一種海洋生物抗菌肽的應(yīng)用及含有其的藥物組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種具有抗菌活性的多肽的應(yīng)用;本發(fā)明還涉及含有其的藥物組合物 以及殺滅VBNC狀態(tài)微生物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] VBNC(活的但不可培養(yǎng)的微生物（viable but non-culturable state，VBNC))狀 態(tài)細(xì)菌是指原來可進(jìn)行培養(yǎng)的微生物在不良外界環(huán)境的脅迫下進(jìn)入了的一個(gè)休眠時(shí)期，用 常規(guī)方法培養(yǎng)時(shí)，不能繁殖，但仍然具有新陳代謝活性的一種特殊存在形式，并在一定的環(huán) 境條件下可以復(fù)蘇，即可以恢復(fù)到用常規(guī)方法培養(yǎng)的狀態(tài)。VBNC狀態(tài)菌因特定的自我保護(hù) 機(jī)制使其能夠在不利環(huán)境條件下繼續(xù)存活較長(zhǎng)時(shí)間，細(xì)菌的這種特殊VBNC狀態(tài)存活形式成 為環(huán)境中病原體的重要組成部分。這對(duì)于細(xì)菌本身來說是非常有利的，但是對(duì)公共衛(wèi)生卻 具有極大威脅，因?yàn)檫M(jìn)入VBNC狀態(tài)的細(xì)菌會(huì)保留若干毒力因素和潛在的毒力，且一旦復(fù)蘇 便具有感染性。食品工業(yè)質(zhì)量監(jiān)測(cè)樣本和水分配系統(tǒng)，或臨床樣本檢測(cè)也會(huì)低估評(píng)估風(fēng)險(xiǎn) 或檢測(cè)不到該狀態(tài)的活細(xì)胞，這無疑又增加了一層安全隱患。VBNC狀態(tài)的細(xì)菌因其具有不 可培養(yǎng)的特點(diǎn)，不但可逃避傳統(tǒng)檢測(cè)方法的檢測(cè)，還對(duì)多種理化因子包括抗生素產(chǎn)生抗性， 并在適當(dāng)?shù)臈l件下可復(fù)蘇，進(jìn)而成為疫病發(fā)生的源頭。因此，VBNC狀態(tài)細(xì)菌是極大的公共衛(wèi) 生安全隱患，找到一種能夠安全、高效殺滅VBNC狀態(tài)細(xì)菌的方法意義重大。
[0003] 抗微生物多肽又稱為抗菌肽(Antimicmbial peptides，AMPs)是生物體合成的一 類小分子防御多肽，是動(dòng)物固有免疫系統(tǒng)的重要成員。繼1972年瑞典科學(xué)家Boman等首先在 果繩中發(fā)現(xiàn)抗菌肽及其具有免疫功能（Boman HG,Nilsson I，Rasmuson B. Inducible antibacterial defence system in Drosophila.Nature, 1972,237:232-235)，隨后眾多 研究者先后從細(xì)菌、真菌、高等植物、無脊椎動(dòng)物、脊椎動(dòng)物乃至人體中發(fā)現(xiàn)并分離獲得上 千種具有抗菌活性的多肽。
[0004] 抗菌肽的抑菌機(jī)制有桶-板模型（barrel stave model)、毯式模型（carpet model)及環(huán)狀孔模型（toroidal pore model)，關(guān)鍵都是通過其陽離子性接近細(xì)胞膜，再以 其疏水性氨基酸插入生物膜，若濃度適宜或較高，形成跨膜通道或引起膜破碎，使細(xì)胞內(nèi)物 質(zhì)外泄和跨膜電勢(shì)瓦解，從而導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞裂解性的死亡;若抗菌肽濃度偏低時(shí)不足以裂 解性殺死病原體，則會(huì)有一部分抗菌肽進(jìn)入細(xì)胞與胞內(nèi)多聚陰離子(如DNA、蛋白質(zhì))結(jié)合而 抑制微生物的繁殖?？咕牡淖饔脵C(jī)制讓細(xì)菌等微生物難有機(jī)會(huì)產(chǎn)生有抗性的突變性，即 不易產(chǎn)生耐藥性。
