一種石蒜生物堿靶向緩釋制劑及其制備方法和用圖
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種石蒜生物堿靶向緩釋制劑及其制備方法和用途。本發(fā)明的石蒜生物堿靶向緩釋制劑是由石蒜生物堿、丙炔?；瘹ぞ厶呛途哂携B氮探針的低密度脂蛋白組成，三者的摩爾比為1:(0.1～1):(0.1～2)。本發(fā)明選取血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞的LDL受體作為傳輸石蒜生物堿來(lái)治療AD的靶點(diǎn)，以生物相容性很好的殼聚糖作為藥物載體材料，研制低毒高效的石蒜生物堿納米腦靶向制劑，填補(bǔ)了目前石蒜生物堿作為AD治療藥物的臨床應(yīng)用前研究的一些空白。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種石蒜生物堿靶向緩釋制劑及其制備方法和用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種石蒜生物堿靶向緩釋制劑及其制備方法 和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 老年性癡呆(Alzheimer ' s disease， AD)是一種以記憶缺損和認(rèn)知障礙為主要臨 床表現(xiàn)的老年性神經(jīng)退行性疾病，其病理特征為細(xì)胞外淀粉樣肽(0-Amyloid peptide，A0) 大量沉積為主的老年斑（Seni 1 eplaques，SP)、細(xì)胞內(nèi)磷酸化的tau蛋白為主的神經(jīng)纖維纏 結(jié)(Neurofibri 1 lary tangles，NFT)和膽堿能神經(jīng)元為主的中樞神經(jīng)細(xì)胞的大量變性和丟 失。雖然AD的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但膽堿能假說(shuō)和AP假說(shuō)最受關(guān)注。
[0003] 目前，AD藥物治療尤其是改善認(rèn)知功能的藥物仍以抗乙酰膽堿酯酶制劑為主，已 有幾種合成藥物，例如他克林(tacrine)，多奈哌齊(donepezil)和基于天然產(chǎn)物的卡巴拉 汀(rivastigmine)被用來(lái)治療由AD引起的認(rèn)知功能障礙和記憶力減退，從中草藥石蒜中提 取的加蘭他敏和其他的石蒜生物堿也被證實(shí)具有抑制乙酰膽堿酯酶的作用。但這些化合物 引起胃腸道紊亂、肝臟和全身毒副作用大及存在生物利用度低問(wèn)題。因此，研究人員必須在 自然資源中尋找更好的乙酰膽堿酯酶抑制劑和其他抗癡呆藥物。
[0004] 石蒜（Lycoris Herb?)屬于單子葉植物綱石蒜科(Amaryllidaceae)植物，有20多 種，主要分布于亞洲，在我國(guó)石蒜有16種(含2變種），其中有12種為世界上特有種。在我國(guó)的 石蒜資源主要處于野生狀態(tài)，分布于長(zhǎng)江流域至華東、華南、西南、西北地區(qū)等16個(gè)省區(qū)； 其分布區(qū)域無(wú)論是經(jīng)煒度還是海拔高度都相當(dāng)廣泛，其分布區(qū)內(nèi)氣候和土壤條件差異很 大，可見(jiàn)石蒜類(lèi)植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力強(qiáng)。
[0005] 力可拉敏是一種石蒜生物堿，又稱(chēng)石蒜胺堿。片狀結(jié)晶（丙酮），易溶于水，溶于乙 醇，其鹽易水解。存在于石蕊科植物石蒜（Lycoris radiate Herb)的鱗莖，紫花石蕊 (L. squamigera Maxim)的鱗莖，鐵色箭(L. sanguinea Maxim.)的鱗莖。有抑制膽堿酯酶的 作用，對(duì)中樞性M-及N-膽堿能受體有興奮作用。
[0006] 迄今為止，對(duì)力可拉敏的藥理，特別是膽堿酯酶的抑制作用國(guó)內(nèi)外都有了些研究； 此外，從石蒜資源中提取、或者化學(xué)合成方面的研究開(kāi)展的比較多;并研究了含量的測(cè)量方 法，有高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法、薄層層析及紙層析鑒別法 和紫外分光光度法。
[0007] 研究表明：石蒜多種生物堿均具有膽堿酯酶抑制作用，其中加蘭他敏已在美國(guó)等 多個(gè)國(guó)家被批準(zhǔn)用于老年性癡呆的治療，但其體內(nèi)分布廣泛、存在較多的外周副作用，特別 是西方國(guó)家報(bào)道有增加中老年人死亡的風(fēng)險(xiǎn)，因而臨床使用受限。石蒜三種主要生物堿加 蘭他敏、石蒜堿、力可拉敏中，除加蘭他敏外，其他生物堿尚無(wú)用于老年性癡呆的研究。而對(duì) 于如何增強(qiáng)力可拉敏血腦屏障通透性與腦靶向性、提高生物利用度、降低其毒副作用的研 究尚屬罕見(jiàn)。本發(fā)明基于低密度脂蛋白（LDL)受體為靶點(diǎn)，進(jìn)行力可拉敏腦靶向納米藥物的 腦靶向研究，來(lái)填補(bǔ)這一空白，為力可拉敏的臨床應(yīng)用提供一定的研究基礎(chǔ)。
[0008] 血腦屏障（blood-brain barrier，BBB)的存在對(duì)腦組織形成有效保護(hù)，避免有害 物質(zhì)（如毒素和病毒等）的侵害，但也阻礙許多治療藥物進(jìn)入腦部病灶區(qū)，如抗癌藥、抗生 素和大分子物質(zhì)(肽類(lèi))等。如何使藥物有效透過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦內(nèi)成為藥物發(fā)揮治療作用 的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前解決這一難題的方法有:制備前體藥物、打開(kāi)血腦屏障緊密結(jié)構(gòu)或使用載 體系統(tǒng)如抗體、脂質(zhì)體、納米粒等。
[0009] 納米粒載體由一些多聚體顆粒制備而成，藥物可通過(guò)吸附、包裹或共價(jià)結(jié)合等方 式結(jié)合到納米粒表面，形成載藥納米粒。載體體系遞送至靶組織后，藥物通過(guò)解吸、擴(kuò)散以 及納米粒降解等機(jī)制釋放;載藥納米粒經(jīng)過(guò)表面修飾后，可避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬，使藥物 有效透過(guò)血腦屏障，提高藥物的腦內(nèi)濃度。
[0010] Kreuter提出載藥納米粒透過(guò)血腦屏障的可能機(jī)制為：（1)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞可通過(guò) 胞吞作用攜帶納米粒，使藥物擴(kuò)散入腦；（2)吸附于腦毛細(xì)血管壁，延長(zhǎng)藥物在毛細(xì)血管壁 的滯留時(shí)間并提高血管內(nèi)外藥物的濃度梯度，從而通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散促進(jìn)藥物通過(guò)血管內(nèi)皮進(jìn) 入腦內(nèi)；（3)納米粒表面活性劑聚山梨酯-80能夠抑制高效外排栗的作用，尤其是抑制P-糖 蛋白（P-glycoprotein，P-gp)的外排作用，從而延長(zhǎng)藥物活性；（4)使血腦屏障的緊密連接 開(kāi)放，從而使藥物入腦；（5)通過(guò)跨膜方式透過(guò)血腦屏障并釋放藥物入腦；（6)納米粒表面活 性物質(zhì)可提高血管內(nèi)皮細(xì)胞膜脂質(zhì)的溶解度，使膜流動(dòng)性增加，提高血腦屏障對(duì)藥物的通 透性。
