帶有一氧化氮供體的芳香酸衍生物在制備治療惡性腫瘤遷移疾病藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了帶有一氧化氮供體的芳香酸衍生物在制備治療惡性腫瘤遷移疾病藥物中的新應(yīng)用，本發(fā)明在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過大量實(shí)驗(yàn)研究，開發(fā)新的臨床功效，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，帶有一氧化氮供體的芳香酸衍生物具有很好的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，尤其是具有很好的抑制腫瘤細(xì)胞遷移的功效，療效可靠，安全性好，具有重要的應(yīng)用前景。
【專利說明】
帶有一氧化氮供體的芳香酸衍生物在制備治療惡性腫瘤遷移 疾病藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種藥物，具體涉及帶有一氧化氮供體的芳香酸衍生物在制備治療惡 性腫瘤疾病藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤已成為21世紀(jì)威脅人類生存的頭號(hào)殺手，臨床上目前治療腫瘤的藥物，抗腫 瘤效果取得了一定的進(jìn)步，但藥物毒性大，在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也無選擇性的殺死白細(xì) 胞、淋巴細(xì)胞等人體自身免疫細(xì)胞，導(dǎo)致病人常常由于因自身免疫能力低下并發(fā)感染，尤其 是對(duì)于腫瘤細(xì)胞迀移后，目前的抗腫瘤藥物療效一般，在臨床使用中有較大的局限性。
[0003] 目前腫瘤的診斷與治療主要是依靠一些西醫(yī)的方法與手段，如化學(xué)藥物的治療與 放射治療等等，目前治療腫瘤的藥物在臨床上大多是具有靶點(diǎn)特性的細(xì)胞毒性藥物，可是 這仍存在很多的不足之處如選擇性差、毒副作用強(qiáng)、易產(chǎn)生耐藥性等等。
[0004] -氧化氮不僅可以對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖產(chǎn)生顯著的抑制作用，而且還可以加速腫瘤 細(xì)胞的凋亡，另外一氧化氮在體內(nèi)通過與氧自由基結(jié)合的方式，生成的活性氮對(duì)腫瘤細(xì)胞 有間接的阻滯作用，一氧化氮雖然有很好的抗腫瘤作用，但是仍然存在許多的缺點(diǎn)和需要 改進(jìn)的地方，如體內(nèi)半衰期短，不穩(wěn)定等等。
[0005] 芳香酸類化合物，如阿魏酸、咖啡酸、肉桂酸、異阿魏酸以及香豆酸報(bào)道具有很好 的抗血栓活性，臨床上常用于心血管疾病，盡管芳香酸類化合物具有多種藥理活性，但是， 由于他們的分子親水性較強(qiáng)，較難透過生物膜脂質(zhì)雙分子層而影響其藥效作用(王汝濤，周 四元，張峰，等.阿魏酸乙酯對(duì)過氧化氫損傷人血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用[J].中國(guó)臨床藥理 學(xué)與治療學(xué)，2004,9(7) :763-765.)限制了該類化合物的應(yīng)用。中國(guó)專利201010214044.6， 報(bào)道了帶有一氧化氮供體的芳香酸前體藥物及其制備方法和其應(yīng)用，另外中國(guó)專利 201210306272.5報(bào)道了帶有一氧化氮供體的芳香酸衍生物在制備治療惡性腫瘤疾病藥物 中的應(yīng)用，但目前還未有帶有一氧化氮供體的芳香酸衍生物在抗惡性腫瘤迀移疾病藥物中 的應(yīng)用的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明目的：本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供帶有一氧化氮供體的 芳香酸衍生物在制備治療惡性腫瘤迀移疾病藥物中的新應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，帶有一氧化 氮供體的芳香酸衍生物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有強(qiáng)抗腫瘤細(xì)胞迀移的活性，臨床使用安全，不 良反應(yīng)低。
