葡萄球菌感染的被動(dòng)免疫的制作方法
【專利摘要】本文公開特異性結(jié)合至葡萄球菌屬自溶素N?乙酰胞壁酰?L?丙氨酸酰胺酶催化結(jié)構(gòu)域和/或細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體或其結(jié)合部分，以及含有所述抗體或其結(jié)合部分的藥物組合物。還公開表達(dá)所述單克隆抗體的細(xì)胞系，包括雜交瘤。描述使用所述單克隆抗體來安裝矯形植入物、移植物或醫(yī)療裝置，治療或預(yù)防葡萄球菌感染，和治療骨髓炎的方法，并且描述檢測(cè)樣品中的葡萄球菌的診斷方法。
【專利說明】葡萄球菌感染的被動(dòng)免疫
[0001 ]本申請(qǐng)要求2013年12月13日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)61/915，953的優(yōu)先 權(quán)權(quán)益，所述申請(qǐng)全部以引用方式并入本文。
[0002] 使用領(lǐng)域
[0003] 本文公開用于針對(duì)葡萄球菌感染的被動(dòng)免疫，尤其預(yù)防或治療骨髓炎和由于植入 醫(yī)療裝置，或矯形植入物或移植物引起的感染的方法和組合物。特異性結(jié)合至葡萄球菌屬 自溶素N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶催化結(jié)構(gòu)域和/或細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體，和含有 所述抗體的藥物組合物可用于這些用途。
[0004] 背景
[0005] 存在對(duì)于慢性骨髓炎(0M)的新干預(yù)措施的極大需求，因?yàn)樵诿绹?guó)每年發(fā)生大約 I 12,000例矯形裝置相關(guān)感染，每個(gè)感染事件的醫(yī)院成本大概為$15,000-70,000 (Darouiche，"Treatment of Infections Associated With Surgical Implants，'， N.Engl.J.Med.350(14): 1422-9(2004)) ^雖然外科技術(shù)和積極抗生素預(yù)防的改進(jìn)將矯形植 入物手術(shù)之后的感染率降低至1-5%，但是骨髓炎(0M)仍然是嚴(yán)重問題并且似乎由于微創(chuàng) 手術(shù)而出現(xiàn)上升勢(shì)頭（Mahomed等人，"Rates and Outcomes of Primary and Revision Total Hip Replacement in the United States Medicare PopulationJ.Bone Joint Surg.Am.85(A-l):27-32(2003)；WHO Global Strategy for Containment of Antimicrobial Resistance，2001) D骨髓炎再次激增的80%是由金黃色葡萄球菌造成的， 這一現(xiàn)象的重要性由于以下事實(shí)而增加:~50%的臨床分離物是甲氧西林抗性金黃色葡萄 球菌(MRSA)。雖然在最近十年間，關(guān)節(jié)假體和骨折固定裝置的感染率僅分別占病例的0.3- II %和5-15%(Lew和Waldvogel，"Osteomyelitis，"Lancet 364(9431):369-79(2004); Toms等人，"The Management of Peri-Prosthetic Infection in Total Joint Arthroplasty，" J.Bone Joint Surg.Br.88(2): 149-55(2006))，但是此結(jié)果可導(dǎo)致截肢或 死亡。另外，在選任的全關(guān)節(jié)置換(TJR)的"微創(chuàng)手術(shù)"中，極小切口經(jīng)常導(dǎo)致由于假體在植 入期間接觸皮膚而引起并發(fā)癥，這種微創(chuàng)手術(shù)的普及化顯著地增加0M的發(fā)病率(Mahomed等 人，"Rates and Outcomes of Primary and Revision Total Hip Replacement in the United States Medicare Population/Jj.Bone Joint Surg.Am.85(A~1):27-32(2003)； WHO Global Strategy for Containment of Antimicrobial Resistance，2001 )〇這些感 染需要極高代價(jià)的兩階段翻修手術(shù)，并且最近的報(bào)告表明成功率可低至50% (Azzam等人， "Outcome of a Second Two-stage Reimplantation for Periprosthetic Knee Inf ect ion，" Cl in .Orthop.Relat. Res .467(7): 1706-14(2009)) D然而，最大的問題是出現(xiàn) 藥物抗性葡萄球菌菌株，最顯著地MRSA，它已經(jīng)超越HIV成為北美洲最致命的病原體，并且 繼續(xù)使慢性0M的控制變得更加困難和高代價(jià)，導(dǎo)致對(duì)于治療患有這些感染的患者的新治療 干預(yù)措施的極大需求。存在對(duì)于替代干預(yù)策略的極大需求，尤其對(duì)于作為TJR的主要接受者 的免疫受損老年人來說更是如此。
[0006]目前，不存在可保護(hù)高風(fēng)險(xiǎn)患者免遭MRSA的預(yù)防性療法，最顯著地是占每年在美 國(guó)進(jìn)行的150萬TJR中的大多數(shù)的逐漸衰老的"在嬰兒潮時(shí)期出生的人"。降低MRSA發(fā)病率 50-80 %的疫苗將不僅減少關(guān)節(jié)置換和開放骨折修復(fù)程序的頭號(hào)并發(fā)癥，而且在類似的程 度上削減醫(yī)療保健負(fù)擔(dān)。
[0007] 研究證明80%的慢性0M由金黃色葡萄球菌導(dǎo)致。這些細(xì)菌含有使得它們成為骨骼 病原體的若干因素，包括促進(jìn)其結(jié)合至骨骼基質(zhì)的若干細(xì)胞表面粘附分子(Flock等人， "Cloning and Expression of the Gene for a Fibronectin-Binding Protein from Staphylococcus aureus，"EMB0 J. 6(8): 2351-7(1987))、能夠刺激骨骼再吸收的毒素 (Nair等人，"Surface-Associated Proteins from Staphylococcus aureus Demonstrate Potent Bone Resorbing Activity/'J.Bone Miner.Res. 10(5) :726_34(1995))，以及通過 刺激破骨細(xì)胞活性增加而使骨路降解（Marriott等人，"Osteoblasts Express the Inflammatory Cytokine Interleu kin-6 in a Murine Model of Staphylococcus aureus Osteomyelitis and Infected Human Bone Tissue，'，Am. J.Pathol ? 164(4): 1399-406(2004) h感染進(jìn)展和持續(xù)的速率限制步驟是在植入裝置周圍形成生物膜(Costerton等 人，"Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections，'，Science 284 (5418): 1318-22(1999))。在植入之后不久，由來源于宿主的細(xì)胞外基質(zhì)組分(包括纖維蛋 白原、纖連蛋白和膠原蛋白）組成的調(diào)節(jié)層在植入物的表面上形成并且引起來源于血行性 傳染的自由漂浮細(xì)菌或來自以下來源的細(xì)菌的粘附：鄰近感染病灶諸如傷口附近皮膚、在 手術(shù)過程中細(xì)菌在骨骼中的接種，或與相關(guān)聯(lián)軟組織骨骼殼層的顯著破壞一致的外傷 (Darouiche，"Treatment of Infecti ons Associated With Surgical Implants，'， N.Engl. J.Med. 350(14): 1422-9(2004) h在隨后幾天，增加的菌落粘附、細(xì)菌細(xì)胞分裂、募 集額外浮游生物體和分泌細(xì)菌細(xì)胞外聚合物(諸如形成糖萼的聚合物)產(chǎn)生細(xì)菌生物膜。此 生物膜充當(dāng)保護(hù)細(xì)菌免于抗生素、吞噬細(xì)胞和抗體作用的主要屏障并且削弱宿主淋巴細(xì)胞 功能（Gray等人，"Effect of Extracellular Slime Substance from Staphylococcus epidermidis on the Human Cellular Immune Response，'，Lancet 1 (8373) : 365-7 (1984); Johnson等人，"Interference with Granulocyte Function by Staphy lococcus epidermidis SIime，" Infect ? Immun ? 54( 1): 13-20(1986);Naylor等人，"Antibiotic Resistance of Biomaterial-Adherent Coagulase-Negative and Coagulase-Positive Staphylococci，"Clin.Orthop.Relat.Res?261:126_33(1990))。
