基于殼聚糖包裹ALV-J P-miRNA-env重組質(zhì)粒納米復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用
【專利說明】
(一)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥和病毒學(xué)領(lǐng)域，具體涉及了一種基于殼聚糖包裹的ALV-JP-miRNA-env重組質(zhì)粒納米復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用。
(二)
【背景技術(shù)】
[0002]J亞群禽白血病是由J亞群禽白血病病毒(ALV-J)引起的一種腫瘤性疾病，其主要禽臨床表現(xiàn)為髓細(xì)胞性白血病，并多以免疫耐受、高死亡率、生長遲緩和多組織器官出現(xiàn)腫瘤等為主要特征，我國ALV-J的發(fā)生成上升趨勢，臨床病例已經(jīng)從商品肉雞群發(fā)展到了商品蛋雞、地方種雞群及其他家禽，其發(fā)生特點主要含有發(fā)病早、感染率及發(fā)病率高、宿主廣泛、致病性強(qiáng)、腫瘤多樣化等。此外，以ALV-J為主的禽腫瘤性疾病還可與馬立克氏病、網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥等腫瘤性疾病混合感染，這大大增加疾病的預(yù)防和治療難度，給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]由于ALV-J病毒囊膜蛋白的超變性及其自身的免疫逃避能力，至今對ALV-J的防治研究還未見顯著成效，并且尚無有效控制和防治的藥物或疫苗，也沒有確實可行的防控措施。國外是通過凈化來控制本病的發(fā)生，但由于其周期長、成本高等原因，國內(nèi)目前還未能有效實施，只能通過淘汰感染雞進(jìn)行大群凈化。此外，不合理、不科學(xué)的凈化措施，還會加速病毒的進(jìn)化和突變，使疾病愈加復(fù)雜，基于我國的養(yǎng)殖現(xiàn)狀，尋求ALV-J防控的新技術(shù)、新手段有著重要的現(xiàn)實意義。
[0004]近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)及基因工程藥物的不斷發(fā)展，對基因藥物及其遞送系統(tǒng)的研究成為當(dāng)前研究的熱點，殼聚糖是自然界中唯一的堿性多糖，不溶于水，可溶于醋酸和無機(jī)酸等稀酸溶液。其化學(xué)名稱為聚葡萄糖胺，是由線性聚合物甲殼質(zhì)經(jīng)脫乙酞反應(yīng)后的產(chǎn)物。甲殼素是一種天然高分子化合物，自然界中，甲殼質(zhì)廣泛存在于低等生物菌類，藻類的細(xì)胞，節(jié)支動物蝦、蟹、昆蟲的外殼，軟體動物(如魷魚、鳥賊)的內(nèi)殼和軟骨，高等植物的細(xì)胞壁等，甲殼素每年生命合成資源可達(dá)2000億噸，是地球上僅次于植物纖維的第二大生物資源，是人類取之不竭的生物資源。甲殼素結(jié)構(gòu)式中糖基上的N-乙酞基大部分被去掉的話，就是甲殼素的最為重要的衍生物一殼聚糖，脫乙酰度是用來表征殼聚糖大分子鏈中伯氨基含量的，脫乙酰度大于85%的殼聚糖稱為高脫乙酰度殼聚糖，含有大量的伯氨基。伯氨基在偏酸性條件帶正電荷，能夠很好地吸附DNA或RNA，而且伯氨基具有結(jié)合氫離子的能力，因此殼聚糖具有一定的緩沖能力，能夠幫助殼聚糖逃離內(nèi)小體。它來源廣泛，具有良好生物相容性和生物降解性，對人體無毒無害;現(xiàn)有技術(shù)中殼聚糖作為作為載體承載對應(yīng)的小RNA或其他靶向藥物的技術(shù)方案在人藥的腫瘤藥物、核酸藥物領(lǐng)域均有涉及，但是在禽類白血病方面一直都是空白，如何利用殼聚糖獲得抗禽白血病生物制劑成為亟待解決的問題之一。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對現(xiàn)有存在的上述問題，本發(fā)明提供了一種小干擾基因藥物的制備技術(shù)及應(yīng)用，更為具體的涉及基于天然陽離子載體殼聚糖與J-亞群禽白血病ALV-JP-miRNA-env基因形納米復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用，結(jié)果顯示采用本發(fā)明制備的CTS-P-miRNA-env納米復(fù)合物可比原裸質(zhì)粒的抑制ALV-J病毒復(fù)制的效果更明顯，能更為有效地防治J亞群禽白血病發(fā)生和傳播，為禽白血病防控提供了新的抗病毒方法和手段，也為其成抗禽白血病生物制劑的臨床應(yīng)用提供了技術(shù)支持。