[0007] 技術(shù)方案:為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下：
[0008] 帶有一氧化氮供體的芳香酸衍生物在制備治療惡性腫瘤迀移藥物中的應(yīng)用。
[0009] 作為優(yōu)選方案，所述的帶有一氧化氮供體的芳香酸衍生物在制備治療惡性腫瘤迀 移藥物中的應(yīng)用，所述的帶有一氧化氮供體的芳香酸衍生物為(E)-3_(4-羥基-3-甲氧基苯 基)丙烯酸-2-{2-[4-苯磺?；?1，2,5-噁二唑-5-氧-3-氧基]-乙氧基}乙酯，（E)-3-(4-羥 基-3-甲氧基苯基)丙烯酸-4-[4-苯磺?；?1，2,5-噁二唑-5-氧-3-氧基]-2-丁酯和(E)-3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)丙烯酸-4-[ 4-苯磺?；?1，2，5-噁二唑-5-氧-3-氧基]-1 - 丁酯。
[0010]帶有一氧化氮供體的芳香酸衍生物在制備治療肺癌、肝癌或乳腺癌細(xì)胞迀移藥物 中的應(yīng)用。
[0011]作為優(yōu)選方案，以上所述的帶有一氧化氮供體的芳香酸衍生物在制備治療肺癌、 肝癌或乳腺癌細(xì)胞迀移藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的帶有一氧化氮供體的芳香酸衍 生物為(E)-3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)丙烯酸-2-{2-[4-苯磺酰基-l，2,5-噁二唑-5-氧-3-氧基]-乙氧基}乙酯，（E)-3-(4-羥基-3-甲氧基苯基）丙烯酸-4-[4-苯磺酰基-l，2,5-噁二 唑-5-氧-3-氧基]-2-丁酯和(E)-3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)丙烯酸-4-[4-苯磺?；鵢1，2， 5-噁二唑-5-氧-3-氧基]-1 - 丁酯。
[0012] 本發(fā)明提供的帶有一氧化氮供體的芳香酸衍生物在制備治療肺癌、肝癌或乳腺癌 細(xì)胞迀移藥物中的應(yīng)用，將帶有一氧化氮供體的芳香酸衍生物和藥學(xué)上可接受的載體制備 成片劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、粉針劑或注射劑。
[0013] 有益效果:本發(fā)明提供的中藥組合物和現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0014] 本發(fā)明在帶有一氧化氮供體的芳香酸衍生物現(xiàn)有活性的基礎(chǔ)上，通過大量實(shí)驗(yàn)研 究，開發(fā)其新的臨床功效，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，帶有一氧化氮供體的芳香酸衍生物具有很好的抑 制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，尤其是具有很好的抑制腫瘤細(xì)胞迀移的功效，療效可靠，安全性好，具有 重要的應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而 不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的各種等價(jià)形 式的修改均落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求所限定的范圍。
[0016] 實(shí)施列1帶有一氧化氮供體的芳香酸衍生物對(duì)C57BL/6小鼠 Lewis肺癌侵襲迀移的 抑制作用研究
[0017] 1實(shí)驗(yàn)材料
[0018] 1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0019] 雌性C57BL/6小鼠（201500-05)，質(zhì)量(20 ± 2)g，南京青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
[0020] 1.2藥品與試劑
[0021] (E) -3- (4-羥基-3-甲氧基苯基)丙烯酸-2- {2- [ 4-苯磺酰基-1，2，5-噁二唑-5-氧- 3-氧基]-乙氧基}乙酯(簡(jiǎn)稱FXS-3)由自己實(shí)驗(yàn)室合成提供，純度大于98%;LewiS肺癌細(xì)胞 株和SABC免疫組化試劑盒(南京凱基生物有限公司）;MMP-2抗體，MMP-9抗體，ρ-ΑΚΤ抗體、p-ERK抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）。
