具有血管生成抑制活性的肽和包含所述肽的組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于抑制血管生成的藥物組合物，更具體而言，本發(fā)明涉及有效治療和預(yù)防血管生成相關(guān)疾病的組合物，所述組合物包含源自端粒酶的肽。根據(jù)本發(fā)明，具有本發(fā)明序列編號(hào)的序列的肽、或序列與所述序列或其片段具有80％同源性的肽具有顯著的抑制血管生成的效果。
【專利說(shuō)明】
具有血管生成抑制活性的肽和包含所述肽的組合物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種具有血管生成抑制活性的肽和包含所述肽的藥物組合物。更具體 地，本發(fā)明涉及包含源自端粒酶的肽的用于抑制血管生成的藥物組合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 用于維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的細(xì)胞和組織的增殖、分化和破壞是通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)中的各種 細(xì)胞刺激因子和細(xì)胞之間相互作用的平衡所控制的。當(dāng)在所述調(diào)控中發(fā)生不平衡時(shí)，會(huì)發(fā) 生多種疾病，包括細(xì)胞凋亡或不激活增殖停止信號(hào)、連續(xù)性血管生成的營(yíng)養(yǎng)供給、滲透到周 圍組織而表達(dá)的惡性腫瘤，及轉(zhuǎn)移。
[0003] 血管生成包括細(xì)胞基底膜的降解、細(xì)胞移動(dòng)、細(xì)胞外基質(zhì)的侵襲、細(xì)胞增殖和毛細(xì) 血管內(nèi)皮腔的合成的全部。為了抑制血管生成，存在靶向血管內(nèi)皮細(xì)胞的直接方法來(lái)、和靶 向癌細(xì)胞或產(chǎn)生血管生成因子的周圍細(xì)胞的間接方法。已深入進(jìn)行了以開(kāi)發(fā)抑制血管生成 因子活性的抗體蛋白或阻斷受體的低分子物質(zhì)為目的的研究。
[0004] 通過(guò)包括內(nèi)皮細(xì)胞的移動(dòng)和分裂以產(chǎn)生血管壁的一系列步驟，發(fā)生血管生成。已 知有約15種蛋白激活內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和移動(dòng)，并且它們調(diào)節(jié)血管生成。因此，血管生成可通 過(guò)用于抑制激活蛋白的抑制劑來(lái)抑制，如血管生成素、表皮生長(zhǎng)因子、雌激素、纖維母細(xì)胞 生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞介素8、前列腺素 E1和E2、腫瘤壞死因子、或G-CSF(granulocyte colony-stimulating factor，粒細(xì)胞集落刺激因子）。
[0005] 熱休克蛋白（Heat shock protein，HSP)是在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用的 分子伴侶。它們對(duì)細(xì)胞的存活至關(guān)重要，特別是在諸如缺氧的壓力下。HSP，特別是HSP90和 HSP 70,在多種腫瘤中高表達(dá)[Morano KA，Annals of the New York Academy of Sciences，1113:1-14，2007;Calderwood SK等，Trends in biochemical sciences,31： 164-72,2006]。幾種HSP的表達(dá)已在多種腫瘤中被證實(shí)與腫瘤細(xì)胞增殖、分化和凋亡有關(guān)， 表明HSP因其細(xì)胞保護(hù)作用在癌細(xì)胞的生存中起著至關(guān)重要的作用。HSP70的過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo) 小鼠纖維肉瘤細(xì)胞的致瘤性，HSP70在轉(zhuǎn)基因小鼠 T細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致在所述小鼠中T細(xì) 胞淋巴瘤的增加 [Jaat t e 1 a M, International journal of cancer Journal international du cancer,60：689-93,1995；Seo JS等，Biochemical and biophysical research communications，218:582-7，1996;Volloch VZ等，Oncogene，18:3648-51，1999; Murphy ME，Carcinogenesis，34:1181-8，2013]。特別是，已知HSP70在保護(hù)細(xì)胞免于凋亡中 發(fā)揮重要作用。此外，HSP的過(guò)表達(dá)似乎參與血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移[Calderwood SK等， Trends in biochemical sciences，31:164-72·2006;Zhou J等，The Journal of biological chemistry，279:13506-13,2004;Bruns AF等，PloS one，7:e48539,2012;Sun J等，Arteriosclerosis，thrombosis and vascular biology.24：2238-44,2004；Gong ff 等，Oncology reports，2013;Eustace BK等，Cell cycle，3:1098-100,2004;Eustace BK 等，Nature cell biology，6:507_14,2004]〇
[0006] 基于可以通過(guò)阻斷對(duì)細(xì)胞提供氧和營(yíng)養(yǎng)的血管生成而抑制癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移治愈癌 癥的理論，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出抗血管生成的藥物，其治療不僅用于抗癌，還用于關(guān)節(jié)炎、糖尿病性 視網(wǎng)膜病變、慢性炎癥和缺血性心臟病?？寡苌傻闹委熤苯右种颇[瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移且 間接使腫瘤血管環(huán)境正?；蕴岣咧委熜Ч?，腫瘤血管環(huán)境正常化有效遞送生物和化學(xué)藥 物并改善缺氧環(huán)境。
[0007] 因此，有必要開(kāi)發(fā)抗血管生成藥物以治療或預(yù)防惡性腫瘤、多種疾病（關(guān)節(jié)炎、糖 尿病性視網(wǎng)膜病變、慢性炎癥、缺血性心臟病等）、過(guò)度血管生成相關(guān)腫瘤(癌癥）、心血管疾 病(例如動(dòng)脈粥樣硬化）、慢性炎癥(例如，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或克羅恩氏?。?、糖尿病(例如，糖尿 病性視網(wǎng)膜病變）、銀肩病和子宮內(nèi)膜異位癥。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 技術(shù)問(wèn)題
[0009] 因此，本發(fā)明的發(fā)明人試圖開(kāi)發(fā)一種具有最小的副作用和優(yōu)異的治療效果的用于 抗血管生成的組合物，并且已經(jīng)完成本發(fā)明。
[0010] 本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式的目的是提供一種具有抗血管生成作用的肽，包含所述肽的 組合物，和用于治療血管生成相關(guān)疾病的方法。
[0011] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式的目的是提供一種用于有效抑制腫瘤生成和轉(zhuǎn)移的組 合物。
[0012] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式的目的是提供一種用于治療和預(yù)防血管生成相關(guān)疾病 的組合物。
[0013]技術(shù)方案
[0014] 為了實(shí)現(xiàn)所述目的，在本發(fā)明的實(shí)施方式中，可以提供一種用于抗血管生成的組 合物，所述組合物包含具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的肽、與所述肽具有80%以上同源性 的氨基酸序列的肽、或者所述氨基酸序列的片段。
[0015] 在根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式中的組合物中，所述片段可包含3個(gè)以上氨基酸。
[0016] 在根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式中的組合物中，所述組合物可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、 或血管生成。
[0017]在根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式中的組合物中，所述組合物可抑制由VEGF-A( Vascular endothelial growth factor-A，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A)引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管生 成、或內(nèi)皮細(xì)胞侵襲。
[0018] 在根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式中的組合物中，所述組合物可用于預(yù)防和治療血管生成相 關(guān)疾病。
[0019] 在根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式中的用于抗血管生成的組合物中，所述片段可包含3個(gè)以 上氨基酸。
[0020] 在根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式中的用于抗血管生成的組合物中，所述組合物可用于預(yù)防 或治療腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、角膜移植排斥、新生血 管性青光眼、猩紅熱綜合征、增殖性視網(wǎng)膜病變、銀肩病、黃斑變性、血友病性關(guān)節(jié)病、動(dòng)脈 粥樣硬化斑塊內(nèi)毛細(xì)血管增生、瘢痕瘤、創(chuàng)面肉芽、血管粘連、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性炎癥、 骨關(guān)節(jié)炎、自體免疫疾病、克羅恩氏病、再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化、腸狹窄、貓抓病、潰瘍、肝硬 化并發(fā)癥、腎小球性腎炎、糖尿病性腎病、惡性腎硬化、血栓性微血管綜合征、器官移植排 斥、腎小球病、糖尿病、或炎癥或神經(jīng)退行性病變的不受控制的血管生成相關(guān)病癥或疾病。
