青刺果油在制備治療癌癥藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及青刺果油在制備治療癌癥藥物中的應(yīng)用，所述癌癥為結(jié)腸癌或前列腺癌，所述藥物制劑中青刺果油的含量為8%~85%；本發(fā)明提供的青刺果油尤其適用于在制備抑制結(jié)腸癌細(xì)胞CT?26和抑制前列腺癌細(xì)胞PC?3生長的藥物中的應(yīng)用；本發(fā)明提供的青刺果油中含有的抗癌活性物質(zhì)能夠直接殺傷并作用于癌細(xì)胞，其毒副作用小，具有較好的抗癌效果。
【專利說明】
青刺果油在制備治療癌癥藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及青刺果油在制備治療癌癥藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥是嚴(yán)重威脅人類生命和健康的主要疾病之一，由于目前癌癥治療中所使用的 化療藥物大都存在毒副作用且價格昂貴，因此從天然化合物中尋找低毒、經(jīng)濟(jì)的抗癌藥物 是腫瘤治療所面臨的問題之一;而傳統(tǒng)中醫(yī)藥在抗腫瘤治療中具有重要地位，因此從中草 藥和天然藥物中提取有效成分，并探究其抗腫瘤的作用已逐漸成為研究的熱點(diǎn)。
[0003] 青刺果（PrinsepiautilisRoyle)為薔薇科(Rosaceae)扁核木屬（Prinsepia)植 物，別名青刺尖、槍刺果、打油果等，高1~5米，為常綠或落葉小灌木，生長于海拔1000~ 3000米的山坡、溪邊或灌木叢中，主要分布于云南、貴州、四川、臺灣、西藏等省區(qū)。青刺果果 實為核果，初綠或紅褐色，4~6月成熟時呈黑褐色。果子腎形長圓形，果長1.5~2cm，直徑0.8~ lcm?！兜崮媳静荨肥纵d其曰："性散寒，味苦，攻一切瘡毒癰疽，有膿出頭，無膿立消;散結(jié)核， 嚼細(xì)用酒服。"青刺果根、莖、葉、果實均可入藥，在納西族、白族、彝族、摩梭族等少數(shù)民族中 已有上千年的應(yīng)用歷史。其莖葉主治癰疽毒瘡，風(fēng)火牙痛，槍傷，骨折，蛇咬傷;根主治虛咳， 久咳，積食，風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;果主治目翳多淚，消化不良等。
[0004] 青刺果油為從青刺果的干燥成熟果實中提取得到的脂肪油，其作為一種特殊食用 油在民間已使用多年;現(xiàn)代文獻(xiàn)報道其具有調(diào)節(jié)血脂、抗氧化、抑菌、抑制血小板聚集及保 濕護(hù)膚等功效，還可以促進(jìn)骨髓干細(xì)胞形成，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，起到增效減毒的作用，但是 青刺果油在治療癌癥方面的應(yīng)用并未報道過。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供青刺果油在制備治療癌癥藥物中的 應(yīng)用，本發(fā)明提供的青刺果油中含有的抗癌活性物質(zhì)能夠直接殺傷并作用于癌細(xì)胞，其毒 副作用小，具有較好的抗癌效果。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供以青刺果油為活性成分的用于治療癌癥的藥物。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 青刺果油在制備治療癌癥藥物中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過大量實驗研究后發(fā)現(xiàn)青刺果油中含有大量的不飽和脂肪酸 和抗癌活性成分，這些不飽和脂肪酸和抗癌活性成分能夠干擾腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期，并且 選擇性破壞腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和線粒體，從而抑制腫瘤細(xì)胞DNA、RNA及蛋白質(zhì)的合成，使細(xì) 胞增殖速率減慢或誘導(dǎo)其凋亡;另外，青刺果油還有可能能夠激活人體免疫系統(tǒng)，促進(jìn)骨髓 干細(xì)胞形成，增強(qiáng)和恢復(fù)機(jī)體免疫力，具有增效減毒的作用。本發(fā)明提供的青刺果油中含有 的抗癌活性物質(zhì)能夠直接殺傷并作用于癌細(xì)胞，其毒副作用小，聯(lián)合放、化療有較好的防止 白細(xì)胞和血小板降低的作用，具有較好的抗癌效果。
