用于緊密連接屏障調(diào)節(jié)的設(shè)計(jì)肽的制作方法
【專利說(shuō)明】
[00011本申請(qǐng)要求2013年8月16日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列第61/866,818號(hào)的權(quán) 益，該申請(qǐng)據(jù)此以引用的方式整體并入。
[0002] 本發(fā)明是在授權(quán)號(hào)5 T32 AR007472-25下借助美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院的支持進(jìn)行 的。美國(guó)政府對(duì)本發(fā)明具有一定權(quán)利。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本文公開(kāi)了適用于破壞上皮屏障的分離肽，經(jīng)上皮藥物或疫苗制劑，用于遞送這 些制劑的藥物遞送媒介物，以及使用這些制劑來(lái)破壞上皮屏障的方法。
[0004] 背景
[0005] 完整得上皮屏障（例如皮膚)對(duì)于健康至關(guān)重要，用于從身體排除外源化學(xué)物、抗 原以及病原體（De Benedetto等人，"Skin Barrier Disruption:A Requirement for A1 lergen Sensitization?，'，J · Invest ·Dermatol · 132 :949-963(2012);0'Neil 1等人， "Tight Junction Proteins and the EpidermisExp.Dermatol.20:88-91(2011)；Kubo 等人，"Epidermal Barrier Dysfunction and Cutaneous Sensitization in Atopic Diseases，"J.Clin. Invest. 122:440-447(2012))。同樣地，其妨礙治療劑和疫苗的經(jīng)皮遞 送。為了解決這個(gè)問(wèn)題，已經(jīng)進(jìn)行了持續(xù)且大量的努力來(lái)開(kāi)發(fā)細(xì)胞穿透肽以促進(jìn)經(jīng)皮遞送 (Milletti，"Cell-Penetrating Peptides:Classes ,Origin,and Current Landscape，'， Drug Discov.Todayl7:850_860(2012);Stanzl等人，"Fifteen Years of Cell-Penetrating,Guanidinium-Rich Molecular Transporters : Basic Science ,Research Tools，and Clinical Applications，"Acc.Chem.Res .46( 12) :2944-54(2013))。雖然這種 努力已經(jīng)產(chǎn)生了許多顯著成就，但一種替代策略是可逆地弱化細(xì)胞之間的相互作用，由此 使得能夠進(jìn)行細(xì)胞旁路遞送而不使用細(xì)胞穿透肽。
[0006] 上皮細(xì)胞層中的細(xì)胞旁路屏障經(jīng)由緊密連接（"TJ"）密封。在皮膚中，TJ形成于顆 粒層（"SG"）中（Yoshida等人，"Functional Tight Junction Barrier Localizes in the Second Layer of the Stratum Granulosum of Human Epidermis .Dermatol. Sci . 71 (2): 89-99(2013))且甚至可存留于角質(zhì)層（"SC"）中（Haftek等人，"Compartmentalization of the Human Stratum Corneum by Persistent Tight Junction-Like Structures，'， Exp.Dermatol .20:617-621(2011) ;Sugawara等人，"Tight Junction Dysfunction in the Stratum Granulosum Leads to Aberrant Stratum Corneum Barrier Function in Claudin-1-Deficient Mice，" J.Dermatol .Sci.70(1) :12-18(2013))JJ和SC-致用于形 成表皮屏障。