[0021] 在根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式中的用于抗血管生成的組合物中，所述組合物可用于預(yù)防 或治療腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。
[0022] 在根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式中的用于抗血管生成的組合物中，所述組合物可用于預(yù)防 或治療過(guò)度血管生成相關(guān)眼病。
[0023] 在根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式中的用于抗血管生成的組合物中，所述眼病可以是糖尿病 性視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、猩紅熱綜合征、增殖 性視網(wǎng)膜病變、銀肩病和黃斑變性。
[0024] 在根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式中的用于抗血管生成的組合物中，所述組合物可抑制血管 內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)誘導(dǎo)的血管化、和血管內(nèi)皮細(xì)胞的侵襲。
[0025] 在根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式中的用于抗血管生成的組合物，所述組合物可以是藥物組 合物。
[0026] 在根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式中的用于抗血管生成的組合物中，所述組合物可以是食品 組合物。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式，可提供一種用于預(yù)防和治療血管生成相關(guān)疾病的方 法，該方法包括將所述組合物施用于受試者的步驟。
[0028] 在根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式中的組合物中，所述血管生成相關(guān)疾病可以是腫瘤生長(zhǎng)和 轉(zhuǎn)移、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、猩紅熱 綜合征、增殖性視網(wǎng)膜病變、銀肩病、黃斑變性、血友病性關(guān)節(jié)病、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)毛細(xì) 血管增生、瘢痕瘤、創(chuàng)面肉芽、血管粘連、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性炎癥、骨關(guān)節(jié)炎、自體免疫疾 病、克羅恩氏病、再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化、腸狹窄、貓抓病、潰瘍、肝硬化并發(fā)癥、腎小球性腎 炎、糖尿病性腎病、惡性腎硬化、血栓性微血管綜合征、器官移植排斥、腎小球病、糖尿病，或 炎癥或神經(jīng)退行性病變的不受控制的血管生成相關(guān)病癥或疾病。
[0029] 在根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式中的組合物中，所述用于治療和預(yù)防血管生成相關(guān) 疾病的方法包含將所述組合物施用于有需要的受試者的步驟。
[0030] 有益效果
[0031] 根據(jù)本發(fā)明，可提供有效抑制血管生成的組合物。因此，根據(jù)本發(fā)明的組合物可用 于治療和預(yù)防血管生成相關(guān)疾病，特別是通過(guò)抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移以及過(guò)度血管生成治療 眼病。
[0032] 此外，具有SEQ ID N0:1的氨基酸序列的肽、與所述肽具有80%以上同源性的氨基 酸序列的肽、或者所述氨基酸序列的片段具有優(yōu)異的抗血管生成效果。
【附圖說(shuō)明】
[0033]圖1和圖2表示PEP1在缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞中抑制HIF-la生成的結(jié)果的照片。MCF7細(xì)胞 和HeLa細(xì)胞在PEP1 (20μΜ)或載質(zhì)處理后，在缺氧環(huán)境中孵育固定的時(shí)間。細(xì)胞裂解產(chǎn)物進(jìn) 行免疫印跡，用于分析HIF-la的量。
[0034] 圖3表示在缺氧環(huán)境中TOP1誘導(dǎo)的抑制VEGF生成的圖。MCF7細(xì)胞和HeLa細(xì)胞以 Ι?Ρ1(20μΜ)或載質(zhì)處理后，在常氧環(huán)境和缺氧環(huán)境中孵育指定的時(shí)間。細(xì)胞培養(yǎng)上清中 VEGF分泌的量通過(guò)ELISA確認(rèn)(與空白組相比分別為，*表示ρ〈0.05，#表示ρ〈0.01，)Κ表示ρ 〈0.001)。
[0035] 圖4和圖5為通過(guò)在腫瘤細(xì)胞中用PEP1處理，HSP70和HSP90下調(diào)的結(jié)果。在無(wú)血清 培養(yǎng)基中，Jurkat細(xì)胞（圖4)和MCF7細(xì)胞（圖5)通過(guò)增加 PEP1或亂序肽的濃度處理2小時(shí)。使 用HSP70、HSP90和GAPDH的抗體進(jìn)行免疫印跡，從而分析HSP70和HSP90肽的量。
[0036] 圖6和圖7為證明在缺氧誘導(dǎo)的環(huán)境中PEP1抑制HSP生成的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。MCF7細(xì)胞和 HeLa細(xì)胞以ΡΕΡ1(20μΜ)或載質(zhì)處理，并在缺氧環(huán)境中孵育一定的時(shí)間。細(xì)胞裂解產(chǎn)物進(jìn)行 免疫印跡，以用于分析HSP70和HSP90的量。
[0037] 圖8顯示Jurkat細(xì)胞和MCF7細(xì)胞通過(guò)載質(zhì)、PEP1、17-AAG和ΚΑΚ437處理的結(jié)果。在 無(wú)血清培養(yǎng)基中，Jurkat細(xì)胞和MCF7細(xì)胞用載質(zhì)、PEP1( Jurkat細(xì)胞5yM，MCF7細(xì)胞20μΜ)、 17-AAG(lyM)和ΚΝΚ437(1μΜ)處理2小時(shí)。細(xì)胞裂解產(chǎn)物通過(guò)與圖4中使用的相同的方法進(jìn)行 免疫印跡分析。
[0038] 圖9是MCF7細(xì)胞在存在或不存在MG132(5yM)時(shí)，用ΡΕΡ1或roS處理的結(jié)果。如材料 和方法所述，細(xì)胞內(nèi)HSP和細(xì)胞外HSP通過(guò)使用表面細(xì)胞內(nèi)染色和表面染色進(jìn)行染色，并且 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析(紅色:DMSP;藍(lán)色:PEP 1+DMS0;橙色:PEP 1+MG132;綠色:MG 132)。
[0039] 圖10和圖11表示在缺氧環(huán)境下通過(guò)PEP1抑制癌細(xì)胞增殖的圖。MCF7細(xì)胞和HeLa細(xì) 胞在常氧環(huán)境(左圖）或缺氧環(huán)境(右圖）中在存在或不存在PEP1的情況下孵育。在孵育的第 2天、第4天、第6天，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)(數(shù)據(jù)用平均值土SD表示，與空白組相比，*表示p〈0.05， 使用單向t-檢驗(yàn)）。
[0040] 圖12和圖13是表示PEP1對(duì)腫瘤細(xì)胞中Tie2+單核細(xì)胞群影響的結(jié)果。Tie2+CDllb+ 單核細(xì)胞群通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)Tie2(綠色，AlexaFlour 488)和CDllb(紅色， AlexaFlour 633)進(jìn)行分析。通過(guò)使用DAPI染色，細(xì)胞核被可視化。比例條表示50μΜ。放大圖 像中的箭頭表示Tie2+CDllb+。巨噬細(xì)胞通過(guò)每hpf表示。從腫瘤組織處理組中每2個(gè)載玻片 中隨機(jī)選擇5個(gè)區(qū)域進(jìn)行定量(*表示p〈0.05，**表示p〈0.01，***表示p〈0.001，使用雙向檢 驗(yàn))。
[0041 ] 圖14至圖16表示通過(guò)PEP1處理，腫瘤中HSP70和HSP90蛋白水平降低的結(jié)果。通過(guò) 使用HSP70和HSP90的抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，HSP70和HSP90蛋白水平被可視化（圖 14)，并且通過(guò)使用Leica Qwin軟件定量（圖15)。從每個(gè)處理組中6個(gè)載玻片中隨機(jī)選擇10 個(gè)區(qū)域進(jìn)行定量(數(shù)據(jù)用平均值土SD表示，與對(duì)照相比，*表示p〈0.05,使用雙向T-檢驗(yàn)）。從 腫瘤中提取的蛋白通過(guò)HSP70、HSP90、GRP78和GAPDH抗體進(jìn)行免疫印跡(圖16)。
[0042]圖17和圖18表示PEP 1對(duì)血液中HSP70分泌水平的影響的結(jié)果。在圖17中，使用從用 PEP 1 (50yg/kg)或roS (每組10只小鼠 ；η = 20)處理的小鼠模型中收集的血清，通過(guò)EL ISA確 認(rèn)HSP70水平(左圖）和HSP90(右圖）。在圖18中，分析HSP70的血液水平和腫瘤的重量(左圖） 或腫瘤的大小（右側(cè)腫瘤)之間的關(guān)系（R 2 = l，與腫瘤重量相比，HSP70顯示P = 0.037,與腫 瘤大小相比，HSP70顯示p = 0.039,使用雙向t-檢驗(yàn)）。
[0043] 圖19至圖21表示通過(guò)PEP1在體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)。MC38細(xì)胞皮下注射到BALB/c無(wú)胸 腺的（Nu/Nu)小鼠（每組10只小鼠 ；η = 20)模型中。PEP 1或roS每2天一次腹腔注射到具有腫 瘤的小鼠模型中。當(dāng)腫瘤的直徑為1 〇mm時(shí)，PEP 1或PBS注射到腫瘤中。在圖19的實(shí)驗(yàn)中，腫瘤 的體積每2天測(cè)量。在圖20的實(shí)驗(yàn)中，在第14天處死所述小鼠后測(cè)量腫瘤重量。摘除的腫瘤 顯示在圖21中（與載質(zhì)相比，*表示口〈0.05，**表示口〈0.01，使用雙向1：-檢驗(yàn)）。
