人參總次苷在制備治療和/或預(yù)防心肌缺血后脂質(zhì)代謝異常的藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及人參總次苷、Rg3、Rg5和/或Rk1在制備治療和/或預(yù)防心肌缺血后脂質(zhì)代謝異常的藥物中的應(yīng)用。具體包括人參總次苷、Rg3、Rg5和/或Rk1在制備調(diào)節(jié)心肌缺血后的血液或心肌組織中脂肪酸、鞘酯、磷酸甘油酯、甘油酯水平的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明從脂質(zhì)組學(xué)角度研究人參總次苷對心肌缺血損傷大鼠的心臟保護作用，不僅揭示了人參總次苷的機理，并且為治療心機缺血損傷提供了全新的途徑。
【專利說明】
人參總次苷在制備治療和/或預(yù)防心肌缺血后脂質(zhì)代謝異 常的藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體講涉及人參總次苷、Rg3、Rg5和/或Rkl在制備治療和 /或預(yù)防心肌缺血后脂質(zhì)代謝異常的藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 人參為五加科植物人參（Panax ginseng C. A.Mey)的干燥根。人參是中醫(yī)補氣 之要藥。性味與歸經(jīng)：甘、微苦，平。功能與主治：大補元氣，復(fù)脈固脫，補脾益肺，生津，安 神。用于體虛欲脫，肢冷脈微，脾虛食少，肺虛喘咳，津傷口渴，內(nèi)熱消渴，久病虛贏，驚悸失 目民，陽痿宮冷；心力衰竭，心原性休克。三七為加科植物三七（Panax notoginseng(Burk.) F.H. Chen)的干燥根。其性溫，味辛，具有散淤止血，消腫定痛的功效，可用于治療衄血、便 血、崩漏、咯血、吐血、外傷出血、胸腹刺痛等癥。
[0003] 現(xiàn)代科研結(jié)果表明：人參的主要生物活性成分是人參皂苷。紅參和生曬人參雖 然都含有皂昔，但其皂苷單體有所不同，紅參中含有生曬參中沒有的皂苷一人參皂苷Rg2、 Rg3、Rhl、Rh2等。這些新的皂苷是在人參加工過程中，經(jīng)過蒸制、干燥時，人參皂苷水解產(chǎn) 生的次生皂苷。這些次生皂苷具有許多新的活性，例如：人參次生皂苷Rhl、Rh2、Rg3有明 顯的抗癌活性，對癌細(xì)胞有誘導(dǎo)再分化作用，可誘導(dǎo)癌細(xì)胞重新分化為健康細(xì)胞，其它皂苷 單體卻沒有這種作用，或者作用強度較弱。人參皂苷Rg3對膠原或ADP誘導(dǎo)的血小板聚集 有較強的抑制作用。人參皂苷Rhl對凝血酶誘導(dǎo)的纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白有明顯的抑 制作用。
[0004] 另外，近年運用血清藥理學(xué)理念研究人參皂苷的體內(nèi)代謝的結(jié)果表明，原人參皂 苷在人體內(nèi)吸收率很低（人參皂苷Rbl 口服僅吸收1%)，真正被人體吸收的活性成份是 經(jīng)腸菌代謝產(chǎn)生的次生皂昔。王本祥教授在研究人參皂苷體內(nèi)代謝過程時發(fā)現(xiàn)，口服人參 皂苷Rgl后，吸收入血的生物活性成份主要是經(jīng)腸菌代謝產(chǎn)生的次生皂苷Rhl。但是，這 些次生皂苷天然含量極低，例如：Rg3在白參中的含量僅為0. 0003%，在紅參中的含量約為 0. 03%，而Rh2在天然人參中并不存在，僅在紅參中含有Rh2約0. 001 %。
[0005] 臨床前及臨床研究已證實，人參總次苷有增強心肌收縮力、擴張冠狀動脈、增加冠 脈血流量、減少心肌耗氧量、保護心肌再灌注損傷、抑制血小板聚集、抗凝血酶等藥理活性， 臨床應(yīng)用于胸痹心痛（冠心病穩(wěn)定性心絞痛）等疾病的治療。
[0006] 本發(fā)明針對人參總次苷對心肌缺血后的作用進行了深入的研究，從脂質(zhì)組學(xué)角度 研究人參總次苷對心肌缺血損傷大鼠的心臟保護作用，特提出本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的主要發(fā)明目的在于提出了人參總次苷、Rg3、Rg5和/或Rkl在制備治療 和/或預(yù)防心肌缺血后脂質(zhì)代謝異常的藥物中的應(yīng)用。
[0008] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用的技術(shù)方案為：
[0009] 本發(fā)明涉及人參總次苷、Rg3、Rg5和/或Rkl在制備治療和/或預(yù)防心肌缺血后 脂質(zhì)代謝異常的藥物中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明還涉及人參總次苷、Rg3、Rg5和/或Rkl在制備調(diào)節(jié)心肌缺血后的血液或心 肌組織中心肌酶水平、S0D水平或MDA水平的藥物中的應(yīng)用。其中，所述的心肌酶包括AST、 LDH 和 CK。
[0011] 本發(fā)明還涉及人參總次苷、Rg3、Rg5和/或Rkl在制備調(diào)節(jié)心肌缺血后的血液或心 肌組織中脂肪酸水平的藥物中的應(yīng)用。其中，所述脂肪酸包括FA13、FA26、FA31或FA (22:0) 中的至少一種。