[0006]本發(fā)明是基于下述理論基礎(chǔ)進(jìn)行的深入研究獲得的:
[0007]小干擾基因藥物是目前國際上最先進(jìn)的一種生物醫(yī)藥技術(shù)，無論是國內(nèi)還是國際，在建立多靶向藥物設(shè)計加強(qiáng)小干擾核酸藥物療效和改善體內(nèi)藥物導(dǎo)入效率的創(chuàng)新技術(shù)上發(fā)展可謂是日新月異。
[0008]RNA干擾(RNAi)是近年來發(fā)現(xiàn)的在生物體內(nèi)普遍存在的一種生物學(xué)現(xiàn)象。利用RNA干擾技術(shù)能特異性抑制致病基因的表達(dá)，具有高效和多樣化的特征，在包括腫瘤在內(nèi)的畜禽疾病治療中極具潛力。
[0009]在RNAi藥物開發(fā)中，一方面，需要不斷發(fā)現(xiàn)新的靶點并弄清其功能和作用機(jī)制，從而指導(dǎo)臨床開發(fā)切實有效的RNA藥物用于重大疾病診斷和治療中，為養(yǎng)殖者帶來真正福音。另一方面，由于siRNA穩(wěn)定性差，易于降解，細(xì)胞攝入差，轉(zhuǎn)運入胞質(zhì)效率低以及缺乏靶向能力，因此小干擾基因藥物開發(fā)的另一個重要關(guān)鍵是開發(fā)高效的遞送系統(tǒng)。
[0010]殼聚糖表面帶有正電荷，使其能通過靜電吸附作用攜帶帶負(fù)電荷的重組質(zhì)?；?，從而通過空間位阻效應(yīng)，防止體內(nèi)核酸酶對質(zhì)粒DNA的降解;殼聚糖為水溶性高分子，可解決基因載體制備和轉(zhuǎn)染過程中的沉淀問題;殼聚糖為多糖類物質(zhì)，可與某些腫瘤表面的多糖受體結(jié)合，增加該類基因載體的腫瘤靶向性;殼聚糖是可生物降解的高分子材料，可通過納米生物技術(shù)達(dá)到基因的控制緩慢釋放，從而使基因治療達(dá)到最佳效果。因此本發(fā)明基于篩選獲得的能顯著抑制ALV-J的囊膜蛋白結(jié)構(gòu)基因(env)，以表達(dá)獲得小干擾RNA重組表達(dá)質(zhì)粒為靶向藥物，選擇殼聚糖納米粒為ALV-J臨床制劑的藥物載體，制備抗ALV-J重組表達(dá)干擾質(zhì)粒-殼聚糖納米復(fù)合物臨床制劑。
[0011]本發(fā)明的具體實現(xiàn)步驟如下:
[0012]對P-miRNA-env重組質(zhì)粒進(jìn)行去內(nèi)毒素大量提取，并測序鑒定，對殼聚糖、P-miRNA-env納米復(fù)合物的制備條件進(jìn)行摸索;對制備的殼聚糖、P-miRNA-env納米復(fù)合物進(jìn)行粒徑、形態(tài)、包封率、抗DNAseI消化能力等進(jìn)行檢測;細(xì)胞轉(zhuǎn)染檢測殼聚糖、P-miRNA-env納米復(fù)合物體外抑制ALV-J病毒復(fù)制效果并探索其有效劑量，
[0013]其中CTS-P-miRNA-env納米復(fù)合物的制備方法如下:
[0014]采用復(fù)凝聚法制備CTS-P-miR-env納米復(fù)合物:將60yg無RNase的P-miR-env(0.225ug/yL)加入到lmg/ml TPP水溶液ImL中，混合均勻；將P-miR-env-TPP溶液用2ml針頭點滴狀滴入3mL濃度為2mg/ml的殼聚糖醋酸溶液中，滴加速度為40d-50d/min，滴入后漩渦混合30s，室溫孵育30min ；收集納米復(fù)合物混懸液于無RNAse、無DNase的EP管中即得；
[0015]通過控制上述制備工藝，本發(fā)明最終得到的納米復(fù)合物粒徑范圍在100納米左右(90-110納米)，現(xiàn)有技術(shù)中還沒有獲得過這一粒徑范圍的產(chǎn)品，而這個范圍的粒徑進(jìn)入動物體內(nèi)更加容易，轉(zhuǎn)染效率更好，較之人體使用范圍也有不同；