[0005] 近年來研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽具有廣譜抗菌作用，對(duì)革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌均 有抑殺作用，還可以抗原蟲、抗病毒以及殺傷動(dòng)物體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞，使其最有可能替代抗生 素成為新一代相對(duì)安全的抗菌藥物(Guani-Guerra E，Santos_Mendoza T，Lug〇-Reyes S0, Teran LM.Antimicrobial peptides:general overview and clinical implications in human health and disease.Clin.Immunol.,2010,135(1):1-11.；Lakshmaiah Narayana J,Chen JY.Antimicrobial peptides:Possible anti-infective agents·Peptides， 2015,72:88-94.)〇
[0006]美國學(xué)者Silphaduang和Noga從雜交條紋f盧（Morone saxatilia^XM. chrysops 早）的肥大細(xì)胞中分離出3條長(zhǎng)為22aa的抗菌肽，分別命名為Piscidin-l，-2，-3(詞源自 piscine-魚的），N端富含Phe、Ile或His等氨基酸，C端多變(序列見圖lhPiscidin是魚類特 有的一個(gè)抗菌肽家族，為典型兩親性α螺旋構(gòu)型陽離子肽。Piscidin家族成員對(duì)多種致病菌 包括多重耐藥菌株格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)均有較強(qiáng)抑殺作用，而且對(duì)病毒、 真菌乃至寄生蟲也均有抑制作用（Silphaduang U，Noga EJ.Peptide antibiotics in mast cells of fish.Nature ,2001,414(6861):268-269.；Silphaduang U,Colorni A, Noga EJ.Evidence for widespread distribution of piscidin antimicrobial peptides in teleost fish.Diseases of Aquatic Organisms,2006,72(3):241-252·)〇 如圖1所示，斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)piscidin家族成員之一epinecidin-1的 完整序列是epinecidin-1 prepropeptide，共67aa，切除信號(hào)肽后為46aa，由于命名抗菌肽 piscidin的美國學(xué)者Si lphaduang等分離到的piscidin為22aa，人們推測(cè)石斑魚抗菌肽 piscidin家族成員發(fā)揮抗菌作用的多肽可能為21aa，即切除信號(hào)肽后再去除C端25aa(見圖 1 中的epinecidin-Ι )，21aa的epinecidin-1 (GFIFHIIKGLFHAGKMIHGLV，以下稱GV21)顯示其 具有抗菌活性。近年來，國內(nèi)外學(xué)者及發(fā)明人均在多種石斑魚(Epinephelus sp.)體內(nèi)發(fā) 現(xiàn)抗菌肽piscidin家族的成員（命名為epinecidin或piscidin) (Yin ZX,He W, Chen WJ, Yan JH,Yang JN,Chan SM,He JG.Cloning,expression and antimicrobial activity of an antimicrobial peptide,epinecidin-1,from the orange-spotted grouper, Epinephelus coioides.Aquaculture,2006,253:204-211 ·;陳大瑋，鄧?yán)畏?，邱聰齡，馬 一見，劉志剛.棕點(diǎn)石斑魚piscidin抗菌肽基因的克隆及其成熟肽的原核表達(dá).漁業(yè)科學(xué)進(jìn) 展，2011 ,32(4):126-133.)。尚無證據(jù)顯示pise id in家族基因是否與別的抗菌肽如 hepcidin家族類似，表達(dá)的氨基酸序列在切除信號(hào)肽后的prodomain還將切去部分片段以 釋放成熟肽。
[0007]金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)是人類的一種重要病原菌，隸屬于葡 萄球菌屬，是革蘭氏陽性菌的代表，可引起許多嚴(yán)重感染。大腸桿菌(Escherichia coli)為 革蘭氏陰性短桿菌，一般多不致病，為人和動(dòng)物腸道中的常居菌，在一定條件下可引起腸道 外感染，某些血清型菌株的致病性強(qiáng)，引起腹瀉，引起嚴(yán)重腹瀉和敗血癥。副溶血弧菌 (Vibrio parahaemolyticus)，又稱為腸炎弧菌，屬于弧菌屬，是一種常見的病原菌。腸炎弧 菌是一種嗜鹽性的革蘭氏陰性菌，主要的棲息地在海水中，是引起食物中毒的主要病原菌 之一，在沿海地區(qū)，每年都有相當(dāng)多的病患因食用被腸炎弧菌污染的海產(chǎn)品而發(fā)生食物中 毒。