[0008] 另一個(gè)最近發(fā)現(xiàn)是金黃色葡萄球菌不僅移居骨骼基質(zhì)，而且由成骨細(xì)胞在體外 (Ellington等人，"Involvement of Mitogen-Activated Protein Kinase Pathways in Staphylococcus aureus Invasion of Normal Osteoblasts，'，Infect?Immun?69(9): 5235-42(2001))和體內(nèi)（Reilly等人，"In Vivo Internalization of Staphylococcus aureus by Embryonic Chick 0steoblasts，"Bone 26(1) :63_70(2000))內(nèi)在化。這提供另 一層的抗體和抗生素抗性。此階段的感染在代謝活動(dòng)顯著減少的狀況下發(fā)生并且有時(shí)以所 謂小菌落變體形式出現(xiàn)，這些變體可能造成其持續(xù)性(Proctor等人，"Persistent and Relapsing Infections Associated with Small-Colony Variants of Staphylococcus aureus，"Clin.Infect.Dis.20(l) :95_102(1995))。在此時(shí)點(diǎn)，細(xì)菌還可表達(dá)對(duì)于抗菌劑治 療的表型抗性，這也為短治療過程的較高失效率提供原因（Chuard等人，"Resistance of Staphylococcus aureus Recovered From Infected Foreign Body in Vivo to Killing by Antimicrobials，"J. Infect .Dis. 163(6): 1369_73( 1991)) D 由于這些廣泛發(fā)病機(jī)理，眾 所周知0M往往甚至在被遏制幾年之后也會(huì)復(fù)發(fā)，并且通常認(rèn)為最終完全治愈是不可能的 (Mader和Calhoun，"Long-Bone Osteomyelitis Diagnosis and Management，'， Hosp.Pract.(Off Ed)29(10):71-6,9,83##(1994))。
[0009] 慢性0M領(lǐng)域中的一個(gè)關(guān)鍵問題是為什么當(dāng)前對(duì)于調(diào)控慢性0M的因素的了解如此 有限。按照推測(cè)，闡明細(xì)菌致病基因所需要的實(shí)驗(yàn)工具一個(gè)多世紀(jì)以來已經(jīng)為人所利用。對(duì) 于此不正常情況，存在三種解釋。首先，雖然骨髓炎病例的總數(shù)較高，但是對(duì)于嚴(yán)格前瞻性 臨床研究來說，其1-5%的發(fā)病率太低，并且有可能不需要翻修關(guān)節(jié)成形術(shù)。其次，熟知體外 培養(yǎng)物迅速地對(duì)于不獲取細(xì)胞外包膜的生物體的生長(zhǎng)作出有利的選擇，以使得生物膜生物 學(xué)只可使用體內(nèi)模型來研究（Costerton等人，"Bacterial Biofilms:A Common Cause of Persistent Infections，" Science 284(5418): 1318_22( 1999)) D這導(dǎo)致此領(lǐng)域中的"最大 障礙，"即不存在可評(píng)估在生物膜形成之前的細(xì)菌初始浮游生長(zhǎng)階段的定量動(dòng)物模型。迄今 為止，其致病原因的很多知識(shí)來自動(dòng)物模型（Norden，"Lessons Learned from Animal Models of Os teomyel it is，" Rev ? Inf ect .Dis.lO(l): 103-10 (1988))，所述模型針對(duì)雞 (Daum等人，"A Model of Staphylococcus aureus Bacteremia，Septic Arthritis，and Osteomyelitis in Chickens，"J.0rthop. Res .8(6): 804-13(1990))、大鼠（Rissing等人， "Model of Experimental Chronic Osteomyelitis in Rats，'，Infect ? Immun .47(3): 581-6(1985))、膝鼠（Passl等人，"A Model of Experimental Post-Traumatic Osteomyelitis in Guinea Pigs，" J.Trauma 24(4) :323_6(1984))、兔（Worlock 等人，"An ExperimentalModel of Po s t-Trauma t i c Osteomyelitis in Rabbits，'， Br ? J ? Exp ? Pathol ? 69(2): 235_44( 1988))、犬（Varshney等人，"Experimental Model of Staphylococcal Osteomyelitis in Dogs，'，Indian J.Exp.Biol.27(9):816_9(1989))、綿 羊（Kaarsemaker等人，"New Model for Chronic Osteomyelitis With Staphylococcus aureus in Sheep，"Clin.Orthop.Relat.Res .339:246-52(1997))和最近小鼠（Marriott等 人，"Osteoblasts Express the Inflammatory Cytokine Interleukin_6in a Murine Model of Staphylococcus aureus Osteomyelitis and Infected Human Bone Tissue，'， Am. J.Pathol. 164(4): 1399-406(2004))來開發(fā)。雖然這些模型用于證實(shí)從體外測(cè)定中識(shí)別 的細(xì)菌粘附素的重要性（Chuard等人，"Susceptibility of Staphylococcus aureus Growing on Fibronectin-Coated Surfaces to Bactericidal Antibiotics，'， Antimicrob.Agents Chemo ther.37(4):625_32(1993);Buxton等人，"Binding of a Staphylococcus aureus Bone Pathogen to Type I Collagen，'，Microb.Pathog.8(6): 441_8( 1990); Switalski等人，"A Collagen Receptor on Staphylococcus aureus Strains Isolated From Patients With Septic Arthritis Mediates Adhesion to Cartilage，"Mol.Microbiol. 7(1): 99-107(1993))，但是其不具有體內(nèi)生長(zhǎng)、細(xì)菌負(fù)載或骨 質(zhì)溶解的結(jié)果量度。因此，其不能有效地用于評(píng)估藥物效果、細(xì)菌突變體，和使用轉(zhuǎn)基因小 鼠的宿主因子的作用。