[0012] 本發(fā)明還涉及人參總次苷、Rg3、Rg5和/或Rkl在制備調(diào)節(jié)心肌缺血后的血 液或心肌組織中鞘酯水平的藥物中的應(yīng)用。其中，所述的鞘酯包括Cer(dl8 :1/18:0)、 Cer(dl8:1/26:0)、dhCer(dl8:0/18:0)、dhSph(dl8:0)、HexCer(dl8:1/18: 1)、 HexCer(dl8:1/24:0)、 Cer(dl8:1/16:0)、 dhCer(dl8:0/16:0)、 dhCer(dl8:0/24:0)、 HexCer (dl8:1/16:0)、HexCer (dl8:1/16:1)或 dhCer (dl8:0/16:0) -1_P 中的至少一種。
[0013] 本發(fā)明還涉及人參總次苷、Rg3、Rg5和/或Rkl在制備調(diào)節(jié)心肌缺血后的血液或 心肌組織中磷酸甘油酯水平的藥物中的應(yīng)用。其中，所述的磷酸甘油酯包括LPE(16:0)、 PC (36:2)、PC (36:6)、PC (38:7)、PE (40:4)、PE (40:6)、PE (42:2) P、LPE (20:4)、PE (40:8)、 LPI (20:4)、PC (32:2) 0、PI (34:2)、PI (36:1)、PI (36:3)、PI (36:4)和 PI (38:5)或磷脂酸乙 醇胺中的至少一種。
[0014] 本發(fā)明還涉及人參總次苷、Rg3、Rg5和/或Rkl在制備調(diào)節(jié)心肌缺血后的血液或 心肌組織中甘油酯水平的藥物中的應(yīng)用。其中，所述的甘油酯包括甘油三酯或甘油二酯。
[0015] 本發(fā)明還涉及人參總次苷、Rg3、Rg5和/或Rkl在制備調(diào)節(jié)心肌缺血后的心肌組 織中輔酶Q水平的藥物中的應(yīng)用；所述的輔酶Q包括輔酶Q8、輔酶Q9、輔酶Q10中的至少一 種。
[0016] 本發(fā)明還涉及一種血漿中與心肌酶相關(guān)的人參總次苷、Rg3、Rg5和/或Rkl藥 效生物標(biāo)志物，包括 FA3、FA4、FA13、FA14、FA (16:1)、FA31、FA34、FA37、FA (22:1)、FA48、 FA(20:6)、FA53、Cer (dl8:1/10:0)、Cer (dl8:1/14:0)、Cer (dl8:1/16:0、Cer (dl8:1/24:1)、 Cer(dl8:1/14:1)-1-P、 dhCer(dl8:0/16:0)、 dhCer(dl8:0/24:0)、 dhCer(dl8:0/24:l)、 HexCer (dl8:1/14:0)、HexCer (dl8:1/16:1)、HexCer (dl8:1/16:0)、HexCer (dl8:1/24:1)、 SM(dl8:1/16:1)、PC(38:5)P、PC(38:7)、PC(40:9)、PI(34:1)、PI(34:2)、PI(36:4)、 PI (36:5)、PI (38:1) P、PI (38:6)、PI (40:6)、DG (36:3) 0、DG (44:10)、TG (42:6)、TG (50:1)、 和TG (50:2)中的至少一種。
[0017] 本發(fā)明還涉及一種心肌中與心肌酶相關(guān)的人參總次苷、Rg3、Rg5和/或Rkl藥效 生物標(biāo)志物，包括C0Q9和dhCer (dl8:0/24:1)中的至少一種。
[0018] 下面對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步的解釋和說明
[0019] 人參總次苷是采用人參屬植物包括人參、三七、西洋參、竹節(jié)參進行提取、水解制 備而成。常用的制備方法有用酸水解、高溫高壓處理等。制備得到的人參總次苷中含有人 參水提物和人參醇提物中不存在的人參次苷成分。本發(fā)明從脂質(zhì)組學(xué)角度研究人參總次苷 對心肌缺血損傷大鼠的心臟保護作用，發(fā)現(xiàn)人參總次苷對于心肌缺血模型中血液和心肌細(xì) 胞的脂質(zhì)代謝具有顯著的調(diào)節(jié)作用。從而揭示了人參總次苷對心臟保護作用的機理。
[0020] 當(dāng)發(fā)生心肌缺血后，血漿和心肌組織中的心肌酶（包括：AST、LDH、CK)的活性在血 漿中顯著升高（P〈〇. 01)，在心肌組織中顯著降低（P〈〇. 01)，顯示心肌缺血損傷后心臟細(xì)胞 受損細(xì)胞破裂，將心肌酶釋放入血。血漿和心肌組織中MDA的活性顯著上升、S0D的活性顯 著下降（P〈0. 01)，顯示大鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度升高，氧自由基的清除能力下降。
[0021] 心肌缺血損傷模型大鼠脂質(zhì)代謝紊亂，人參總次苷能夠調(diào)節(jié)心肌缺血引起的代謝 紊亂。
[0022] 1?當(dāng)發(fā)生心機缺血后，血液中的脂肪酸FA13、FA26、FA31、FA39、FA(22:0)、 FA(22:2)顯著升高，F(xiàn)A30、FA32、FA43顯著下降，而人參總次苷能夠使脂肪酸含量整體下 降，包括 FA13、FA26、FA31 和 FA(22:0)。