[0011] 目前，細(xì)胞胞吞作用是研究最多，也是載藥納米粒入腦最有可能的機(jī)制。它包括受 體介導(dǎo)的胞吞作用和吸附介導(dǎo)的胞吞作用。關(guān)于受體介導(dǎo)的胞吞作用，如胰島素受體、葉酸 受體及轉(zhuǎn)鐵蛋白受體等受關(guān)注。由于某些轉(zhuǎn)運(yùn)體在腦內(nèi)皮細(xì)胞上也呈高表達(dá)，其本身可允 許一些重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入腦內(nèi)，維持腦中內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，故可通過(guò)這些轉(zhuǎn)運(yùn)體使靶向治療 藥物入腦。目前相關(guān)的研究報(bào)道有葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體、膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)體等，載藥納米?？膳c其結(jié)合透 過(guò)血腦屏障到達(dá)腦內(nèi)。
[0012] 目前關(guān)于納米技術(shù)在AD上的應(yīng)用，主要是診斷和從氧化應(yīng)激方面用金屬綴合物納 米顆粒進(jìn)行治療AD。采用納米技術(shù)從抑制AchE來(lái)治療AD的報(bào)道很少，2008年Wilson等人利 用1%聚山梨酯-80包裹聚氰基丙烯酸正丁酯納米顆粒來(lái)傳輸卡巴拉汀用于治療AD，發(fā)現(xiàn)卡 巴拉汀的腦內(nèi)濃度比無(wú)載體的情況下高出3.82倍。因此，對(duì)高效負(fù)載藥物且具有腦靶向性 的載體進(jìn)行的研究是目前欠缺而又具有研究意義和應(yīng)用價(jià)值的科學(xué)研究。
[0013]在體外血腦屏障模型中，Dehouck等研究發(fā)現(xiàn)對(duì)比乙酰化LDL，酰化前的LDL能夠被 模型的細(xì)胞層胞吞。這一過(guò)程能夠被C7單克隆抗體阻斷，說(shuō)明該過(guò)程與LDL受體有關(guān)。而且 Dehouck等發(fā)現(xiàn)胞吞量與LDL受體表達(dá)的上調(diào)成正比。Kreuter等推測(cè)納米粒經(jīng)包裹聚山梨 酯后，血漿中ApoE吸附到納米粒表面(ApoE通常只吸附于被表面活性劑包被的納米粒)并與 血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞的低密度脂蛋白（LDL)受體作用后，被腦內(nèi)皮細(xì)胞識(shí)別和攝取，隨后藥物 在內(nèi)皮細(xì)胞中釋放，并擴(kuò)散至腦組織。Michaelis等和Kim等近幾年的先后研究也證實(shí)了這 個(gè)假說(shuō)。因此，我們選取血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞的LDL受體作為傳輸力可拉敏來(lái)治療AD的靶點(diǎn)。 希望能夠通過(guò)LDL與其受體的特異性結(jié)合將力可拉敏靶向性輸送到腦內(nèi)，高效治療AD。
[0014]脂蛋白是指一類(lèi)由類(lèi)脂體與蛋白構(gòu)成的大分子聚集體。其外形近乎球形，組成包 含類(lèi)脂體(甘油三酯和膽固醇酯）構(gòu)成的核心、磷脂膜和嵌在膜上的未酯化膽固醇與蛋白。 機(jī)體可將疏水性的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)脂蛋白運(yùn)送給細(xì)胞。載酯蛋白ApoB-100是LDL上唯一的蛋 白，LDL上能被LDL受體識(shí)別的配體。
[0015] LDL被視為脂質(zhì)體的天然搭檔，具有脂質(zhì)核心，可被應(yīng)用于藥物載體的研究中。LDL 作為靶向因子在腫瘤診斷（負(fù)載顯影劑）、抗腫瘤藥物和基因載體等領(lǐng)域得到過(guò)應(yīng)用。如法 國(guó)Paul Sabatier大學(xué)Francoise Nepveu研究小組提出將與In絡(luò)合的分子中接上一段疏水 鏈段，將疏水鏈段作為"鉚釘"插入LDL的磷脂單分子層，達(dá)到靶向輸送In造影劑到癌細(xì)胞以 增強(qiáng)造影效果的目的。美國(guó)Pennsylvania大學(xué)Rong Zhou研究小組利用該方法制備了LDL介 導(dǎo)靶向Gd造影劑，并用活體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了這種靶向造影劑造影增強(qiáng)效果。
[0016] 盡管用途不同，但是根據(jù)治療因子與LDL復(fù)合物形成的方法，認(rèn)為這些研究主要分 為兩種類(lèi)型：1:治療因子通過(guò)疏水鏈插入LDL磷脂層，從而"錨定"在LDL表面上（"鉚釘法"； 2:萃取LDL的類(lèi)脂體再用脂溶性的藥物重組LDL( "重組法"）。
[0017]含疏水側(cè)鏈的大分子同樣存在"嵌入"LDL可能。Jin-Seok Kim等人研究了由帶硬 脂基側(cè)鏈的聚賴(lài)氨酸/LDL/DNA所形成的"Terplex"體系作為DNA載體的應(yīng)用。體系間主要是 通過(guò)疏水聚賴(lài)氨酸、LDL和質(zhì)粒DNA之間的電荷/疏水力平衡達(dá)到穩(wěn)定，在組成比合適的情況 下并不會(huì)發(fā)生沉淀。這一體系對(duì)平滑肌A7R5細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率甚至超過(guò)了Lipofectin相當(dāng)（高 出2.2倍），在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)"Terplex"的胞吞是經(jīng)由LDL受體介導(dǎo)的。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 在不同細(xì)胞系（CCD-32LU成纖維細(xì)胞)這一體系仍然可以被用作DNA載體。然而需要注意的 是，聚合物與LDL之間的比例非常重要，否則會(huì)造成聚合物完全覆蓋LDL。
[0018] "重組法"是將LDL中心的膽固醇脂萃取出來(lái)，再把藥物填入LDL的磷脂單分子層空 殼中，這種"重組法"弊端是工序繁瑣，蛋白質(zhì)收率不高，且整個(gè)過(guò)程可能會(huì)破壞LDL的結(jié)構(gòu)， 而且要求對(duì)親水藥物進(jìn)行疏水改性。