[0010]基于超過150年的研究，解釋葡萄球菌致病原因的清楚范式已經(jīng)出現(xiàn)。此模型也適 用于0M。初始感染步驟在單細(xì)胞細(xì)菌侵入身體時(shí)發(fā)生。在此時(shí)點(diǎn)，微生物必須對(duì)于環(huán)境變化 作出響應(yīng)并且表達(dá)幫助它戰(zhàn)勝先天性免疫并且為它提供連接至宿主的粘附素受體的致病 基因。為了使粘附和表面移生能夠發(fā)生，細(xì)菌還依賴于來自壞死組織或外來物體諸如植入 物的宿主粘附目標(biāo)的隨機(jī)可獲得性。這些步驟的成功完成導(dǎo)致指數(shù)生物膜生長(zhǎng)階段，所述 階段在營(yíng)養(yǎng)物耗盡和/或顯現(xiàn)適應(yīng)性免疫的時(shí)點(diǎn)處停止。在指數(shù)生長(zhǎng)階段之后，細(xì)菌在多層 生物膜內(nèi)、在隱匿生長(zhǎng)條件下繼續(xù)存在直到群體感測(cè)驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá)變化允許生物膜的一 部分分離為浮游細(xì)胞或生物膜斑片的移動(dòng)片段為止(Yarwood等人，"Quorum Sensing in Staphylococcus aureus Biofilms，"J.Bact ? 186(6): 1838-1850(2004))。然而，在此時(shí)點(diǎn)， 感染現(xiàn)在是慢性的并且不能通過藥物或宿主免疫來根除。因此，此領(lǐng)域的焦點(diǎn)在于細(xì)胞表 面細(xì)胞外基質(zhì)組分，所述組分與被稱為MSCRAMM(識(shí)別粘附基質(zhì)分子的微生物表面組分）的 一類細(xì)菌粘附素特異性相互作用（Patti等人，"MSCRAMM-Mediated Adherence of Microorganisms to Host Tissues，"Annu.Rev.Microbiol.48:585-617(1994))。事實(shí)上， 迄今為止開發(fā)的基本上所有抗金黃色葡萄球菌疫苗一直針對(duì)對(duì)于宿主組織移生和侵入至 關(guān)重要的MSCRAMM。這些疫苗的目標(biāo)是產(chǎn)生抗體，所述抗體結(jié)合至這些細(xì)菌表面抗原，從而 抑制其連接至宿主組織并且抑制充當(dāng)長(zhǎng)期感染儲(chǔ)槽的生物膜的形成。通過調(diào)理細(xì)菌表面， 這些抗體也可介導(dǎo)通過吞噬細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)的金黃色葡萄球菌清除。遺憾的是，金黃色葡萄球 菌具有許多粘附素，以使得抑制一或多種可能不足以防止細(xì)菌連接。此外，通過吞噬細(xì)胞的 細(xì)菌清除可在無血管組織諸如骨骼中受到限制以使得單獨(dú)抗體可能需要額外抗微生物作 用機(jī)制以顯著減少金黃色葡萄球菌的體內(nèi)浮游生長(zhǎng)并且防止慢性0M的確立或翻修全關(guān)節(jié) 置換手術(shù)期間的再感染。
[0011] 雖然Schwarz等人的PCT公布號(hào)W02011/140114和W02013/066876描述特異性結(jié)合 至葡萄球菌氨基葡萄糖苷酶并且抑制葡萄球菌菌株的體內(nèi)生長(zhǎng)的多種單克隆抗體（以下 "mAb"），但是仍然需要識(shí)別特異性結(jié)合至不同葡萄球菌目標(biāo)并且抑制其功能的額外mAb。
[0012] 本發(fā)明旨在克服本領(lǐng)域中的這些和其它不足。
[0013] 發(fā)明概述
[0014] 第一方面涉及特異性結(jié)合至葡萄球菌屬自溶素N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶催 化結(jié)構(gòu)域或細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體或其結(jié)合部分。
[0015] 第二方面涉及表達(dá)如本文公開的單克隆抗體或其結(jié)合部分的細(xì)胞系。
[0016] 第三方面涉及包括載體和如本文公開的一或多種單克隆抗體或單克隆抗體結(jié)合 部分的藥物組合物。
[0017] 第四方面涉及將矯形植入物或醫(yī)療裝置引入患者的方法，涉及向需要矯形植入物 的患者施用有效量的根據(jù)如本文公開的第一方面的單克隆抗體或單克隆抗體結(jié)合部分、根 據(jù)如本文公開的第三方面的藥物組合物或其組合，并且將矯形植入物、組織移植物或醫(yī)療 裝置引入患者。
[0018]第五方面涉及治療或預(yù)防葡萄球菌感染的方法，包括向易患或患有葡萄球菌感染 的患者施用有效量的根據(jù)如本文公開的第一方面的單克隆抗體或單克隆抗體結(jié)合部分、根 據(jù)如本文公開的第三方面的藥物組合物或其組合。
[0019] 第六方面涉及治療骨髓炎的方法，涉及向患有葡萄球菌骨骼或關(guān)節(jié)感染的患者施 用有效量的根據(jù)如本文公開的第一方面的單克隆抗體或單克隆抗體結(jié)合部分、根據(jù)如本文 公開的第三方面的藥物組合物或其組合。
[0020] 第七方面涉及確定樣品中的葡萄球菌的存在的方法，涉及將樣品暴露于根據(jù)如本 文公開的第一方面的單克隆抗體或結(jié)合部分，并且檢測(cè)是否在單克隆抗體或結(jié)合部分與存 在于樣品中的葡萄球菌或葡萄球菌酰胺酶之間形成免疫復(fù)合物，由此所述暴露之后的免疫 復(fù)合物的存在指示樣品中的葡萄球菌的存在。
[0021 ]葡萄球菌N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶（以下"Amd"或"酰胺酶"）具有使它成為 被動(dòng)免疫的有吸引力的目標(biāo)的多種性質(zhì)。酰胺酶涉及多種關(guān)鍵細(xì)胞功能，包括細(xì)菌細(xì)胞粘 附、細(xì)胞分裂、經(jīng)由其介導(dǎo)產(chǎn)生糖萼細(xì)胞外DNA的自溶作用來分泌和生物膜糖萼形成;它在 金黃色葡萄球菌臨床分離物之間是高度保守的；它是萬古霉素的目標(biāo)并且它在整個(gè)細(xì)胞周 期中表達(dá)。此外，因?yàn)锳md展示于細(xì)胞壁上，所以它可被存在于細(xì)胞外環(huán)境中的抗體接近。
[0022] 單克隆抗體和其結(jié)合部分，以及含有所述抗體或其結(jié)合部分的藥物組合物是適合 于在患有葡萄球菌菌株感染或處于所述感染風(fēng)險(xiǎn)中的患者中進(jìn)行免疫療法的治療劑。這些 單克隆抗體的能力來自于其阻礙葡萄球菌菌株的生長(zhǎng)、粘附和免疫逃避的多種活性。首先， 作為抗體，其在初始葡萄球菌感染位點(diǎn)處促進(jìn)嗜中性白細(xì)胞的噬菌作用。其次，作為葡萄球 菌酰胺酶，一種在葡萄球菌存活和表面移生中具有多種作用的酶的抑制劑，這些抗體潛在 地阻礙細(xì)胞分裂和生物膜形成中的一個(gè)或兩個(gè)。最后，如在本文中展示，所公開的抗體減少 葡萄球菌擴(kuò)散，如形成較少膿腫所證明，并且提供膿腫的巨噬細(xì)胞侵入，促進(jìn)形成無菌膿腫 并且加速骨骼愈合。
[0023] 附圖簡(jiǎn)述
[0024] 圖1是代表所有葡萄球菌屬雙功能自溶素蛋白質(zhì)的金黃色葡萄球菌雙功能自溶素 (AtlA)的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的示意圖。雙功能自溶素作為1276氨基酸前酶原來合成。31-氨基酸信 號(hào)肽(aa 1-31)在分泌期間移除并且167-氨基酸前肽(aa 32-197)在自溶素插入細(xì)胞壁中 時(shí)移除。細(xì)胞分裂之后，成熟自溶素在氨基酸775處裂解以產(chǎn)生獨(dú)立AmdRlR2(N-乙酰胞壁 酰-L-丙氨酸酰胺酶，或酰胺酶(Amd);aal98-775)和R3Gmd(內(nèi)切-0-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶 (Gmd);aa776-1276)。
[0025] 圖2是展示八種抗Amd單克隆抗體和具有不相關(guān)特異性的同種型匹配抗體抑制Amd 酶活性的圖表。重組Amd (rAmd)在大腸桿菌中制備(表1中的Hi s-AmdR 1R2-B)。rAmd (1.5ug/ mL)在PBS中與從金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁制備的肽聚糖的混濁懸浮液混合并且其溶解活性 在37°C下孵育60分鐘（A 60)之后通過混濁度（測(cè)量為A49〇)的減少來測(cè)量。對(duì)于抑制測(cè)試， rAmd的濃度足以減少A49Q達(dá)70%。將純化抗Amd mAb在指示濃度下添加至rAmd，然后測(cè)量肽 聚糖通過Mab:rAmd混合物的溶解。抑制百分比計(jì)算為：100x( 1-( A 60A49Q抑制劑/ A 6OA490無 抑制劑對(duì)照））。