[0009] 本發(fā)明提供的青刺果油對結(jié)腸癌細(xì)胞或前列腺癌細(xì)胞有明顯的抑制作用。
[0010] 優(yōu)選地，所述藥物制劑中青刺果油的含量為8%~85%。發(fā)明人在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，并 不是只要在藥物制劑中添加青刺果油就都有抗癌抑癌效果，青刺果油也并非一定會有抗癌 抑癌的效果，其含量對其作用的發(fā)揮影響較大，當(dāng)藥物制劑中的青刺果油的含量過低時，其 對腫瘤細(xì)胞的生長不但不具備抑制作用，反而會呈現(xiàn)出輕微的促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖作用； 而當(dāng)青刺果油含量過高時，青刺果油對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用也并沒有顯著性增長，而 且如果再增加藥物制劑中的青刺果油含量反而會增加成本。
[0011] 優(yōu)選地，所述應(yīng)用為青刺果油在制備抑制結(jié)腸癌細(xì)胞CT-26生長的藥物中的應(yīng)用。 [0012 ]優(yōu)選地，所述應(yīng)用為青刺果油在制備抑制前列腺癌細(xì)胞PC-3生長的藥物中的應(yīng) 用。
[0013] 優(yōu)選地，所述青刺果油由壓榨法、超聲波處理法、超臨界C02萃取法提取得到;更為 優(yōu)選地，所述青刺果油由超臨界C0 2萃取法提取得到。超臨界C02萃取法能夠有效防止青刺果 油中的熱敏性物質(zhì)的氧化和逸散，最大程度的保留了青刺果油中的藥物活性成分，并且超 臨界C02萃取法萃取得到的萃取物中無溶劑殘留，對人體無害。
[0014] 以青刺果油為活性成分的用于治療癌癥的藥物。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果： 青刺果油中含有大量的不飽和脂肪酸和抗癌活性成分，能夠直接殺傷并作用于癌細(xì) 胞，其毒副作用小，聯(lián)合放、化療有較好的防止白細(xì)胞和血小板降低的作用，具有較好的抗 癌效果。另外，青刺果油還能夠激活人體免疫系統(tǒng)，促進(jìn)骨髓干細(xì)胞形成，增強(qiáng)和恢復(fù)機(jī)體 免疫力，具有增效減毒的作用。本發(fā)明為臨床提供了一種新的、純天然、高效、無毒副作用的 植物來源的輔助抗腫瘤藥物，本發(fā)明提供的青刺果油能夠顯著提高患者的生活質(zhì)量，延長 患者的生命長度。
【附圖說明】
[0016] 圖1是青刺果油對前列腺癌細(xì)胞的抑制效果圖； 圖2是青刺果油對結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制效果圖； 圖3是青刺果油對前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯作用圖； 圖4是青刺果油對結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯作用圖。
【具體實施方式】
[0017] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。這些實施例僅是對本發(fā)明的典型描 述，但本發(fā)明不限于此。下述實施例中所用的試驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法，所使 用的原料，試劑等，如無特殊說明，均為可從常規(guī)市購等商業(yè)途徑得到的原料和試劑。
[0018] 試驗例1:青刺果油的制備 取青刺果粉碎過40目篩，稱取100g過篩后的青刺果粉末置1000 mL具塞錐形瓶中，加入 5倍量的石油醚(沸程60~90 °C )，在超聲功率為100W下提取2次，每次lh，合并石油醚液，抽 濾兩次，收集濾液，旋轉(zhuǎn)蒸餾回收溶劑，得亮黃色青刺果油。
[0019] 試驗例2:青刺果油的制備 取青刺果粉碎過40目篩，稱取5kg過篩后的青刺果粉末置萃取爸中，啟動設(shè)備，萃取參 數(shù)按如下設(shè)置:萃取壓力為30MPa，萃取溫度為35°C，萃取流速為2.4 kg/m2 · s，分離釜壓力 為5MPa，分離釜溫度為40°C，萃取時間為2h。萃取結(jié)束后得淺亮黃色青刺果油。
