí)體腫瘤微環(huán)境特 征之一，當(dāng)氧濃度過(guò)低時(shí)，HIF-la表達(dá)增加，并通過(guò)調(diào)控多種靶基因的表達(dá)，以適應(yīng)低氧環(huán) 境，在腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中具有重要作用。研究表明HIF-la的表達(dá)水平升高可導(dǎo)致 放療療效降低，然而也有部分文獻(xiàn)認(rèn)為HIF-la并不影響腫瘤細(xì)胞的放射敏感性。
[0006] 目前雖然關(guān)于肺癌細(xì)胞放射增敏性的報(bào)道較多，但是在放療抵抗的非小細(xì)胞肺癌 細(xì)胞中miRNA-21是如何控制的尚不清楚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，研究驗(yàn)證了 miRNA-21在放療抵抗中起到的作用并發(fā) 現(xiàn)糖酵解和放療抵抗的相關(guān)性，提供了相應(yīng)證據(jù)表明非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中miRNA-21調(diào)節(jié)放 療抵抗的機(jī)制。
[0008] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0009] 本發(fā)明的第一個(gè)方面，miRNA-21抑制劑在制備用于降低非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中HIF-1α水平的藥物中的應(yīng)用，其中miRNA-21的核苷酸序列為
[0010] 5 ' -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3 '，如SEQ ID N0 · 1所示。
[0011] 本發(fā)明的另一個(gè)方面，一種包含miRNA-21抑制劑的組合物在制備用于降低非小細(xì) 胞肺癌細(xì)胞中HIF-la水平的藥物中的應(yīng)用。
[0012] 優(yōu)選的，所述非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞具有高HIF-la水平。
[0013] 優(yōu)選的，所述非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞具有輻射耐受性/放療抵抗性或者所述非小細(xì)胞 肺癌細(xì)胞放射敏感性低。
[0014]優(yōu)選的，所述藥物進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體。
[0015] miRNA-21抑制劑是指降低miRNA-21的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)或活性的藥物。也就是，藥物直 接作用于mi RNA-21或間接作用于mi RNA-21的上調(diào)物，以在轉(zhuǎn)錄水平降低mi RNA-21的表達(dá)、 促進(jìn)表達(dá)的miRNA-21的降解或破壞miRNA-21的活性，從而減少miRNA-21的表達(dá)水平或活 性。
[0016] miRNA-21抑制劑通常為生物分子、化合物或植物、動(dòng)物中的提取物，它們可以使用 本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)應(yīng)用于細(xì)胞，比如核酸或者多肽。用于本發(fā)明的miRNA-21抑制劑的實(shí)例 包括與m i R N A - 2 1堿基序列互補(bǔ)的反義核酸分子，其核苷酸序列為：5 ' -TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3'，如SEQIDN0.2所示。與miRNA-21堿基序列互補(bǔ)的反義核酸 分子互補(bǔ)地結(jié)合于細(xì)胞中miRNA-21的單鏈片段，以降低miRNA-21的加工效率，從而抑制 miRNA-21的表達(dá)以及抑制miRNA-21的活性。本發(fā)明的miRNA-21的堿基序列互補(bǔ)的反義核酸 分子可以使用例如化學(xué)合成物或重組的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)分離或制備物，或者通過(guò)商業(yè) 獲得。
[0017] 本發(fā)明的反義核酸分子導(dǎo)入細(xì)胞引起具有放療抵抗的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中HIF-1 a含量降低。"導(dǎo)入"的含義是將外源DNA或RNA通過(guò)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)輸送進(jìn)入非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞。
[0018] 優(yōu)選的，所述藥物可以進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體(vehicle)和用藥學(xué)上可 接受的載體進(jìn)行配制。只要其確保使本發(fā)明的組合物或者miRNA-21抑制劑到達(dá)特定的組 織，可以采用任意途徑給藥。例如，本發(fā)明的miRNA-21抑制劑可以口服、直腸、局部及外用、 靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、透皮、鼻內(nèi)、胸內(nèi)、眼內(nèi)或皮內(nèi)給藥。
[0019] 本發(fā)明的有益效果是：
[0020] 由于腫瘤的異質(zhì)性，并且不同腫瘤處在不同的生存環(huán)境，同一腫瘤細(xì)胞中分泌的 各種蛋白的調(diào)控機(jī)理完全不同，多種腫瘤細(xì)胞分泌的一種蛋白的調(diào)控機(jī)理也不完全相同。
