一種蜂窩狀絲素蛋白多孔微球藥物緩釋載體的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種蜂窩狀絲素蛋白多孔微球藥物緩釋載體的制備方法。將蠶繭脫膠后形成的纖維狀絲素溶解，經(jīng)過過濾、透析、濃縮后獲得絲素蛋白水溶液；將絲素蛋白溶液超聲進(jìn)行分散，裝入透析袋中并置于不同倍濃度的人模擬體液中浸泡，在勻速搖床中處理，每間隔時(shí)間更換人模擬體液得到微球懸濁液；將微球懸濁液洗滌數(shù)次，離心分離干燥后獲得磷灰石/絲素蛋白微球粉末，作為藥物緩釋載體。本發(fā)明可在絲蛋白表面形成一定大小及孔徑的磷灰石微球，分散性、載藥性能和緩釋性能優(yōu)良，對正常細(xì)胞無毒副作用，顯著提升藥物載體的生物相容性，在藥物緩釋、組織工程、酶工程等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說明】
一種蜂窩狀絲素蛋白多孔微球藥物緩釋載體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明公開了一種蜂窩狀絲素蛋白多孔微球藥物緩釋載體的制備方法，屬于生物醫(yī)藥材料領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]蠶絲纖維是人類最早利用的天然蛋白之一，主要由絲素蛋白組成的天然蛋白質(zhì)纖維是一種可降解的生物高分子材料，具有優(yōu)良的生物相容性、力學(xué)性能及低免疫原性，是用于制備生物材料的理想材料。近年來，隨著絲蛋白材料在生物醫(yī)藥技術(shù)的高速發(fā)展，已廣泛應(yīng)用于保健品、生物醫(yī)藥、組織工程、藥物緩釋等諸多領(lǐng)域。。
[0003]藥物緩釋載體的作用在于對給藥部位(如:腫瘤組織)提供持續(xù)的藥物遞送，經(jīng)過長時(shí)間(例如，數(shù)天或數(shù)周)的藥物緩釋為患者提供了給藥的便利性，并且減少了治療頻率，降低了護(hù)理費(fèi)用，同時(shí)減少了快速釋放藥物對身體其他健康組織造成的副作用。在藥物緩釋體系中，藥物載體起著關(guān)鍵性的作用。由于絲素蛋白溶液在改變物、化條件下很容易變性，因此通過改變絲素溶液中的pH值，加入醇溶液等方法既可以得到絲素微球。然而，目前絲素蛋白用于藥物釋放載體的研究還剛剛起步，大多數(shù)研究得到的絲素微球具有光滑的表面，而且在水溶液體系中極不穩(wěn)定，因此存在載藥性單一，生物穩(wěn)定性差，載藥量少，藥物緩釋效果不佳等缺點(diǎn)，這在很大程度上都限制絲素蛋白微球在藥物緩釋領(lǐng)域中的應(yīng)用。如申請日為2011年11月11日，公開號為CN201110357105.9的中國專利中，公開了一種絲素蛋白納米球的制備方法。從該專利的附圖1可以看到:所制備的微球表面成光滑的球形，分散性不好，容易相互吸引而發(fā)生沉降，會顯著降低對藥物的包埋及釋放效果，因此不能滿足藥物緩釋與生產(chǎn)的需要。
[0004]綜上所述，目前還沒有一種工序簡單，載藥效果和釋放效果良好的絲素蛋白多孔微球制備方法。因此，開發(fā)具有多孔形貌，載藥量高，具有藥物緩釋效果的絲素蛋白微球已是刻不容緩。