[0026] 圖3是通過代表性抗Amd抗體的金黃色葡萄球菌沉淀的圖像。當(dāng)金黃色葡萄球菌細(xì) 胞在最具有葡萄球菌特異性的mAb存在下培養(yǎng)時(shí)，其形成較大集群，所述集群從懸浮液中沉 降以產(chǎn)生相對(duì)透明上清液。在各自25yg/mL的所指示抗Amd mAb存在下，USA300LAC金黃色葡 萄球菌在37°C下在TSB中培養(yǎng)八小時(shí)。不含有抗體(無Ab)并且具有不相關(guān)同種型匹配抗體 (同種型對(duì)照）的樣品具有混池上清液而沒有明顯細(xì)胞球團(tuán);mAb Amdl. 1、Amdl .6、Amdl .8、 Amdl. 11和Amdl. 16具有透明上清液和細(xì)胞球團(tuán)。產(chǎn)生透明上清液和細(xì)胞球團(tuán)的其他mAb與 未能使金黃色葡萄球菌從懸浮液中沉淀的mAb-樣在以下表2中列出。
[0027] 圖4示出固定mAb Amdl .6與可溶性Amd的生物分子相互作用分析。mAb Amdl .6與可 溶性Amd之間的相互作用的親和力在Biacore T-200上測(cè)量。將兔抗小鼠Fc IgG固定于CM-5 生物傳感器芯片表面上并且用于捕獲mAb Amdl .6,其然后捕獲來自流動(dòng)場(chǎng)的Amd。由mAb Amdl .6結(jié)合的Amd的質(zhì)量相對(duì)于x軸上的時(shí)間以共振單位(y軸)來測(cè)量。呈現(xiàn)捕獲(締合，t = 0至120sec)和釋放(解離，t=120至420sec)階段。使用以兩倍增量從1.56至25nM變化的Amd 的濃度來重復(fù)實(shí)驗(yàn)。測(cè)量根據(jù)制造商說明書來進(jìn)行并且動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)使用來自Biacore AB的 生物分子相互作用分析(BIA)評(píng)估軟件(版本3.1)來分析。
[0028]圖5是示出如與AmcUGmd和自溶素缺失突變體菌株相比，抗Amd抗體對(duì)于體外生物 膜形成的抑制效應(yīng)的圖表。使用卡爾加里板的生物膜測(cè)定通過在4°C下將板和蓋銷用人血 漿涂布16小時(shí)來進(jìn)行。然后在存在或不存在25yg/mL抗Amd(Amdl.6)，抗Gmd(lCll)和抗Amd+ 抗Gmd(Amdl. 6+1C11 )mAb的組合的情況下，金黃色葡萄球菌在0.05的0D 600nm下接種。在37 °C下允許生物膜形成24小時(shí)。沖刷之后，生物膜用結(jié)晶紫染色并且生物膜內(nèi)含物通過595nm 下的分光光度測(cè)定法來測(cè)量。作為生物膜抑制的陽性對(duì)照，酰胺酶（A amd)、氨基葡萄糖苷 酶（Agmd)或自溶素（Aatl)的UAMS-1缺陷菌株在相同0D下接種。結(jié)果以作為野生型(WT)， 未處理的UAMS-1培養(yǎng)物(A)的百分比的生物膜形成（即，結(jié)晶紫染色）的量來報(bào)告;*與WT相 比，p〈0.05〇
[0029]圖6A-E示出如與自溶素缺陷相比，使用抗Amd單克隆抗體和抗Amd與抗Gmd單克隆 抗體的組合的被動(dòng)免疫對(duì)于體內(nèi)植入物上的生物膜形成的效應(yīng)。六至十周齡、雌性Balb/c 小鼠（n 2 3)用40mg/kg劑量的抗Amd(Amdl .6)、抗Amd與抗Gmd的組合(Amdl .6+1C11)或IgG同 種型匹配對(duì)照mAb來腹膜內(nèi)被動(dòng)免疫。一天后，每個(gè)小鼠使用以USA300LAC CA-MRSA菌株或 其同基因Aatl突變體污染的經(jīng)脛骨不銹鋼銷釘來感染。銷釘保持在適當(dāng)位置以允許基于 生物膜的感染變成熟。感染后第14天，將銷釘移除并且通過掃描電子顯微術(shù)(SEM)來檢查。 示出展示感染植入物（銷釘）上的生物膜形成程度的代表性顯微照片：IgG對(duì)照（圖6A);抗 八111(1(舳(11.6，圖68) ;抗六111(1+抗6111(1(六111(11.6+1(：11，圖6〇;和用六&七1突變體感染（圖60)。以生 物膜覆蓋的所關(guān)注區(qū)域(扁平銷釘?shù)?.5x2.0mm端面)的百分比使用NIH軟件（圖像J)來量化 并且展示于圖6E中；*p < 0.05。
[0030]圖7A-C示出用抗Amd、抗Gmd和抗Amd與抗Gmd單克隆抗體的組合的被動(dòng)免疫對(duì)于減 少骨骼破壞量的效應(yīng)。雌性Balb/c小鼠（n = 5)用roS或40mg/kg劑量的抗Gmd(lCl 1)、抗Amd (1 . 6 )或組合（1C11 + 1 . 6 )來腹膜內(nèi)被動(dòng)免疫，如前所述（Varrone等人，"Passi ve Immunization With Anti-Glucosaminidase Monoclonal Antibodies Protects Mice From Implant-Associated Osteomyelitis by Mediating Opsonophagocytosis of Staphylococcus aureus Megaclusters，"J Orthop Res 32(10): 1389-96(2014)，其全部 以引用方式并入本文）。二十四小時(shí)后，所有小鼠接收用USA300LAC:: lux污染的經(jīng)脛骨銷 釘，并且生物發(fā)光成像在第3天進(jìn)行以證實(shí)感染（圖7A)。小鼠在感染之后14天安樂死，并且 將脛骨收獲用于微觀CT分析。示出來自內(nèi)側(cè)和外側(cè)的感染脛骨的代表性3D效果圖（圖7B)以 例示每一組(B)脛骨中的骨質(zhì)溶解的相對(duì)水平。每個(gè)脛骨中的骨質(zhì)溶解體積使用下式來量 化:骨質(zhì)溶解體積(mm 3 )=[內(nèi)側(cè)骨質(zhì)溶解面積+外側(cè)骨質(zhì)溶解面積(mm2)] X皮質(zhì)厚度(mm)(* 相比于?834〈0.05)。結(jié)果在圖7(：中圖形化示出。
[0031]圖8A-C示出使用Amd 1.6被動(dòng)免疫的效應(yīng)，其示出顯著減少細(xì)菌擴(kuò)散，如在骨髓管 中形成較少膿腫所證明。6-10周齡、雌性Balb/c小鼠（n = 5)用40mg/kg總劑量的PBS(陰性對(duì) 照）、抗Gmd mAb 1C11、抗Amd mAb六111(11.6或組合（1(]11+六1]1(11.6)來腹膜內(nèi)免疫。二十四小時(shí) 后，每個(gè)小鼠在其右脛骨中插入用USA300LAC: : lux，一種生物發(fā)光CA-MRSA菌株污染的銷 釘。允許所得感染發(fā)展十四天，此時(shí)將動(dòng)物處死并且將感染脛骨收獲、固定、脫鈣并且切片 供組織學(xué)分析。對(duì)于（圖8A)未處理的對(duì)照和（圖8B)用抗Gmd 1C11與抗Amd Amdl.6的組合處 理的小鼠，描繪用橙黃G/阿爾新藍(lán)(ABG/OH)染色的代表性感染脛骨。呈現(xiàn)在每一組小鼠中 觀察到的膿腫的數(shù)目（圖8〇。*，？<0.05;**4<0.01。
[0032 ]圖9A-H示出使用抗Amd、抗Gmd和抗Amd與抗Gmd單克隆抗體的組合的被動(dòng)免疫在預(yù) 防形成葡萄球菌膿腫群落(SAC)中的效應(yīng)，所述效應(yīng)導(dǎo)致無菌膿腫。小鼠（n = 5)用40mg/kg 劑量的(陰性對(duì)照）或mAb 1C11、Amdl. 6或組合（1C11+Amdl. 6)腹膜內(nèi)免疫。二十四小時(shí) 后，所有小鼠接收用USA300LAC: : lux生物發(fā)光CA-MRSA菌株污染的經(jīng)脛骨銷釘。對(duì)于經(jīng)過革 蘭氏染色以展示細(xì)菌的組織學(xué)切片，示出來自感染后第14天的代表性感染脛骨。PBS處理的 脛骨示出典型SAC病變，含有膿腫區(qū)域內(nèi)的由嗜酸粒細(xì)胞性假包膜包圍的中心細(xì)菌病灶(圖 9A-B)，這在用以下mAb處理的小鼠是不存在的：1C11 (圖9C-D)、Amdl.6(圖9E-F)和組合1C11 +Amdl.6(圖9G-H)。
[0033 ] 圖1OA-H示出用抗Amd、抗Gmd和抗Amd與抗Gmd單克隆抗體的組合的被動(dòng)免疫對(duì)于 膿腫內(nèi)的巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞的募集的效應(yīng)。六至十周齡雌性Balb/c小鼠（n = 5)用PBS或40mg/ kg劑量的mAb lCll、Amdl.6或組合（lCll+Amdl.6)來腹膜內(nèi)免疫。二十四小時(shí)后，所有小鼠 接收用USA300LAC: :lux生物發(fā)光CA-MRSA菌株污染的經(jīng)脛骨銷釘。對(duì)于用橙黃G/阿爾新藍(lán) (ABG/OH)染色的組織學(xué)切片，示出來自感染后第14天的代表性感染脛骨。用抗Amd、抗Gmd和 抗Amd與抗Gmd mAb的組合的被動(dòng)免疫將巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞募集至膿腫中心（圖10C-H，箭頭）， 而PBS免疫的小鼠不展示膿腫內(nèi)的巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞募集（圖10A-B)并且顯示在形態(tài)上類似 于嗜中性白細(xì)胞的細(xì)胞。多個(gè)膿腫存在于PBS處理脛骨（圖10A)的骨髓管和骨骼周圍的軟組 織中，與Amdl.6和組合lCll+Amdl.6處理小鼠中的單一膿腫(分別為圖10E和10G)，或1C11處 理小鼠中的兩個(gè)膿腫結(jié)構(gòu)（圖10C)形成對(duì)比。