[0023] 2.心肌缺血損傷發(fā)生后，血漿中32種鞘酯含量呈現(xiàn)顯著上升趨勢，包括6種神 經(jīng)酰胺，2種一磷酸神經(jīng)酰胺，4種二氫神經(jīng)酰胺，2種一磷酸二氫神經(jīng)酰胺，4種糖基化神 經(jīng)酰胺，鞘胺醇，二氫鞘胺醇和12種鞘磷脂。其中Cer(dl8 :l/18:0)、Cer(dl8:l/26:0)、 dhCer(dl8:0/18:0)、 dhSph(dl8:0)、 HexCer(dl8:1/18:1)、 HexCer(dl8:1/24:0) 和SM(dl8:0/18:1)上升幅度較大。人參總次苷、Rg3、Rg5和/或Rkl能夠顯著降 低包括 Cer (dl8:1/18:0)、Cer(dl8:1/26:0)、dhCer(dl8:0/18:0)、dhSph(dl8:0)、 HexCer (dl8:1/18:1)和HexCer (dl8:1/24:0)在內(nèi)的上述神經(jīng)酰胺、一磷酸神經(jīng)酰胺、二氫 神經(jīng)酰胺、糖基化神經(jīng)酰胺、二氫鞘胺醇、糖基化鞘胺醇和鞘磷脂。
[0024] 3.心肌缺血損傷發(fā)生后，血漿中29種磷酸甘油酯呈現(xiàn)顯著紊亂，其中4種溶血 性磷脂酸膽堿顯著上升；1種溶血性磷脂酸乙醇胺LPE(16:0)顯著下降；除PC(34:0)、 PC (34:2)、PC (36:0)、PC (36:2)顯著上升外，13種磷脂酸膽堿顯著下降；除PE (42:2) P顯著 上升外，6種磷脂酸乙醇胺顯著上升；7種磷脂酸肌醇顯著上升；而人參總次苷、Rg3、Rg5和 / 或 Rkl 能使 LPE(16:0)顯著上升；PC(36:2)、PC(36:6)和 PC(38:7)顯著下降；PE(40:4)、 PE(40:6)和PE(42:2)P顯著上升；使磷脂酸乙醇胺顯著下降；但對溶血性磷脂酸膽堿沒有 顯著性影響。
[0025] 4.心肌缺血損傷發(fā)生后血漿中25種甘油酯呈現(xiàn)顯著紊亂，其中3種甘油二酯顯著 下降，10種甘油三酯顯著下降（主要是酰基碳鏈為50-54的甘油三酯），12種甘油三酯顯著 上升（主要是?；兼湠?6-62的甘油三酯）。而人參總次苷、Rg3、Rg5和/或Rkl能使上 述甘油酯均呈現(xiàn)顯著性下降。
[0026] 5.當(dāng)發(fā)生心機缺血后，3種輔酶Q造模后顯著降低，人參總次苷、Rg3、Rg5和/或 Rkl能夠顯著升高這3種輔酶Q。
[0027] 6.心肌缺血損傷發(fā)生后，心肌細(xì)胞中34種鞘酯含量呈現(xiàn)顯著紊亂， 除Cer(dl8:1/16:0)和Cer(dl8:1/24:1)顯著上升外，6種神經(jīng)酰胺顯著下降；除 Cer(dl8:1/18:0)-1_P顯著上升外，3種一磷酸神經(jīng)酰胺顯著下降，除dhCer (dl8:0/20:0) 和dhCer (dl8:0/22:0)顯著下降外，5種二氫神經(jīng)酰胺顯著上升；1種一磷酸二氫神經(jīng)酰胺 dhCer(dl8 :0/16:0)-1-P顯著下降，7種糖基化神經(jīng)酰胺顯著上升，二氫鞘胺醇顯著上升， 除SM(dl8:1/20:0)和SM(dl8:1/22:0)顯著下降外，4種鞘磷脂顯著上升。人參總次苷、 Rg3、Rg5和/或Rkl能夠顯著降低心肌缺血造成的Cer (dl8:1/16:0)、dhCer (dl8:0/16:0)、 dhCer (dl8:0/18:0)、dhCer (dl8:0/24:0)、HexCer (dl8:1/16:0)、HexCer (dl8:1/16:1)和 dhSph(dl8:0)上升，顯著升高心肌缺血造成的dhCer(dl8:0/16:0)-l_P下降。
[0028] 7.心肌缺血損傷發(fā)生后，心肌細(xì)胞中44種磷酸甘油酯呈現(xiàn)顯著紊亂，其中除 LPC(22:4)顯著上升外，8種溶血性磷脂酸膽堿顯著下降；3種溶血性磷脂酸乙醇胺顯著下 降；1種溶血性磷脂酸乙醇胺LPI (20:4)顯著上升；1種溶血性磷脂酸絲氨酸LPS(18:0)顯 著上升；除PC (32:2)、PC (32:0)0、PC (34:0)、PC (36:3) P顯著上升外，9種磷脂酸膽堿顯著 下降；4種磷脂酸乙醇胺顯著下降；9種磷脂酸肌醇顯著上升。人參總次苷、Rg3、Rg5和/ 或Rkl能顯著升高心肌缺血造成的LPE(20:4)和PE(40:8)下降；顯著降低心肌缺血造成的 LPI (20:4)、PC (32:2) 0、PI (34:2)、PI (36:1)、PI (36:3)、PI (36:4)和 PI (38:5)升高；但對 溶血性磷脂酸膽堿沒有顯著性影響。
[0029] 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)心肌缺血發(fā)生后，不論是血漿還是心肌組織，整個脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)發(fā) 生嚴(yán)重紊亂，而人參總次苷、Rg3、Rg5和/或Rkl能夠全網(wǎng)絡(luò)多靶點地顯著調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊 亂。由此可見，人參總次苷、Rg3、Rg5和/或Rkl對心肌缺血的心臟保護作用與其全方位地 調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝素亂有關(guān)。