[0019]以上研究結(jié)果顯示LDL作為靶向因子的作用主要是LDL表面的載酯蛋白在發(fā)揮作 用，而如何保護(hù)載酯蛋白ApoB-100使其充分暴露在細(xì)胞膜受體表面也是LDL實(shí)現(xiàn)靶向的關(guān) 鍵。
[0020]因此，本發(fā)明提出一個(gè)新的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)LDL對(duì)力可拉敏的高效負(fù)載，并盡可能保護(hù) 載酯蛋白使其充分暴露在LDL表面從而實(shí)現(xiàn)靶向功能。這一過(guò)程分為兩步:首先是利用帶有 疊氮功能基團(tuán)的小分子疏水探針插入LDL，實(shí)現(xiàn)對(duì)LDL表面的修飾。用體積比較小的分子對(duì) LDL表面進(jìn)行修飾，可能增大LDL的負(fù)載量，增強(qiáng)復(fù)合物的穩(wěn)定性。第二步則是通過(guò)含炔基的 藥物載體特異性的化學(xué)反應(yīng)與疏水探針鍵合，從而將藥物錨定在LDL表面。這種方法可以同 時(shí)解決"鉚釘法"藥物負(fù)載率較低和"重組法"的LDL易于失活的不足。
[0021]此外，由于力可拉敏為水溶性的藥物，LDL無(wú)法通過(guò)脂蛋白將其運(yùn)送給細(xì)胞。所以 本項(xiàng)目設(shè)計(jì)合成高效、兩親性、含炔基的丙炔?；瘹ぞ厶?，并建立丙炔酰化殼聚糖在LDL表 面發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)的溫和方法，從而形成LDL為疏水端的兩親性分子，通過(guò)自組裝將親水 的藥物力可拉敏包裹在其中，保護(hù)載酯蛋白ApoB-100使其充分暴露在細(xì)胞膜受體表面，制 備力可拉敏靶向納米載體。
[0022] 殼聚糖，1，4_2_氨基-2-脫氧-0-D-葡萄糖，由廣泛分布于自然界甲殼綱動(dòng)物蝦蟹 的甲殼素脫乙酰化而得，是一種天然陽(yáng)離子聚合物。殼聚糖的分子中存在著羥基、氨基、乙 酰氨基，能進(jìn)行一系列的化學(xué)修飾，制成具有各種特性的衍生物。
[0023] 殼聚糖及其衍生物作為一種天然有機(jī)高分子，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性。這種生物 學(xué)特性來(lái)自于其殼聚糖的聚陰離子特征及溶液中的高電荷密度。殼聚糖可生物降解，具有 良好的生物兼容性，殼聚糖兼有高等動(dòng)物組織中膠原質(zhì)和高等植物組織中纖維素兩者的生 物功能，對(duì)動(dòng)植物具有良好的適應(yīng)性，可以與生物體在細(xì)胞水平上進(jìn)行親和作用，大大減少 了抗原出現(xiàn)的機(jī)會(huì)。無(wú)口服毒性，殼聚糖典型的葡萄糖基結(jié)構(gòu)單元，與體內(nèi)存在的無(wú)毒氨基 葡萄糖結(jié)構(gòu)類(lèi)似，作為人體服用的材料是安全的。目前，美國(guó)和日本已經(jīng)允許少量殼聚糖添 加到食品中。此外，殼聚糖還具有良好的生物黏附性、凝結(jié)能力和免疫刺激活性?；谝陨?種種優(yōu)良的生物特性，近年來(lái)，殼聚糖作為一種新型的藥物載體，在各種給藥系統(tǒng)中得到了 廣泛的應(yīng)用。
[0024]已有幾種合成藥物，例如他克林（丨3〇1'；[116)，多奈哌齊((10116口62；[1)和基于天然產(chǎn) 物的卡巴拉汀(rivastigmine)被用來(lái)治療由AD引起的認(rèn)知功能障礙和記憶力減退時(shí)會(huì)引 起胃腸道紊亂、肝臟和全身毒副作用大及存在生物利用度低等問(wèn)題。因此，必須在自然資源 中尋找更好的乙酰膽堿酯酶抑制劑和其他抗癡呆藥物。
[0025]石蒜多種生物堿均具有膽堿酯酶抑制作用，其三種主要生物堿加蘭他敏、石蒜堿、 力可拉敏中，除加蘭他敏外，其他生物堿尚無(wú)用于老年性癡呆的研究。加蘭他敏已在美國(guó)等 多個(gè)國(guó)家被批準(zhǔn)用于老年性癡呆的治療，但其體內(nèi)分布廣泛、存在較多的外周副作用，特別 是西方國(guó)家報(bào)道有增加中老年人死亡的風(fēng)險(xiǎn)，因而臨床使用受限。
[0026] 此外，血腦屏障的存在限制了它們應(yīng)用于臨床。目前解決藥物有效透過(guò)血腦屏障 的方法有：制備前體藥物、打開(kāi)血腦屏障緊密結(jié)構(gòu)或使用載體系統(tǒng)如抗體、脂質(zhì)體、納米粒 等。前體藥物存在改變藥性、引入毒性的風(fēng)險(xiǎn)而打開(kāi)血腦屏障緊密結(jié)構(gòu)有可能引入其他有 害物質(zhì)。
[0027] 本發(fā)明選取血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞的LDL受體作為傳輸石蒜生物堿來(lái)治療AD的靶點(diǎn)， 以生物相容性很好的殼聚糖作為藥物載體材料，研制低毒高效的石蒜生物堿納米腦靶向制 劑。其目的是增強(qiáng)石蒜生物堿的腦靶向性、增強(qiáng)療效、降低其毒副作用，并提高其生物利用 度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0028] 目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于石蒜生物堿腦靶向制劑的研究非常罕見(jiàn)，本發(fā)明從降低有效成分 的毒性，提高有效成分的腦靶向性和緩釋性出發(fā)，研究適用于老年性癡呆治療的石蒜生物 堿靶向緩釋制劑。
[0029]本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0030] 本發(fā)明的石蒜生物堿靶向緩釋制劑是由石蒜生物堿、丙炔?；瘹ぞ厶呛途哂携B氮 探針的低密度脂蛋白組成，三者的摩爾比為1: (〇. 1~1): (〇. 1~2)。
[0031] 優(yōu)選:石蒜生物堿、丙炔?；瘹ぞ厶呛途哂携B氮探針的低密度脂蛋白的摩爾比為1 :0?5:1?5〇
[0032] 本發(fā)明的石蒜生物堿靶向緩釋制劑的制備方法是：
[0033] 通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)在20_60°C的條件下丙炔酰化殼聚糖上的炔基與具有疊氮探針 的低密度脂蛋白上的疊氮發(fā)生反應(yīng)2-24小時(shí)后合成LDL靶向端作為疏水端的兩親性分子， 該分子與石蒜生物堿自組裝形成LDL靶向端裸露在外面的石蒜生物堿納米腦靶向制劑。
[0034] 作為一種天然多糖，殼聚糖具有生物相容性好，可生物降解等特點(diǎn)，特別適合于藥 物載體。然后限制其應(yīng)用的主要問(wèn)題是水溶性較差，需要在酸性介質(zhì)中才能溶解。因此本發(fā) 明中，首先利用高碘酸鹽對(duì)殼聚糖進(jìn)行氧化處理，得到了不同分子量、殼聚糖鏈上含有鄰二 醛功能基團(tuán)的，大大提高了其水溶性。