[0007] TJ在上皮細(xì)胞周?chē)某嗟缼е行纬傻鞍捉M裝鏈。Claudin橋接胞質(zhì)面上的肌動(dòng)蛋 白細(xì)胞骨架(經(jīng)由TJ斑中的閉鎖小帶蛋白），跨越質(zhì)膜，且與鄰近細(xì)胞上的claudin相互作 用。迄今已經(jīng)鑒定了至少23種哺乳動(dòng)物claudin(Van Itallie等人，"Claudin Interactions In and Out of the Tight Junction/tissue Barriers 1(3):e25247 (2013))。(：1311(1；[11為四跨膜蛋白(^6奸38口31111；[11)，具有兩個(gè)細(xì)胞外環(huán)和一個(gè)長(zhǎng)的細(xì)胞質(zhì)(：端 結(jié)構(gòu)域。在細(xì)胞表面處，claudin經(jīng)由其細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域形成二聚體，所述細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與對(duì) 面細(xì)胞膜上的那些組裝，從而形成包埋于兩個(gè)細(xì)胞膜中的鏈（Kaufmann等人， "Visualization and Quantitative Analysis of Reconstituted Tight Junctions Using Localization Microscopy，"PLoS ONE 7:631128(2012))。這些鏈的數(shù)目和特征決 定了細(xì)胞旁路屏障的強(qiáng)度。Claudin家族成員的差異表達(dá)為各組織屏障(腸對(duì)皮膚對(duì)血腦屏 障）制定滲透性特征（Anderson 等人，"Physiology and Function of the Tight Junction，"Cold Spring Harb Perspect Biol .1(2) :&002584_&002584(2009))。包括封閉 蛋白（"Ocln"）、t ricellulin以及JAM-A的其它幾種膜蛋白也參與TJ復(fù)合物且有助于屏障功 能和調(diào)控(Kirschner等人，"Contribution of Tight Junction Proteins to Ion, Macromolecule ,and Water Barrier in Keratinocytes ,，：，J. Invest .Dermatol. 133:1161-1169(2013) ;Cording等人，"In Tight Junctions，Claudins Regulate the Interactions Between Occludin,Tricellulin and Marveld3,Which, Inversely,Modulate Claudin 01igomerization，"J.Cell Sci.126:554-564(2013))0
[0008] ClaudinirCldnl"）在肺上皮、表皮角化細(xì)胞和填充表皮的樹(shù)突細(xì)胞中高度表達(dá) (Kast等人，"The Broad Spectrum of Interepithelial Junctions in Skin and Lung，" J.Allergy Clin. Immunol · 130:544-546(2012) ;Kubo等人，"External Antigen Uptake by Langerhans Cells With Reorganization of Epidermal Tight Junction Barriers，'， J.Exper.Med. 206:2937-2946(2009))。增加的Cldnl體外表達(dá)會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞旁路滲透性屏障 (Pfeiffer等人，"Claudin-1 Induced Sealing of Blood-Brain Barrier Tight Junctions Ameliorates Chronic Experimental Autoimmune Encephalomyelitis，'，Acta Neuropat ho 1.122:601_614(2011);Inai 等人，"Cl audin-1 Contributes to the Epithelial Barrier Function in MDCK Cells/'European J. Cel1 Biol.78:1-7 (1999))。在人類(lèi)中，遺傳性Cldnl缺乏在新生兒魚(yú)鱗病-少毛癥-硬化性膽管炎綜合征中已 有報(bào)道，其導(dǎo)致嚴(yán)重的魚(yú)鱗病和新生兒膽汁齡積（Had j-Rabia等人，"Claudin-lGene Mutations in Neonatal Sclerosing Cholangitis Associated With Ichthyosis: A Tight Junction Disease/'Gastroenterology 127:1386-1390(2004))。