[0030] 本發(fā)明從脂質(zhì)代謝組學(xué)角度，研究了人參總次苷對大鼠心肌缺血損傷的心臟保護 作用。通過生化指標(biāo)和病理切片研究發(fā)現(xiàn)人參總次苷有效保護大鼠心臟免受心肌缺血造成 的損傷。通過T-test尋找組間差異脂質(zhì)以及脂質(zhì)代謝通路的分析，發(fā)現(xiàn)造模后脂質(zhì)代謝發(fā) 生顯著紊亂，而給予人參總次苷后可以顯著改善脂質(zhì)代謝紊亂。通過多統(tǒng)計分析和相關(guān)性 分析，在血漿中找到了 93個與心肌缺血損傷相關(guān)的病理生物標(biāo)志物，129個與人參總次苷 發(fā)揮藥效的生物標(biāo)志物，在心肌中發(fā)現(xiàn)了 94個與心肌缺血損傷相關(guān)的病理生物標(biāo)志物，34 個與人參總次苷發(fā)揮藥效的生物標(biāo)志物。其中，血漿中58種病理生物標(biāo)志物與心肌酶顯著 相關(guān)，77種藥效生物標(biāo)志物與心肌酶顯著相關(guān)；心肌中62種病理生物標(biāo)志物與心肌酶顯著 相關(guān)，5種藥效生物標(biāo)志物與心肌酶顯著相關(guān)。這些生物標(biāo)志物可以用來衡量心肌缺血損 傷的嚴(yán)重程度和人參總次苷心臟保護作用的藥效。以上研究表明人參總次苷對心肌缺血損 傷的心臟保護作用與其全方位多靶點的調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)密切相關(guān)。心肌酶可以用來衡量 心肌缺血損傷模型的成功和嚴(yán)重程度以及給藥組發(fā)揮心臟保護作用的療效。通過將找到的 生物標(biāo)志物與心肌酶進行spearman相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)血衆(zhòng)中有58種心肌缺血損傷病理生 物標(biāo)志物與心肌酶顯著相關(guān)，77種人參總次苷藥效生物標(biāo)志物與心肌酶顯著相關(guān)；心肌中 62種心肌缺血損傷病理生物標(biāo)志物與心肌酶顯著相關(guān)，5種人參總次苷藥效生物標(biāo)志物與 心肌酶顯著相關(guān)，這些生物標(biāo)志物可以用來衡量心肌缺血損傷的嚴(yán)重程度和人生總次苷心 臟保護作用的藥效。
[0031] 本發(fā)明從脂質(zhì)代謝組學(xué)角度研究人參總次苷、Rg3、Rg5和/或Rkl對心肌缺血損 傷大鼠的心臟保護作用，不僅揭示了人參總次苷治療的機理，并且為治療心機缺血提供了 全新的途徑。為與人參皂苷單體結(jié)構(gòu)相似的人工藥物的合成提供了全新的視角，并且可指 導(dǎo)其各類衍生物結(jié)構(gòu)的設(shè)計、為其藥效的評價提供全新的途徑。
【附圖說明】：
[0032] 圖1為大鼠心肌組織病理切片（A:對照組，B:模型組，C:地爾硫卓組，D:人參總 次苷組）；
[0033] 圖2為血漿中組間存在顯著性差異的脂肪酸；
[0034] 圖3為血漿中組間存在顯著性差異的鞘酯；
[0035] 圖4為血漿中組間存在顯著性差異的鞘酯；
[0036] 圖5為血漿中組間存在顯著性差異的磷酸甘油酯；
[0037] 圖6為血漿中組間存在顯著性差異的磷酸甘油酯和甘油酯；
[0038] 圖7為血漿中組間存在顯著性差異的甘油酯；
[0039] 圖8為心肌中組間存在顯著性差異的輔酶和鞘酯；
[0040] 圖9為心肌中組間存在顯著性差異的鞘酯；
[0041] 圖10為心肌中組間存在顯著性差異的磷酸甘油酯；
[0042] 圖11為心肌中組間存在顯著性差異的磷酸甘油酯；
[0043] 圖12為心肌中組間存在顯著性差異的甘油酯。
[0044] 本發(fā)明的【具體實施方式】僅限于進一步解釋和說明本發(fā)明，并不對本發(fā)明的內(nèi)容構(gòu) 成限制。
【具體實施方式】
[0045] 實施例1
[0046] 1 ?實驗步驟
[0047] 1. 1實驗材料
[0048] 人參總次苷（按照ZL200510083855. 6公開方法制備）；鹽酸地爾硫卓片（天津 田邊制藥有限公司）；異丙腎上腺素（Sigma，St. Louis，M0, USA);肌酸激酶（CK)、谷草轉(zhuǎn)氨 酶（AST)、乳酸脫氫酶（LDH)試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司）；超氧化物歧化酶 (S0D)和丙二醛（MDA)試劑盒（南京建成科技有限公司）。
[0049] 所有脂類化合物對照品和內(nèi)標(biāo)均購自Avanti公司，純度>98% ;甲基叔丁基醚 (HPLC 級，J.T.Baker);乙腈（MS 級，J.T.Baker);甲醇（農(nóng)殘級，J.T.Baker);異丙醇、氯仿 (均為HPLC級，Burdick&Jackson);甲酸銨、乙酸銨（均為HPLC級，Sigma);甲酸（HPLC級， TEDDIA);去離子水使用Millipore水凈化器制備。
[0050] 1. 2動物實驗