[0044]圖22至圖24表示PEP1施用的小鼠腫瘤的組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果。制備從用PEP1或載質(zhì)處 理的具有腫瘤的小鼠模型中收集的腫瘤細(xì)胞用于免疫組織化學(xué)。在圖22的實(shí)驗(yàn)中，石蠟固 定的切片通過(guò)H&E染色法進(jìn)行染色，并用顯微鏡觀察。在圖23的實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)切片的TUNEL測(cè) 試分析凋亡。在圖24的實(shí)驗(yàn)中，增殖細(xì)胞通過(guò)用PCNA(增殖細(xì)胞核抗原）的抗體進(jìn)行免疫組 織化學(xué)分析。從每個(gè)處理組的6個(gè)載玻片中隨機(jī)選擇10個(gè)區(qū)域進(jìn)行定量，通過(guò)Leica Qwin軟 件分析。
[0045]圖25a和25b表示，在用于評(píng)價(jià)PEP1在人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的抗血管生成作用的 實(shí)驗(yàn)中，在每個(gè)濃度(0.05μΜ、0.5μΜ、5μΜ)的PEP1處理后，通過(guò)測(cè)量細(xì)胞增殖（圖la)和細(xì)胞 活力（圖lb)得到的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制作用的結(jié)果。
[0046]圖26a和26b表示，在用于評(píng)價(jià)PEP1的抗血管生成作用的實(shí)驗(yàn)中，在每個(gè)濃度(0.05 μM、0.5μM、5μM)的PEPl處理血管內(nèi)皮細(xì)胞后，通過(guò)觀察結(jié)果（圖2a)并且繪制圖表（圖2b)得 到的抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞血管化的作用。
[0047]圖27a和圖27b表示，在用于評(píng)價(jià)TOP1的抗血管生成作用的實(shí)驗(yàn)中，在每個(gè)濃度 (0·05μΜ、0·5μΜ、5μΜ)的PEP1處理通過(guò)VEGF-A(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞后， 通過(guò)測(cè)量細(xì)胞增殖（圖3a)和細(xì)胞活力（圖3b)，觀察得到的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制作用的 結(jié)果。
[0048]圖28a和圖28b表示，在用于評(píng)價(jià)TOP1的抗血管生成作用的實(shí)驗(yàn)中，在每個(gè)濃度 (0·05μΜ、0·5μΜ、5μΜ)的PEP1處理通過(guò)VEGF-A(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞后， 通過(guò)觀察結(jié)果（圖4a)并且繪制圖表(圖4b)，得到的血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制血管化的作用。
[0049]圖29是安裝Transwell插入物的模擬圖。
[0050]圖30a和圖30b表示，在用于評(píng)價(jià)TOP 1的抗血管生成作用的實(shí)驗(yàn)中，在每個(gè)濃度 (0·05μΜ、0·5μΜ、5μΜ)的PEP1處理通過(guò)VEGF-A(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞后， 通過(guò)觀察在甲醇固定插入物后和去除所述插入物的上層部分中非侵蝕細(xì)胞后的結(jié)果（圖 6a)并且繪制圖表(圖6b)，得到的抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞侵蝕的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0051] 因?yàn)楸景l(fā)明可適用于多種應(yīng)用領(lǐng)域和進(jìn)行多種變化，接下來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì) 的描述。然而，這并不意味著限定了實(shí)際應(yīng)用的形式;應(yīng)該理解，本發(fā)明的主旨在于包括所 有的變化形式、等同形式或替代形式中的概念和技術(shù)程度。在本發(fā)明的描述中，如果任何關(guān) 于現(xiàn)有技術(shù)的詳細(xì)描述被認(rèn)為會(huì)破壞本發(fā)明的基本原則，則忽略該描述。
[0052] 端粒已知是在染色體末端發(fā)現(xiàn)的遺傳物質(zhì)的重復(fù)序列，其防止染色體損傷或與其 它的染色體合并。端粒的長(zhǎng)度在每次細(xì)胞分裂時(shí)縮短，并且在一定次數(shù)的細(xì)胞分裂后，端粒 長(zhǎng)度極度縮短以致細(xì)胞停止分裂并且死亡。另一方面，已知端粒的延長(zhǎng)會(huì)延長(zhǎng)細(xì)胞壽命。例 如，癌細(xì)胞制造一種稱為端粒酶的酶，其阻止端粒的縮短，因此導(dǎo)致癌細(xì)胞的增殖。本發(fā)明 的發(fā)明人鑒別出一種源自端粒酶的肽可有效地抗血管生成，并且已經(jīng)完成了本發(fā)明。
[0053] 過(guò)度血管生成與諸如癌癥、年齡相關(guān)黃斑變性、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和銀肩病等疾病 相關(guān)。如果有這樣的疾病，其通過(guò)過(guò)度血管生成，使具有疾病的組織制造新的血管破壞正常 組織。在癌癥的情況下，所述新的血管可能使得腫瘤細(xì)胞通過(guò)循環(huán)在其它組織中寄生。
[0054] 這樣的血管生成相關(guān)疾病為腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng) 膜病變、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、猩紅熱綜合征、增殖性視網(wǎng)膜病變、銀肩病、黃 斑變性、血友病性關(guān)節(jié)病、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)毛細(xì)血管增生、瘢痕瘤、創(chuàng)面肉芽、血管粘 連、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性炎癥、骨關(guān)節(jié)炎、自體免疫疾病、克羅恩氏病、再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬 化、腸狹窄、貓抓病、潰瘍、肝硬化并發(fā)癥、腎小球性腎炎、糖尿病性腎病、惡性腎硬化、血栓 性微血管綜合征、器官移植排斥、腎小球病、糖尿病、或例如炎癥或神經(jīng)退行性病變的不受 控制的血管生成相關(guān)疾病，但不限于此。
[0055]因此，作為糖尿病性視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜黃斑變性、新生血管 性青光眼、視網(wǎng)膜靜脈閉塞性疾病、視網(wǎng)膜動(dòng)脈閉塞性疾病、翼板(alar plate)、虹膜炎、視 網(wǎng)膜血管生成、實(shí)體瘤、血管瘤、腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的治療藥物，尋找有用的抗血管生成化合 物對(duì)于尋找許多疾病可廣泛使用的藥物是有意義的。
[0056] HSP90,通過(guò)調(diào)節(jié)對(duì)細(xì)胞活力和腫瘤生長(zhǎng)重要的客戶蛋白（client protein)，與產(chǎn) 生腫瘤密切相關(guān)[Calderwood SK，Trends in biochemical sciences.31，164_72,2006; Garcia-Carbonero R等，The lancet 011(301087，14,6358-69,2013]。所述客戶蛋白的列表 包括酪氨酸激酶受體、信號(hào)傳遞蛋白、細(xì)胞周期蛋白、抗凋亡蛋白等[Garcia-Carbonero R 等，The lancet oncology · 14，e358_69,2013]。對(duì)于所述蛋白，HIF-la(alpha)在缺氧環(huán)境 的誘導(dǎo)血管生成中發(fā)揮重要作用。因此HSP90的過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤血管化的增加 [Sun J等， Arteriosclerosis,thrombosis,and vascular biology.,24：2238-44,2004；Pfosser A 等，Cardiovascular research · 65:728-36 · 2005]。批？70和HSP90均顯示局部在細(xì)胞外裂和 質(zhì)膜中[Ferrarini Μ等，International journal of cancer Journal international du cancer·51:613-9·1992;Vanbuskirk A等，The Journal of experimental medicine.170： 1799-809,1989]，特別是從腫瘤中釋放的HSP70與某些腫瘤的進(jìn)程和不良預(yù)后密切相關(guān) [Yeh CH等，Leukemia research,34：605-9,2010；Kocsis J等，Cell stress&chaperones， 15:143-51，2010]，且發(fā)現(xiàn)HSP70的血清值與HSP70的內(nèi)部值有關(guān)[Dempsey NC等，Journal of leukocyte biology，87:467-76，2010]。同時(shí)，抑制HSP90導(dǎo)致血管生成的減少并且對(duì)癌 細(xì)胞有直接的細(xì)胞病變作用[Ganji PN等，Angiogenesis，16:903-17，2013;Bohonowych JE 等，BMC cancer，11:520，2011 ] ASP70也是用于藥物治療的靶標(biāo)，且開(kāi)發(fā)出一些候選化合物 [Evans CG等，Journal of medicinal chemistry，53:4585-602,2010;Powers MV等，Cell cycle，9:1542-50,2010]。
[0057] 在本發(fā)明中，我們發(fā)現(xiàn)常氧環(huán)境和缺氧環(huán)境中TOPI在癌細(xì)胞生長(zhǎng)中對(duì)HIF-Ια和 VEGF的值的影響，并且通過(guò)使用異種移植小鼠模型評(píng)估PEP1在體內(nèi)的作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0058]在本發(fā)明中，我們確認(rèn)了當(dāng)PEP1處理癌細(xì)胞時(shí)，在缺氧環(huán)境下其減少HIF-la的生 成，并且當(dāng)PEP1處理癌細(xì)胞時(shí)，其降低HSP70和HSP90蛋白的水平。
[0059]在本公開(kāi)的一個(gè)實(shí)施方式中，SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的肽、上述肽的肽片段、 或與上述肽氨基酸序列具有80%以上同一性的氨基酸序列的肽包括端粒酶，特別是，包括 來(lái)源于人類的端粒酶。