[0020] 試驗例3:青刺果油的制備 取青刺果粉碎過40目篩，稱取5kg過篩后的青刺果粉末置萃取爸中，啟動設(shè)備，萃取參 數(shù)按如下設(shè)置:萃取壓力為20MPa，萃取溫度為50°C，萃取流速為2.4 kg/m2 · s，分離釜壓力 為5MPa，分離釜溫度為40°C，萃取時間為2h。萃取結(jié)束后得淺亮黃色青刺果油。
[0021] 試驗例4:細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代與凍存 1.供試品溶液配置 用少許DMS0溶解青刺果油，制成貯備液，4°C保存?zhèn)溆谩Ｊ褂们坝门囵B(yǎng)基稀釋至所需濃 度，其中DMS0濃度小于或等于0.1%。
[0022] 2.儀器與材料 DMEM培養(yǎng)基（Dulbecco's modified eagle medium)購自Gibco公司，含2.2mg/mL NaHC〇3、2· 385mg/mLHepes、100U/mL青霉素、100yg/mL鏈霉素、100U/mL卡那霉素、5mg/mL酸 紅，pH7 · 2;MTT [溴化-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基四氮唑]購自Sigma公司，臨用 PBS溶解；胰蛋白酶（trypsin)購自Gibco公司，臨用D-Hanks液溶解，含0.04% EDTA-2Na pH7.2;Hepes購自Sigma公司；新生牛血清（newborn caif serum, NCS)購自Gibco公司；二 甲亞砜(dimethyl sulphoxide, DMS0)購自上海生工生物工程有限公司；PBS液:8.00mg/ mLNacl、0.20mg/mL KCL、1.56mg/mL Na2HPO4.H2CKO.2Omg/mL KH2P〇4;D_Hanks液：8.00mg/ mLNacl、0.40mg/mL KCL、0.06mg/mL Na2HPO4.H2CKO.O6mg/mL KH2P〇4、0.35mg/mL NaHC〇3、 Glucose 1.00mg/mL、20mg 酸紅。
[0023] 3.細(xì)胞實驗 3.1儀器與材料 細(xì)胞，引自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；C02培養(yǎng)箱，美國Thermo公 司；倒置顯微鏡，日本Olympus公司；酶標(biāo)儀，美國Biotech公司；高速離心機(jī)，美國Thermo fisher公司；超凈工作臺，蘇凈安泰公司。
[0024] 3.2 方法 3.2.1細(xì)胞復(fù)蘇 (1) 超凈工作臺紫外輻射30min，水浴鍋打開，水溫升至37°C ; (2) 從液氮罐中分別取出一管凍存的前列腺癌細(xì)胞PC-3和結(jié)腸癌細(xì)胞CT-26,迅速放入 盛有37 °C水的恒溫水浴鍋內(nèi)解凍，注意勿將水浴鍋內(nèi)的水沒過凍存管管口位置； (3) 細(xì)胞完全解凍后用移液槍將細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，800r/min離心5min; (4) 超凈工作臺內(nèi)，將離心管內(nèi)的上清液倒掉，加入lmL完全培養(yǎng)基，吹打均勻后，轉(zhuǎn)移 至60_細(xì)胞培養(yǎng)皿中，并添加3mL培養(yǎng)基，混勻； (5) 然后將細(xì)胞培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至37°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。次日，觀察細(xì)胞復(fù)蘇情況并換 液。