[0034]圖11A-E示出用抗Amd與抗Gmd單克隆抗體的組合的被動(dòng)免疫的效應(yīng)，其通過將M2 巨噬細(xì)胞募集至無菌膿腫內(nèi)來加速骨骼愈合。六至十周齡雌性Balb/c小鼠（n = 5)用PBS或 40mg/kg劑量的11^1(：11^111(11.6或組合（1(：11+4111(11.6)來腹膜內(nèi)免疫。二十四小時(shí)后，所有 小鼠接收用USA300LAC: : lux生物發(fā)光CA-MRSA菌株污染的經(jīng)脛骨銷釘。對(duì)于用橙黃G/阿爾 新藍(lán)(ABG/0H)染色的組織學(xué)切片，示出來自手術(shù)后第14天的代表性脛骨（圖11A-C)。在用 mAb免疫的小鼠中明顯可見與接受無菌銷釘對(duì)照的小鼠中的愈合類似的顯著愈合（圖11A-C)。為了確定使用與重構(gòu)相關(guān)聯(lián)的巨噬細(xì)胞表現(xiàn)型的愈合與傷口愈合過程的相互關(guān)系，使 用抗精氨酸酶-1抗體來進(jìn)行免疫組織化學(xué)以將M2巨噬細(xì)胞染色。在被動(dòng)免疫的小鼠中，M2 巨噬細(xì)胞被募集至膿腫中心（褐色染色）（圖11E)，但是在陰性對(duì)照PBS組中，所述巨噬細(xì)胞 不存在于膿腫中心（圖11D)。
[0035] 詳述
[0036]本文公開特異性結(jié)合至葡萄球菌屬自溶素N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶(Amd) 催化結(jié)構(gòu)域或細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一或多種單克隆抗體或其結(jié)合部分。
[0037]如在本文中使用的術(shù)語"抗體"意欲包括來源于天然來源或重組來源的免疫球蛋 白以及免疫球蛋白的免疫活性部分（即，抗原結(jié)合部分）。本文公開的單克隆抗體可以各種 形式存在或可以各種形式分離，包括例如大致上純單克隆抗體、抗體片段或結(jié)合部分、嵌合 抗體和人源化抗體（Ed Harlow和David Lane,USING ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)，其全部以引用方式并入本文）。
[0038] 本文公開的單克隆抗體的特征是結(jié)合至葡萄球菌N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸-酰胺 酶或其片段的特異性?？贵w特異性結(jié)合至葡萄球菌自溶素(Atl)的酰胺酶亞單位中的表位， 通常是但是并不一定是免疫顯性表位。在某些實(shí)施方案中，這些單克隆抗體抑制葡萄球菌 菌株的體內(nèi)生長(zhǎng)。在其他實(shí)施方案中，這些單克隆抗體抑制金屬、塑料和/或有機(jī)表面上的 生物膜建立。在更進(jìn)一步實(shí)施方案中，一或多種單克隆抗體可一起用于抑制葡萄球菌菌株 的體內(nèi)生長(zhǎng)和金屬、塑料和/或有機(jī)表面上的生物膜建立。
[0039] 根據(jù)本文公開的此和所有其他方面，葡萄球菌菌株是對(duì)于人或動(dòng)物具有致病性或 可致病的菌株。葡萄球菌可為凝結(jié)酶陽性或凝結(jié)酶陰性。示例性葡萄球菌菌株包括但不限 于金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、路鄧葡萄球菌、腐生葡萄球菌、溶血葡萄球菌、山羊葡萄 球菌和猿葡萄球菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文公開的單克隆抗體有效抗御葡萄球菌的抗生 素抗性菌株，包括甲氧西林抗性或萬古霉素抗性菌株。
[0040] 在某些實(shí)施方案中，酰胺酶亞單位的表位（由mAb或其結(jié)合片段結(jié)合的表位)是免 疫顯性表位。免疫顯性抗原是抗原決定簇的一部分，其最容易由免疫系統(tǒng)識(shí)別并且因此對(duì) 于所誘導(dǎo)抗體的特異性發(fā)揮最大影響。"免疫顯性表位"是指抗原上的如下表位，此表位選 擇性地在宿主生物體中引發(fā)免疫響應(yīng)以致于大致上排除此抗原上的其他表位。
[0041] 通常，可能帶有免疫顯性表位的抗原可通過選擇致病生物體的外表面上的抗原來 識(shí)別。舉例來說，最簡(jiǎn)單生物體，諸如真菌、細(xì)菌和病毒具有在致病生物體的外表面上暴露 的一種或兩種蛋白質(zhì)。這些外表面蛋白質(zhì)很可能帶有適當(dāng)抗原。很可能帶有免疫顯性表位 的蛋白質(zhì)可在蛋白質(zhì)印跡測(cè)定中識(shí)別，其中總蛋白質(zhì)在凝膠上相對(duì)于來自感染致病生物體 的生物體的血清運(yùn)作。來自血清的結(jié)合抗體通過經(jīng)過標(biāo)記的抗抗體，諸如在一種熟知ELISA 技術(shù)中來識(shí)別。免疫顯性表位可通過檢查來自感染致病生物體的宿主生物體的血清來識(shí) 另IJ。將血清針對(duì)其結(jié)合至已識(shí)別抗原的抗體內(nèi)含物來進(jìn)行評(píng)估，所述抗原可能在宿主生物 體中導(dǎo)致免疫響應(yīng)。如果免疫顯性表位存在于這些抗原中，那么血清中的大致上所有抗體 結(jié)合至免疫顯性表位，并且極少抗體結(jié)合至存在于抗原中的其他表位。
[0042] AtlA是金黃色葡萄球菌中的在有絲分裂期間消化細(xì)胞壁所需要的一種催化性獨(dú) 特肽聚糖水解酶（Baba和Schneewind, "Targeting of Muralytic Enzymes to the Cell Division Site of Gram-Positive Bacteria:Repeat Domains Direct Autolysin to the Equatorial Surface Ring of Staphylococcus aureus，"EMB0?J.17(16):4639-46 (1998)，其全部以引用方式并入本文）。除了作為有利于生長(zhǎng)的必需基因以外，掃描電子顯 微研究證明在二等分裂期間結(jié)合至金黃色葡萄球菌的抗AtlA抗體定位于未由細(xì)胞壁覆蓋 的細(xì)菌區(qū)域（Yamada等人，"An Autolysin Ring Associated With Cell Separation of Staphylococcus aureus，" J.Bacteriol ? 178(6): 1565-71(1996)，其全部以引用方式并入 本文）。
[0043] AtlA酶包含經(jīng)由裂解過程從相同AtlA前體蛋白產(chǎn)生的酰胺酶(62kD)和氨基葡萄 糖苷酶（53kD) (Baba和Schneewind，"Targeting of Muralytic Enzymes to the Cell Division Site of Gram-Positive Bacteria:Repeat Domains Direct Autolysin to the Equatorial Surface Ring of Staphylococcus aureus，'，Embo?J.17(16):4639-46 (1998) ；Komatsu zawa等人，"Subcellular Localization of the Major Autolysin，ATL and Its Processed Proteins in Staphylococcus aureus /'Microbiol Immunol.41： 469-79( 1997) ;0shida等人，"A Staphylococcus aureus Autolysin That Has an N-acetylmuramoyl-L-alanine Ami da s e Domain and an End〇-beta_N-acetylglucosaminidase Domain：Cloning,Sequence Analysis,and Characterization，'' Proc.Nat'1 .Acad. Sci.U.S.A.92(l) :285-9(1995)，其全部以引用形式并入本文）。自溶素 通過指定為R1、R2和R3的三個(gè)~150氨基酸細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域來保持于細(xì)胞壁。在最后成熟 步驟中，蛋白裂解將酰胺酶結(jié)構(gòu)域和其相關(guān)聯(lián)的R1和R2結(jié)構(gòu)域(共同地稱為"Amd"）與氨基 葡萄糖苷酶和其相關(guān)聯(lián)的N末端R3結(jié)構(gòu)域(共同地稱為"Gmd"）分離。參見圖1。