缺乏Cldnl的小鼠 在出生一日內(nèi)由于脫水而死，表明該蛋白為皮膚屏障所必需的(Yoshida等人，"Functional Tight Junction Barrier Localizes in the Second Layer of the Stratum Granulosum of Human Epidermis，"J .Dermatol · Sci. 71 (2): 89-99(2013) ;Furuse 等人， "Claudin-Based Tight Junctions are Crucial for the Mammalian Epidermal Barrier:A Lesson From Claudin-1-Deficient MiceJ.Cell Biol.156:1099-1111 (2002))。類(lèi)似地，患有異位性皮炎（"AD"）的患者在其非病灶性皮膚中具有較大的經(jīng)表皮水 分損失和細(xì)胞旁路滲透性，并且還具有顯著降低的Cldnl表達(dá)（De Benedetto，"Tight Junction Defects in Patients With Atopic Dermatitis J.Allergy Clin.Immunol.127:773-786.e7(2010))〇
[0009] 幾個(gè)研究組已經(jīng)顯示源于TJ蛋白（claudin和Ocln)的細(xì)胞外環(huán)的序列的合成肽在 高濃度下破壞屏障功能（Wong等人，"A Synthetic Peptide Corresponding to the Extracellular Domain of Occludin Perturbs the Tight Junction Permeability Barrier，"J.Cell Biol. 136:399-409(1997) ;Mrsny等人，"A Key Claudin Extracellular Loop Domain Is Critical for Epithelial Barrier Integrity/'Am.J.Path.172:905-915(2008) ;Baumgartner等人，"A d-Peptide Analog of the Second Extracellular Loop of Claudin-3and_4Leads to Mislocalized Claudin and Cellular Apoptosis in Mammary Epithelial Cells，"Chem.Biol .&Drug Des.77:124-136(2011) ;Zwanziger等人， "A Peptidomimetic Tight Junction Modulator to Improve Regional Analgesia," Mol .Pharm.9:1785-1794(2012))。來(lái)自claudin 3和4的第二細(xì)胞外環(huán)的肽誘導(dǎo)封閉蛋白的 錯(cuò)誤定位和細(xì)胞凋亡（Baumgartner等人，"A d-Peptide Analog of the Second Extracellular Loop of Claudin-3and_4Leads to Mislocalized Claudin and Cellular Apoptosis in Mammary Epithelial Cells Chem.Biol.&Drug Des.77:124-136(2011) ;Beeman等人，"Occludin Is Required for Apoptosis When Claudin-Claudin Interactions are Disrupted，"Cell Death Dis.3:e273(2012))。在T84(可移植人類(lèi)腫 瘤)細(xì)胞中，顯示25μΜ大鼠 Cldnl(53-80)肽的應(yīng)用抑制鈣誘導(dǎo)TJ形成，并且200μΜ能夠破壞 完整TJ(Mrsny等人，"A Key Claudin Extracellular Loop Domain Is Critical for Epithelial Barrier Integrity，"Am. J.Path · 172:905-915(2008)) 破壞不需要半脫氨 酸。大鼠<：1(1111(53-81，054,645)肽在體內(nèi)200-30(^]?下破壞03(3〇-2、冊(cè)1(-293以及大鼠神經(jīng) 周TJ屏障（Zwanziger等人，"A Peptidomimetic Tight Junction Modulator to Improve Regional Analgesia,"Mol .Pharm.9:1785-1794(2012)) aZwanziger等人指出，這種肽當(dāng)用 SDS溶解時(shí)具有β折疊結(jié)構(gòu)，如圓二色性所證明。大鼠(：1(1111(53-81，054,643)肽與(：1(1111共定 位并且由近匯合ΗΕΚ-293細(xì)胞內(nèi)化（Zwanziger等人，"Claudin-Derived Peptides are Internalized Via Specific Endocytosis Pathways，"Ann·NY Acad·Sci·1257:29-37 (2012))。