[0060] 本文公開(kāi)的肽可包括包含與SEQ ID NO: 1的肽或其片段有至少80%、至少85%、至 少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99 %氨基酸序列同源性的肽。另外， 本發(fā)明公開(kāi)的肽可包括與SEQ ID NO: 1或其片段相差至少1個(gè)氨基酸、至少2個(gè)氨基酸、至少 3個(gè)氨基酸、至少4個(gè)氨基酸、至少5個(gè)氨基酸、至少6個(gè)氨基酸或至少7個(gè)氨基酸的肽。
[0061] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，氨基酸的變化包括肽的物理和化學(xué)性質(zhì)的改變。例 如，可以進(jìn)行氨基酸修飾以改變肽的熱穩(wěn)定性，改變底物特異性，及改變最優(yōu)pH。
[0062] 本文中的術(shù)語(yǔ)"氨基酸"不僅包括天然組成肽的22種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，也可以是D-異構(gòu) 體和修飾的氨基酸。因此，在本發(fā)明的具體的實(shí)施方式中，本文的肽包括具有D型氨基酸的 肽。另外，肽可包括非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，諸如那些被翻譯后修飾的氨基酸。翻譯后修飾的實(shí)例包 括磷酸化、糖基化、?；?包括乙酰化、豆蔻酰化、棕櫚酰化）、烷基化、羧基化、羥基化、糖 化、生物素化、泛素化、化學(xué)性質(zhì)的修飾(例如消除脫酰胺化、脫酰胺化)和結(jié)構(gòu)修飾(例如 二硫鍵的形成）。同時(shí)，氨基酸的變化包括由于在用于形成肽綴合物的采用交聯(lián)劑的結(jié)合過(guò) 程中的化學(xué)反應(yīng)而發(fā)生的氨基酸變化，如氨基、羧基和側(cè)鏈的變化。
[0063]本文公開(kāi)的肽可為從天然來(lái)源中鑒定和分離出的野生型肽。同時(shí)，當(dāng)與SEQ ID NO: 1或其片段比較時(shí)，本文公開(kāi)的肽可以為人工變體，其包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失 和/或插入。野生型多肽(不僅人工變體）的氨基酸變換包括不會(huì)顯著影響活性的蛋白的折 疊和/或氨基酸的保守取代。保守取代的實(shí)例可在以下的組內(nèi)：堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸 和組氨酸）、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸）、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺）、疏水性 氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和甲硫氨酸）、芳香族氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸和酪氨 酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸）。通常不改變特定活性的氨基酸取代是 本領(lǐng)域已知的。最常發(fā)生的變換為 Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、 Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/ 6111^叩/61 7，及其反向變換。保守取代的其它實(shí)例顯示在下表1中：
[0065] 通過(guò)在下述功效中選擇進(jìn)行顯著不同的取代來(lái)進(jìn)行肽的生物性質(zhì)的顯著轉(zhuǎn)化： (a)在取代區(qū)域保持多肽骨架的結(jié)構(gòu)(如片狀或螺旋狀的三維結(jié)構(gòu)）的功效，（b)在靶標(biāo)區(qū)域 保持分子的電荷或疏水性的功效，或(c)保持側(cè)鏈的體積的功效。天然殘基通過(guò)一般側(cè)鏈性 質(zhì)分為以下幾組：
[0066] (1)疏水性：正亮氨酸，met，ala，val，leu，i le;
[0067] (2)中性親水性:cy s，ser，thr;
[0068] (3W^_:asp，glu;
[0069] (4)喊性：&811，區(qū);[11，1118，15^，&坪；
[0070] (5)影響鏈取向的殘基:gly，pro;及
[0071] (6)芳香族：trp，tyr，phe。
[0072] 非保守取代可以通過(guò)將上述類組的成員變換為不同類組的成員來(lái)進(jìn)行。與保持合 適的肽三維結(jié)構(gòu)無(wú)關(guān)的任何半胱氨酸殘基通?？梢员蝗〈鸀榻z氨酸，以此增加分子的氧化 穩(wěn)定性和避免不合適的交聯(lián)。相反，可以通過(guò)對(duì)肽添加半胱氨酸鍵獲得穩(wěn)定性的提高。
[0073]肽的另一種類型的氨基酸變體為那些具有改變的肽糖基化模式的肽。本文的術(shù)語(yǔ) "變化"意味著缺失至少一個(gè)在肽中存在的碳水化合物殘基和/或添加至少一個(gè)在肽中不存 在的糖基化殘基。
[0074]肽的糖基化通常為N連接或者0連接。本文的術(shù)語(yǔ)"N連接"指碳水化合物殘基與天 冬酰胺殘基的側(cè)鏈相連。作為三肽序列，天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X 為除了脯氨酸的任何氨基酸）為用于以酶促方式將糖殘基連接至天冬酰胺側(cè)鏈的識(shí)別序 列。因此，在多肽中存在這樣的三肽序列之一時(shí)，創(chuàng)立了潛在的糖基化位點(diǎn)。"0連接糖基化" 意味著將糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一個(gè)連接至羥基氨基酸。所述羥基氨基酸 最典型為絲氨酸或蘇氨酸，但也可以使用5-羥基脯氨酸或5-羥基賴氨酸。
[0075]通過(guò)改變氨基酸序列以包含上述的三肽序列（對(duì)N連接糖基化位點(diǎn)而言），可方便 地進(jìn)行多肽的糖基化位點(diǎn)的添加。所述變化可以通過(guò)將來(lái)自絲氨酸或蘇氨酸的至少一個(gè)殘 基添加至第一抗體序列或通過(guò)用這些殘基進(jìn)行取代來(lái)進(jìn)行(對(duì)0連接糖基化位點(diǎn)而言）。 [0076]同時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的肽、包含與上述序列具有大 于80%同源性的氨基酸序列的肽、或上述肽的片段具有在生物中低毒性和高穩(wěn)定性的優(yōu) 勢(shì)。本文使用的SEQ ID No: 1為包含16個(gè)氨基酸的端粒酶來(lái)源的肽。
[0077] SEQ ID N0:1中描述的肽與下表1是相同的。表2中的"名稱"用于區(qū)別不同的肽。一 方面，SEQ ID N0:1的肽為人端粒酶的整個(gè)肽。在本發(fā)明的另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，具有 SEQ ID NO: 1的序列的肽、作為具有SEQ ID NO: 1的序列的肽的片段的肽、或者與根據(jù)本公 開(kāi)的肽具有80%以上序列同一性的肽包括通過(guò)選擇和合成相對(duì)于端粒酶內(nèi)的相關(guān)位置的 肽合成的"合成肽"。SEQ ID N0:2是整個(gè)端粒酶的氨基酸序列。
[0078][表 2]
[0079]
[0080] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式提供藥物組合物，所述藥物組合物作為活性成分包含:包 括SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的肽、具有抗血管生成活性的包括與上述序列具有大于80% 同源性的氨基酸序列的肽、或具有抗血管生成活性的上述肽的片段。
[0081] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的用于抗血管生成的組合物可包含0.01g/L至lkg/L、 特別是〇.lg/L至100g/L、更特別是lg/L至10g/L的至少一種包含SEQ ID N0:1的肽、包含與 上述序列具有至少80%序列同源性的氨基酸序列的肽、或上述序列的片段。當(dāng)所述肽包含 在上述范圍內(nèi)，組合物的安全性和穩(wěn)定性均可被滿足，且所述范圍在成本效益方面是合適 的。
[0082] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的組合物可具有包含人、狗、雞、豬、牛、綿羊、豚鼠和 猴的所有動(dòng)物的應(yīng)用。
[0083]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的組合物可提供用于抑制血管生成的藥物組合物，所 述藥物組合物包含:包括SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的肽、包括與上述序列具有大于80%同 源性的氨基酸序列的肽、或上述肽的片段。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的藥物組合物可通 過(guò)口服、直腸、經(jīng)皮、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、骨髓內(nèi)、硬膜外或皮下途徑施用。
[0084] 口服施用的形式可以為但不限于：片劑、丸劑、軟膠囊或硬膠囊、顆粒、粉末、溶液 或乳液。非口服施用的形式可以為但不限于:注射劑、滴劑、洗劑、軟膏、凝膠、乳膏、懸浮液、 乳劑、栓劑、貼劑或噴霧。
[0085] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的藥物組合物在必要時(shí)可包含添加劑，如稀釋劑、賦 形劑、潤(rùn)滑劑、粘合劑、崩解劑、緩沖劑、分散劑、表面活性劑、著色劑、芳香劑或甜味劑。在本 發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述藥物組合物可通過(guò)本領(lǐng)域的傳統(tǒng)工業(yè)方法制造。
[0086] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，所述藥物組合物的活性成分的劑量可根據(jù)患者的年 齡、性別、體重、病理學(xué)和狀態(tài)、施用路徑或處方者的判斷而改變。根據(jù)所述因素的劑量可在 本領(lǐng)域技術(shù)人員的水平內(nèi)確定，且每日劑量例如可為但不限于：1 〇ng/kg/天至1 Omg/kg/天， 特別是0. lyg/kg/天至lmg/kg/天，更特別是lyg/kg/天至100yg/kg/天，更特別是2yg/kg/天 至50yg/kg/天，但如果根據(jù)施用劑量具有不同影響，可以調(diào)整所述劑量。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí) 施方式中，所述藥物組合物可以但不限于每天1至3次施用。