[0044] His-Amd的示例性所編碼共有蛋白質(zhì)和編碼開放解讀碼組序列識(shí)別為以下SEQ ID N0:1和2。
[0049] 葡萄球菌Amd可通過固相或液相肽合成、重組表達(dá)來合成，或可從天然來源獲得。 自動(dòng)肽合成儀可商購(gòu)自眾多供應(yīng)商，如Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，California。化 學(xué)肽合成的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在本領(lǐng)域中是熟知的（參見例如，SYNTHETIC PEPTIDES:A USERS GUIDE 93-210(Gregory A.Grant編輯，1992)，其全部以引用方式并入本文）。經(jīng)由重組表達(dá) 的蛋白質(zhì)或肽產(chǎn)生可使用細(xì)菌諸如大腸桿菌、酵母、昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞和表達(dá)系統(tǒng)來進(jìn) 行。重組蛋白/肽表達(dá)的程序在本領(lǐng)域中是熟知的并且由Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(C.S.H.P.Press，NY第2版，1989)描述。
[0050] 重組表達(dá)肽可使用在本領(lǐng)域中容易已知的多種方法中的任何一種，包括離子交換 色譜法、疏水性相互作用色譜、親和色譜、凝膠過濾和反相色譜來純化。肽優(yōu)選地通過常規(guī) 技術(shù)以純化形式(優(yōu)選地至少約80 %或85 %純，更優(yōu)選地至少約90 %或95 %純）產(chǎn)生。取決 于是否使重組宿主細(xì)胞將肽分泌至生長(zhǎng)培養(yǎng)基中（參見Bauer等人的美國(guó)專利號(hào)6,596， 509,其全部以引用方式并入本文），肽可通過離心來分離并純化(將細(xì)胞組分從含有分泌肽 的上清液中分離），隨后順序進(jìn)行上清液的硫酸銨沉淀。含有肽的部分在適當(dāng)大小的葡聚糖 或聚丙烯酰胺柱中經(jīng)受凝膠過濾以將肽與其他蛋白質(zhì)分離。必要時(shí)，肽部分可通過HPLC和/ 或透析來進(jìn)一步純化。
[0051] 在某些實(shí)施方案中，單克隆抗體或結(jié)合部分可特異性結(jié)合至Amd催化結(jié)構(gòu)域的表 位。如本文使用，Amd催化結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO: 1的氨基酸9-252至少70%相同，或與SEQ ID NO: 1的氨基酸9-252至少75%或80%相同，或甚至與SEQ ID NO: 1的氨基酸9-252至少85% 或90%相同。在某些實(shí)施方案中，酰胺酶催化結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO: 1的氨基酸9-252至少 95 %相同。
[0052] 在某些實(shí)施方案中，單克隆抗體或結(jié)合部分由稱為Amdl .6、Amdl. 10、Amdl. 13、 Amdl. 16、Amdl. 17、Amd2.1或Amd2.2的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。
[0053] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，單克隆抗體或結(jié)合部分結(jié)合至全部或部分在Amd R1或R2細(xì) 胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)的表位。如本文使用，R1或R2細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域分別與SEQ ID NO: 1的氨 基酸253-399或421-568至少70%相同；或分別與SEQ ID NO: 1的氨基酸253-399或421-568 至少75%或80%相同；或甚至分別與SEQ ID NO: 1的氨基酸253-399或421-568至少85%或 90%相同。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域分別與SEQ ID NO: 1的氨基酸253-399或 421-568至少95%相同。
[0054] 在某些實(shí)施方案中，單克隆抗體或結(jié)合部分由稱為Amdl. 1、Amdl. 2、Amdl. 5、 Amdl .7、Amdl .8、Amdl .9、Amdl ? ll、Amdl ? 12、Amdl ? 14、Amdl ? 15、Amd2.4或Amd2.5的雜交瘤細(xì) 胞系產(chǎn)生。
[0055]在某些實(shí)施方案中，本文公開的單克隆抗體以大于1(T8M或1(T9M，但是優(yōu)選地大于 1(T1()M的親和力結(jié)合至Amd催化結(jié)構(gòu)域或細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0056] 如以上提及，在某些實(shí)施方案中，單克隆抗體或結(jié)合部分還抑制葡萄球菌的體內(nèi) 生長(zhǎng)。葡萄球菌的體內(nèi)生長(zhǎng)的抑制可根據(jù)許多合適標(biāo)準(zhǔn)來測(cè)量。在一個(gè)這類實(shí)施方案中，葡 萄球菌的體內(nèi)生長(zhǎng)可根據(jù)生物發(fā)光測(cè)定來評(píng)估。舉例來說，生物發(fā)光金黃色葡萄球菌(Xen 29 ； ATCC 12600) (Francis等人，"Monitoring Bioluminescent Staphylococcusaureus Infections in Living Mice Using a Novel luxABCDE Construct，''Infect ? Immun ? 68 (6) :3594_600(2000);也參見 Contag 等人，"Photonic Detection of Bacterial Pathogens in Living Hosts，"Mol.Microbiol.l8(4):593-603(1995)，其各自全部以引用 方式并入本文）用于在手術(shù)植入之前給予經(jīng)脛骨植入物500,000CFU。五周齡雌性BALB/cJ小 鼠可在手術(shù)之前3天接受腹膜內(nèi)注射鹽水或0.25ml鹽水中的lmg純化抗體/抗體片段。可在 不同日期（例如，〇、3、5、7、11和14)對(duì)小鼠成像以評(píng)估生物發(fā)光并且可比較BLI圖像的比較 以評(píng)估相對(duì)于鹽水對(duì)照或注射安慰劑抗體的對(duì)照小鼠，抗體是否抑制金黃色葡萄球菌的體 內(nèi)生長(zhǎng)。
[0057] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，葡萄球菌的體內(nèi)生長(zhǎng)可根據(jù)生物膜形成來評(píng)估。舉例來說， 雌性Balb/c小鼠可用40mg/kg劑量的抗體/抗體片段或?qū)φ諄砀鼓?nèi)被動(dòng)免疫，并且一天后 每個(gè)小鼠可用以MRSA菌株污染的經(jīng)脛骨不銹鋼銷釘來感染。感染后第14天，銷釘可移除并 且通過掃描電子顯微術(shù)(SEM)來檢查，并且以生物膜覆蓋的所關(guān)注的區(qū)域(例如，扁平銷釘 的0.5x 2.0_端面)的百分比可用NIH軟件（圖像J)來量化。
[0058]在另一個(gè)實(shí)施方案中，感染骨骼的骨質(zhì)溶解體積可使用顯微CT成像來測(cè)量。舉例 來說，雌性Balb/c小鼠可用40mg/kg劑量的抗體/抗體片段或?qū)φ諄砀鼓?nèi)被動(dòng)免疫，并且 一天后每個(gè)小鼠可用以MRSA菌株污染的經(jīng)脛骨不銹鋼銷釘來感染。14天之后，可將小鼠安 樂死并且收獲脛骨。使用所得圖像，病灶面積可在兩個(gè)不同視圖（例如，內(nèi)側(cè)和外側(cè)）中測(cè) 量，相加在一起并且乘以皮質(zhì)厚度（參見Varrone等人，"Passive Immunization With Anti-Glucosaminidase Monoclonal Antibodies Protects Mice From Implant-Associated Osteomyelitis by Mediating Opsonophagocytosis of StaphyloCoCCus aureus Megaclusters，"J Orthop Res 32(10):1389_96(2014)，其全部以引用方式并入本 文)。