[0010] 在這些先前研究中需要相對(duì)高濃度的測(cè)試肽來(lái)誘導(dǎo)TJ外觀的改變并且增加細(xì)胞 旁路滲透性。先前尚未鑒定出能夠在低或亞微摩爾濃度下破壞TJ的claudin衍生肽。除了對(duì) claudin-Ι第二環(huán)結(jié)構(gòu)域和其氨基酸序列的認(rèn)識(shí)，迄今尚未鑒定出負(fù)責(zé)破壞的結(jié)構(gòu)特征。
[0011] 此外，大和/或親水性治療劑或抗原的經(jīng)上皮(包括經(jīng)皮)遞送由于例如皮膚和粘 膜的雙重屏障功能而不簡(jiǎn)便。小分子藥物的小子集由于其小尺寸和疏水性可經(jīng)由跨細(xì)胞轉(zhuǎn) 運(yùn)容易地橫經(jīng)上皮細(xì)胞屏障。較大或較多親水性分子不會(huì)自發(fā)地橫跨細(xì)胞膜并且會(huì)被細(xì)胞 旁路緊密連接屏障排除在外。將使藥物和無(wú)針疫苗的非侵入性遞送成為可能的可逆、受控 屏障破壞對(duì)于不會(huì)容易地橫跨細(xì)胞膜的基于肽/蛋白的治療劑或抗原是特別合乎需要的。 [0012 ]本文公開(kāi)針對(duì)克服本領(lǐng)域中的這些和其它限制的肽和制劑。
[0013] 概述
[0014]根據(jù)本文例示的方面，提供一種短暫地破壞緊密連接內(nèi)的claudin-Ι的試劑。所述 試劑包括含有至少40%的極性、不帶電氨基酸殘基和自組裝β折疊二級(jí)結(jié)構(gòu)的肽。
[0015] 根據(jù)本文例示的其它方面，提供一種短暫地破壞緊密連接中的Claudin-l的試劑。 所述試劑包括含有至少40%的極性、不帶電氨基酸殘基和自組裝β折疊二級(jí)結(jié)構(gòu)的肽。所述 肽不由氨基酸序列 SSVSQSTGQIQSKVFDSLLNLNSTLQATR( SEQ ID N0:1)、 SCVSQSTGQIQCKVFDSLLNLNSTLQAT(SEQ ID N0:2)、SSVSQSTGQIQSKVFDSLLNLSSTLQAT(SEQ ID N0:3)或SCVSQSTGQ[I/V]QCKVFDSLLNLSSTLQAT(SEQ ID N0:4)組成。
[0016] 根據(jù)本文例示的其它方面，提供一種經(jīng)上皮藥物制劑。所述經(jīng)上皮藥物制劑包含 藥學(xué)上適合的載體；有效量的治療劑；以及如本文所述的短暫地破壞緊密連接內(nèi)的 claudin-1 的試劑。
[0017] 根據(jù)本文例示的其它方面，提供一種經(jīng)上皮疫苗制劑。所述經(jīng)上皮疫苗制劑包含 藥學(xué)上適合的載體;有效量的存在于所述載體中的抗原或抗原編碼核酸分子，和任選地一 種或多種佐劑；以及如本文所述的短暫地破壞緊密連接內(nèi)的c 1 audiη-1的試劑。
[0018] 根據(jù)本文例示的其它方面，提供一種分離肽，其包含氨基酸序列 SSVSQSTGQIQSKVFDSLLNLSSTLQATR(SEQ ID NO:5)、SILTGVSTLDQSLKQLSNFSQAVSTQSSR(SEQ ID N0:6)、GGMSCVSQSTGQIQCKV(SEQ ID N0:7)、SCVSQSTGQIQCKV(SEQ ID N0:8)、 RRGSCVSQSGRR(SEQ ID N0:9)、ISGVQCCQTKQSS(SEQ ID N0:10)、RRGVCSSSQGRR(SEQ ID NO: 11)、LWMSSVSQSTGQIQSKVFDS(SEQ ID N0:12)、MSSVSQSTGQIQSKVFDS(SEQ ID N0:13)、 MSSVSQSTGQIQSKV(SEQ ID N0:14)、MSSVSQST(SEQ ID N0:15)、ISMSQQVSQSGVSDKFST(SEQ ID N0:16)、SIMSGKQSSVQSQVT(SEQ ID N0:17)、VSMSSTSQ(SEQ ID N0:18)、VSSSSQ(SEQ ID N0:19)、SILTGVST(SEQ ID N0:20)、SSVSQSTG(SEQ ID N0:21)、GQIQSKVG(SEQ ID N0:22)、 LNLSSTLQG(SEQIDN0:23)、NSVVQSTG(SEQIDN0:24)、GQMQSKVG(SEQIDN0:25)S SCVSQSTGQIQCKVFDSLLNLSSTLQATR(SEQ ID N0:26)。