[0005]羥基磷灰石是構(gòu)成天然骨骼和牙齒的主要無機(jī)成分，具有良好的生物相容性。由于其較低的生產(chǎn)成本，良好的水溶性，較大的比表面積，和自身具有兩親性等特點(diǎn)，正在被應(yīng)用于更為廣泛的研究領(lǐng)域。動物體內(nèi)骨組織的最小微觀結(jié)構(gòu)為納米晶磷灰石在膠原蛋白纖維上的有序組裝結(jié)構(gòu)，膠原纖維以規(guī)則的陣列結(jié)構(gòu)為磷灰石的提供形核位點(diǎn)并控制其生長取向，形成長度大約為30-50nm，寬度為10-30nm的骨單元。因此從仿生的角度，利用這一特性，通過仿生生物礦化方法，利用絲素蛋白來調(diào)控礦物的成核及生長，制備出多孔的絲素蛋白微球，可用于藥物緩釋的應(yīng)用。使用絲素蛋白來調(diào)控羥基磷灰石用以藥物緩釋領(lǐng)域的應(yīng)用還鮮有研究。對于昂貴的抗癌藥物或基因修復(fù)藥物，需要高載藥量及緩釋延效性，以達(dá)到最佳的載藥和釋放效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]克服現(xiàn)有制備絲素蛋白微球技術(shù)中存在的上述不足，本發(fā)明提出了一種蜂窩狀絲素蛋白多孔微球藥物緩釋載體的制備方法。
[0007]基于【背景技術(shù)】的情況，本發(fā)明用蛋白質(zhì)易變性的特點(diǎn)，在特定條件下誘導(dǎo)羥基磷灰石在絲素蛋白質(zhì)表面組裝形成多孔微球，該絲素多孔微球具有良好的分散性，較高的比表面積，良好的生物相容性，持久的緩釋效果，因此從根本上徹底解決了以上的問題。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0009](I)將蠶繭脫膠后形成的纖維狀絲素溶解，經(jīng)過過濾、透析、濃縮后獲得絲素蛋白水溶液；
[00?O] (2)將步驟(I)中的絲素蛋白溶液濃度調(diào)節(jié)為0.1?50mg/mL并超聲進(jìn)行分散，裝入透析袋中并置于不同倍濃度的人模擬體液中浸泡，溶液溫度為37°C，在勻速搖床中處理；
[0011](3)搖床處理時(shí)間為1-14天，每24小時(shí)更換步驟(2)中的人模擬體液，得到微球懸濁液；
[0012](4)將步驟(3)中的微球懸濁液用去離子水和無水乙醇洗滌3?5次，離心分離，冷凍干燥或60 V下干燥5-48小時(shí)，經(jīng)模仿生物礦化過程，在絲素蛋白基質(zhì)上原位成核并經(jīng)自組裝形成具有蜂窩狀的多孔微球結(jié)構(gòu)，粒徑為0.2?5μπι，微球上帶有蜂窩狀孔，小孔的直徑約為20-100nm，作為藥物緩釋載體。
[0013]本發(fā)明利用模擬體液仿生礦化方法，通過絲素蛋白肽鏈中的功能性官能團(tuán)(如羧基、氨基等)來誘導(dǎo)磷灰石礦物在絲素蛋白表面快速成核與生長，從而使磷灰石在絲素蛋白表面進(jìn)行有序自組裝與沉積，得到具有蜂窩狀多孔外表面的絲素/磷灰石微球，其電荷為帶負(fù)電。
[0014]所述步驟(I)中的絲素原料采用家蠶絲素、絲腺蛋白、野蠶絲素、蜘蛛絲蛋白或者重組絲蛋白，但不限于此。
[0015]所述的人模擬體液的一倍濃度采用方式配制:在800ml去離子水中依順序加入NaCl: 7.996g, NaHCO3: 0.350g, KCl: 0.224g, K2HPO4.3H20: 0.228g ,MgCl2.6H20:0.305g,CaCl2:0.278g, Na2SO4:0.07 Ig，再用50mmol/L的三羥甲基氨基甲烷/鹽酸緩沖將模擬體液的PH值調(diào)整為7.40，定容至1000ml，即配成本實(shí)驗(yàn)中所用的模擬體液。
[0016]所述步驟(2)中模擬體液的配比包括但不限于所述的模擬體液配比，可在上述模擬體液的配制方法進(jìn)行適當(dāng)?shù)男薷?化學(xué)試劑的量可以變動，部分化學(xué)試劑可進(jìn)行替換；同理，也可配置1.5-5倍的模擬體液(模擬體液離子濃度乘以相應(yīng)倍數(shù)即可)用于本發(fā)明的應(yīng)用。