[0035] 在高碘酸鹽氧化后，CS-CH0的水溶性大幅度提高，可以很好地溶解于去離子水中， 因此可以在均相介質(zhì)中對(duì)其進(jìn)行修飾。采用NHS活化羧基，EDC鹽酸鹽作為縮合劑，在水介質(zhì) 中進(jìn)行"一鍋煮"的反應(yīng)。所有反應(yīng)物和產(chǎn)物均溶于水，小分子雜質(zhì)可以在透析中除去。
[0036] 所述的丙炔?；瘹ぞ厶堑暮铣陕肪€(xiàn)如下：
[0037] (1)醛化殼聚糖(CS-CH0)的合成：
[0039] (2)丙炔?；瘹ぞ厶?PA-CS-CH0)的合成：
[0041 ]所述合成方法的具體步驟如下：
[0042] (1)醛化殼聚糖(CS-CH0)的合成：
[0043]氮?dú)鈿夥障拢瑲ぞ厶堑拇姿?醋酸鈉緩沖溶液與高碘酸鉀以合適的比例4°C下攪拌 反應(yīng)24~48h后，然后向溶液中加入適量的乙二醇溶液來(lái)中止反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后 分別在NaCl水溶液和去離子水中透析以除去雜質(zhì)，最后產(chǎn)物冷凍干燥，備用。其中，所述殼 聚糖、醋酸-醋酸鈉緩沖溶液、高碘酸鉀、乙二醇之間的摩爾體積比為1: (1~5): (0.1~1): (0.1~1)〇
[0044] (2)丙炔?；瘹ぞ厶?PA-CS-CH0)的合成：
[0045] 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，丙炔酸水溶液中，加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，溶解后逐滴滴入 CS-CH0水溶液中，攪拌均勻后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC-HCL)，醛化殼聚糖、丙炔酸、N-羥基琥珀酰亞胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽 酸鹽的摩爾比為1: (1~4): (1~3): (1~3)混合物反應(yīng)10~72h后，轉(zhuǎn)移至透析袋中，在 NaCl水溶液和去離子水中透析除去未反應(yīng)的小分子，冷凍干燥得到產(chǎn)物，備用。
[0046] 所述的具有疊氮探針的低密度脂蛋白的合成方法的具體步驟如下：
[0047] (1)疊氮探針的合成：
[0048] 合成路線(xiàn)如下：
[0050] a，2-( 2-氨基乙氧基）乙醇，1N的HBTU和HOBt，在DMF溶液中室溫反應(yīng)24小時(shí)；b， TsCl，吡啶;c，1.2N氮化鈉，吡啶
[0051 ] (1 ? 1 )Ci5H3iCONHCH2CH2〇CH2CH2〇H(NHEP)的合成：
[0052] 棕櫚酸、羥基乙氧基乙胺和三乙胺在氮?dú)鈿夥障?，加入二甲基甲酰?DMF)攪拌溶 解，置入冰浴中，冷卻后加入事先混合的苯并三氮唑_N，N，N入屮-四甲基脲六氟磷酸鹽 (HBTU)和N-羥基苯并三氮唑(HOBt )，室溫反應(yīng)，薄層層析確定反應(yīng)終點(diǎn)，反應(yīng)物溶液逐滴滴 入攪拌中的冷水中，用氯仿萃取，收集到的氯仿溶液依次用檸檬酸溶液，碳酸氫鈉溶液，飽 和氯化鈉溶液洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥后旋蒸去氯仿得到粗產(chǎn)物，粗產(chǎn)物在乙醇中重結(jié)晶純 化，真空干燥，干燥器保存;其中，所述棕櫚酸、2-(2_氨基乙氧基）乙醇、三乙胺、二甲基甲酰 胺、苯并三氮唑-N，N，Y，M -四甲基脲六氟磷酸鹽和N-羥基苯并三氮唑的摩爾比為1: (1~ 1.5):(1~3):(1~5):(1~4.5):(1~6)。
[0053] (1.2)Ci5H3iCONHCH2CH2〇CH2CH2〇Ts(PEMBS)的合成：
[0054] NHEP溶于氯仿中，加入吡啶，降溫后，加入對(duì)甲基苯磺酰氯，回復(fù)至室溫，攪拌過(guò) 夜，薄層層析確定反應(yīng)終點(diǎn)，產(chǎn)物滴入鹽酸溶液中，離心出去上清液后得到產(chǎn)物，產(chǎn)物分別 用鹽酸和水沖洗，在室溫下真空干燥，干燥器儲(chǔ)存;其中，所述NHEP、氯仿、吡啶、對(duì)甲基苯磺 酰氯的摩爾比為1:(1~6): (4~5.6): (1~1.4)。
[0055] (1.3)Ci5H3iCONHCH2CH2〇CH2CH2N3(NAEP)的合成：
[0056] PEMBS在氮?dú)獗Ｗo(hù)下溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，加入疊氮鈉(NaN3)，緩慢加熱，回 流10~72h后降至室溫，產(chǎn)物溶液在攪拌中滴入冰水中，過(guò)濾，用水反復(fù)沖洗濾餅后，室溫真 空干燥，通過(guò)柱層析純化得到最終產(chǎn)物，在室溫下真空干燥，干燥器儲(chǔ)存。其中，所述PEMBS、 二甲基甲酰胺、疊氮鈉的摩爾比為1:(1~5): (4~5.6)。
[0057] (2)LDL的探針標(biāo)記：
[0058] 采用密度梯度法從人血漿中提取LDL，NAEP與LDL在共溶溶劑中混合，通過(guò)自組裝 反應(yīng)得到表面具有疊氮探針的LDL (NAEP-LDL，標(biāo)記為N3-LDL)。
[0059] 所采用的殼聚糖為聚合物，故其分子量的范圍可為0.4-2萬(wàn)g/mol;
[0060] 固定在LDL的磷脂層中疊氮探針的脂肪酸的烷基的碳鏈長(zhǎng)度為10-16個(gè)碳原子。 [0061 ]本發(fā)明的方法具有以下特點(diǎn)：
[0062] (1)選擇生物相容性好，可生物降解的殼聚糖作為藥物載體，且利用高碘酸鹽對(duì)殼 聚糖進(jìn)行氧化處理，解決殼聚糖水溶性較差的主要問(wèn)題。
[0063] (2)以具有十六烷基的棕櫚酸作為"探針"固定在LDL的磷脂層中，并引入了一個(gè)單 縮二乙二醇單元作為"spacer"，來(lái)防止功能基團(tuán)一一疊氮端基被完全埋入LDL中而失去反 應(yīng)性。
[0064] (3)設(shè)計(jì)合成形成LDL為疏水端的兩親性分子，通過(guò)自組裝將親水的藥物包裹在其 中，解決LDL負(fù)載親水的藥物無(wú)法通過(guò)脂蛋白將其運(yùn)送給細(xì)胞的問(wèn)題。
[0065] 本發(fā)明的石蒜生物堿靶向緩釋制劑可以用于治療老年性癡呆。
[0066]本發(fā)明的積極效果如下：
[0067] 本發(fā)明選取血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞的LDL受體作為傳輸石蒜生物堿來(lái)治療AD的靶點(diǎn)， 以生物相容性很好的殼聚糖作為藥物載體材料，研制低毒高效的石蒜生物堿納米腦靶向制 劑，填補(bǔ)了目前石蒜生物堿作為AD治療藥物的臨床應(yīng)用前研究的一些空白。與已有的合成 藥物相比：
[0068] 1、本發(fā)明中由天然藥物石蒜生物堿以及可生物降解的殼聚糖載體制備的納米腦 靶向制劑的毒性低，在靶向穿透血腦屏障的同時(shí)不會(huì)改變藥物的藥性和引入其他有害物 質(zhì)；
[0069] 2、石蒜生物堿通過(guò)納米腦靶向制劑更加集中地分布在腦內(nèi)，生物利用度得到提 尚。