[0087] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，提供用于抗血管生成的食品組合物，所述食品組合 物包含:包括SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的肽、包括與上述序列具有大于80%同源性的氨基 酸序列的肽、或上述肽的片段。
[0088] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，食品組合物不限于特別的形式，但例如可為片劑、顆 粒、粉末、液體和固體形式。每種形式可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇適合的除了所述活性成 分之外的工業(yè)常用成分共同形成，并可與其它成分組合產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。
[0089] 本文使用的術(shù)語(yǔ)旨在用于描述實(shí)施方式，但不限制本發(fā)明。在術(shù)語(yǔ)前面沒(méi)有數(shù)字 并非限制數(shù)量，而是表明可以使用多于一個(gè)該術(shù)語(yǔ)的事物。術(shù)語(yǔ)"包含"、"具有"、"包括"、 "含有"應(yīng)該理解為開(kāi)放式(即"包括但不限于"）。
[0090] 數(shù)值以范圍形式給出的原因僅是因?yàn)橐苑秶枋霰葌€(gè)體的數(shù)字描述方便。除非另 外提出，每個(gè)個(gè)體的數(shù)值可被理解為分別描述并被整合到說(shuō)明書中。所有范圍的閾值都包 括在內(nèi)并且可以獨(dú)立地組合。
[0091] 除非另外提出或語(yǔ)境中明顯矛盾，本文提出的所有方法均以適當(dāng)?shù)捻樞蜻M(jìn)行。除 非其被包含在權(quán)利要求中，使用"任何一個(gè)實(shí)施方式"和"所有實(shí)施方式"或者示例性語(yǔ)言 (例如，"諸如"、"如"）是用來(lái)更清楚地描述本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明的范圍。本文中除了 權(quán)利要求以外的任何語(yǔ)言均不應(yīng)該被解釋為本發(fā)明的必要條件。除非另外限定，此處使用 的科技術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的意義。
[0092] 本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式包括發(fā)明人所知的本發(fā)明的最佳實(shí)施方式。優(yōu)選實(shí)施方式 的變化形式在本領(lǐng)域技術(shù)人員閱讀上述說(shuō)明后可變得顯而易見(jiàn)。本發(fā)明發(fā)明人希望本領(lǐng)域 技術(shù)人員可以充分利用所述變化形式，并且本發(fā)明可以以除了本文所列出以外的其它方式 進(jìn)行實(shí)施。因此，本發(fā)明在專利法允許的情況下包括權(quán)利要求中所陳述的本發(fā)明的關(guān)鍵點(diǎn) 的等同形式、改造形式和變化形式。另外，在上述成分的任何組合內(nèi)的所有可能的變化形式 都包括在本發(fā)明之內(nèi)，除非另有明確聲明或與上下文相悖。雖然已通過(guò)示例性實(shí)施方式描 述并展示了本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以清楚知曉，在不脫離本發(fā)明的主旨和后文權(quán)利要 求所限定的范圍的情況下，可以進(jìn)行形式和細(xì)節(jié)方面的各種變化。
[0093] 在下列實(shí)施方式中，通過(guò)使用人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human umbilical vein endothelial cel 1，HUVEC)，嘗試確認(rèn)PEP1對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管化和細(xì)胞侵襲的直接 抑制作用。
[0094]建立本發(fā)明的實(shí)施方式
[0095]在下文中，將通過(guò)實(shí)施例和測(cè)試?yán)敿?xì)描述本公開(kāi)。但是，下列的實(shí)施例和測(cè)試?yán)?僅以說(shuō)明為目的，并且對(duì)于領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是本公開(kāi)的范圍不受所述實(shí)施例 和測(cè)試?yán)拗啤?br>[0096]實(shí)施例1:肽的合成
[0097] SEQ ID N0:1的肽根據(jù)固相肽合成的傳統(tǒng)已知方法合成。更具體地，利用ASP48S (Peptron, Inc.，Daejeon R0K)，通過(guò)Fmoc固相肽合成（SPPS)從C端偶聯(lián)各氨基酸來(lái)合成所 述肽。如下使用其C端第一個(gè)氨基酸連接在樹(shù)脂上的那些肽：
[0098] NH2-Lys(Boc)-2-氯三苯甲基樹(shù)脂
[0099] NH2-Ala_2-氯三苯甲基樹(shù)脂
[0100] NH2-Arg(Pbf)-2-氯三苯甲基樹(shù)脂
[0101] 用以合成肽的所有氨基酸在N端通過(guò)Fmoc保護(hù)，所述氨基酸殘基通過(guò)能溶解在酸 中的Trt、Boc、t-Bu(叔丁酯）、？匕以2,2,4,6,7-五甲基二氫-苯并呋喃-5-磺酰基)保護(hù)。實(shí)例 包括以下：
[0102] Fmoc-Ala-〇H、Fmoc-Arg(Pbf)-〇H、Fmoc-Glu(OtBu)-〇H、Fmoc-Pr〇-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-〇H、Fmoc-Phe-〇H、Fmoc-Ser(tBu)-〇H、Fmoc-Thr(tBu)-〇H、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-〇H、Fmoc-Trp(Boc)-〇H、Fmoc-Met-〇H、Fmoc-Asn(Trt)-〇H、Fmoc_Tyr (tBu) -OH、Fmoc-Ahx-〇H、Tr t_ 疏基乙酸。
[0103] 作為偶聯(lián)試劑，使用了 HBTU[2-(1H-苯并三唑-1-基)-l，l，3,3-四甲基脲六氟磷酸 酯]/HOBt [ N-羥基苯并三唑]/NMM[ 4-甲基嗎啉]。使用在20 % DMF中的哌啶溶液以移除Fmoc。 為了從殘基上移除保護(hù)基或者將合成的肽從樹(shù)脂上分離，使用了切割混合物[TFA(三氟乙 酸)/TIS(三異丙基硅烷)/EDT(乙二硫醇)/H 20 = 92.5/2.5/2.5]。
[0104] 肽的合成通過(guò)使用固相支架并重復(fù)下列過(guò)程進(jìn)行：以氨基酸的保護(hù)起始，每個(gè)氨 基酸的分離反應(yīng)，用溶劑沖洗和脫保護(hù)。每個(gè)肽的合成通過(guò)使用固相支架以結(jié)合至具有氨 基酸保護(hù)基的起始氨基酸，分別使相應(yīng)的氨基酸反應(yīng)，用溶劑沖洗和脫保護(hù)，并重復(fù)此過(guò) 程。在從樹(shù)脂釋放后，合成的肽通過(guò)HPLC純化，通過(guò)質(zhì)譜驗(yàn)證，凍干，通過(guò)MS來(lái)驗(yàn)證合成，然 后凍干。
[0105] 通過(guò)高效液相色譜發(fā)現(xiàn)所制備的肽的純度為95%以上。
[0106] PEP 1的具體合成過(guò)程可以如下：
[0107] 1)偶聯(lián)
[0108] 用NH2-Lys(B〇C)-2-氯三苯甲基樹(shù)脂保護(hù)的氨基酸(8當(dāng)量)與溶于DMF中的偶聯(lián)試 劑HBTU(8當(dāng)量)/H0Bt(8當(dāng)量)/NMM(16當(dāng)量)混合在一起，并在室溫(RT)孵育2小時(shí)。孵育后， 反應(yīng)混合物依次用DMF、Me0H和DMF沖洗。
[0109] 2)Fmoc 去保護(hù)
[0110] 添加在20%DMF中的哌啶溶液并在RT孵育5分鐘，進(jìn)行2次，然后依次用DMF、Me0H和 DMF沖洗。
[0111] 3)通過(guò)重復(fù)上述的反應(yīng)1)和2)來(lái)制造肽的基本框架，NH2-E(0tBu)-A-R(Pbf)-P- A-L-L-T (tBu) -S (tBu) -R (Pbf) L-R (Pbf) -F-I -P-K (Boc) -2-氯三苯甲基樹(shù)脂。
[0112] 4)切割：向完成合成的肽添加切割混合物，以此將所合成的肽與樹(shù)脂分離。
[0113] 5)將預(yù)冷的乙醚添加至獲得的混合物中，然后離心以使收集的肽沉淀。
[0114] 6)在通過(guò)Prep-HPLC純化后，通過(guò)LC/MS確認(rèn)分子量，并且凍干以制造成粉末形式。
[0115] 實(shí)施例2:細(xì)胞系培養(yǎng)和分析方法
[0116] 細(xì)胞系培養(yǎng)
[0117] MCF7 (人類乳腺腺癌）細(xì)胞系、Jurkat (人類T-淋巴細(xì)胞)細(xì)胞系及MC38 (小鼠結(jié)腸 腺癌）細(xì)胞系保持在添加10%胎牛血清和?οου/ml青霉素和鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中。 HeLa(人類宮頸腺癌）細(xì)胞系保持在添加 10%胎牛血清和100U/ml青霉素和鏈霉素的DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)培養(yǎng)基中。
[0118] 驗(yàn)證缺氧環(huán)境下的蛋白表達(dá)和細(xì)胞生長(zhǎng)
[0119] 為了驗(yàn)證PEP1在缺氧環(huán)境中對(duì)HSP水平的影響，MCF7和HeLa細(xì)胞用20μΜ PEP1處 理，且在缺氧環(huán)境和常氧環(huán)境中孵育。使用BBL GasPak(Becton Dickinson)，其通過(guò)催化反 應(yīng)在90分鐘內(nèi)降低氧氣至不可檢測(cè)水平，從而誘導(dǎo)缺氧環(huán)境。孵育時(shí)間在2至24小時(shí)的范圍 內(nèi)。如上所述，收集細(xì)胞且通過(guò)使用a-HSP70、a-HSP90、a-HIF_la或α-GAPDH的抗體進(jìn)行免疫 印跡。對(duì)于蛋白定量使用a-GAPDH，以GAPDH的量將HSP70/90的量標(biāo)準(zhǔn)化。
[0120] 為了驗(yàn)證PEP1在缺氧環(huán)境中對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，MCF7和HeLa細(xì)胞以1χ104個(gè)細(xì) 胞/孔接種在96孔板中，并且在添加10%FBS的完全培養(yǎng)基(37°C，5%C02)的環(huán)境中培養(yǎng)。在 血清饑餓處理2小時(shí)后，其使用具有或不具有PEP1 (20μΜ)的完全培養(yǎng)基孵育。如上所述，細(xì) 胞在缺氧環(huán)境或常氧環(huán)境中孵育1天至6天。存活細(xì)胞的數(shù)量通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排除染色方法測(cè) 量。重復(fù)所有的計(jì)算實(shí)驗(yàn)。