[0025] 3.2.2細(xì)胞傳代 (1) 超凈工作臺紫外輻射30min，預(yù)熱PBS、培養(yǎng)基和0.25%胰酶蛋白溶液； (2) 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞貼壁融合度達(dá)80%時，即可進(jìn)行傳代操作； (3) 在超凈臺內(nèi)，將培養(yǎng)皿中己有培養(yǎng)基倒掉，用lmLPBS清洗除去殘留的培養(yǎng)基，防止 血清抑制胰蛋白酶的消化作用； (4)加入lmLO. 25%胰蛋白酶溶液，輕輕晃動培養(yǎng)皿，使胰蛋白酶平鋪于整個底面，消化2 ~5min左右； (5 )倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞邊緣收縮，細(xì)胞間隙變大，輕微晃動培養(yǎng)瓶，有少量細(xì)胞 漂浮時，立即加入1 mL完全培養(yǎng)基終止消化； (6)用移液槍將細(xì)胞輕輕地從壁上吹打下來，并充分吹散，吹打過程緩慢輕柔保證無氣 泡產(chǎn)生，并吹打至每個角落； (7 )將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，800r/min離心5min; (8) 棄去上清液，加入lmL培養(yǎng)基充分混勻，取細(xì)胞懸液的三分之一轉(zhuǎn)移至60mm細(xì)胞培 養(yǎng)皿中，并添加3mL培養(yǎng)基，混勻； (9) 轉(zhuǎn)移至37 °C、5%C02培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。
[0026] 3.2.3細(xì)胞凍存 (1) 超凈工作臺紫外福照30min; (2) 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞貼壁融合度達(dá)80%時，即可進(jìn)行消化，同傳代步驟，待吹打得到 細(xì)胞懸液； (3) 取已滅菌凍存管1只，加入l-2mL細(xì)胞懸液，800r/min離心5min;向培養(yǎng)皿內(nèi)補(bǔ)加完 全培養(yǎng)基，置于37 °C、5%C02培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)； (4) 超凈工作臺內(nèi)，倒掉凍存管內(nèi)上清液，加入1 mL預(yù)先配置的細(xì)胞凍存液(胎牛血清： DMS0=9:1)重懸細(xì)胞； (5) 凍存管外標(biāo)記細(xì)胞名稱、操作人姓名與時間。將凍存管于4°C放置0.5h后轉(zhuǎn)移至-20 °C放置1.5h，最終轉(zhuǎn)移至液氮罐中儲存。
[0027] 3.2.4細(xì)胞計數(shù) 細(xì)胞消化步驟同細(xì)胞傳代，離心棄上清后加入合適體積培養(yǎng)液重懸，用移液槍取i〇yL 細(xì)胞懸液，從計數(shù)板邊緣緩緩打入，使懸液完全充滿計數(shù)板和蓋片間的空隙，避免產(chǎn)生氣 泡。正置顯微鏡下（10X)計數(shù)細(xì)胞，細(xì)胞密度計算公式如下:細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)/mL= ( 4個大 格細(xì)胞數(shù)總和/4) X104 實施例1 MTT法考察青刺果油對前列腺癌細(xì)胞PC-3和結(jié)腸癌細(xì)胞CT-26生長的抑制作 用 1.試驗方法 (1) 取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，消化后用完全培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)； (2) 調(diào)整細(xì)胞濃度，按照2000/孔的細(xì)胞濃度將PC-3細(xì)胞、CT-26細(xì)胞接種于96孔板中， 每孔180yL，邊緣孔用無菌PBS填充，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24h; (3) 每孔加入20yL不同濃度的加藥培養(yǎng)基(加藥培養(yǎng)基為添加有試驗例1~3任一試驗 例中提取得到的青刺果油），使藥物終濃度為25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μ g/ml、400μg/ml、500μg/ml，并設(shè)調(diào)零孔和加有0.1%DMS0的完全培養(yǎng)基的對照孔，每組6個復(fù) 孔； ⑷于培養(yǎng)24h、48h、72h后檢測，按以下步驟進(jìn)行：棄上清，將5mg/mL的MTT20yL與新的 培養(yǎng)基180yL混勻后加入96孔板，繼續(xù)放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入 150mLDMS0,均勻振蕩lOmin后于酶標(biāo)儀570nm波長處讀取0D值。計算腫瘤細(xì)胞生長抑制率： 腫瘤細(xì)胞生長抑制率(％)=(1_加藥組平均0D值/空白對照組平均0D值）X 100% 利用Ex cel的FORECAST命令計算半數(shù)抑制率濃度I C5 〇( Half Inhibitory Concentration of a Substance，即細(xì)胞增殖抑制率達(dá)50%時，所需的藥物濃度）。