[0022] 2實(shí)驗(yàn)方法
[0023] 2.1腫瘤細(xì)胞接種、分組及給藥
[0024] 收集處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的Lewis消化并調(diào)整濃度至5X106cell/mL，接種于雌性 C57BL/6小鼠左前肢腋部皮下，每只0.2mL，建立小鼠 Lewis肺癌模型。20d后肉眼可見左腋部 腫塊明顯，則該造模方法視為成功。成功的40小鼠只隨機(jī)分為5組，即模型對(duì)照組、環(huán)磷酰胺 組(50mg/kg/d)和(E) -3- (4-羥基-3-甲氧基苯基)丙烯酸-2- {2- [ 4-苯磺酰基-1，2，5-噁二 唑-5-氧-3-氧基]-乙氧基}乙酯（簡(jiǎn)稱FXS-3)低、中、高劑量組(25、50、1 OOmg/kg/d)，每組8 只。
[0025] 2.2腫瘤生長(zhǎng)抑制率及肺轉(zhuǎn)移抑制率
[0026] 末次給藥24h，采取頸椎脫臼的方法處死小鼠，剝離腋下腫瘤瘤塊并稱腫瘤瘤重， 從而計(jì)算FXS-3對(duì)腫瘤的抑制率。摘取整個(gè)肺臟并稱量重量，利用10%中性HCH0進(jìn)行固定， 利用解剖顯微鏡，計(jì)算轉(zhuǎn)移瘤的結(jié)節(jié)數(shù)。
[0027] 2.3肺組織病理學(xué)檢查
[0028]肺利用10 %中性HCH0進(jìn)行固定12h，常規(guī)石蠟包埋、切片，經(jīng)蘇木精-怡紅染色，利 用光學(xué)顯微鏡，檢測(cè)其病理學(xué)變化。
[0029] 2 · 4肺組織中麗卩^~麗卩-^口-厶燈和卩^服檢測(cè)
[0030] 肺組織進(jìn)行石蠟切片，按試劑盒說明進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。石蠟切片均要在同一條 件下采用軟件進(jìn)行分析，測(cè)定每個(gè)視野的平均灰度值?；叶戎翟叫?，其含量越高，反之則含 量越低。
[0031] 2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
[0032]采用SPSS 21.0軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以"X土SD"表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，多 組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析，以P<〇.05或P<0.01表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0033] 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0034] 3.1 FXS-3對(duì)肺癌的生長(zhǎng)及肺轉(zhuǎn)移作用
[0035] 與模型組比較，給藥FXS-3(100mg/kg和50mg/kg)組，腫瘤的瘤重明顯減輕（P< 〇. 〇 1 )，各劑量組，肺表面轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)數(shù)明顯減少(Ρ< 〇. 〇 1 )，表明FXS-3能明顯抑制肺癌的 生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移(表1，表2)。
[0036] 表1 FXS-3對(duì)Lewis肺癌生長(zhǎng)及肺轉(zhuǎn)移的影響(>:±.s,n = 8)
[0037]
[0038] 注：與模型對(duì)照組比較，*P〈0 · 05，林P〈0 · 01
[0039] 3.2 FXS-3對(duì)肺組織形態(tài)學(xué)變化的作用