[0121] 通過(guò)免疫印跡分析HSP70和HSP90蛋白水平的方法
[0122] 接種Jurkat和MCF7細(xì)胞(5χ105)并且孵育12小時(shí)。
[0123] 與附圖中顯示的相同，在通過(guò)添加0ΡΤΙ-ΜΕΜ培養(yǎng)基饑餓處理2小時(shí)后，細(xì)胞用不同 濃度的ΡΕΡ1、亂序肽、l-AAG(lyM)或ΚΝΚ437 (ΙμΜ)處理。2小時(shí)的孵育后，收集細(xì)胞并且使用 細(xì)胞裂解緩沖液（Thermo Scientific，IL，USA)裂解。使用BradfordProtein Assay (Bio-Rad，USA)，對(duì)蛋白濃度定量，所述樣品用SDS-PAGE處理，并使用a-HSP70(sc-32239和8。_ 66048，Santa Cruz，CA，USA)、a-HSP90(abl429，abcam，USA)、a-GRP78(sc-13968)、a-HIF-la (sc-10790)或a-GAroH(sc-25778)抗體進(jìn)行免疫印跡。所述免疫反應(yīng)條帶通過(guò)密集化學(xué)發(fā) 光試劑盒（iNtRoN Biotechnology，INC，Korea)可視化，并且使用ImageQuantTM LAS-4000 (GE Healthcare Life Science，NJ，US)分析。
[0124] 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析HSP70和HSP90蛋白水平的方法。
[0125] MCF7細(xì)胞用PEP1或?qū)φ战M處理。對(duì)于蛋白酶體抑制測(cè)試，在孵育期間，細(xì)胞使用5μ Μ蛋白酶體抑制劑MG132(Calboicam)處理。通過(guò)使用胰蛋白酶，分離細(xì)胞并且使用冰冷的 roS(磷酸鹽緩沖液)和FACS緩沖液(包含1%BSA和0.1%NaN3的roS)沖洗。對(duì)于細(xì)胞內(nèi)染色， 根據(jù)制造商的說(shuō)明將細(xì)胞使用透化緩沖液（681 〇8(^611(^，04，1^4)處理。所述細(xì)胞與€[-HSP70-FITC(ab61907，Abcam)或a-HSP90-PE(ab65171，Abcam)在4°C 反應(yīng)30分鐘。使用 FACScan流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson Co.，CA，USA)完成流式細(xì)胞分析。數(shù)據(jù)使用 FlowjoTM軟件（version 10.0.5，Tree Star，Inc.，0R，USA)進(jìn)行分析。
[0126] 評(píng)估PEP1對(duì)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)影響的方法
[0127] 7周齡的BALB/c無(wú)胸腺小鼠（Nu/Nu)(每組10只小鼠 ；η = 20，雌性，Or i ent B i 〇 0〇.6711叫8丨(1〇，1((^63)在皮下注射小鼠結(jié)腸癌抓38(每個(gè)位點(diǎn)20(^1的51105個(gè)細(xì)胞/1111 PBS)后隨機(jī)分為兩組。PEPl(50yg/kg在100μΙ 0.9%NaCl溶液中）或PBS每2天一次注射到小 鼠中。當(dāng)腫瘤的大小達(dá)到l〇mm時(shí)，注射PEP1和roS到腫瘤內(nèi)部。腫瘤的大小每2天測(cè)量一次， 腫瘤的體積根據(jù)下列公式計(jì)算;體積(mm 3)=((寬度2 X長(zhǎng)度)/2)。所有的實(shí)驗(yàn)通過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 所（College of Medicine,Seoul National University at Seoul，Korea)的批準(zhǔn)。
[0128] 在腫瘤切片中評(píng)估增殖細(xì)胞和凋亡
[0129] 通過(guò)使用福爾馬林固定和石蠟包埋的腫瘤切片評(píng)估腫瘤的凋亡，DNA碎片使用 T u η n e 1檢測(cè)分析。根據(jù)制造商的說(shuō)明，所述腫瘤切片通過(guò)凋亡檢測(cè)試劑盒 (ApopTagPeroxidase In 3;11：11，]\1;[1]^〇代)染色。腫瘤中增殖的細(xì)胞通過(guò)使用？0熟(增殖細(xì) 胞核抗原)檢測(cè)。為了尋找所述抗原，組織切片在1〇μΜ檸檬酸(pH6.0)緩沖液中脫蠟40分鐘， 水合并加熱。組織使用抗小鼠 PCNA單克隆抗體(ab29，Abeam)染色。在抗體的第二次處理與 發(fā)展后，所述組織切片使用H&E染色方法對(duì)比染色。然后，從每個(gè)處理組的6個(gè)載玻片中隨機(jī) 選擇視野，所述視野通過(guò)Leica Qwin軟件分析定量。
[0130]腫瘤中HSP表達(dá)的免疫印跡分析
[0131] 與PCNA染色方法相同，通過(guò)使用免疫組織化學(xué)染色，評(píng)估腫瘤中HSP70和HSP90的 蛋白表達(dá)。使用熱休克蛋白（HSP70;s C-7298，HSP90;abl429)的抗體作為第一抗體。腫瘤 HSP70和HSP90的蛋白表達(dá)使用腫瘤裂解產(chǎn)物進(jìn)行免疫印跡來(lái)評(píng)價(jià)。使用液態(tài)氧冷凍后，使 用研缽破壞腫瘤，并使用提取緩沖液（20mMHEPES，pH7.5、100mMNaCl、0.05%TritonX-100、lmM DTT、0.5mM原釩酸鈉 、ImM EDTA、0.5mM PMSF、10μg/ml抑肽酶、5μg/ml亮抑酶肽、2μ g/ml胃酶抑素)勻衆(zhòng)。在如上所述的重復(fù)離心后，上清液用于SDS-PAGE和免疫印跡。
[0132] ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）分析
[0133] 癌細(xì)胞中VEGF的分泌通過(guò)ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))確認(rèn)。在添加 PEP1或載質(zhì)24 小時(shí)后，MCF7和HeLa細(xì)胞在缺氧環(huán)境或常氧環(huán)境中孵育。根據(jù)制造商的說(shuō)明，細(xì)胞上清液中 VEGF的量通過(guò)人VEGF免疫分析試劑盒(R&D 378七61118，1]34)確認(rèn)。為了分析血液中!^?70和 HSP90的濃度，從具有腫瘤的小鼠模型中收集血液。在制備血清后，血液中HSP70和HSP90的 濃度通過(guò)HSP70免疫分析試劑盒（R&D 878丨61118，1^4)和!《?90免疫分析試劑盒（〇18&1^〇 Biotech co·，Ltd，DE，USA)確認(rèn)。
[0134] 共聚焦顯微鏡分析
[0135] 切片的腫瘤切片在室溫下用4%多聚甲醛固定15分鐘。用PBS沖洗2次，在具有 0.25%Triton X-100的PBS中孵育10分鐘，然后再用PBS沖洗3次。用1%BSA-PBST封閉組織 30分鐘后，組織在4°C濕盒中用小鼠抗Tie2 (557039，BDPharmigen)和抗CD 1 lb(大鼠抗-0)1113抗體，3&8878,31^3111)抗體的混合物孵育。沖洗后，所述組織用41613?1〇1^ 488山羊抗 小鼠 I gG和Ae 1 xaF 1 our 6 3 3山羊抗大鼠 I gG的混合物孵育。為了使細(xì)胞核可視化，用DAP I (Sigma Aldrich)孵育1分鐘，并且使用共聚焦顯微鏡分析。
[0136] 數(shù)據(jù)分析方法
[0137] 對(duì)照組和治療組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較使用學(xué)生t檢驗(yàn)進(jìn)行。當(dāng)P值等于或小于0.05(P <0.05)，認(rèn)為其具有顯著性。
[0138] 實(shí)施例3:驗(yàn)證缺氧誘導(dǎo)的HIF-la和VEGF生成的抑制
[0139] 已知HIF-M缺氧誘導(dǎo)因子Ια)是通過(guò)與缺氧刺激、多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子反應(yīng) 而激活的物質(zhì)。同時(shí)，VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)通過(guò)HIF-la調(diào)節(jié)并且直接刺激血管生成。 [0140] 在這個(gè)實(shí)施例和本發(fā)明中，驗(yàn)證了在缺氧環(huán)境中PEP1對(duì)HIF-la蛋白水平的影響， 并且因?yàn)橐阎狧IF-la用于調(diào)節(jié)VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)生成，驗(yàn)證了 PEP1的處理是否影響 缺氧環(huán)境誘導(dǎo)的VEGF合成。
[0141] 作為HIF-la的表達(dá)水平，MCF7和HeLa細(xì)胞中HIF-la的量在缺氧環(huán)境中隨著時(shí)間的 推移而降低(參見(jiàn)圖1和圖2)。因此，在空白處理的對(duì)照組中，HIF-la的表達(dá)因缺氧環(huán)境而增 加，但是在PEP1處理組的細(xì)胞中顯著降低。
[0142] 作為實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，分泌的VEGF的量因誘導(dǎo)的缺氧環(huán)境而增加。但是，確認(rèn)了分泌的 VEGF的量因 PEP1的處理而減少(參見(jiàn)圖3)。
[0143] 實(shí)施例4:驗(yàn)證PEP1處理對(duì)HSP70和HSP 90表達(dá)的抑制
[0144] 因?yàn)橐阎绊懷苌傻腍IF-la為HSP客戶蛋白，在本實(shí)施例中，確認(rèn)了PEP1是否 影響HSP70和HSP90的蛋白水平。如圖4和圖5中提及，如果用PEP1處理2小時(shí)，其在Jurkat T-細(xì)胞淋巴細(xì)胞和MCF7乳腺癌癥細(xì)胞中均顯著降低HSP70和HSP90。在使用Jurkat細(xì)胞的實(shí)驗(yàn) 中，5μΜ PEP1 降低超過(guò)50 % 的HSP70和HSP90。
[0145] 在MCF7細(xì)胞中，與對(duì)照組比較，5μΜ ΡΕΡ1處理組使HSP90降低超過(guò)20%。與對(duì)照組 比較，20μΜ ΡΕΡ1處理組使HSP70降低至50%。然而，在序列與ΡΕΡ1相似和而不相同的亂序肽 中，所述肽不影響HSP70和HSP90的水平(參見(jiàn)圖4和圖5)。
[0146] 另外，對(duì)HSP70和HSP90進(jìn)行與實(shí)施例3中提及的驗(yàn)證在缺氧環(huán)境下ΡΕΡ1對(duì)HIF-la 的影響的實(shí)驗(yàn)相同的實(shí)驗(yàn)。其結(jié)果顯示在圖6和圖7中。如圖6和圖7所示，驗(yàn)證了在MCF7和 HeLa細(xì)胞中，在空白處理對(duì)照組中HSP70和HSP90的表達(dá)隨著時(shí)間的推移不受影響，而在 PEP1處理組的細(xì)胞中顯著降低。清楚地確認(rèn)了 PEP1的處理導(dǎo)致了 HSP的降解并且調(diào)節(jié)其客 戶蛋白（參見(jiàn)圖1、2、6和7)。所述結(jié)果顯示了PEP1可以通過(guò)降低HSP蛋白的水平影響多種缺 氧環(huán)境相關(guān)的細(xì)胞反應(yīng)。