[0070] 3、本發(fā)明采用的藥物負(fù)載在LDL上的新方法，同時(shí)解決"鉚釘法"藥物負(fù)載率較低 和"重組法"的LDL易于失活的不足。
【具體實(shí)施方式】
[0071] 下面的實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0072] 實(shí)施例1
[0073] 本發(fā)明的石蒜生物堿靶向緩釋制劑是由石蒜生物堿、丙炔酰化殼聚糖和具有疊氮 探針的低密度脂蛋白組成，三者的摩爾比為1:0.5:1.5。
[0074]本發(fā)明的石蒜生物堿靶向緩釋制劑的制備方法是：
[0075]通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)在室溫的條件下丙炔?；瘹ぞ厶巧系娜不c具有疊氮探針的 低密度脂蛋白上的疊氮發(fā)生反應(yīng)24小時(shí)后合成LDL靶向端作為疏水端的兩親性分子，該分 子與石蒜生物堿自組裝形成LDL靶向端裸露在外面的石蒜生物堿納米腦靶向制劑。
[0076]作為一種天然多糖，殼聚糖具有生物相容性好，可生物降解等特點(diǎn)，特別適合于藥 物載體。然后限制其應(yīng)用的主要問(wèn)題是水溶性較差，需要在酸性介質(zhì)中才能溶解。因此本 發(fā)明中，首先利用高碘酸鹽對(duì)殼聚糖進(jìn)行氧化處理，得到了不同分子量、殼聚糖鏈上含有鄰 二醛功能基團(tuán)的，大大提高了其水溶性。
[0077]在高碘酸鹽氧化后，CS-CH0的水溶性大幅度提高，可以很好地溶解于去離子水中， 因此可以在均相介質(zhì)中對(duì)其進(jìn)行修飾。采用NHS活化羧基，EDC鹽酸鹽作為縮合劑，在水介質(zhì) 中進(jìn)行"一鍋煮"的反應(yīng)。所有反應(yīng)物和產(chǎn)物均溶于水，小分子雜質(zhì)可以在透析中除去。
[0078] 所述的丙炔?；瘹ぞ厶堑暮铣陕肪€(xiàn)如下：
[0079] (1)醛化殼聚糖(CS-CH0)的合成：
[00811 (2)丙炔?；瘹ぞ厶?PA-CS-CH0)的合成：
[0083]所述合成方法的具體步驟如下：
[0084] (1)醛化殼聚糖(CS-CH0)的合成：
[0085] 氮?dú)鈿夥障拢瑲ぞ厶堑拇姿?醋酸鈉緩沖溶液與高碘酸鉀以1:0.2的比例4°C下攪 拌反應(yīng)48h后，然后向溶液中加入0.2倍殼聚糖摩爾量的乙二醇溶液來(lái)中止反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后分別在NaCl水溶液和去離子水中透析以除去雜質(zhì)，最后產(chǎn)物冷凍干燥，備用。 [0086] (2)丙炔?；瘹ぞ厶?PA-CS-CH0)的合成：
[0087] 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，丙炔酸水溶液中，加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，溶解后逐滴滴入 CS-CH0水溶液中，攪拌均勻后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC-HCL)，醛化殼聚糖、丙炔酸、N-羥基琥珀酰亞胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽 酸鹽的摩爾比為1: 2: 2:1混合物反應(yīng)48h后，轉(zhuǎn)移至透析袋中，在NaCl水溶液和去離子水中 透析除去未反應(yīng)的小分子，冷凍干燥得到產(chǎn)物，備用。
[0088]所述的具有疊氮探針的低密度脂蛋白的合成方法的具體步驟如下：
[0089] (1)疊氮探針的合成：
[0090] 合成路線(xiàn)如下：
[0092] a，2-( 2-氨基乙氧基）乙醇，1N的HBTU和HOBt，在DMF溶液中室溫反應(yīng)24小時(shí)；b， TsCl，吡啶;c，1.2N氮化鈉，吡啶
[0093] (1 ? l)Ci5H3iCONHCH2CH2〇CH2CH2〇H(NHEP)的合成：
[0094] 棕櫚酸、羥基乙氧基乙胺和三乙胺在氮?dú)鈿夥障?，加入二甲基甲酰?DMF)攪拌溶 解，置入冰浴中，冷卻后加入事先混合的苯并三氮唑_N，N，N入屮-四甲基脲六氟磷酸鹽 (HBTU)和N-羥基苯并三氮唑(HOBt )，室溫反應(yīng)，薄層層析確定反應(yīng)終點(diǎn)，反應(yīng)物溶液逐滴滴 入攪拌中的冷水中，用氯仿萃取，收集到的氯仿溶液依次用檸檬酸溶液，碳酸氫鈉溶液，飽 和氯化鈉溶液洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥后旋蒸去氯仿得到粗產(chǎn)物，粗產(chǎn)物在乙醇中重結(jié)晶純 化，真空干燥，干燥器保存;其中，所述棕櫚酸、2-(2_氨基乙氧基）乙醇、三乙胺、二甲基甲酰 胺、苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽和N-羥基苯并三氮唑的摩爾比為1:1:2:3 :2.5:4〇
[0095] (1.2)Ci5H3iCONHCH2CH2〇CH2CH2〇Ts(PEMBS)的合成：
[0096] NHEP溶于氯仿中，加入吡啶，降溫后，加入對(duì)甲基苯磺酰氯，回復(fù)至室溫，攪拌過(guò) 夜，薄層層析確定反應(yīng)終點(diǎn)，產(chǎn)物滴入鹽酸溶液中，離心出去上清液后得到產(chǎn)物，產(chǎn)物分別 用鹽酸和水沖洗，在室溫下真空干燥，干燥器儲(chǔ)存;其中，所述NHEP、氯仿、吡啶、對(duì)甲基苯磺 酰氯的摩爾比為1:4:5:1。
[0097] (1.3)Ci5H3iCONHCH2CH2〇CH2CH2N3(NAEP)的合成：
[0098] PEMBS在氮?dú)獗Ｗo(hù)下溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，加入疊氮鈉(NaN3)，緩慢加熱，回 流48h后降至室溫，產(chǎn)物溶液在攪拌中滴入冰水中，過(guò)濾，用水反復(fù)沖洗濾餅后，室溫真空干 燥，通過(guò)柱層析純化得到最終產(chǎn)物，在室溫下真空干燥，干燥器儲(chǔ)存。
[0099] (2)LDL的探針標(biāo)記：
[0100]采用密度梯度法從人血漿中提取LDL，NAEP與LDL在共溶溶劑中混合，通過(guò)自組裝 反應(yīng)得到表面具有疊氮探針的LDL(NAEP-LDL，標(biāo)記為N3-LDL)。
[0101] 實(shí)施例2
[0102] 本發(fā)明的石蒜生物堿靶向緩釋制劑是由石蒜生物堿、丙炔?；瘹ぞ厶呛途哂携B氮 探針的低密度脂蛋白組成，三者的重量比或摩爾比為1:1:1.5。
[0103] 其他同實(shí)施例1。
[0104] 實(shí)施例3
[0105] 本發(fā)明的石蒜生物堿靶向緩釋制劑是由石蒜生物堿、丙炔酰化殼聚糖和具有疊氮 探針的低密度脂蛋白組成，三者的重量比或摩爾比為1:1: 2。
[0106] 其他同實(shí)施例1。
[0107] ( - )納米腦靶向制劑藥物釋放規(guī)律和體系降解機(jī)理的研