[0040] 光鏡下可見模型組小鼠肺組織表面均有白色腫瘤結(jié)節(jié)，且轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)數(shù)量較多。 而FXS-3各劑量組轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)數(shù)明顯減少，結(jié)節(jié)較小，且多為孤立結(jié)節(jié)。模型組肺內(nèi)瘤結(jié)核 碎裂像少見，并可見肺泡壁增厚，瘤細(xì)胞沿肺邊緣浸潤(rùn)，瘤組織內(nèi)微血管豐富，偶見壞死?；?合物FXS-3中、高劑量組瘤細(xì)胞生長(zhǎng)不良，呈散在分布，大片壞死多見，瘤組織內(nèi)及其周圍微 血管較少，可見淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，提示FXS-3可明顯抑制Lewis肺癌肺轉(zhuǎn)移及生長(zhǎng)。 [0041 ] 3.3 FXS-3對(duì)小鼠肺組織中的MMP-2和MMP-9蛋白含量的作用
[0042] MMP-2于腫瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)表達(dá)。由表2可見，與模型組相比，F(xiàn)XS-3(lOOmg/kg)組， 麗P-2含量水平明顯降低(P〈0.05)，提示FXS-3可顯著抑制肺組織中的MMP-2的含量。由表2 可見，F(xiàn)XS-3(100mg/kg和50mg/kg)組，小鼠肺組織中的MMP-9表達(dá)水平明顯降低(P〈0 · 01)， 提示FXS-3可顯著抑制Lewis肺癌小鼠肺組織中的MMP-9蛋白表達(dá)。
[0043] 表2 FXS-3對(duì)Lewis肺癌小鼠肺組織中的MMP-2和MMP-9表達(dá)的影響（7士s ,η = 8)
[0045] 3.4 FXS-3對(duì)小鼠肺組織中的ρ-ΑΚΤ和p-ERK蛋白含量的作用
[0046] 和模型組相比較，F(xiàn)XS-3(100mg/kg和50mg/kg)組小鼠肺組織中的ρ-ΑΚΤ和p-ERK表 達(dá)水平明顯降低(P〈〇. 05)，提示FXS-3可顯著抑制Lewis小鼠肺中的P-AKT和Ρ-ERK的含量。 [0047]浸潤(rùn)性生長(zhǎng)和已有轉(zhuǎn)移灶的惡性腫瘤中，MMPs的表達(dá)量增加且活性增強(qiáng)，在已發(fā) 現(xiàn)26種基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，MMP-2和MMP-9可以顯著的降解細(xì)胞外機(jī)制以及基底膜中 IV型膠原、V型膠原、纖連蛋白等主要成分。
[0048] 本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，與模型對(duì)照組相比，F(xiàn)XS-3處理組小鼠肺組織中的MMP-2和MMP-9 含量均有所下降，并且隨著FXS-3給藥量的升高，下降水平更加顯著。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)XS-3 能夠通過降低肺組織中的MMP-2和MMP-9的含量從而抑制其在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移能力。
[0049]實(shí)施例2帶有一氧化氮供體的芳香酸衍生物（簡(jiǎn)稱FXS-3)對(duì)A549轉(zhuǎn)移和侵襲的抑 制作用研究
[0050] 1實(shí)驗(yàn)材料
[0051] 1.1主要試劑
[0052] Matrigel(美國(guó)BD 356234) ;MMP-2和MMP-9PCR引物由上海生物工程有限責(zé)任公司 合成;AKT及ERK特異性抑制劑LY294002與U0126(Sigma);鼠抗人MMP-2、MMP-9、ρ-ΑΚΤ/ΑΚΤ、 p-mT0R/mT0R、p-MEK/MEK和p-ERK/ERK的單克隆抗體均為Santa Cruz公司產(chǎn)品；其余見第四 早。
[0053] 1.2主要試劑配制
[0054] 實(shí)驗(yàn)藥物：（E)-3-(4-羥基-3-甲氧基苯基）丙烯酸-2-{2-[4-苯磺酰基-1，2,5-噁 二挫-5-氧_3_氧基]-乙氧基}乙酯（簡(jiǎn)稱FXS-3)由自己實(shí)驗(yàn)室合成提供，純度大于98% ; Matrigel的配制:無血清培養(yǎng)基將融化的Matrigel稀釋一倍。
[0055] 2實(shí)驗(yàn)方法
[0056] 2.1傷口愈合試驗(yàn)