[0017]所述的藥物顆粒大小小于磷灰石/絲素蛋白微球中的蜂窩狀孔徑大小。
[0018]所述的藥物包括鹽酸阿霉素等抗癌藥物但不限于抗癌藥物，也可用于其它藥物的包載。
[0019]本發(fā)明通過實(shí)施例的人體細(xì)胞生物相容性實(shí)驗(yàn)表明，未載藥的絲素蛋白多孔微球具有良好的生物相容性。
[0020]本發(fā)明的人體細(xì)胞生物相容性實(shí)驗(yàn)具體是按藥物與絲素蛋白微球的質(zhì)量比為(I?50): 100將藥物溶液充分分散于絲素蛋白微球溶液中，在搖床上震蕩，37°C溫浴12小時(shí)，得到包載有藥物的絲素多孔微球。
[0021]本發(fā)明的原理在于，絲素蛋白多孔微球制備過程中，絲素蛋白鏈作為模板對礦物進(jìn)行調(diào)控，使得礦物在絲素蛋白模板上規(guī)整排列結(jié)晶，宏觀形貌為具有蜂窩狀的多孔微球結(jié)構(gòu)。本發(fā)明所使用到的原料中含有羥基磷灰石、絲素蛋白和類骨磷灰石等成分，天然安全，能被生物體吸收再利用;具有多層的自組裝結(jié)構(gòu)，這種由一維或二維的磷灰石納米結(jié)構(gòu)單元基于在絲素模板中自組裝而成，在絲素模板外部生成一圈堅(jiān)硬的球形多孔外殼。該絲素微球還具有其自身獨(dú)特的物化性質(zhì)，如比表面積大、不溶于水等;其帶負(fù)電荷的特性，使得微球與微球之間因?yàn)殡姾膳懦舛灰讏F(tuán)聚，并且能夠與帶正電的藥物(如阿霉素)發(fā)生靜電吸附作用，提高微球包載能力。
[0022]本發(fā)明所述的可控緩釋作用體現(xiàn)為蜂窩狀的多孔結(jié)構(gòu)能夠?yàn)樗幬锾峁﹩为?dú)的儲存空間，有利于大量藥物的吸附，通過調(diào)節(jié)PH值可以調(diào)節(jié)藥物的緩釋效率。此方法工藝簡單，操作容易，生物相容性好。不僅可用于家蠶、野蠶(柞蠶絲和天蠶絲等)等絲素蛋白膜的礦化，甚至可用于其它生物大分子材料用以制備微球。此發(fā)明豐富了絲素蛋白微球的類型，可作為具有生物活性物質(zhì)的載體，裝載酶、核酸、多肽、蛋白質(zhì)藥物等，應(yīng)用于疾病診斷和治療等。在藥物緩釋、組織工程、酶工程、光催化領(lǐng)域等有應(yīng)用前景。
[0023]由于上述技術(shù)方案的運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下突出特點(diǎn):
[0024](I)優(yōu)良的生物相容性;原料中使用的絲素蛋白和磷灰石都為天然活性物質(zhì)，已普遍用于生物醫(yī)藥行業(yè)，對細(xì)胞或組織無毒性反應(yīng);細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)出較高的細(xì)胞粘附率和增殖率，具有良好的生物相容性，生物安全性高，能滿足生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用；
[0025](2)操作簡單，生產(chǎn)周期短:提取工藝簡單、高效，沒有復(fù)雜繁瑣的制備過程；
[0026](3)不使用有機(jī)或有毒試劑，制備過程對環(huán)境及試驗(yàn)人員不造成傷害；
[0027](4)表面具有形狀規(guī)則均勻的蜂窩多孔結(jié)構(gòu)，將模式藥物(阿霉素)加載于微球中制備的載藥緩釋微球，與表面光滑的絲素微球相比，能夠顯著提高模式藥物的載藥量，并能夠使藥物緩慢、線性釋放；
[0028](5)具有pH敏感性，能夠通過溶液pH值的變化調(diào)節(jié)藥物從微球中釋放的速度，具有可控性；