[0059] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，葡萄球菌的體內(nèi)生長(zhǎng)可通過骨髓管或骨骼周圍的軟組織中 的葡萄球菌膿腫群落(SAC)的存在(包括頻率)或不存在來評(píng)估。舉例來說，雌性Balb/c小鼠 可用40mg/kg劑量的抗體/抗體片段或?qū)φ諄砀鼓?nèi)被動(dòng)免疫，并且一天后每個(gè)小鼠可用以 MRSA菌株污染的經(jīng)脛骨不銹鋼銷釘來感染。14天之后，可將小鼠安樂死并且收獲脛骨和相 關(guān)聯(lián)軟組織。組織學(xué)樣品可制備并且用橙黃G/阿爾新藍(lán)(ABG/0H)染色，然后膿腫的存在或 不存在可在分析組織學(xué)樣品后確定。
[0060] 根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，單克隆抗體或結(jié)合部分包括包含以下氨基酸序列之一的VH結(jié) 構(gòu)域(CDR結(jié)構(gòu)域加下劃線）：
[0061] SEQ ID N0：5(Amdl.2)：
[0062] PELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYIMHffVKQKPGQGLEffIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSTTAYMELSS LTSEDXAVYYCARLDGYYDCFDYffGQGTTLTVSS
[0063]其中X可為任何氨基酸。此氨基酸序列由以下核苷酸序列（SEQ ID N0:6)編碼：
[0194] 本公開還涵蓋結(jié)合至與一種或多種公開的抗Amd抗體相同Amd表位的Amd抗體和其 Amd結(jié)合部分。因此，額外抗體和Amd結(jié)合抗體部分可基于其在Amd結(jié)合測(cè)定中與公開抗體交 叉競(jìng)爭(zhēng)（例如，以統(tǒng)計(jì)上顯著方式競(jìng)爭(zhēng)性抑制其結(jié)合)的能力來識(shí)別。測(cè)試抗體抑制本文公 開的抗Amd參考抗體結(jié)合至Amd蛋白質(zhì)（例如，具有SEQ ID NO: 1的至少一部分序列，諸如催 化結(jié)構(gòu)域或SEQ ID NO: 1的氨基酸9-252或細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Amd蛋白質(zhì)或多肽）的能力 證明測(cè)試抗體可與參考抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合至Amd。根據(jù)非限制性理論，這類抗體可結(jié)合至Amd蛋 白質(zhì)上的與它所競(jìng)爭(zhēng)的參考抗體相同或相關(guān)(例如，在結(jié)構(gòu)上類似或在空間上最接近)表 位。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合至Amd上的與本文公開的參考抗體相同表位的抗體是人源化抗 體。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合至Amd上的與本文公開的參考抗體相同表位的抗體是人抗體。 Amd-結(jié)合抗體和Amd結(jié)合抗體部分也可為結(jié)合至與參考抗體相同表位的其他小鼠或嵌合 Amd-結(jié)合抗體和Amd結(jié)合抗體部分。
[0195] 阻斷或與參考抗體結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)的能力指示Amd-結(jié)合測(cè)試抗體或Amd-結(jié)合抗體部分 結(jié)合至與參考抗體限定的表位相同或類似的表位，或結(jié)合至足夠接近由參考Amd-結(jié)合抗體 結(jié)合的表位的表位。這類抗體尤其可能共有針對(duì)參考抗體所識(shí)別的有利性質(zhì)。
[0196] 阻斷或與參考抗體競(jìng)爭(zhēng)的能力可使用在本領(lǐng)域中已知的技術(shù)諸如競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定 來確定。使用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定，所測(cè)試的抗體或Amd-結(jié)合抗體部分針對(duì)抑制參考抗體特異性 結(jié)合至Amd蛋白質(zhì)或Amd蛋白質(zhì)的一部分(例如，催化結(jié)構(gòu)域或SEQ ID NO: 1的氨基酸9-252， 或細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域)的能力來檢查。如果過量測(cè)試抗體大致上抑制參考抗體的結(jié)合，那么 測(cè)試抗體與參考抗體競(jìng)爭(zhēng)特異性結(jié)合至作為抗原的Amd蛋白質(zhì)或其一部分。大致上抑制意 味著測(cè)試抗體減少參考抗體的特異性結(jié)合通常至少10%、25%、50%、75%或90%。
[0197] 已知競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定可總體上采用或常規(guī)調(diào)適以評(píng)估Amd-結(jié)合抗體或Amd-結(jié)合抗 體部分與參考Amd-結(jié)合抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合至Amd蛋白質(zhì)或其一部分。這類競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定包括但 不限于固相直接或間接放射免疫測(cè)定(RIA)、固相直接或間接酶免疫測(cè)定(EIA)、夾心競(jìng)爭(zhēng) 測(cè)定（參見等人，"Distinction of Epitopes by Monoclonal Antibodies," Methods in Enzymology 92:242-253,(1983)，其全部以引用方式并入本文）；固相直接生 物素-抗生物素蛋白EIA(參見Kirkland等人，"Analysis of the Fine Specificity and Cross-reactivity of Monoclonal Anti-lipid A Antibodies,"J.Immunol?137:3614-3619(1986)，其全部以引用方式并入本文）；固相直接標(biāo)記測(cè)定、固相直接標(biāo)記夾心測(cè)定(Ed Harlow和David Lane,USING ANTIB0DIES:A LABORATORY MANUAL(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999)，其全部以引用方式并入本文）；使用1-125標(biāo)記的固相直接標(biāo)記 RIA(參見Morel等人，"Monoclonal Antibodies to Bovine Serum Albumin:Affinity and Specificity Determinations，"Molec ? Immunol ? 25:7-15(1988)，其全部以引用方式并入 本文）；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等人，"Epitope-Specific Antibody Response to the Surface.Antigen of Duck Hepatitis B Virus in Infected Ducks," Virology 176: 546-552( 1990)，其全部以引用方式并入本文）；和直接標(biāo)記RIA (Moldenhauer等人，"Identity of HML-lAntigen on Intestinal Intraepithelial T Cells and of B_ly7 Antigen on Hairy Cell LeukaemiaScand.J.Immunol.32:77-82 (1990)，其全部以引用方式并入本文）。通常，所述分析涉及使用與固體表面結(jié)合的純化抗 原，或帶有這些未標(biāo)記測(cè)試Amd結(jié)合抗體和標(biāo)記的參考抗體中任一者的細(xì)胞。競(jìng)爭(zhēng)性抑制是 通過測(cè)定在測(cè)試抗體存在下與固體表面或細(xì)胞結(jié)合的標(biāo)記的量來測(cè)量。通常，測(cè)試抗體過 量存在。由競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定(競(jìng)爭(zhēng)抗體)識(shí)別的抗體和抗原結(jié)合抗體部分包括結(jié)合至與參考抗體相 同表位的抗體和抗原結(jié)合抗體部分以及結(jié)合至與由參考抗體結(jié)合的表位充分接近的相鄰 表位以致于發(fā)生位阻的抗體。