[0057] 取A549，0.25 %TE消化后，800rpm離心4min，用無血清DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行重懸， A549計(jì)數(shù)，使得密度為2 X 105cell/mL，接種于24well板中。無血清DMEM培養(yǎng)基孵育24h，10μ L小槍頭垂直每孔劃一道直線后吸棄的舊的培養(yǎng)基，用PBS清洗兩次，洗掉漂浮的細(xì)胞，更換 新鮮的培養(yǎng)液，并加入不同劑量(ο. 625、1.25、2.5μΜ)的FXS-3，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24h。于不同時(shí) 間點(diǎn)至倒置顯微鏡下觀察傷口愈合情況，24h后用相機(jī)拍照。重復(fù)二次，每次隨意取三個(gè)視 野。
[0058] 2.2 Transwell小室遷移試驗(yàn)
[0059] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549,用無血清培養(yǎng)基A549饑餓培養(yǎng)24h;Transwell小室先加入50μ L無血清培養(yǎng)基3h，計(jì)數(shù)Α549,使用無血清培養(yǎng)基調(diào)整Α549密度至2Χ 105cell/mL， Transwel 1小室中每孔加入A54950yL，下室加入500yL含20 %FBS的培養(yǎng)基;分別加入不同劑 量(0.625、1.25、2.5yM)FXS-3，對(duì)照組不加 FXS-3，繼續(xù)培養(yǎng)24h;細(xì)胞計(jì)數(shù):用棉簽小心地將 Transwel 1上室的A549擦干凈，移出小室，倒置，使其風(fēng)干，再在24well板中加入0 · 1 %結(jié)晶 紫溶液(500μυ，將小室置于結(jié)晶紫溶液中，使其完全浸沒在結(jié)晶紫溶液，放置在37°C環(huán)境 中30min，用PBS洗一遍，在顯微鏡下觀察，直徑取3個(gè)視野，拍照(200 X )，并且A549計(jì)數(shù)。
[0060] 2.3 Transwell小室侵襲試驗(yàn)
[0061 ] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549,用無血清培養(yǎng)基A549饑餓培養(yǎng)24h;將Matrigel放置4°C環(huán)境 中使其融化;使用無血清培養(yǎng)基將融化的Matrigel稀釋一倍，然后加入30yL至Transwell上 室中，于37°C孵育120min;然后在Transwe 11小室先加入50yL無血清培養(yǎng)基3h，計(jì)數(shù)A549，使 用無血清培養(yǎng)基調(diào)整A549密度至2\105〇611/1^，1'抑118￥611小室中每孔加入45495(^1^，下 室加入500yL含20 %FBS的培養(yǎng)基;分別加入不同劑量(0.625、1.25、2.5yM)FXS-3，對(duì)照組不 加 FXS-3，繼續(xù)培養(yǎng)24h;細(xì)胞計(jì)數(shù)：用棉簽小心地將Transwe 11上室的A549擦干凈，移出小 室，倒置，使其風(fēng)干，再在24we 11板中加入0.1 %結(jié)晶紫溶液(500yL)，將小室置于結(jié)晶紫溶 液中，使其完全浸沒在結(jié)晶紫溶液，放置在37°C環(huán)境中30min，用PBS洗一遍，在顯微鏡下觀 察，直徑取3個(gè)視野，拍照(200 X )，并且A549計(jì)數(shù)。
[0062] 2.4 Western blot檢測(cè)MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)
[0063] 2.4.1細(xì)胞總蛋白的提取
[0064]提取A549總蛋白的方法見第四章第一節(jié)。
[0065] 2.4.2 Western blot檢測(cè)
[0066] 2.5 Western blot檢測(cè)FXS-3對(duì)AKT/mTOR和MEK/ERK信號(hào)通路的影響
[0067] Western blot檢測(cè)AKT、mT0R、MEK和ERK蛋白及磷酸化水平，一抗使用ρ-ΑΚΤ/ΑΚΤ、 p-mT0R/mT0R、p-MEK/MEK和p-pERK/ERK的單克隆抗體，方法同第四章第一節(jié)。
[0068] 2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