[0147] 接下來(lái)，PEP1對(duì)HSP抑制的活性分別與作為HSP90和HSP70抑制劑的17-AAG和 KNK437對(duì)HSP抑制的活性進(jìn)行比較。17-AAG通過(guò)抑制HSP90ATP酶活性抑制HSP90[Uehara Y， Current cancer drug七&坪6七8,3:325-30,2003]。1(服437抑制由應(yīng)激誘導(dǎo)的!13?的合成。作 為結(jié)果，在Jurkat和MCF細(xì)胞中，只有PEP 1降低HSP70和HP90的水平(參見(jiàn)圖8)。
[0148] 在Jurkat細(xì)胞中，只有PEP 1降低HSP70和HSP90的蛋白水平，17-AAG和KNK437降低 HSP90的量而不降低HSP70的量。在MCF7細(xì)胞的情況下，PEP1和KNK437均降低HSP90的量和 HSP70的量，而17-AAG對(duì)HSP70和HP90水平顯示出非常輕微的影響。
[0149] 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析更加清楚地驗(yàn)證了 PEP1對(duì)HSP90和HSP70的降低。通過(guò)HSP90 和HSP70的細(xì)胞表面染色和細(xì)胞內(nèi)染色，顯示PEP1的處理對(duì)細(xì)胞表面HSP的影響小于對(duì)細(xì)胞 內(nèi)HSP的影響，但是其在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞質(zhì)中降低HSP90和HSP70(參見(jiàn)圖9)。在用PEP1和蛋白 酶體抑制劑MG132處理的情況下，PEP1的影響消失，表明PEP1可以引起HSP90和HSP70的蛋白 酶體依賴的降解(參見(jiàn)圖9)。
[0150] 實(shí)施例5:驗(yàn)證缺氧環(huán)境和常氧環(huán)境中的腫瘤生長(zhǎng)
[0151] 與實(shí)施例3和4類似，研究了缺氧環(huán)境和常氧環(huán)境中PEP1對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。常氧 環(huán)境中PEP1幾乎不抑制MCF7和HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)，但是在缺氧環(huán)境中其抑制作用顯著增加（參 見(jiàn)圖10和圖11)。
[0152] 實(shí)施例6:在腫瘤中PEP1對(duì)Tie2+單核細(xì)胞募集的影響
[0153] Tie2在血管生成中發(fā)揮重要作用[Du R等，Cancer。611，13:206-20,2008]?；?PEP1可以通過(guò)HSP去穩(wěn)定化抑制HIF-la和VEGF的表達(dá)，進(jìn)行PEP1是否可以募集TEM (Tie2expressing monocyte in tumor，腫瘤中表達(dá)Tie2的單核細(xì)胞）的實(shí)驗(yàn)。在免疫組織 化學(xué)染色的結(jié)果中，確認(rèn)了從PEP1處理小鼠中收集的Tie2+⑶llb+單核細(xì)胞的數(shù)量顯著低于 對(duì)照小鼠腫瘤中的該細(xì)胞數(shù)量(參見(jiàn)圖12和圖13)。顯示PEP 1對(duì)HIF-1 a和VEGF的表達(dá)的抑制 影響對(duì)血管生成至關(guān)重要的TEM的募集。
[0154] 實(shí)施例7:通過(guò)PEP1處理降低腫瘤中的HSP70和HSP90
[0155] 為了驗(yàn)證PEP1是否抑制體內(nèi)HSP70和HSP90的表達(dá)，以a-HSP70或a-HSP90抗體進(jìn)行 免疫組織化學(xué)染色。與從癌細(xì)胞系獲得的數(shù)據(jù)一致，當(dāng)與roS處理對(duì)照組比較時(shí)，從PEP1處 理組收集的腫瘤切片顯示更弱的染色模式(參見(jiàn)圖14) WEP1處理的樣本中陽(yáng)性染色部分與 對(duì)照組相比是非常小的（參見(jiàn)圖15)。
[0156] 使用腫瘤裂解產(chǎn)物通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了在PEP1處理腫瘤樣本中HSP70和 HSP90蛋白水平的降低。在全部三個(gè)PEP1處理腫瘤樣本中均觀察到HSP70和HSP90的降低(參 見(jiàn)圖16)。特別是在PEP1處理樣本中幾乎未發(fā)現(xiàn)HSP90。作為HSP的其它家族，GRP78在PEP1處 理樣本中也有所降低。綜合來(lái)看，這些結(jié)果證明了 PEP1在體內(nèi)系統(tǒng)中降低HSP并且具有抑制 腫瘤生長(zhǎng)的能力。
[0157] 實(shí)施例8:PEP1對(duì)血液中分泌的HSP70水平的影響
[0158] HSP70和HSP90可以從腫瘤細(xì)胞中分泌，最近的研究顯示了它們?cè)谀[瘤形成和抗腫 瘤反應(yīng)中的數(shù)種作用。在HSP90和HSP70的分泌中，為了更加詳細(xì)的說(shuō)明PEP 1的作用，測(cè)量了 從具有腫瘤的小鼠中收集的血液的HSP70和HSP90的濃度。盡管在PEP1處理組和對(duì)照組之間 分泌的HSP90的水平?jīng)]有變化，但是PEP1處理小鼠的HSP70水平比對(duì)照組要低(參見(jiàn)圖17)。
[0159] 同時(shí)，較低的HSP70水平與腫瘤的量和腫瘤的重量有關(guān)(參見(jiàn)圖18)。
[0160] 實(shí)施例9: PEP1對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制
[0161] 上述實(shí)施例的結(jié)果顯示PEP1對(duì)HSP90和HSP70功能的抑制作用，其提示PEP1與其它 的HSP抑制劑一樣具有潛在的腫瘤抑制作用。
[0162] 因此，在此實(shí)施例中，通過(guò)使用小鼠模型研究了PEP1在體內(nèi)對(duì)腫瘤的抑制作用。在 體內(nèi)分析了存在或者不存在PEP1處理時(shí)，MC38小鼠腫瘤細(xì)胞中的腫瘤生長(zhǎng)。觀察到在PEP1 處理組和對(duì)照組之間腫瘤的量的顯著差異（參見(jiàn)圖19)。在注射后的第18天，觀察到對(duì)照組 腫瘤的平均量是PEP1處理組的3倍。綜合地說(shuō)，對(duì)照組的腫瘤重量比PEP1處理組高出許多， 且所述結(jié)果顯示PEP1可以抑制體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)(參見(jiàn)圖20和21)。
[0163] 實(shí)施例10:從PEP1處理小鼠中收集的腫瘤的組織學(xué)檢測(cè)
[0164] 利用H&E(Hematoxylin and Eosin)染色的組織學(xué)檢測(cè)顯示，與對(duì)照組相比，PEP1 處理小鼠的組織切片具有更多的空腔。提示在PEP1處理小鼠的腫瘤中發(fā)生了更多的凋亡 (參見(jiàn)圖22)。同時(shí)從PEP1處理小鼠中收集的腫瘤中檢測(cè)到更少的血管化。其意味著PEP1與 其它的HSP抑制劑類似，具有抑制血管生成的作用（參見(jiàn)圖22)。細(xì)胞凋亡的進(jìn)程可以通過(guò) TUNEL染色觀察，其無(wú)疑確定了 PEP1的抗癌作用。如圖23所示，與對(duì)照組的腫瘤相比，檢測(cè)到 PEP1處理的腫瘤樣品中顯著高水平的細(xì)胞凋亡。同時(shí)，用于檢測(cè)PCNA增殖的腫瘤切片染色 清楚顯示PEP1處理組細(xì)胞增殖的減少(參見(jiàn)圖24)。
[0165] 實(shí)施例11:驗(yàn)證血管內(nèi)皮細(xì)胞中PEP1對(duì)細(xì)胞增殖和血管生成的抑制作用
[0166] 1)細(xì)胞培養(yǎng)
[0167] 在此實(shí)施例中，人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在EGM-2培養(yǎng)基中培養(yǎng)，且僅選擇2-5個(gè)周期 的血管內(nèi)皮細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
[0168] 2)材料
[0169] 作為實(shí)驗(yàn)材料，分別購(gòu)買人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(LonZa，Walkersville，MD，USA)和 VEGF-A(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A，Merck Millipore，Billerica，MA，USA)。PEPl溶解在PBS(磷酸 鹽緩沖液，pH 7.4)中并使用。
[0170] 3)分析血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及其影響
[0171] 血管內(nèi)皮細(xì)胞以lxlO5個(gè)細(xì)胞/孔接種在6孔板(BD Biosciences，Bedford，MA， USA)上。所述細(xì)胞通過(guò)基礎(chǔ)EBM-2培養(yǎng)基(Lonza)(不含血清和血管生成因子）同步化，用各 個(gè)濃度(0.05μM、0.5μM、5μM)的PEPl處理，并用EGM-2培養(yǎng)基刺激，以觀察細(xì)胞增殖的抑制作 用。
[0172] 為了檢測(cè)細(xì)胞增殖，使用臺(tái)盼藍(lán)染色溶液（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，細(xì)胞 直接在顯微鏡（X 100)下計(jì)數(shù)，細(xì)胞活力通過(guò)使用活力分析試劑盒(Merck Millipore Inc.)用Muse ?分析儀分析。
[0173] PEP1以濃度依賴方式抑制通過(guò)包括多種血管生成誘導(dǎo)物的EGM-2培養(yǎng)基刺激的血 管內(nèi)皮細(xì)胞（圖la)，且其根本不影響細(xì)胞存活率（圖lb)。其提示PEP1有效抑制血管內(nèi)皮細(xì) 胞增殖且沒(méi)有細(xì)胞毒性。
[0174] 4)分析血管內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮血管形成和作用
[0175] 在用 SOOylM.atrigrl·* 基底膜基質(zhì)（10.4mg/mL，BD 13;[08(^11068)在37<€包被30分鐘 的24孔板上，接種血管內(nèi)皮細(xì)胞，并且在基礎(chǔ)EBM-2培養(yǎng)基中血清饑餓2小時(shí)。使用奧林巴斯 CKX41 倒置顯微鏡（CAchN 10/0.25php物鏡，Olympus Optical Co.，Tokyo，Japan)和 1'0卯161^1'0卯￥丨6￥軟件(>618；[011186,3.5.563，中國(guó)浙江杭州圖譜光電科技有限公司）觀 察血管形成的變化(圖2a)。