[0051] 雄性SD大鼠24只，適應(yīng)性飼養(yǎng)2周，正常飲食，溫度25±2°C，濕度50±5 %， 12h/12h晝夜交替。隨機分為4組，每組6只：對照組、模型組、地爾硫卓組（50mg/kg/day)、 人參總次苷組（200mg/kg/day)，每日灌胃給藥1次，連續(xù)28天，第27、28天給藥0. 5h后除 對照組外其余組大鼠皮下注射異丙腎上腺素（85mg/kg)造模。第29天斷頭采血，采樣前禁 食12h，全血經(jīng)4500r/min離心10min后分取血漿置于-80°C冰箱保存?zhèn)溆?。大鼠處死后?速取出心臟，用冰生理鹽水清洗、吸水紙拭干后，分離心尖用10%中性福爾馬林溶液固定， 進行蘇木精一伊紅染色01E stain)制作切片觀察心肌細(xì)胞損傷狀態(tài)；其余部分在液氮中 研成粉末后置于-80 °C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0052] 1. 3生化指標(biāo)測定
[0053] 取血漿和心肌組織按照試劑盒說明書測定谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST)、乳酸脫氫酶（LDH)、 肌酸激酶（CK)、超氧化物歧化酶（S0D)活性和丙二醛（MDA)含量。
[0054] 1.4脂質(zhì)組學(xué)分析測定
[0055] 脂肪酸采用反相SPE固相微萃取后經(jīng)柱前衍生化采用Agilent 6410B triple quadrupole LC-MS 測定。
[0056] 鞘脂類、磷酸甘油酯類、甘油脂類采用甲基叔丁醚萃取。其中低豐度脂質(zhì)采 用 Agilent6410B triple quadrupole LC-MS 測定；高豐度脂質(zhì)米用 ThermoHPLC-LTQ/ FTICR-MS 測定。
[0057] 此外，還米用 Agilent 6410B triple quadrupole LC-MS 測定了 3 種輔酶 Q。
[0058] 生物樣本中的低豐度脂質(zhì)采用Agilent MassHunter定量分析軟件中進行積分，采 用外標(biāo)曲線法計算得到各脂質(zhì)含量；高豐度脂質(zhì)采用Lipid Data Analyzer定量分析軟件 中快速識別積分得到峰面積，采用內(nèi)標(biāo)法計算得到各脂質(zhì)含量。
[0059] 1. 5統(tǒng)計分析
[0060] 采用SPSS軟件進行T-檢驗（符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)）和Mann-Whitney U檢驗 (不符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)）尋找組間有顯著性差異的脂質(zhì)（P〈〇. 05);采用Simca. P+軟件 對所有脂質(zhì)數(shù)據(jù)進行正交偏最小二乘判別分析（0PLS-DA)，尋找組間生物標(biāo)志物（VIP>1， Jack-knife>0，| Pcorr | >0. 58);采用SPSS軟件對脂質(zhì)生物標(biāo)志物和心肌酶進行 Spearman相關(guān)性分析，尋找與心肌酶變化具有顯著相關(guān)性的脂質(zhì)生物標(biāo)志物。
[0061] 2結(jié)果和討論
[0062] 2. 1心肌缺血損傷模型的驗證
[0063] 表1和表2為血漿和心肌組織中心肌酶（包括：AST、LDH、CK)和SOD、MDA的 活性。實驗發(fā)現(xiàn)模型組與對照組相比，AST、LDH、CK三種心肌酶的活性在血漿中顯著升 高（P〈0. 01)，在心肌組織中顯著降低（P〈0. 01)，顯示心肌缺血損傷后心臟細(xì)胞受損細(xì)胞 破裂，將心肌酶釋放入血。血漿和心肌組織中MDA的活性顯著上升、S0D的活性顯著下降 (P〈0. 01)，顯示大鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度升高，氧自由基的清除能力下降。上述指標(biāo)的變化 均顯示大鼠心肌缺血損傷后與正常大鼠存在顯著性差異，說明模型建立成功。
[0064] 圖1為大鼠心肌組織病理切片。其中，A:對照組，B:模型組，C:地爾硫卓組，D: 人參總次苷組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組大鼠心肌細(xì)胞排列緊密，肌纖維結(jié)構(gòu)清晰。模型組大鼠心 室壁及心內(nèi)膜下多處肌組織大面積凝固性壞死，壞死區(qū)域大量心肌細(xì)胞細(xì)胞核固縮，呈現(xiàn) 凋亡樣改變；部分心肌細(xì)胞腫脹，心肌細(xì)胞肌原纖維減少、消失，肌漿溶解，細(xì)胞空泡化，細(xì) 胞核仍存在；壞死灶中及其周圍組織可見炎性細(xì)胞浸潤，周圍間質(zhì)纖維組織增生明顯；心 內(nèi)膜下大量心肌細(xì)胞壞死，并且組織壞死嚴(yán)重，大量炎細(xì)胞浸潤，炎性肉芽組織生成；整個 心肌組織壞死區(qū)域范圍超過1/2 (透壁性心肌梗死）心室壁厚度。上述組織病理切片結(jié)果 顯示模型建立成功。2. 2人參總次苷的心臟保護作用