[0108] 將納米腦靶向制劑的溶液轉(zhuǎn)移至透析袋中，在ros溶液(pH = 7.4)中于37 ± 1°C的 電熱恒溫振蕩水槽中透析。在不同的透析時(shí)間點(diǎn)取透析液，以加蘭他敏為對(duì)照品，分別采用 高效液相法和紫外分光光度法對(duì)透析液中石蒜生物堿的含量進(jìn)行測(cè)定。以時(shí)間為橫軸和生 物堿含量為縱軸繪制釋放曲線(xiàn)，研究腦靶向制劑的組成、粒徑和形態(tài)對(duì)藥物釋放的影響，揭 示釋放規(guī)律。
[0109] 將納米腦靶向制劑的溶液轉(zhuǎn)移至透析袋中，在ros溶液(pH = 7.4)中于37 ± 1°C的 電熱恒溫振蕩水槽中透析。在不同的透析時(shí)間點(diǎn)取一定量的透析液，進(jìn)行相關(guān)的測(cè)定，計(jì)算 出透析液中制備腦靶向制劑的原材料的含量，推算出腦靶向制劑材料的降解率，探討降解 機(jī)理。
[0110] (二)納米腦靶向制劑的安全性(細(xì)胞毒性以及急性毒性）
[0111] 將載藥體系分五組分別進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn):①空白對(duì)照組;②石蒜生物堿原藥;③ 空白載體PA-CS-CH0;④未組裝LDL的負(fù)載石蒜生物堿的納米粒;⑤組裝LDL后的負(fù)載石蒜生 物堿體系。
[0112] 采用MTT法進(jìn)行對(duì)各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞毒性測(cè)定；急性毒性試驗(yàn):取健康小白鼠，每組 10只，將各實(shí)驗(yàn)組灌胃給藥，觀(guān)察小鼠的毒性反應(yīng)與死亡率，Bliss法計(jì)算LD 50。
[0113 ](三)納米腦革巴向制劑的體外及體內(nèi)的焚光分析
[0114]對(duì)石蒜生物堿、鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞和LDL分別以不同的熒光試劑標(biāo)記，研究不同載 體結(jié)構(gòu)、載藥量及濃度的藥物納米腦靶向制劑在體外培養(yǎng)的鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞體系及動(dòng)物 體內(nèi)的靶向效果。
[0115](四）納米腦靶向制劑通過(guò)血腦屏障的評(píng)價(jià)
[0116]將載藥體系分三組分別進(jìn)行抑制乙酰膽堿酯酶率的檢測(cè):①石蒜生物堿原藥;② 未組裝LDL的負(fù)載石蒜生物堿的納米粒;③組裝LDL后的負(fù)載石蒜生物堿體系。進(jìn)行以下研 究來(lái)考察通過(guò)血腦屏障的效果。
[0117] 1)對(duì)體外血腦屏障模型的檢測(cè)
[0118] DeBauh和Cane i 1 la首次報(bào)道了部分喪失的屏障特性可以經(jīng)由血管內(nèi)皮細(xì)胞同星 形膠質(zhì)細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)的方式再誘導(dǎo)，而且有實(shí)驗(yàn)證明星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)于誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞，維 持血腦屏障特性有著非常重要的作用。
[0119] 本課題應(yīng)用共培養(yǎng)鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建血腦屏障的體外實(shí)驗(yàn) 模型:在明膠包埋的24孔板細(xì)胞插入器的微孔濾膜的一側(cè)培養(yǎng)鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞，底部培 養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞，至匯合狀態(tài)。通過(guò)4h液面滲透實(shí)驗(yàn)、掃描和透射電鏡的形態(tài)學(xué)觀(guān)察、以及 血腦屏障形成前后膜兩側(cè)的電阻來(lái)證實(shí)血腦屏障的形成。
[0120] 運(yùn)用此體外模型研究納米腦靶向制劑的通透性，采用高效液相法來(lái)測(cè)定石蒜生物 堿的含量。
[0121] 2)對(duì)離體腦組織檢測(cè)
[0122] 通過(guò)給藥后對(duì)腦組織中的藥物成分定性或定量評(píng)價(jià)，來(lái)驗(yàn)證其可通過(guò)BBB。本課題 采用靜脈注射技術(shù)，并聯(lián)合運(yùn)用高效液相色譜分析來(lái)檢測(cè)離體腦組織中的石蒜生物堿。
[0123] 靜脈注射技術(shù)被譽(yù)為評(píng)價(jià)BBB通透性的"金標(biāo)準(zhǔn)"。小鼠經(jīng)股靜脈或尾靜脈置管，注 入目標(biāo)藥劑及血漿體積標(biāo)記物(用以校正腦微血管內(nèi)的殘存的目標(biāo)化合物），經(jīng)股動(dòng)脈置管 于不同時(shí)間點(diǎn)取血。實(shí)驗(yàn)完畢后，殺死動(dòng)物，取腦組織，勻漿，再用右旋糖酐成分密度離心法 來(lái)清除腦勻漿中微血管壁上及微血管內(nèi)皮細(xì)胞中尚未進(jìn)入腦組織中的化合物，最后用高效 液相色譜測(cè)腦內(nèi)石蒜生物堿濃度。
[0124] 3)對(duì)動(dòng)物活體的檢測(cè)
[0125] 通過(guò)腦內(nèi)微透析法對(duì)動(dòng)物活體進(jìn)行檢測(cè)。腦內(nèi)微透析技術(shù)是在推挽灌流基礎(chǔ)上發(fā) 展起來(lái)的一種連續(xù)灌注并采集清醒自由活動(dòng)動(dòng)物特定腦區(qū)灌流液的一種新方法。本課題將 該技術(shù)與高效液相色譜檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合，灌流能透過(guò)透析膜的藥物腦靶向制劑，檢測(cè)石蒜 生物堿的含量。
[0126] 具體操作為:將PE10導(dǎo)管與透析探頭的輸入管相連，而將PE10的另一端通過(guò)旋轉(zhuǎn) 接頭和與無(wú)脈沖的微量灌流栗相連的PE50相連。灌流栗以l-2iil/min流速、恒速輸入經(jīng)過(guò)濾 的納米腦靶向制劑溶液。探頭的輸出管經(jīng)另一 PE10導(dǎo)管與400iU離心管(作為收集管)相連。 收集到的液體，經(jīng)適當(dāng)處理后，用高效液相法來(lái)測(cè)定其中的石蒜生物堿的含量。
[0127] (五)體外納米腦靶向制劑對(duì)乙酰膽堿酯酶抑制作用的研究
[0128] 將載藥體系分四組分別進(jìn)行抑制乙酰膽堿酯酶率的檢測(cè):①石蒜生物堿原藥;② 空白載體PA-CS-CH0;③未組裝LDL的負(fù)載石蒜生物堿的納米粒;④組裝LDL后的負(fù)載石蒜生 物堿體系。