[0021] 本發(fā)明經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌中的miR-21的過(guò)度表達(dá)激活HIF-la，從而刺 激糖酵解酶的表達(dá)。當(dāng)使用本發(fā)明所述的miRNA抑制劑，可以降低具有放療抵抗的非小細(xì)胞 肺癌細(xì)胞中HIF-la的含量，從而使得非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的放射增敏性增高，提高非小細(xì)胞 肺癌的放射治療的療效。
[0022] miR-21抑制劑使具有放療抵抗的癌細(xì)胞恢復(fù)放療敏感性，可通過(guò)抑制糖酵解介導(dǎo) HIF-la，根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用，為探討miR-21調(diào)節(jié)HIF-la詳細(xì)機(jī)制奠定了良好的基礎(chǔ)，更有利 于提尚肺癌的療效。
【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1A~圖lC:miR-21在輻射耐受癌細(xì)胞中上調(diào)，并且與放療抵抗性呈正相關(guān)。圖 1A:來(lái)源于A549肺癌細(xì)胞中的輻射耐受細(xì)胞的產(chǎn)生，為了產(chǎn)生放療抵抗癌細(xì)胞，在常規(guī)細(xì)胞 培養(yǎng)條件下，對(duì)親代細(xì)胞逐漸增加放射劑量，劑量條件:輻射劑量為〇，2，4，6，8和10Gy，劑量 速率為2Gy/min，檢測(cè)每個(gè)劑量下放療抵抗克隆情況，放療抵抗性*P<0.05和*P<0.01。圖 IB: A549親代細(xì)胞和放療抵抗細(xì)胞中的miR-21表達(dá)水平，輻射敏感性*#P<0.001。圖1C:轉(zhuǎn) 染miR-21前體的A549親代細(xì)胞經(jīng)過(guò)48h，隨后在0、1、5和10Gy作輻射處理，劑量速率為2Gy/ min，然后做細(xì)胞生存分析，對(duì)照組*P〈0.05和**P〈0.01。計(jì)算數(shù)據(jù)為平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差。 [0024]圖2A~圖2C:輻射耐受細(xì)胞具有上調(diào)糖酵解的作用。圖2A:檢測(cè)A549親代細(xì)胞和輻 射耐受細(xì)胞中的葡萄糖消耗量和乳糖生成量；圖2B:放療抵抗性細(xì)胞和親代細(xì)胞采用免疫 印跡檢測(cè)己糖激酶(HK)II、丙酮酸激酶(PK)M2和乳酸脫氫酶(LDH)A的上調(diào)蛋白質(zhì)的表達(dá)， β-肌動(dòng)蛋白作為對(duì)照組。圖2C:在A549親代細(xì)胞和放療抵抗性細(xì)胞中，采用定量逆轉(zhuǎn)錄-聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)HKII、PDK1和LDHA的mRNA表達(dá)水平。數(shù)據(jù)作為三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值土 標(biāo)準(zhǔn)誤差。放射敏感性***P<〇 · 001。
[0025] 圖3A~圖3D:miR-21通過(guò)調(diào)控HIF-la來(lái)上調(diào)糖酵解過(guò)程。圖3A:A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR- 21，48h，收集細(xì)胞然后采用免疫印跡分析。β-肌動(dòng)蛋白作為對(duì)照組。圖3B:轉(zhuǎn)染miR-21后，檢 測(cè)A549細(xì)胞和對(duì)照組的細(xì)胞中的葡萄糖的消耗量和乳酸產(chǎn)生量，對(duì)照組***P<0.001。圖 3C:采用免疫印跡檢測(cè)，隨著小干擾RNA對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的HIF-la的干擾，HIF-la在轉(zhuǎn)染miR-21 的細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞的表達(dá)水平下調(diào)， β_ 肌動(dòng)蛋白作為對(duì)照組。圖 3D: 葡萄糖的消耗量和乳 酸的生成量的檢測(cè)，對(duì)照組miR、前體miR-21或者是前體miR-21加siHIF-la，計(jì)算數(shù)據(jù)為平 均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差，***P<0.001，ΗΚ Π :己糖激酶2、PKM2、丙酮酸激酶M2，LDHA:乳糖酸脫氫 酶。
[0026]圖4A~圖4D: miR-21的抑制劑抑制糖酵解和增強(qiáng)A549細(xì)胞的放射敏感性。圖4A:轉(zhuǎn) 染對(duì)照組miRNA或反義的miR-21，測(cè)其在A549細(xì)胞的表達(dá)水平；圖4B:葡萄糖消耗量和圖4C: 乳酸生成量，在轉(zhuǎn)染對(duì)照組miRNA或反義的miR-21的細(xì)胞中，對(duì)照組*P〈0.05，**P〈0.01 和*#P〈0.001;圖4D:轉(zhuǎn)染對(duì)照組miRNA或反義的miR-21的A549親代細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)間48h，然 后進(jìn)行照射處理，劑量:0，0.5，1，2，4 and 6Gy，劑量速率2Gy/min，然后顯示細(xì)胞生存分析。 反義miR-21*P〈0.05，計(jì)算數(shù)據(jù)為平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0027] 圖5A~圖5D:復(fù)敏的放療抵抗性細(xì)胞通過(guò)抑制miR-21來(lái)調(diào)控HIF-la。圖5A:miR-21 在轉(zhuǎn)染了對(duì)照miRNA或