[0065] 表1和表2為血漿和心肌組織中心肌酶（包括：AST、LDH、CK)和S0D、MDA的活 性。實驗發(fā)現(xiàn)人參總次苷給藥組大鼠與模型組大鼠相比，血漿中心肌酶的含量顯著下調(diào) (P〈0. 01)，心肌組織中心肌酶的含量顯著提高（P〈0. 01)，說明人參總次苷對異丙腎上腺素 造成的缺血心肌具有顯著地保護作用。血漿和心肌組織中MDA的含量顯著下調(diào)、S0D的活 性顯著提高（P〈〇. 01)，說明人參總次苷可以增強機體內(nèi)源性氧自由基的清除功能，抑制脂 質(zhì)過氧化，保護缺血心肌組織。上述生化指標(biāo)的變化趨勢與陽性對照藥物地爾硫卓一致。 [0066] 圖1為大鼠心肌組織病理切片。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與模型組比較，地爾硫卓組和人參總次 苷組大鼠心肌細(xì)胞壞死區(qū)域減小，程度減輕，均能在一定程度上減輕心肌缺血造成的損傷。 上述結(jié)果進一步說明人參總次苷對心肌缺血損傷大鼠具有一定程度的心臟保護作用。
[0067] 表1 :大鼠血漿中心肌酶（U/L)和S0D(U/ml)、MDA(nnmol/ml)含量
[0069] **compared with Control，P〈0. 01，##compared with Model，P〈0. 01
[0070] 表2 :大鼠心肌組織中心肌酶（U/mg)和S0D(U/mg)、MDA(nmol/mg)含量
[0073] **compared with Control，P〈0. 01，##compared with Model，P〈0. 01
[0074] 2. 3實驗結(jié)果
[0075] 經(jīng)T-test檢驗，找到血漿組間有差異的脂質(zhì)。通過實驗發(fā)現(xiàn)，發(fā)生心肌缺血損傷 后脂質(zhì)代謝發(fā)生紊亂，而人參總次苷能夠顯著調(diào)節(jié)心肌缺血引起的脂質(zhì)代謝紊亂。
[0076] 2. 3. 1血漿中的脂肪酸含量：
[0077] 如圖2所示（模型組與對照組比較：**P〈0. 01，*P〈0. 05 ;人參總次苷組與模型組 比較：##P〈0. 01，#P〈0. 05)，脂肪酸 FA13、FA26、FA31、FA39、FA(22:0)、FA(22:2)造模后發(fā) 生顯著升高，F(xiàn)A30、FA32、FA43發(fā)生顯著下降，而人參總次苷能夠使脂肪酸含量整體下降，包 括 FA13、FA26、FA31 和 FA(22:0)。
[0078] 2. 3. 2血漿中的鞘酯含量：
[0079] 如圖3和圖4所示（模型組與對照組比較：#P〈0. 01，*P〈0. 05 ;人參總次苷組與 模型組比較：##P〈〇. 01，#P〈〇. 05)，心肌缺血損傷發(fā)生后，血漿中32種鞘酯含量呈現(xiàn)顯著上 升趨勢，包括6種神經(jīng)酰胺，2種一磷酸神經(jīng)酰胺，4種二氫神經(jīng)酰胺，2種一磷酸二氫神經(jīng) 酰胺，4種糖基化神經(jīng)酰胺，鞘胺醇，二氫鞘胺醇和12種鞘磷脂。其中Cer(dl8 :1/18:0)、 Cer(dl8:1/26:0)、dhCer(dl8:0/18:0)、dhSph(dl8:0)、HexCer(dl8:1/18: 1)、 HexCer(dl8:l/24:0)和SM(dl8:0/18:l)上升幅度較大。人參總次苷能夠顯著降 低包括 Cer (dl8:1/18:0)、Cer(dl8:1/26:0)、dhCer(dl8:0/18:0)、dhSph(dl8:0)、 HexCer (dl8:1/18:1)和HexCer (dl8:1/24:0)在內(nèi)的上述神經(jīng)酰胺、一磷酸神經(jīng)酰胺、二氫 神經(jīng)酰胺、糖基化神經(jīng)酰胺、二氫鞘胺醇、糖基化鞘胺醇和鞘磷脂。但對一磷酸二氫神經(jīng)酰 胺、鞘胺醇和大部分鞘磷脂沒有顯著降低作用。2. 3. 3血漿中磷酸甘油酯含量
[0080] 如圖5和圖6所示（模型組與對照組比較：#P〈0. 01，*P〈0. 05 ;人參總次苷組與 模型組比較：##P〈〇. 01，#P〈〇. 05)，心肌缺血損傷發(fā)生后，血漿中29種磷酸甘油酯呈現(xiàn)顯著 紊亂，其中4種溶血性磷脂酸膽堿顯著上升；1種溶血性磷脂酸乙醇胺LPE(16:0)顯著下 降；除PC(34:0)、PC(34:2)、PC(36:0)、PC(36:2)顯著上升外，13種磷脂酸膽堿顯著下降； 除PE(42:2)P顯著上升外，6種磷脂酸乙醇胺顯著上升；7種磷脂酸肌醇顯著上升；而人參 總次苷能使 LPE(16:0)顯著上升；PC(36:2)、PC(36:6)和 PC(38:7)顯著下降；PE(40:4)、 PE(40:6)和PE(42:2)P顯著上升；使磷脂酸乙醇胺顯著下降；但對溶血性磷脂酸膽堿沒有 顯著性影響。
[0081] 2. 3. 4血漿中甘油酯含量
[0082] 如圖6和圖7所示（模型組與對照組比較：#P〈0. 01，*P〈0. 05 ;人參總次苷組與模 型組比較：##P〈〇. 01，#P〈〇. 05)，心肌缺血損傷發(fā)生后，血漿中25種甘油酯呈現(xiàn)顯著紊亂， 其中3種甘油二酯顯著下降，10種甘油三酯顯著下降（主要是酰基碳鏈為50-54的甘油三 酯），12種甘油三酯顯著上升（主要是?；兼湠?6-62的甘油三酯）。而人參總次苷能使 上述甘油酯均呈現(xiàn)顯著性下降。
[0083] 2. 3. 5心肌細(xì)胞中輔酶Q含量
[0084] 如圖8所示（模型組與對照組比較：#P〈0. 01，*P〈0. 05 ;人參總次苷組與模型組 比較：##P〈0. 01，#P〈0. 05)，心肌缺血損傷發(fā)生后，心肌組織中3種輔酶Q造模后顯著降低， 而人參總次苷能夠顯著升高這3種輔酶Q。