[0028] 2.統(tǒng)計學(xué)分析 以上每組實驗及檢測均重復(fù)3次以上，所有數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件包和Sigma-Plot軟件處理，數(shù)據(jù)用表示，兩獨(dú)立樣本比較采用t檢驗，以P〈0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 [0029] 3.結(jié)果分析 采用MTT法考察青刺果油對前列腺癌細(xì)胞PC-3和結(jié)腸癌細(xì)胞CT-26生長的抑制作用。其 檢測原理是活細(xì)胞線粒體可以產(chǎn)生琥珀酸脫氫酶，該酶能使外源性的黃色MTT還原為不溶 于水的藍(lán)紫色結(jié)晶一一甲臜（Formazan)，沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞則不能產(chǎn)生該酶。二甲 基亞砜(DMS0)可將藍(lán)紫色甲臜溶出，用酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm波長處測定其吸光度，可 間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與活細(xì)胞數(shù)成正比。根據(jù)測 得的吸光度值(A570值），來判斷活細(xì)胞數(shù)量，A570值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)。根據(jù)前期摸索結(jié) 果，青刺果油濃度設(shè)置為 〇、25、50、100、200、300、400、500μg/ml。
[0030] 表1 MTT法檢測青刺果油對PC-3細(xì)胞的生長抑制率(％，，n=6)
[0031] 表2 MTT法檢測青刺果油對CT-26細(xì)胞的生長抑制率(％，，n=6)
[0032] 由上表1和表2可知，青刺果油對前列腺癌細(xì)胞PC-3和結(jié)腸癌細(xì)胞CT-26均有明顯 的增殖抑制作用，并呈劑量-時間依賴效應(yīng)。不同濃度青刺果油作用相同時間，細(xì)胞增殖抑 制率在一定劑量范圍內(nèi)隨濃度的增加而增加，具有劑量依賴性;在一定時間范圍內(nèi)，隨著作 用時間的延長，同一濃度的青刺果油對細(xì)胞生長的抑制率增加，具有時間依賴性。另外，在 作用24、48、7211，青刺果油對？(：-3細(xì)胞的1050分別為46 11^/1^、285以8/1^、120以8/11^，對 CT-=26細(xì)胞的IC50分別為23 mg、278 yg/mL、lll yg/mL。
[0033] 實施例2倒置顯微鏡觀察青刺果油處理前后腫瘤細(xì)胞的生長情況 1.試驗方法 將前列腺癌細(xì)胞PC-3和結(jié)腸癌細(xì)胞CT-26用完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)于37°C、5% 0)2細(xì)胞 培養(yǎng)箱中，隔天換液，每3天傳代培養(yǎng)一次。取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗，按IX 105個/mL 接種于24孔板，各孔lmL。培養(yǎng)過夜待細(xì)胞貼壁后吸去培養(yǎng)基，分別加入用DMEM完全培養(yǎng)基 稀釋配制的25、50、100、200、300、400、500yg/mL青刺果油，對照組加入含0.1%DMS0的DMEM完 全培養(yǎng)基，每孔lmL。于培養(yǎng)48h后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，與對照孔細(xì)胞相 比，主要觀察細(xì)胞形狀、輪廓改變、胞質(zhì)顆粒、突起等。