[0069]采用SPSS 21.0軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以"X土SD"表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，多 組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析，以P<〇.05或P<0.01表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0070] 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0071] 3.1 FXS-3抑制A549非定向迀移
[0072] 采用Wound Healing方法考察FXS-3對(duì)A549非定向迀移能力的影響。結(jié)果表明， FXS-3(0.625、1.25和2.5μΜ)作用A5490、12和24h，劃痕的寬度變得越來越寬闊，并且劃痕兩 側(cè)的A549的數(shù)目變的越來越少;Control組的A549培養(yǎng)了0、12和24h，劃痕的寬度變得越來 越窄，并且劃痕兩側(cè)的A549的數(shù)目變的越來越多。
[0073] 3.2 FXS-3抑制A549定向迀移
[0074] Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FXS-3對(duì)A549定向能力的改變，表3結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Control 組比較，？乂3-3(0.625、1.25、2.5以1〇有明顯的抑制六549定向迀移的作用；與陽性組比較，高 濃度的FXS-3(2.5yM)給藥組對(duì)細(xì)胞的定向迀移抑制率要強(qiáng)于順鉑。
[0075] 表3 FXS-3對(duì)A549定型迀向能力的影響（.x.i.s ,n = 3)
[0077] 3.3 FXS-3抑制A549侵襲
[0078] Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)考察FXS-3對(duì)A549侵襲能力的改變，表4結(jié)果表明，與 Control組比較，？乂3-3(0.625、1.25、2.5以]\〇有明顯的抑制4549的侵襲作用；與陽性組比較， FXS-3(2.5yM)給藥組對(duì)細(xì)胞的侵襲抑制率要強(qiáng)于順鉑。
[0079] 表4 FXS-3對(duì)A549侵襲能力的影響（7±s,n = 3)
[0081 ] 3.4 FXS-3抑制A549中MMP-2和MMP-9的表達(dá)
[0082] 為了明確FXS-3抑制A549迀移和侵襲的機(jī)制，用2.5μΜ的FXS-3分別處理A549 6h、 12h和24h后提取總RNA和總蛋白，檢測(cè)A549中MMP-2和MMP-9蛋白和基因的表達(dá)。RT-PCR檢測(cè) 結(jié)果顯示隨著FXS-3作用時(shí)間的延長(zhǎng)，MMP-2和MMP-9mRNA的含量逐漸減少，Western blot檢 測(cè)結(jié)果與RT-PCR-致，表明FXS-3能夠阻滯A549迀移和侵襲可能與下調(diào)MMP-2和MMP-9的含 量有著密不可分的關(guān)系。
[0083] 3.5 FXS-3抑制A549中AKT/mTOR和MEK/ERK信號(hào)通路
[0084] 為了考察FXS-3抑制A549迀移和侵襲的信號(hào)通路，用FXS-3處理培養(yǎng)的A549,分別 觀察AKT/mTOR和MEK/ERK信號(hào)通路，即AKT、mT0R、MEK和ERK的變化。用Western blot方法檢 測(cè)FXS-3作用后對(duì)四個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的含量的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)2.5μΜ的FXS-3作用于A549 6h后，AKT、mT0R、MEK和ERK磷酸化水平開始降低，并且FXS-3可以抑制A549中AKT/mTOR和 MEK/ERK信號(hào)通路。
[0085] 3 · 6 FXS-3通過AKT/mTOR和MEK/ERK信號(hào)通路影響A549中MMP-2和MMP-9的表達(dá)