[0129] 結(jié)合TLC生物自顯影法、Ellman法和電泳介導(dǎo)的微量分析法的檢測(cè)結(jié)果，綜合分析 各實(shí)驗(yàn)組抑制乙酰膽堿酯酶的作用效果，探討該課題制備的石蒜生物堿納米靶向腦靶向制 劑抑制乙酰膽堿酯酶的作用機(jī)理。
[0130] 1)TLC生物自顯影法
[0131]選取硫代乙酰膽堿為底物，DTNB為顯色劑。在薄層板上將待測(cè)樣品展開(kāi)，然后將薄 層板與乙酰膽堿酯酶、底物相接觸，培養(yǎng)一定時(shí)間后噴顯色劑，有抑制活性的成分將會(huì)抑制 乙酰膽堿酯酶的活性，不能與底物，顯色劑反應(yīng)，這樣該部位會(huì)出現(xiàn)薄層板本身的白色，而 其他部位根據(jù)不同的底物和顯色劑為不同的背景色。
[0132] 2)Ellman法
[0133] Ellman法是一種能夠定量評(píng)價(jià)乙酰膽堿酯酶抑制活性的方法。與TLC生物自顯影 法不同，本方法選取碘化硫代乙酰膽堿(ATCI)作為底物，它在乙酰膽堿酯酶(AChE)作用下 分解，生成硫代膽堿(Thiocholine)，硫代膽堿與顯色劑DTNB迅速作用，生成405nm下有最大 光吸收的黃色物質(zhì)5-巰基-2-硝基苯甲酸鹽。根據(jù)測(cè)得的A值計(jì)算酶抑制率，公式如下：
[0134] 抑制率=[(A空白組-A完全抑制組)_(A樣品-A樣品本底）]/(A空白組-A完全抑制 組）X100%
[0135] 3)電泳介導(dǎo)的微量分析法
[0136] 電泳介導(dǎo)的微分析法不僅具有快速簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、試劑消耗少、準(zhǔn)確度高。是一 種在毛細(xì)管中用酶催化水解底物的一步反應(yīng)，然后在紫外230nm處直接測(cè)定產(chǎn)物峰面積實(shí) 現(xiàn)酶活的測(cè)定和酶抑制劑的篩選方法。
[0137] 將酶溶液和底物溶液分別導(dǎo)入毛細(xì)管一端;其中為了提高酶活性，將在底物溶液 中加入無(wú)機(jī)鎂離子鹽如硫酸鎂。此后在毛細(xì)管上加上一定的電壓使兩者混合一段時(shí)間后； 斷開(kāi)電壓，使酶和底物反應(yīng)一定時(shí)間;再加上一定的電壓使酶、未反應(yīng)底物及產(chǎn)物根據(jù)其電 泳淌度的不同來(lái)實(shí)現(xiàn)分離。酶活用230nm處產(chǎn)物的峰面積表示，根據(jù)產(chǎn)物峰面積的變化來(lái)判 斷抑制酶的活性。
[0138] (六)體內(nèi)納米腦靶向制劑對(duì)阿爾茨海默病的改善作用及其作用機(jī)制
[0139] 1)對(duì)東莨菪堿所致記憶獲得障礙的改善作用
[0140] (1)小鼠跳臺(tái)法
[0141]取健康小白鼠，隨機(jī)分為5組，分別為石蒜生物堿原藥組(原藥組）；未組裝LDL的負(fù) 載石蒜生物堿的納米粒組(實(shí)驗(yàn)1組）；組裝LDL后的負(fù)載石蒜生物堿體系組(實(shí)驗(yàn)2組）；空白 載體PA-CS-CH0(空白組）；模型對(duì)照組?？瞻捉M和模型對(duì)照組灌服等溶劑的蒸餾水，其余各 組分別灌服相應(yīng)的藥劑，連續(xù)給藥7天。末次給藥后20min，除正常對(duì)照組腹腔注射生理鹽水 外，其余各組均腹腔注射東莨菪堿，l〇min后進(jìn)行跳臺(tái)法訓(xùn)練。24小時(shí)后測(cè)試，記錄5min內(nèi)小 鼠的跳下潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)。
[0142] (2)小鼠避暗法
[0143] 方法同（1)，記錄3min內(nèi)小鼠進(jìn)入暗室的潛伏期。
[0144] 2)對(duì)KA致大鼠癡呆模型的改善作用
[0145] 取健康大鼠隨機(jī)分為石蒜生物堿原藥組(原藥組）；未組裝LDL的負(fù)載石蒜生物堿 的納米粒組（實(shí)驗(yàn)1組）；組裝LDL后的負(fù)載石蒜生物堿體系組（實(shí)驗(yàn)2組）；空白載體PA-CS-CH0(空白組）；模型對(duì)照組。將大鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉后，固定在腦立體定位儀上，沿顱 骨中線(xiàn)剪開(kāi)皮膚。在顱骨上鉆一小孔，直徑約l〇min，用微量注射器分別將海人藻酸在5min 內(nèi)注入兩側(cè)基底核，空白對(duì)照組注入等量的磷酸緩沖液(pH 7.4)，注射完畢，停針5min。術(shù) 后牙托粉封固顱骨，縫合皮膚，3天內(nèi)每天給予青霉素，術(shù)后第二天開(kāi)始灌服藥物，空白對(duì)照 組與模型對(duì)照組灌服等容積的蒸餾水，連續(xù)灌服14天。自第9天開(kāi)始進(jìn)行Morris水迷宮測(cè) 試，記錄每天的訓(xùn)練成績(jī)，連續(xù)訓(xùn)練5天。第14天給藥lh后處死大鼠，測(cè)定腦內(nèi)Ach，AchE。
[0146] (1)大鼠學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)實(shí)驗(yàn)
[0147] Morris水迷宮學(xué)習(xí)測(cè)試：即定位航行實(shí)驗(yàn)，歷時(shí)5天，每天共訓(xùn)練8次，系統(tǒng)自動(dòng)記 錄大鼠入水后找到平臺(tái)的時(shí)問(wèn)即逃避潛伏期，取
[0148] 每天逃避潛伏期的平均值作為該天的學(xué)習(xí)成績(jī)。
[0149] Morris水迷宮記憶測(cè)試：即空間搜索實(shí)驗(yàn)，第5天下午給藥lh后撤出平臺(tái)，記錄大 鼠在120S內(nèi)初次找到原平臺(tái)的時(shí)間和穿越原平臺(tái)的次數(shù)。
[0150] (2)大鼠腦組織中Ach含量的測(cè)定
[0151] 取大鼠大腦皮質(zhì)0.5g，勻漿后室溫放置2h，取上清液按lg腦組織用5ml 10%三氯 醋酸的比例，混勾，3000 X g離心10min，用lmol/L強(qiáng)氧化鈉調(diào)pH值至7.0，最后以洛氏液調(diào)至 lg腦組織容量為8ml，供測(cè)定用。
[0152] 水蛭背肌的制備:將水蛭背位固定于解剖板上，用鹽水使其放松至自然長(zhǎng)度，用眼 科剪刀沿腹背交接處剪開(kāi)兩側(cè)，掀開(kāi)腹肌，剪去白色的內(nèi)臟和神經(jīng)以及黑色葡萄狀組織，然 后用手術(shù)刀切成1-2毫米寬，10毫米長(zhǎng)的肌條，絲線(xiàn)結(jié)扎兩端，備用。肌條始終用稀釋的洛氏 液濕潤(rùn)。
[0153]肌條在浴槽內(nèi)避免貼壁，上端接肌張力換能器，其下端加0.3g的負(fù)荷。肌條掛入浴 槽后，以稀釋洛氏液灌流，穩(wěn)定后開(kāi)始測(cè)定。測(cè)定時(shí)，交替加入與浴槽等容量的標(biāo)準(zhǔn)品和樣 品。最后用等效比值的方法計(jì)算樣品中Ach的含量(nmol/g腦組織）。
[0154] (3)大鼠腦組織中AchE含量的測(cè)定