[0034] 2.結(jié)果分析 說明書附圖1和圖2是倒置顯微鏡觀察青刺果油對腫瘤細(xì)胞PC-3和CT-26細(xì)胞的生長抑 制作用效果圖。圖1是青刺果油對前列腺癌細(xì)胞PC-3的抑制效果圖；a為加入Ο . 1%DMS0作用 48h 后PC-3 細(xì)胞的形態(tài)，b、c、d、e、f、g、h分別為加入25、50、100、200、300、400、500μg/ml青刺 果油作用48h后PC-3細(xì)胞的形態(tài)。正常PC-3細(xì)胞為貼壁生長，鏡下呈不規(guī)則梭形，胞質(zhì)中顆 粒很少，折光性強(qiáng)。隨著青刺果油濃度的上升，細(xì)胞輪廓增強(qiáng)，折光性變?nèi)酰笮渭?xì)胞中異形 細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)較多顆?；蛑尾糠旨?xì)胞皺縮變圓，貼壁能力下降，越來越 多膨大、不規(guī)則形細(xì)胞即死細(xì)胞從培養(yǎng)皿壁上脫落并形成細(xì)胞碎片漂浮于培養(yǎng)液中。
[0035]圖2是青刺果油對結(jié)腸癌細(xì)胞CT-26的抑制效果圖；a為加入0.1%DMS0作用24h后 CT-26細(xì)胞的形態(tài)，b、c、d、e、f分別為加入100、200、300、400、500μg/ml青刺果油作用24h后 CT-26細(xì)胞的形態(tài)。正常CT-26細(xì)胞為貼壁生長，鏡下呈多角形，細(xì)胞形態(tài)較大，胞質(zhì)中顆粒 很少，折光性強(qiáng)。隨著青刺果油濃度的上升，細(xì)胞輪廓增強(qiáng)，折光性變?nèi)?，?xì)胞生長密度略有 降低。細(xì)胞皺縮成圓形，與周圍細(xì)胞的連結(jié)逐漸消失，且異形細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞生長受抑， 隨著藥物濃度增加這種現(xiàn)象越明顯。
[0036] 由圖1和圖2可知，青刺果油對前列腺癌細(xì)胞PC-3和結(jié)腸癌細(xì)胞CT-26具有較好的 抑制效果。
[0037] 實施例3流式細(xì)胞儀測定青刺果油對PC-3和CT-26細(xì)胞周期的影響 1.試驗方法 (1) PC-3、CT-26細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長至培養(yǎng)皿底部70%~80%密度時(此時細(xì)胞處 于對數(shù)生長期），用無血清的培養(yǎng)基對細(xì)胞傳代，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 X 1〇5個/mL; (2) 接種細(xì)胞懸液1 mL于60 mm培養(yǎng)皿，加入不含胎牛血清的培養(yǎng)基3 mL，每組三個平 行，并設(shè)置含〇. 1%DMS0的對照組，置于37 °C、5% C02細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)； (3) 饑餓培養(yǎng)過夜待細(xì)胞貼壁后，棄舊培養(yǎng)基，加入4 mL含不同濃度青刺果油的完全培 養(yǎng)基，使藥物終濃度為300、400、500 yg/mL，并設(shè)加有0.1% DMSO的完全培養(yǎng)基的對照組，繼 續(xù)培養(yǎng)48 h; (4) 倒棄每個培養(yǎng)皿中的舊培養(yǎng)基倒掉，用1 mL PBS清洗后，加入0.25%的胰蛋白酶溶 液500 yL進(jìn)行消化，3-5 min后待細(xì)胞消化完全，加入500 yL完全培養(yǎng)基停止消化，充分混 勻得細(xì)胞懸液，1000 r/min離心5 min收集細(xì)胞； (5) 棄上清，加入1 mL 4°C PBS重懸，輕輕吹打，1000 r/min離心5 min，棄上清； (6) 加入75%冰乙醇1 mL，于4°C固定過夜，次日，1000 r/min離心5 min，棄乙醇，加入1 mL 4°C PBS重懸，1000 rmp/min離心5 min，棄上清； (7) 加入 100 yL RNase A，于37°C水浴30 min; (8) 加入400 yL PI混勻，4°C避光30 min; (9) 轉(zhuǎn)移至流式管，上機(jī)測定細(xì)胞周期，并用Modifit軟件處理數(shù)據(jù)。