[0086] 為了驗(yàn)證FXS-3抑制AKT/mTOR和MEK/ERK信號(hào)通路與下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)有 關(guān)，分別加入P-AKT和P-P70S6K的抑制劑LY294002和rapmycin，分別檢測(cè)FXS-3作用A549后， 上述蛋白的含量的變化情況。結(jié)果顯示，加入抑制劑LY294002和U0126后，進(jìn)一步下調(diào)了 MMP-2和MMP-9的含量。結(jié)果提示AKT/mTOR和MEK/ERK信號(hào)通路均可介導(dǎo)FXS-3對(duì)MMP-2和 MMP-9的含量。
[0087]實(shí)施例3帶有一氧化氮供體的芳香酸衍生物對(duì)SMMC-7721和MCF-7轉(zhuǎn)移侵襲能力的 影響
[0088] 1、實(shí)驗(yàn)方法
[0089] 1.1細(xì)胞迀移的測(cè)定同實(shí)施例2方法。
[0090] 1.2受試藥物：（E)-3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)丙烯酸-2-{2-[4-苯磺?；?1，2,5- 噁二唑-5-氧-3-氧基]-乙氧基}乙酯（簡(jiǎn)稱FXS-3)，（E)-3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)丙烯酸-4-[4_苯磺?；?1，2,5-噁二唑-5-氧-3-氧基]-2-丁酯(簡(jiǎn)稱?乂3-1)和化)-3-(4-羥基-3-甲 氧基苯基)丙烯酸-4-[ 4-苯磺?；?1，2，5-噁二唑-5-氧-3-氧基]-1 - 丁酯(簡(jiǎn)稱FXS-2)
[0091] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0092] 2.1 FXS-UFXS-2 和 FXS-3 抑制 SMMC-7721 和 MCF-7 的轉(zhuǎn)移
[0093] 2.1.1 FXS-l、FXS-2 和 FXS-3 抑制 SMMC-7721 的轉(zhuǎn)移
[0094] 見表5所示。與Control組比較，F(xiàn)XS-l、FXS-2和FXS-3有明顯的抑制SMMC-7721的轉(zhuǎn) 移作用；且隨著FXS-l、FXS-2和FXS-3濃度的增加，抑制SMMC-7721的作用效果更加明顯；與 陽性組比較，高濃度的FXS-UFXS-2和FXS-3組對(duì)SMMC-7721轉(zhuǎn)移的抑制率要強(qiáng)于順鉑；同一 樣品的不同濃度相比較，隨著FXS-1、FXS-2和FXS-3的濃度的不斷提升，對(duì)SMMC-77 21轉(zhuǎn)移的 抑制率也會(huì)越來越強(qiáng)；同一濃度的不同樣品相比較，F(xiàn)XS-3強(qiáng)于FXS-2,強(qiáng)于FXS-1。
[0095] 表5 FXS-l、FXS-2和FXS-3對(duì)SMMC-7721 轉(zhuǎn)移的抑制作用（1±域=3)
[0098] 注：與Control組比較，*P〈0 · 05，林P〈0 · 01
[0099] 2 · 1 · 2 FXS-1、FXS-2和FXS-3抑制MCF-7的轉(zhuǎn)移
[0100] 見表6所示。與Control組比較，F(xiàn)XS-l、FXS-2和FXS-3有明顯的抑制MCF-7轉(zhuǎn)移的作 用;且隨著FXS-l、FXS-2和FXS-3濃度的增加，抑制MCF-7的作用效果更加明顯；與陽性組比 較，高濃度的FXS-l、FXS-2和FXS-3組對(duì)MCF-7轉(zhuǎn)移的抑制率要強(qiáng)于順鉑；同一樣品的不同濃 度相比較，隨著FXS-1、FXS-2和FXS-3的濃度的不斷提升，對(duì)MCF-7轉(zhuǎn)移的抑制率也會(huì)越來越 強(qiáng)；同一濃度的不同樣品相比較，F(xiàn)XS-3強(qiáng)于FXS-2，強(qiáng)于FXS-1。
[0101]表6 FXS-l、FXS-2和FXS-3對(duì)MCF-7轉(zhuǎn)移的抑制作用（?士s,n = 3)
[0103] 注：與Control組比較，*P〈0 · 05，林P〈0 · 01
[0104] 2.2 FXS-l、FXS-2和FXS-3抑制SMMC-7721 和MCF-7的侵襲
[0105] 2.2.1 FXS-l、FXS-2 和 FXS-3 抑制 SMMC-7721 的侵襲
[0106] 見表7所示。與Control組比較，F(xiàn)XS-l、FXS-2和FXS-3有明顯的抑制SMMC-7721的侵 襲作用；且隨著FXS-l、FXS-2和FXS-3濃度的增加，抑制SMMC-7721的作用效果更加明顯；與 陽性組比較，高濃度的FXS-UFXS-2和FXS-3組對(duì)SMMC-7721侵襲的抑制率要強(qiáng)于順鉑；同一 樣品的不同濃度相比較，對(duì)SMMC-7721侵襲有抑制作用隨著濃度的增加而增加，且呈濃度依 賴關(guān)系；同一濃度的不同樣品相比較，F(xiàn)XS-3強(qiáng)于FXS-2，強(qiáng)于FXS-1。