[0155] KA癡呆大鼠實(shí)驗(yàn)中，在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束第二天，給藥后將大鼠快速斷頭處死，取腦 組織(0.2-lg)，在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱(chēng)重，用0.86%的冷生理鹽 水制成10 %勻漿液。按AchE試劑盒進(jìn)行AchE含量測(cè)定。
[0156] 盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以 理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換 和變型，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求及其等同物限定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種石蒜生物堿靶向緩釋制劑，其特征在于:所述的制劑是由石蒜生物堿、丙炔?；?殼聚糖和具有疊氮探針的低密度脂蛋白組成，三者的摩爾比為1: (〇. 1~1): (〇. 1~2)。2. 如權(quán)利要求1所述的石蒜生物堿靶向緩釋制劑，其特征在于:石蒜生物堿、丙炔?；?殼聚糖和具有疊氮探針的低密度脂蛋白的摩爾比為1:0.5:1.5。3. -種制備如權(quán)利要求1或2所述的石蒜生物堿靶向緩釋制劑的方法，其特征在于： 通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)在20-60°C的條件下丙炔酰化殼聚糖上的炔基與具有疊氮探針的低 密度脂蛋白上的疊氮發(fā)生反應(yīng)2-24小時(shí)后合成LDL靶向端作為疏水端的兩親性分子，該分 子與石蒜生物堿自組裝形成LDL靶向端裸露在外面的石蒜生物堿納米腦靶向制劑。4. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于：所述的丙炔?；瘹ぞ厶堑暮铣陕肪€(xiàn)如 下： (1) 醛化殼聚糖(CS-CHO)的合成：(2) 丙炔酰化殼聚糖(PA-CS-CHO)的合成：5. 如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于:所述合成方法的具體步驟如下： (1)醛化殼聚糖(CS-CHO)的合成： 氮?dú)鈿夥障拢瑲ぞ厶堑拇姿?醋酸鈉緩沖溶液與高碘酸鉀在4°C下攪拌反應(yīng)24~48h后， 然后向溶液中加入乙二醇溶液來(lái)中止反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后分別在NaCl水溶液和去 離子水中透析以除去雜質(zhì)，最后產(chǎn)物冷凍干燥，備用；其中，所述殼聚糖、醋酸-醋酸鈉緩沖 溶液、高碘酸鉀、乙二醇之間的摩爾體積比為1: (1~5): (0.1~1): (0.1~1); (2)丙炔?；瘹ぞ厶?PA-CS-CHO)的合成： 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，丙炔酸水溶液中，加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，溶解后逐滴滴入CS-CHO水溶液中，攪拌均勻后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC-HCL)，醛 化殼聚糖、丙炔酸、N-羥基琥珀酰亞胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽的摩 爾比為1: (1~4): (1~3): (1~3)，混合物反應(yīng)10~72h后，轉(zhuǎn)移至透析袋中，在NaCl水溶液 和去離子水中透析除去未反應(yīng)的小分子，冷凍干燥得到產(chǎn)物，備用。6.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于:所述的具有疊氮探針的低密度脂蛋白的 合成方法的具體步驟如下： (1)疊氮探針的合成： 合成路線(xiàn)如下：(1 · 1 )Ci5H3iCONHCH2CH2〇CH2CH2〇H(NHEP)的合成： 棕櫚酸、羥基乙氧基乙胺和三乙胺在氮?dú)鈿夥障?，加入二甲基甲酰?DMF)攪拌溶解， 置入冰浴中，冷卻后加入事先混合的苯并三氮唑_N，N，N'，N'_四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU) 和N-羥基苯并三氮唑(HOBt)，室溫反應(yīng)，薄層層析確定反應(yīng)終點(diǎn)，反應(yīng)物溶液逐滴滴入攪拌 中的冷水中，用氯仿萃取，收集到的氯仿溶液依次用檸檬酸溶液，碳酸氫鈉溶液，飽和氯化 鈉溶液洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥后旋蒸去氯仿得到粗產(chǎn)物，粗產(chǎn)物在乙醇中重結(jié)晶純化，真空 干燥，干燥器保存;其中，所述棕櫚酸、2-(2-氨基乙氧基）乙醇、三乙胺、二甲基甲酰胺、苯并 三氮唑-N，N，N'，N'_四甲基脲六氟磷酸鹽和N-羥基苯并三氮唑的摩爾比為1:(1~1.5):(1 ~3):(1~5):(1~4.5):(1~6); (1 · 2) C15H31CONHCH2CH2OCH2CH2OTS (PEMBS)的合成： NHEP溶于氯仿中，加入吡啶，降溫后，加入對(duì)甲基苯磺酰氯，回復(fù)至室溫，攪拌過(guò)夜，薄 層層析確定反應(yīng)終點(diǎn)，產(chǎn)物滴入鹽酸溶液中，離心出去上清液后得到產(chǎn)物，產(chǎn)物分別用鹽酸 和水沖洗，在室溫下真空干燥，干燥器儲(chǔ)存;其中，所述NHEP、氯仿、吡啶、對(duì)甲基苯磺酰氯的 摩爾比為1: (1~6): (4~5.6): (1~1.4); (1 · 3 )Ci5H3iCONHCH2CH2〇CH2CH2N3(NAEP)的合成： PEMBS在氮?dú)獗Ｗo(hù)下溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，加入疊氮鈉(NaN3)，緩慢加熱，回流10 ~72h后降至室溫，產(chǎn)物溶液在攪拌中滴入冰水中，過(guò)濾，用水反復(fù)沖洗濾餅后，室溫真空干 燥，通過(guò)柱層析純化得到最終產(chǎn)物，在室溫下真空干燥，干燥器儲(chǔ)存，其中，所述PEMBS、二甲 基甲酰胺、疊氮鈉的摩爾比為1:(1~5): (4~5.6); (2)LDL的探針標(biāo)記： 采用密度梯度法從人血漿中提取LDL，NAEP與LDL在共溶溶劑中混合，通過(guò)自組裝反應(yīng) 得到表面具有疊氮探針的LDL(NAEP-LDL，標(biāo)記為N3-LDL)。7.如權(quán)利要求1或2所述的石蒜生物堿靶向緩釋制劑用于制備治療老年性癡呆的藥物 的用途。
【文檔編號(hào)】A61K47/36GK105853392SQ201610038656
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年1月20日
【發(fā)明人】吳正治, 段麗紅
【申請(qǐng)人】深圳市老年醫(yī)學(xué)研究所