[0008] 這三種菌是臨床及食品衛(wèi)生中最常見的病原菌，而且這些細(xì)菌在環(huán)境脅迫下可進(jìn) 入VBNC狀態(tài)，進(jìn)而對(duì)抗生素產(chǎn)生強(qiáng)耐藥性，并在適當(dāng)條件下可以復(fù)蘇成為疫病發(fā)生的源頭 之一，造成公共衛(wèi)生安全隱患。
[0009] 目前，尚未見國內(nèi)外有關(guān)安全、有效地殺滅VBNC狀態(tài)細(xì)菌的方法的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種多肽的抗菌和/或殺菌用途，所述多肽基于海洋 生物基因 Piscidin肽序列設(shè)計(jì)。所述多肽具有抑制或殺滅細(xì)菌特別是處于VBNC狀態(tài)細(xì)胞的 效果。
[0011] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供含有所述多肽的具有抗菌活性的藥物組合物。
[0012] 本發(fā)明的又一個(gè)目的在于提供一種殺滅處于VBNC狀態(tài)的微生物的方法。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的一方面，具有抗菌活性的多肽（以下簡(jiǎn)稱抗菌肽或GV46)，其氨基酸 序列如SEQ ID NO. 1所示。所述抗菌肽由46個(gè)氨基酸組成，序列來源于GenBank，登錄號(hào)為 AY294407(Epinephelus coioides epinecidin-lprepropeptide mRNA,complete cds)，是 從斜帶石斑魚中克隆出的序列，推導(dǎo)的氨基酸序列為：
[0014] MRCIALFLVLSLVVLMAEPGEGFIFHIIKGLFHAGKMIHGLVTRRRHGVEELQDLDQRAFEREKAFA (下劃線所示為預(yù)測(cè)的信號(hào)肽序列）。發(fā)明人從斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)血衆(zhòng)中 鑒定出切除信號(hào)肽后的長(zhǎng)度為46aa的piscidin多肽(GV46)，抑菌實(shí)驗(yàn)顯示該多肽對(duì)大腸桿 菌、金黃色葡萄球菌和/或副溶血弧菌表現(xiàn)出明顯的殺滅效果。更進(jìn)一步的是，所述抗菌肽 對(duì)于處于呢1^(活的但不可培養(yǎng)的微生物(￥丨&1316 13111：11011-(31111：11瓜1316 8七&七6，￥1^(]))狀 態(tài)的微生物顯示出較強(qiáng)的殺滅效果，這些細(xì)菌包括但不限于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和/ 或副溶血弧菌。
[0015] 可以將本發(fā)明的多肽添加藥學(xué)上可接受的各種添加劑和/或輔料制備成藥物組合 物，所述藥物組合物具有抗菌的效果，尤其是具有抑制或殺滅大腸桿菌、金黃色葡萄球菌 和/或副溶血弧菌的效果，更進(jìn)一步是對(duì)處于VBNC狀態(tài)的上述細(xì)菌具有抑制或殺滅效果。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供一種殺滅處于VBNC狀態(tài)的微生物的方法，將所述處 于VBNC狀態(tài)的微生物與所述的抗菌多肽接觸。
[0017] 本發(fā)明的抗菌肽具有對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和/或副溶血弧菌較強(qiáng)的殺滅 效果，特別是針對(duì)處于VBNC狀態(tài)的微生物顯示出很強(qiáng)的殺滅效果。
【附圖說明】
[0018] 圖1是部分piscidin-樣多肽氨基酸序列比對(duì)，epinecidin-lprepropeptide和 epinecidin-l (斜帶石斑魚（Epinephelus coioides)，Genbank登錄號(hào)：AAQ57624); piscidin-1,2,3(條紋魚盧魚（Morone saxati 1 isc^XΜ· chrysops