[0016]除此之外本發(fā)明還包括P-miRNA-env重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和提取以及殼聚糖空白納米粒的制備。
[0017]本發(fā)明獲得的納米復(fù)合物各項性能檢測得到指標(biāo)如下:
[0018](I)透射電鏡觀察:納米復(fù)合物形態(tài)均勻，呈球形或類球形，大小在10nm左右；(2)粒徑測量儀分析測定納米復(fù)合物粒徑，98%的納米復(fù)合物粒徑為103納米，分散度良好；(3)納米復(fù)合物包封率的測定計算包封率的平均值為88%。各項指標(biāo)均說明得到的納米復(fù)合物性能良好，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，為下一步細(xì)胞轉(zhuǎn)染奠定基礎(chǔ)。
[0019]為了進(jìn)一步驗證該納米復(fù)合物的性能，發(fā)明人進(jìn)行了DF-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染:選擇細(xì)胞轉(zhuǎn)染常用試劑脂質(zhì)體作為對照，同時設(shè)置不做任何處理的細(xì)胞作為空白對照，將CTS-P-miR-env納米復(fù)合物分低、中、高3個劑量對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，于24、48、96h分別用熒光倒置顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染率和轉(zhuǎn)染效率;用MTT檢測細(xì)胞毒性，Real-time PCR檢測各組細(xì)胞中ALV-J mRNA的表達(dá);Western blot檢測病毒囊膜蛋白表達(dá)水平。
[0020]結(jié)果顯示，CTS-P-miR-env納米復(fù)合物低、中劑量組和高劑量組轉(zhuǎn)染率均高于脂質(zhì)體對照組，而細(xì)胞毒性低于脂質(zhì)體對照組。Real-time PCR檢測CTS-P-miR-env納米復(fù)合物對ALV-J的增殖比裸質(zhì)粒起到了更好的抑制效果，Western blot檢測ALV-J囊膜蛋白的表達(dá)量較ALV-J脂質(zhì)體對照組和裸質(zhì)粒組來說有明顯的降低，說明制備得到的CTS-P-miR-env納米復(fù)合物在抑制ALV-J的復(fù)制與表達(dá)方面較裸質(zhì)粒和脂質(zhì)體為轉(zhuǎn)染劑的質(zhì)粒組作用效果更佳。
[0021 ]綜上所述，與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明確定了基于殼聚糖包裹的P-miR-env形成納米復(fù)合物制備抗ALV-J臨床制劑小干擾基因藥物的方法，CTS-P-miR-env納米復(fù)合物可有效抑制J亞群禽白血病病毒的復(fù)制，為抗病毒生物制劑及臨床應(yīng)用提供了基礎(chǔ)，同時提供了優(yōu)化后的殼聚糖、P-miR-env重組質(zhì)粒的制備條件，更進(jìn)一步確定了 CTS-P-miR-env納米復(fù)合物抑制病毒復(fù)制的有效劑量，進(jìn)而提供了一種可有效控制J亞群禽白血病病毒感染的方法，解決了養(yǎng)禽業(yè)J亞群禽白血病病毒感染有效控制的難題，與傳統(tǒng)方法相比較，能大幅度的降低J亞群禽白血病造成的直接和間接經(jīng)濟(jì)損失，開創(chuàng)了禽腫瘤性病毒防治研究的新思路。
(四)
【附圖說明】
[0022]圖1為CTS-P-miR-env納米復(fù)合物粒徑測量圖，
[0023]由圖可知，本發(fā)明獲得納米復(fù)合物形態(tài)均勻，呈球形或類球形，大小在10nm左右，其中98%的納米復(fù)合物粒徑為103納米左右；
[0024]圖2為CTS-P-miR-env納米復(fù)合物抗DnaseI消化電泳圖，
[0025]圖中M為D