[0085] 2. 3. 6心肌細(xì)胞中鞘酯含量
[0086] 如圖8和圖9所示（模型組與對照組比較：#P〈0. 01，*P〈0. 05 ;人參總次苷組與 模型組比較：##P〈〇. 01，#P〈〇. 05)，心肌缺血損傷發(fā)生后，心肌中34種鞘酯含量呈現(xiàn)顯著 紊亂，除Cer(dl8:l/16:0)和Cer(dl8 :l/24:1)顯著上升外，6種神經(jīng)酰胺顯著下降；除 Cer(dl8:1/18:0)-1_P顯著上升外，3種一磷酸神經(jīng)酰胺顯著下降，除dhCer (dl8:0/20:0) 和dhCer (dl8:0/22:0)顯著下降外，5種二氫神經(jīng)酰胺顯著上升；1種一磷酸二氫神經(jīng)酰胺 dhCer(dl8 :0/16:0)-1-P顯著下降，7種糖基化神經(jīng)酰胺顯著上升，二氫鞘胺醇顯著上升， 除SM(dl8:1/20:0)和SM(dl8:1/22:0)顯著下降外，4種鞘磷脂顯著上升。人參總次苷能 夠顯著降低心肌缺血造成的 Cer (dl8:1/16:0)、dhCer (dl8:0/16:0)、dhCer (dl8:0/18:0)、 dhCer (dl8:0/24:0)、HexCer(dl8:1/16:0)、HexCer(dl8:1/16:1)和 dhSph(dl8:0)上升，顯 著升高心肌缺血造成的dhCer (dl8:0/16:0)-1-P下降。2. 3. 7心肌細(xì)胞中磷酸甘油酯含量
[0087] 如圖9和圖10所示（模型組與對照組比較：#P〈0. 01，*P〈0. 05 ;人參總次苷組 與模型組比較：##P〈〇. 01，#P〈〇. 05)，心肌缺血損傷發(fā)生后心肌中44種磷酸甘油酯呈現(xiàn)顯 著紊亂，其中除LPC(22:4)顯著上升外，8種溶血性磷脂酸膽堿顯著下降；3種溶血性磷脂 酸乙醇胺顯著下降；1種溶血性磷脂酸乙醇胺LPI (20:4)顯著上升；1種溶血性磷脂酸絲氨 酸 LPS (18:0)顯著上升；除 PC(32:2)、PC(32:0)0、PC(34:0)、PC(36:3)P 顯著上升外，9 種 磷脂酸膽堿顯著下降；4種磷脂酸乙醇胺顯著下降；9種磷脂酸肌醇顯著上升。而人參總 次苷能顯著升高心肌缺血造成的LPE(20:4)和PE(40:8)下降；顯著降低心肌缺血造成的 LPI (20:4)、PC (32:2) 0、PI (34:2)、PI (36:1)、PI (36:3)、PI (36:4)和 PI (38:5)升高；但對 溶血性磷脂酸膽堿沒有顯著性影響。
[0088] 2. 3. 8心肌細(xì)胞中甘油酯含量
[0089] 如圖12所示（模型組與對照組比較：#P〈0. 01，*P〈0. 05 ;人參總次苷組與模型組 比較：##P〈0.01，#P〈0.05)，心肌缺血損傷發(fā)生后心肌中17種甘油酯呈現(xiàn)顯著上升，包括3 種甘油二酯和14種甘油三酯。而人參總次苷對甘油酯沒有顯著性影響。
[0090] 3.正交偏最小二乘-判別分析（0PLS-DA)方法對數(shù)據(jù)進行處理：
[0091] 為了進一步挖掘組間的細(xì)微差異，采用了正交偏最小二乘-判別分析（0PLS-DA) 方法對數(shù)據(jù)進行處理。通過將對照組和模型組進行0PLS-DA分析后，在血漿中發(fā)現(xiàn)了 93個 與心肌缺血損傷相關(guān)的病理生物標(biāo)志物，如表3和表4,其中包括脂肪酸8種，鞘酯29種，甘 油磷酸酯31種，甘油酯25種。在心肌中發(fā)現(xiàn)了 94個與心肌缺血損傷相關(guān)的病理生物標(biāo)志 物，見表3,其中包括輔酶Q3種，鞘酯33種，甘油磷酸酯41種，甘油酯17種。將人參總次 苷組和模型組進行0PLS-DA分析后，在血漿中發(fā)現(xiàn)了 129個與人參總次苷發(fā)揮藥效的生物 標(biāo)志物，其中包括脂肪酸21種，鞘酯25種，甘油磷酸酯31種，甘油酯52種。在心肌中發(fā)現(xiàn) 了 34個與人參總次苷發(fā)揮藥效的生物標(biāo)志物，其中包括輔酶Q 2種，鞘酯15種，甘油磷酸 酯16種，甘油酯1種。
[0092] 表3 :大鼠血漿中與心肌缺血損傷相關(guān)的病理生物標(biāo)志物和人參總次苷的藥效生 物標(biāo)志物
[0093]


[0096] 表4 :大鼠心肌中與心肌缺血損傷相關(guān)的病理生物標(biāo)志物和人參總次苷的藥效生 物標(biāo)志物
[0097]

[0099] 4脂質(zhì)生物標(biāo)志物與心肌酶相關(guān)性研究
[0100] 心肌酶可以用來衡量心肌缺血損傷模型的成功和嚴(yán)重程度以及給藥組發(fā)揮心臟 保護作用的療效。將上述找到的生物標(biāo)志物與心肌酶進行spearman相關(guān)性分析，得到生物 標(biāo)志物與心肌酶相關(guān)性熱圖，具體如表5~8所示。從中發(fā)現(xiàn)血漿中有58種心肌缺血損傷 病理生物標(biāo)志物與心肌酶顯著相關(guān)，77種人參總次苷藥效生物標(biāo)志物與心肌酶顯著相關(guān)； 心肌中62種心肌缺血損傷病理生物標(biāo)志物與心肌酶顯著相關(guān)，5種人參總次苷藥效生物標(biāo) 志物與心肌酶顯著相關(guān)，這些生物標(biāo)志物可以用來衡量心肌缺血損傷的嚴(yán)重程度和人生總 次苷心臟保護作用的藥效。