[0029](6)制備出具有堅(jiān)硬外殼并帶負(fù)電的絲素蛋白微球，避免了純絲素蛋白微球之間相互的粘結(jié)及在水溶液中不穩(wěn)定的問題，微球粒徑分布均勻，提高藥物的生物利用度。
【附圖說明】
[0030]圖1為實(shí)施例1中蜂窩狀絲素蛋白多孔微球藥物緩釋載體的掃描電鏡圖片。
[0031]圖2為實(shí)施例2中蜂窩狀絲素蛋白多孔微球藥物緩釋載體包載阿霉素藥物后在不同pH溶液中的緩釋效果圖。
[0032]圖3為實(shí)施例3中蜂窩狀絲素蛋白多孔微球藥物緩釋載體包載阿霉素藥物后加入至ljBcap-37腫瘤細(xì)胞，經(jīng)過不同時(shí)間處理后的細(xì)胞形貌圖。
【具體實(shí)施方式】
[0033]下面通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以下實(shí)施例是對本發(fā)明的解釋而本發(fā)明并不局限于以下實(shí)施例。
[0034]本發(fā)明的實(shí)施例如下:
[0035]實(shí)施例1
[0036]本實(shí)施例中蜂窩狀絲素蛋白多孔微球藥物緩釋載體的制備方法依次包括如下步驟:
[0037](I)將蠶繭脫膠后形成的纖維狀絲素溶解，經(jīng)過過濾、透析、濃縮后獲得絲素蛋白水溶液；
[0038](2)將步驟(I)中的絲素蛋白溶液濃度調(diào)節(jié)為0.lmg/mL并超聲進(jìn)行分散，裝入透析袋中并置于不同倍數(shù)的人體模擬體液中浸泡，溶液溫度為37°C，轉(zhuǎn)速:100轉(zhuǎn)/分鐘。
[0039](3)搖床處理時(shí)間為14天，每24小時(shí)更換步驟(2)中的模擬體液，得到微球懸濁液；
[0040](4)將步驟(3)中的微球懸濁液用去離子水和無水乙醇洗滌數(shù)次，離心分離，冷凍干燥5小時(shí)，獲得I?5μπι的磷灰石/絲素蛋白微球前；
[0041](7)人體間充質(zhì)干細(xì)胞生物相容性實(shí)驗(yàn)表明，未載藥的絲素蛋白多孔微球具有良好的生物相容性。
[0042]實(shí)施例2
[0043]本實(shí)施例中促進(jìn)細(xì)胞生長的柞蠶絲素的生物礦化方法依次包括如下步驟:
[0044](I)將蠶繭脫膠后形成的纖維狀絲素溶解，經(jīng)過過濾、透析、濃縮后獲得絲素蛋白水溶液；
[0045](2)將步驟(I)中的絲素蛋白溶液濃度調(diào)節(jié)為50mg/mL并超聲進(jìn)行分散，裝入透析袋中并置于不同倍數(shù)的人體模擬體液中浸泡，溶液溫度為37°C，轉(zhuǎn)速:200轉(zhuǎn)/分鐘。
[0046](3)搖床處理時(shí)間為I天，每24小時(shí)更換步驟(2)中的模擬體液，得到微球懸濁液；
[0047](4)將步驟(3)中的微球懸濁液用去離子水和無水乙醇洗滌數(shù)次，離心分離，60 0C下干燥10小時(shí)，獲得0.5?2μπι的磷灰石/絲素蛋白微球；
[0048](5)按鹽酸阿霉素與絲素蛋白微球的質(zhì)量比為1:100，將鹽酸阿霉素溶液充分分散于絲素蛋白微球溶液中，在搖床上震蕩，37°C溫浴12小時(shí)，得到混合液。
[0049](6)將步驟(5)中的混合液，經(jīng)7000轉(zhuǎn)/分鐘離心處理去除上清液，50 %酒精洗滌再次離心去除上清液、冷凍干燥，得到包載阿霉素的絲素蛋白緩釋微球。
[0050](7)將步驟(6)中的包載阿霉素的絲素蛋白緩釋微球用于緩釋實(shí)驗(yàn)，pH為7.4時(shí)，包載阿霉素的絲素蛋白緩釋微球在60小時(shí)的釋放量為38.5%,而pH為6.2時(shí)，包載阿霉素的絲素蛋白緩釋微球在24小時(shí)的釋放量為84.2%。