[0176] 提示PEP1以濃度依賴方式抑制通過(guò)包括多種血管生成誘導(dǎo)物的EGM-2培養(yǎng)基刺激 的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的血管形成（圖2b)，并且因此能夠通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞的移動(dòng)和分化抑 制血管生成。
[0177] 實(shí)施例12:驗(yàn)證PEP1對(duì)VEGF-A刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、血管生成和侵襲的抑 制
[0178] 1)分析血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)VEGF-A刺激的增殖和存活率及作用
[0179] 血管內(nèi)皮細(xì)胞以lxlO5個(gè)細(xì)胞/孔接種在6孔板(BD Biosciences，Bedford，MA， USA)上。所述細(xì)胞通過(guò)基礎(chǔ)EBM-2培養(yǎng)基(Lonza)(不含血清和血管生成因子）同步化，用各 個(gè)濃度(0 · 05μΜ、0 · 5μΜ、5μΜ)的PEP1處理，并用VEGF-A( 10ng/mL)刺激24小時(shí)，以觀察細(xì)胞增 殖的抑制作用。
[0180] 為了檢測(cè)細(xì)胞增殖，使用臺(tái)盼藍(lán)染色溶液（Invi trogen，Carl sbad，CA，USA)，細(xì)胞 直接在顯微鏡（X 100)下計(jì)數(shù)，細(xì)胞活力通過(guò)使用活力分析試劑盒(Merck Mi 11 ipore Inc.)用Muse ?分析儀分析。
[0181 ] PEP1以濃度依賴方式，與包括多種血管生成誘導(dǎo)物的EGM-2培養(yǎng)基條件類似，抑制 由VEGF-A刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，但不影響細(xì)胞存活率(圖3b)。
[0182] 2)分析VEGF-A刺激的內(nèi)皮血管形成及影響
[0183] 在用200ylMairigr產(chǎn)基底膜基質(zhì)（10.4mg/mL，BD Biosciences)在37°C包被30分鐘 的24孔板上，接種血管內(nèi)皮細(xì)胞(4xl04個(gè)細(xì)胞/孔），并且在基礎(chǔ)EBM-2培養(yǎng)基中血清饑餓2 小時(shí)。在用各個(gè)濃度(〇. 〇5μΜ、0.5μΜ、5μΜ)的PEP1處理后，細(xì)胞使用VEGF-A(10ng/mL)刺激6 小時(shí)。使用奧林巴斯CKX41倒置顯微鏡（CAchN 10/0.25php物鏡，Olympus Optical Co.， Tokyo，Japan)和ToupTek Toupview軟件（version x86，3 · 5· 563，中國(guó)浙江杭州圖譜光電科 技有限公司）觀察血管形成的變化(圖4a)。
[0184] 驗(yàn)證了 PEP 1以濃度依賴方式在血管內(nèi)皮細(xì)胞中抑制由VEGF-A刺激的內(nèi)皮血管形 成（圖4b)。
[0185] 3)分析VEGF-A刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞侵襲及其影響
[0186] 通過(guò)基礎(chǔ)EBM-2培養(yǎng)基血清饑餓2小時(shí)的血管內(nèi)皮細(xì)胞每100mL(4xl05個(gè)細(xì)胞/mL) 接種在Matri.gel?:( lmg/mL，BD Biosciences)包被的transwell插入物中（Costar，6 · 5mm直 徑），添加600μ1基礎(chǔ)EBM-2培養(yǎng)基至底孔。安裝的插入物的模擬圖顯示在圖5中。
[0187] 在用各個(gè)濃度（0·05μM、0·5μM、5μM)的PEPl處理后，使用VEGF-A(10ng/mL)刺激18 小時(shí)，插入物用甲醇固定并且使用棉簽拭子去除插入物的上層非穿孔細(xì)胞。在通過(guò)Giemsa 染色溶液(Sigma-Aldrich Co.，3丨丄〇11丨8，10，1^4)染色后，使用顯微鏡（\200)觀察6個(gè)不 同的部分，穿孔的細(xì)胞使用顯微鏡直接計(jì)數(shù)(圖6a)。
[0188] 驗(yàn)證了PEP1強(qiáng)烈抑制VEGF-A刺激的細(xì)胞侵襲(圖6b)。
[0189] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性使用學(xué)生t檢驗(yàn)分析，當(dāng)P值小于0.05時(shí)定義為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯 著的值。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于抗血管生成的組合物，所述組合物包含:具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的 肽、與所述肽具有80%以上同源性的氨基酸序列的肽、或者所述氨基酸序列的片段。2. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述片段包含3個(gè)以上氨基酸。3. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述組合物用于預(yù)防或治療腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移、糖 尿病性視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、猩紅熱綜合征、 增殖性視網(wǎng)膜病變、銀肩病、黃斑變性、血友病性關(guān)節(jié)病、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)毛細(xì)血管增 生、瘢痕瘤、創(chuàng)面肉芽、血管粘連、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性炎癥、骨關(guān)節(jié)炎、自體免疫疾病、克 羅恩氏病、再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化、腸狹窄、貓抓病、潰瘍、肝硬化并發(fā)癥、腎小球性腎炎、糖 尿病性腎病、惡性腎硬化、血栓性微血管綜合征、器官移植排斥、腎小球病、糖尿病、或炎癥 或神經(jīng)退行性病變的不受控制的血管生成相關(guān)病癥或疾病。4. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述組合物用于預(yù)防或治療腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。5. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述組合物用于預(yù)防或治療過(guò)度血管生成相關(guān)眼 病。6. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述眼病是糖尿病性視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜 病變、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、猩紅熱綜合征、增殖性視網(wǎng)膜病變、銀肩病或黃斑 變性。7. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述組合物特征在于抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、 VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)誘導(dǎo)的血管形成、和血管內(nèi)皮細(xì)胞的侵襲。8. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述組合物是藥物組合物。9. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述組合物是食品組合物。10. -種用于治療和預(yù)防血管生成相關(guān)疾病的方法，其中，所述方法包括將權(quán)利要求1 至9中任一項(xiàng)所述的組合物施用于受試者的步驟。11. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述組合物抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖或血管形 成。12. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述組合物抑制VEGF-A(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A) 引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管形成、或血管內(nèi)皮細(xì)胞的侵襲。13. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述組合物用于預(yù)防和治療血管生成相關(guān)疾病。14. 如權(quán)利要求13所述的組合物，其中，所述疾病為腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移、糖尿病性視網(wǎng)膜 病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、猩紅熱綜合征、增殖性視網(wǎng)膜 病變、銀肩病、黃斑變性、血友病性關(guān)節(jié)病、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)毛細(xì)血管增生、瘢痕瘤、創(chuàng) 面肉芽、血管粘連、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性炎癥、骨關(guān)節(jié)炎、自體免疫疾病、克羅恩氏病、再狹 窄、動(dòng)脈粥樣硬化、腸狹窄、貓抓病、潰瘍、肝硬化并發(fā)癥、腎小球性腎炎、糖尿病性腎病、惡 性腎硬化、血栓性微血管綜合征、器官移植排斥、腎小球病、糖尿病、或炎癥或神經(jīng)退行性病 變的不受控制的血管生成相關(guān)病癥或疾病。15. -種用于治療和預(yù)防血管生成相關(guān)疾病的方法，其中，所述方法包含將權(quán)利要求1 至2和權(quán)利要求11至14中任一項(xiàng)所述的組合物施用于受試者的步驟。
【文檔編號(hào)】A61K38/17GK105848667SQ201480070167
【公開(kāi)日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2014年11月21日
【發(fā)明人】金商在
【申請(qǐng)人】杰姆維克斯&凱爾有限公司, 金商在