[0019] 根據(jù)本文例示的其它方面，提供一種藥物組合物，其包含如本文所述的分離肽和 藥學(xué)上適合的載體。
[0020] 根據(jù)本文例示的其它方面，提供一種經(jīng)皮貼片，其包含（i)如本文所述的短暫地破 壞緊密連接內(nèi)的claudin-1的試劑，（ii)如本文所述的經(jīng)上皮藥物制劑，或（iii)如本文所 述的經(jīng)上皮疫苗制劑。
[0021] 根據(jù)本文例示的其它方面，提供一種破壞上皮屏障的方法。所述方法包括向上皮 位點(diǎn)施加一定量的如本文所述的短暫地破壞緊密連接內(nèi)的c 1 aud i η-1的試劑，其中所述施 加有效破壞存在于所述位點(diǎn)處的上皮細(xì)胞中的claudin-Ι，并且由此破壞在所述上皮位點(diǎn) 處的屏障形成。
[0022] 根據(jù)本文例示的其它方面，提供一種向受試者施用經(jīng)上皮藥物制劑的方法。所述 方法包括向所述受試者上的上皮位點(diǎn)施加如本文所述的經(jīng)上皮藥物制劑。
[0023] 根據(jù)本文例示的其它方面，提供一種向受試者施用經(jīng)上皮疫苗制劑的方法。所述 方法包括向所述受試者上的上皮位點(diǎn)施加如本文所述的經(jīng)上皮疫苗制劑。
[0024] 本文例示的方面利用具有確定生理化學(xué)特性的肽來(lái)可逆地破壞TJ功能，TJ功能控 制上皮細(xì)胞中的細(xì)胞旁路擴(kuò)散。這些肽代表新的一類(lèi)非病原、功能性淀粉狀蛋白。如本文所 述，TJ破壞性肽的結(jié)構(gòu)和其作用機(jī)制通過(guò)研究同源人類(lèi)肽hCldnl(53-81，C54,64S)(SEQ ID N0:5)(本文中稱為"肽la"）的生物學(xué)和生物物理學(xué)特征來(lái)檢查。已發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在表面活性劑存 在下溶解時(shí)，肽la在比先前關(guān)于Cldnl肽所報(bào)告的（Mrsny等人，"A Key Claudin Extracellular Loop Domain Is Critical for Epithelial Barrier Integrity，'， Am. J.Path. 172:905-915(2008) ;Zwanziger等人，"A Peptidomimetic Tight Junction Modulator to Improve Regional Analgesia，"Mol.Pharm.9:1785_1794(2012)，其據(jù)此以 引用的方式整體并入)低兩個(gè)數(shù)量級(jí)的濃度下破壞培養(yǎng)細(xì)胞中的TJ。生物物理學(xué)表征表明， 肽la可形成在β折疊二級(jí)結(jié)構(gòu)中富含的淀粉狀蛋白樣原纖維。如本文所述，具有相同氨基酸 含量、疏水性以及pi但具有隨機(jī)序列的先_ij未知的亂序狀(稱為狀2a)也米用β折萱構(gòu)象，形 成原纖維，并且破壞TJ。
[0025] 如下文實(shí)施例中所示，合成基于Cldnl的肽并且分析其結(jié)構(gòu)和生物物理學(xué)特性，以 及其改變TJ的能力。使用人類(lèi)支氣管上皮細(xì)胞系（16HBE)，合成claudin肽和其亂序類(lèi)似物， 兩者均在比使用其它Cldnl肽時(shí)已被報(bào)道的濃度低一個(gè)數(shù)量級(jí)的濃度下以劑量依賴性方式 破壞TJ。肽暴露還破壞細(xì)胞旁路屏障功能，從而允許大小和范圍在熒光素至治療抗體內(nèi)的 分子擴(kuò)散，而無(wú)細(xì)胞毒性的跡象。經(jīng)上皮電阻（"TER"）在去除所述肽后恢復(fù)。肽暴露改變 Cldnl和封閉蛋白表達(dá)模式，如通過(guò)免疫熒光染色所觀察。當(dāng)溶解于表面活性劑中時(shí)，Cldnl 肽和其相應(yīng)亂序類(lèi)似物均自發(fā)地形成原纖維。圓二色性和傅里葉變換紅外光譜法證明，這 些原纖維富含于財(cái)斤疊二級(jí)結(jié)構(gòu)中，并且X射線粉末衍射與交叉結(jié)構(gòu)一致。這些原纖維結(jié)合 硫代黃素 Τ( 一種被視為對(duì)淀粉狀蛋白具診斷性的染料）。所述亂序肽至少與所述Cldnl序列 一樣在屏障破壞中起作用以及采用類(lèi)似構(gòu)象的觀察結(jié)果表明一類(lèi)全新的淀粉狀蛋白形成 肽的存在，并且揭露一種用于增強(qiáng)治療分子的經(jīng)上皮遞送的新策略。
[0026] 附圖簡(jiǎn)述
[0027] 圖1A-1C為表皮中的TJ以及Claudin-Ι、肽1以及肽2(其更詳細(xì)地描述于下文中）的 示意圖（圖1A和1B)，以及顯示