[0051]包載阿霉素的絲素蛋白緩釋微球在不同pH溶液中的緩釋效果如圖2所示，實(shí)驗(yàn)表明:在PH值為7.4時(shí)(正常體液環(huán)境)，120小時(shí)內(nèi)的阿霉素的釋放速率很小，100小時(shí)釋放量約為46.3 % ;而在pH值為6.2時(shí)(與腫瘤組織細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境相近)，24小時(shí)即釋放84.2%,釋放速率非常明顯?？梢?，本發(fā)明實(shí)施例將模式藥物(阿霉素)包載于絲素蛋白基微球所制備的載藥微球能夠可控地(通過調(diào)節(jié)pH)緩慢釋放阿霉素。由此可證明包埋了阿霉素的絲素蛋白微球具有明顯的緩釋性質(zhì)，并具有pH敏感性。
[0052]實(shí)施例3
[0053]本實(shí)施例中促進(jìn)細(xì)胞生長的柞蠶絲素的生物礦化方法依次包括如下步驟:
[0054](I)將蠶繭脫膠后形成的纖維狀絲素溶解，經(jīng)過過濾、透析、濃縮后獲得柞蠶絲素蛋白水溶液；
[0055](2)將步驟(I)中的柞蠶絲素蛋白溶液濃度調(diào)節(jié)為2mg/mL并超聲進(jìn)行分散，裝入透析袋中并置于5倍的人體模擬體液中浸泡，溶液溫度為37 V，轉(zhuǎn)速:20轉(zhuǎn)/分鐘。
[0056](3)搖床處理時(shí)間為7天，每24小時(shí)更換步驟(2)中的模擬體液，得到微球懸濁液；
[0057](4)將步驟(3)中的微球懸濁液用去離子水和無水乙醇洗滌數(shù)次，離心分離，冷凍干燥48小時(shí)，獲得I?5μπι的磷灰石/柞蠶絲素蛋白微球；
[0058](5)收集對數(shù)期腫瘤細(xì)胞，每孔加入200yL，鋪板細(xì)胞調(diào)密度至10000個(gè)/孔。當(dāng)細(xì)胞單層鋪滿孔底，加入梯度濃度的載有DOX藥物的微球，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)、12小時(shí)、48小時(shí)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，載藥微球4小時(shí)及12小時(shí)對腫瘤細(xì)胞毒副作用很弱，在48小時(shí)能夠殺死大多數(shù)細(xì)胞。
[0059]實(shí)施例蜂窩狀絲素蛋白多孔微球藥物緩釋載體包載阿霉素藥物后加入到Bcap-37腫瘤細(xì)胞，經(jīng)過不同時(shí)間處理后的細(xì)胞形貌如圖3所示，由此可證明通過本發(fā)明可顯著降低載藥微球?qū)φ＜?xì)胞的毒副作用，并在癌細(xì)胞周圍釋放藥物殺死癌細(xì)胞。
[0060]實(shí)施例4
[0061 ]本實(shí)施例中促進(jìn)細(xì)胞生長的柞蠶絲素的生物礦化方法依次包括如下步驟:
[0062](I)將蠶繭脫膠后形成的纖維狀絲素溶解，經(jīng)過過濾、透析、濃縮后獲得絲素蛋白水溶液；
[0063](2)將步驟(I)中的絲素蛋白溶液濃度調(diào)節(jié)為lmg/mL并超聲進(jìn)行分散，裝入透析袋中并置于修飾后的人體模擬體液中浸泡，溶液溫度為37 V，轉(zhuǎn)速:66轉(zhuǎn)/分鐘。
[0064](3)將步驟(2)中的體系處理時(shí)間為5天，得到微球懸濁液；
[0065](4)將步驟(3)中的微球懸濁液用去離子水和無水乙醇洗滌數(shù)次，離心分離，冷凍干燥48小時(shí)，獲得I?5μπι的磷灰石/絲素蛋白微球；