[0038] 2.結(jié)果分析 說明書附圖3是青刺果油對前列腺癌細(xì)胞PC-3的細(xì)胞周期阻滯作用圖，附圖4是青刺果 油對結(jié)腸癌細(xì)胞CT-26的細(xì)胞周期阻滯作用圖。本實施例中使用不同濃度的青刺果油處理 雄激素非依賴性前列腺癌PC-3細(xì)胞、結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞48 h后，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 的變化。
[0039] 表3青刺果油對PC-3細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯作用(％，，n=3)
[0040]由上表3可知，隨著青刺果油濃度的增加，分布于S期的細(xì)胞比例逐漸提高，G0/G1 期細(xì)胞比率不斷下降，細(xì)胞分布于G2/M期較少，但同DMS0對照組相比，青刺果油各給藥濃度 組均有顯著性差異(Ρ<〇.〇1)?？梢姡啻坦蛯C-3細(xì)胞阻滯在S期，從而減少在G0/G1和 G2/M期的分布，影響DNA的合成和復(fù)制，從而抑制細(xì)胞分裂和增殖，具有較好的抑癌效果。 [0041 ] 表4青刺果油對CT-26細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯作用(％，，n=3)
[0042] 由上表4可知，隨著青刺果油濃度的增加，分布于S期的細(xì)胞比例逐漸減少，G2/M期 細(xì)胞比率不斷上升，G0/G1期細(xì)胞比率略有上升，但同DMS0對照組相比，除500yg/mL青刺果 油給藥濃度組外，其他給藥組無顯著性差異(P>〇. 05)?？梢?，青刺果油將CT-26細(xì)胞阻滯在 G0/G1和G2/M期，從而減少在S期的分布。
[0043] 由圖2的CT-26細(xì)胞的倒置顯微鏡結(jié)果圖可看出，隨著青刺果油濃度的升高，CT-26 細(xì)胞中死細(xì)胞數(shù)目明顯增多；應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期時亦檢測到較多凋亡的CT-26 細(xì)胞，與倒置顯微鏡結(jié)果一致。因此可得出結(jié)論青刺果油抑制CT-26細(xì)胞的增殖主要是通過 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，即在細(xì)胞還未進(jìn)行分裂復(fù)制的時候便將其殺死，因此細(xì)胞的增殖復(fù)制期S期 分布較少。
【主權(quán)項】
1. 青刺果油在制備治療癌癥藥物中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于，所述癌癥為結(jié)腸癌或前列腺癌。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于，所述藥物制劑中青刺果油的含量為8%~85%。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為青刺果油在制備抑制結(jié)腸癌細(xì)胞 CT-26生長的藥物中的應(yīng)用。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為青刺果油在制備抑制前列腺癌細(xì) 胞PC-3生長的藥物中的應(yīng)用。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于，所述青刺果油由壓榨法、超聲波處理法、超臨 界C02萃取法提取得到。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述應(yīng)用，其特征在于，所述青刺果油由超臨界C02萃取法提取得到。8. 以青刺果油為活性成分的用于治療癌癥的藥物。
【文檔編號】A61P35/00GK105832844SQ201610247562
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月20日
【發(fā)明人】林華慶, 羅程佳, 余楚欽
【申請人】廣東藥學(xué)院