[0107] 表7 FXS-l、FXS-2和FXS-3對(duì)SMMC-7721 侵襲的抑制作用（X土s，n = 3)
[0110] 注：與Control組比較，*P〈0 · 05，**P〈0 · 01
[0111] 2.2.2 FXS-1、FXS-2和FXS-3抑制MCF-7的侵襲
[0112] 見表8所示。與Control組比較，F(xiàn)XS-1、FXS-2和FXS-3有明顯的抑制MCF-7的侵襲作 用;且隨著FXS-l、FXS-2和FXS-3濃度的增加，抑制MCF-7的作用效果更加明顯；與陽性組比 較，高濃度的FXS-l、FXS-2和FXS-3組對(duì)MCF-7侵襲的抑制率要強(qiáng)于順鉑；同一樣品的不同濃 度相比較，對(duì)MCF-7侵襲有抑制作用隨著濃度的增加而增加，且呈濃度依賴關(guān)系；同一濃度 的不同樣品相比較，F(xiàn)XS-3強(qiáng)于FXS-2，強(qiáng)于FXS-1。
[0113] 表8 FXS-l、FXS-2和FXS-3對(duì)MCF-7侵襲的抑制作用（?±5,η = 3)
[0115] 注：與Control組比較，*P〈0 · 05，**P〈0 · 01
[0116] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 帶有一氧化氮供體的芳香酸衍生物在制備治療惡性腫瘤迀移藥物中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的帶有一氧化氮供體的芳香酸衍生物在制備治療惡性腫瘤迀移 藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的帶有一氧化氮供體的芳香酸衍生物為化)-3-(4-羥基_ 3-甲氧基苯基）丙烯酸-2-{2-[4-苯磺?；?1，2,5-噁二唑-5-氧-3-氧基]-乙氧基}乙酯， (E)-3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)丙烯酸-4-[4-苯磺酰基-l，2,5-噁二唑-5-氧-3-氧基]-2-丁酯和(E)-3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)丙烯酸-4-[4-苯磺?；?l，2,5-噁二唑-5-氧-3-氧 基] _1_ 丁酯。3. 帶有一氧化氮供體的芳香酸衍生物在制備治療肺癌、肝癌或乳腺癌細(xì)胞迀移藥物中 的應(yīng)用。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的帶有一氧化氮供體的芳香酸衍生物在制備治療肺癌、肝癌或 乳腺癌細(xì)胞迀移藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的帶有一氧化氮供體的芳香酸衍生物為 (E)-3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)丙烯酸-2-{2-[4-苯磺?；?l，2,5-噁二唑-5-氧-3-氧基]-乙氧基}乙酯，（E)-3-(4-羥基-3-甲氧基苯基）丙烯酸-4-[4-苯磺?；?l，2,5-噁二唑-5-氧-3-氧基]-2-丁酯和(E)-3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)丙烯酸-4-[4-苯磺?；?1，2,5-噁二 唑-5-氧-3-氧基]-1-丁酯。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的帶有一氧化氮供體的芳香酸衍生物在制備治療肺癌、肝癌或 乳腺癌細(xì)胞迀移藥物中的應(yīng)用，其特征在于，將帶有一氧化氮供體的芳香酸衍生物和藥學(xué) 上可接受的載體制備成片劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、粉針劑或注射劑。
【文檔編號(hào)】A61K31/4245GK105832727SQ201610301604
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年5月6日
【發(fā)明人】唐于平, 章鵬軒, 李念光, 段金廒
【申請(qǐng)人】南京中醫(yī)藥大學(xué)