[0066](5)按鹽酸阿霉素與絲素蛋白微球的質(zhì)量比為50:100，將鹽酸阿霉素溶液充分分散于絲素蛋白微球溶液中，在搖床上震蕩，37°C溫浴24小時(shí)，得到混合液。
[0067](6)將步驟(5)中的混合液，經(jīng)7000轉(zhuǎn)/分鐘離心處理去除上清液，75%酒精洗滌再次離心去除上清液、冷凍干燥，得到包載阿霉素的絲素蛋白緩釋微球。
[0068]由本發(fā)明實(shí)施例可證明本發(fā)明微球具有明顯的緩釋性質(zhì)，并具有pH敏感性，通過本發(fā)明可顯著降低載藥微球?qū)φ＜?xì)胞的毒副作用。因此本發(fā)明是一種包載藥物效率高、緩釋效果顯著的藥物緩釋載體。
[0069]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例子。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種蜂窩狀絲素蛋白多孔微球藥物緩釋載體的制備方法，依次包括如下步驟: (1)將蠶繭脫膠后形成的纖維狀絲素溶解，經(jīng)過過濾、透析、濃縮后獲得絲素蛋白水溶液； (2)將步驟(I)中的絲素蛋白溶液濃度調(diào)節(jié)為0.1?50mg/mL并超聲進(jìn)行分散，裝入透析袋中并置于不同倍濃度的人模擬體液中浸泡，溶液溫度為37°C，在勻速搖床中處理； (3)搖床處理時(shí)間為1-14天，每24小時(shí)更換步驟(2)中的人模擬體液，得到微球懸濁液； (4)將步驟(3)中的微球懸濁液用去離子水和無水乙醇洗滌數(shù)次，離心分離，冷凍干燥或60 0C下干燥5-48小時(shí)，獲得粒徑為0.2?5μπι的磷灰石/絲素蛋白微球粉末，作為藥物緩釋載體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蜂窩狀絲素蛋白多孔微球藥物緩釋載體的制備方法，其特征在于:所述步驟(4)中用去離子水和無水乙醇洗滌3?5次。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蜂窩狀絲素蛋白多孔微球藥物緩釋載體的制備方法，其特征在于:所述步驟(I)中的絲素原料采用家蠶絲素、絲腺蛋白、野蠶絲素、蜘蛛絲蛋白或者重組絲蛋白，但不限于此。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蜂窩狀絲素蛋白多孔微球藥物緩釋載體的制備方法，其特征在于:所述的人模擬體液的一倍濃度采用方式配制:在800ml去離子水中依順序加入NaCl: 7.996g, NaHCO3: 0.350g, KCl: 0.224g, K2HPO4.3H20: 0.228g ,MgCl2.6H20:0.305g,CaCl2:0.278g, Na2SO4:0.07 Ig，再用50mmol/L的三羥甲基氨基甲烷/鹽酸緩沖將模擬體液的pH值調(diào)整為7.40，定容至100ml。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蜂窩狀絲素蛋白多孔微球藥物緩釋載體的制備方法，其特征在于:所述的藥物顆粒大小小于磷灰石/絲素蛋白微球中的蜂窩狀孔徑大小。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蜂窩狀絲素蛋白多孔微球藥物緩釋載體的制備方法，其特征在于:所述的藥物包括鹽酸阿霉素等抗癌藥物但不限于抗癌藥物，也可用于其它藥物的包載。
【文檔編號】A61K31/704GK105832682SQ201610369157
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月27日
【發(fā)明人】楊明英, 帥亞俊, 毛傳斌
【申請人】浙江大學(xué)