[0101] 表5 :血漿中與心肌酶相關(guān)的心肌缺血損傷病理生物標(biāo)志物
[0102]

[0104] 其中：1表示顯著性相關(guān)；0表示非顯著性相關(guān)。
[0105] 表6 :血漿中與心肌酶相關(guān)的人參總次苷藥效生物標(biāo)志物
[0106]

[0108] 其中：1表示顯著性相關(guān)；0表示非顯著性相關(guān)。
[0109] 表7 :心肌中與心肌酶相關(guān)的心肌缺血損傷病理生物標(biāo)志物
[0111]
[0112] 其中：1表示顯著性相關(guān)；0表示非顯著性相關(guān)。
[0113] 表8 :心肌中與心肌酶相關(guān)的人參總次苷藥效生物標(biāo)志物
[0115] 其中：1表示顯著性相關(guān)；0表示非顯著性相關(guān)。
[0116] 本發(fā)明采用Rg3、Rg5和/或Rkl進行上述實驗，可取的相似的實驗結(jié)果，限于篇 幅，不再贅述。
【主權(quán)項】
1. 人參總次苷、Rg3、Rg5和/或Rkl在制備治療和/或預(yù)防心肌缺血后脂質(zhì)代謝異常 的藥物中的應(yīng)用。2. 人參總次苷、Rg3、Rg5和/或Rkl在制備調(diào)節(jié)心肌缺血后的血液或心肌組織中脂肪 酸水平的藥物中的應(yīng)用。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述脂肪酸包括FA13、FA26、FA31或 FA (22:0)中的至少一種。4. 人參總次苷、Rg3、Rg5和/或Rkl在制備調(diào)節(jié)心肌缺血后的血液或心肌組織中鞘酯 水平的藥物中的應(yīng)用。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的鞘酯包括Cer(dl8:1/18:0)、 Cer(dl8:1/26:0)、dhCer(dl8:0/18:0)、dhSph(dl8:0)、HexCer(dl8:1/18: 1)、 HexCer(dl8:1/24:0)、 Cer(dl8:1/16:0)、 dhCer(dl8:0/16:0)、 dhCer(dl8:0/24:0)、 HexCer (dl8:1/16:0)、HexCer (dl8:1/16:1)或 dhCer (dl8:0/16:0) -1_P 中的至少一種。6. 人參總次苷、Rg3、Rg5和/或Rkl在制備調(diào)節(jié)心肌缺血后的血液或心肌組織中磷酸 甘油酯水平的藥物中的應(yīng)用。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的磷酸甘油酯包括LPE(16:0)、 PC (36:2)、PC (36:6)、PC (38:7)、PE (40:4)、PE (40:6)、PE (42:2) P、LPE (20:4)、PE (40:8)、 LPI (20:4)、PC (32:2) 0、PI (34:2)、PI (36:1)、PI (36:3)、PI (36:4)和 PI (38:5)或磷脂酸乙 醇胺中的至少一種。8. 人參總次苷、Rg3、Rg5和/或Rkl在制備調(diào)節(jié)心肌缺血后的血液或心肌組織中甘油 酯水平的藥物中的應(yīng)用。9. 人參總次苷、Rg3、Rg5和/或Rkl在制備調(diào)節(jié)心肌缺血后的心肌組織中輔酶Q水平 的藥物中的應(yīng)用。10. -種血漿中與心肌酶相關(guān)的人參總次苷、Rg3、Rg5和/或Rkl藥效生物標(biāo)志 物，包括 FA3、FA4、FA13、FA14、FA(16:1)、FA31、FA34、FA37、FA(22:1)、FA48、FA(20:6)、 FA53、Cer(dl8:1/10:0)、Cer(dl8:1/14:0)、Cer(dl8:1/16:0、Cer(dl8:1/24:1)、 Cer(dl8:1/14:1)-1-P、 dhCer(dl8:0/16:0)、 dhCer(dl8:0/24:0)、 dhCer(dl8:0/24:l)、 HexCer (dl8:1/14:0)、HexCer (dl8:1/16:1)、HexCer (dl8:1/16:0)、HexCer (dl8:1/24:1)、 SM(dl8:1/16:1)、PC(38 :5) P、PC(38:7)、PC(40:9)、PI(34:1)、PI(34:2)、PI(36:4)、 PI (36:5)、PI (38:1) P、PI (38:6)、PI (40:6)、DG (36:3) 0、DG (44:10)、TG (42:6)、TG (50:1)、 和TG (50:2)中的至少一種。11. 一種心肌中與心肌酶相關(guān)的人參總次苷、Rg3、Rg5和/或Rkl藥效生物標(biāo)志物，包 括 C0Q9 和 dhCer (dl8:0/24:1)中的至少一種。
【文檔編號】A61K36/258GK105853482SQ201510030935
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2015年1月21日
【發(fā)明人】熊慧
【申請人】熊慧