[0198] 在一些實(shí)施方案中，抗體或其Amd結(jié)合部分特異性結(jié)合至Amd并且與本文描述的抗 Amd抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)。在其他實(shí)施方案中，抗體或其Amd結(jié)合部分特異性結(jié)合至Amd并且與選自 Amdl?1、Amdl?2、Amdl?5、Amdl?6、Amdl?7、Amdl?8、Amdl?9、Amdl?10、Amdl?11、Amdl?12、 Amdl ? 13、Amdl ? 14、Amdl ? 15、Amdl ? 16、Amdl ? 17、Amd2 ? 1、Amd2 ? 2、Amd2 ? 4和Amd2 ? 5的抗Amd抗 體交叉競(jìng)爭(zhēng)。在具體實(shí)施方案中，抗體或其Amd結(jié)合部分特異性結(jié)合至Amd并且與抗體 Amdl .6交叉競(jìng)爭(zhēng)。在其他實(shí)施方案中，抗體或其Amd結(jié)合部分特異性結(jié)合至Amd并且與抗體 Amd2.1交叉競(jìng)爭(zhēng)。在其他實(shí)施方案中，抗體或其Amd結(jié)合部分特異性結(jié)合至Amd，與一種或多 種上述抗Amd抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)，并且抑制Amd催化活性。
[0199] 在額外實(shí)施方案中，抗體或其Amd結(jié)合部分結(jié)合至與本文所述抗體相同的表位。在 其他實(shí)施方案中，抗體或其Amd結(jié)合部分結(jié)合至與選自Amdl. 1、Amdl. 2、Amdl. 5、Amdl .6、 Amdl.7、Amdl.8、Amdl.9、Amdl.10、Amdl.ll、Amdl.12、Amdl.13、Amdl.14、Amdl.15、Amdl.16、 Amdl. 17、Amd2.1、Amd2.2、Amd2.4和Amd2.5的抗體相同的表位。在具體實(shí)施方案中，抗體或 其Amd結(jié)合部分結(jié)合至與抗體Amdl .6相同的表位。在其他實(shí)施方案中，抗體或其Amd結(jié)合部 分結(jié)合至與抗體Amd2.1相同的表位。在其他實(shí)施方案中，抗體或其Amd結(jié)合部分結(jié)合至與一 種或多種上述抗Amd抗體相同的表位并且抑制Amd催化活性。
[0200] 在一些實(shí)施方案中，抗體或其Amd結(jié)合部分特異性結(jié)合至Amd并且與結(jié)合葡萄球菌 屬Amd催化結(jié)構(gòu)域的抗Amd抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)。在其他實(shí)施方案中，抗體或其Amd結(jié)合部分特異性 結(jié)合至Amd并且與選自Amdl .6、Amdl ? 10、Amdl ? 13、Amdl ? 16、Amdl ? 17、Amd2.1 和Amd2.2的抗 Amd抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)。在其他實(shí)施方案中，抗體或其Amd結(jié)合部分特異性結(jié)合至Amd，與一種或 多種以上識(shí)別抗Amd抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)，并且抑制Amd催化活性。
[0201 ]在額外實(shí)施方案中，抗體或其Amd結(jié)合部分結(jié)合至與本文所述抗體相同的Amd催化 結(jié)構(gòu)域表位。在其他實(shí)施方案中，抗體或其Amd結(jié)合部分結(jié)合至與選自Amdl .6、Amdl. 10、 Amdl. 13、Amdl. 16、Amdl. 17、Amd2.1和Amd2.2的抗體相同的Amd催化結(jié)構(gòu)域表位。在其他實(shí) 施方案中，抗體或其Amd結(jié)合部分結(jié)合至與一種或多種以上識(shí)別抗Amd抗體相同的表位并且 抑制Amd催化活性。
[0202] 在一些實(shí)施方案中，抗體或其Amd結(jié)合部分特異性結(jié)合至Amd并且與結(jié)合葡萄球菌 屬Amd細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗Amd抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)。在額外實(shí)施方案中，抗體或其Amd結(jié)合部分 特異性結(jié)合至Amd并且與本文描述的結(jié)合細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗Amd抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)。在其他 實(shí)施方案中，抗體或其Amd結(jié)合部分特異性結(jié)合至Amd并且與選自Amdl. l、Amdl .2、Amdl .5、 Amdl .7、Amdl .8、Amdl .9、Amdl ? ll、Amdl ? 12、Amdl ? 14、Amdl ? 15、Amd2.4和Amd2.5的抗體交叉 競(jìng)爭(zhēng)。
[0203] 在一些實(shí)施方案中，抗體或其Amd結(jié)合部分結(jié)合至與本文所述抗Amd抗體相同的 Amd細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域表位。在其他實(shí)施方案中，抗體或其Amd結(jié)合部分結(jié)合至與選自 Amdl?1、Amdl?2、Amdl?5、Amdl?7、Amdl?8、Amdl?9、Amdl?11、Amdl?12、Amdl?14、Amdl?15、 Amd2.4和Amd2.5的抗體相同的Amd細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域表位。
[0204] 本文公開的抗體也可為合成抗體。合成抗體是使用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的抗體，例如 像通過噬菌體來表達(dá)的抗體?；蛘撸铣煽贵w的產(chǎn)生方法是通過合成編碼抗體的DNA分子， 隨后表達(dá)抗體（即，合成指定抗體的氨基酸），其中DNA或氨基酸序列已經(jīng)使用可利用并且在 本領(lǐng)域中熟知的合成DNA或氨基酸序列技術(shù)來獲得。
[0205] 在某些實(shí)施方案中，合成抗體使用如以上識(shí)別的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè) CDR、如以上識(shí)別的不同重鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR的組合、所識(shí)別輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多 個(gè)CDR或來自如以上識(shí)別的不同輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR的組合來產(chǎn)生。舉例來說，Amdl. 6和 Amd2.1包括以下CDR: 來源和CDR 序列 SEQ ID NO: Amdl.6 Vn，CDRi GYSFTNYW 65 Arndl.6 V",CDR2 丨YPGNSDT 66 Amd 1.6 V丨丨，CDR3 DDYSRFSY 67 Amdl.6 V丨，CDR1 QSVSND 68
[0206] Amdl.6 V：,CDR2 YTS 69 Amd2.1 Vn，CDR 1 GFTFSSYA 70 Amd2.1 Vn,CDR2 ISSGGSXT 71 Amd2.1 Vh，CDR3 VGLYYDYYYSMDY 72 Amd2,l V, , CDR1 QSLLYSGNQKNY 73 Arnd2.1 V,, CDR2 WAS 74
[0207] 在Amd2.1 Vh，CDR2(SEQ ID勵(lì):71)中，父可為任何氨基酸。
[0208] 在一個(gè)實(shí)施方案中，單克隆抗體或結(jié)合部分是部分人源化或完全人抗體或結(jié)合部 分。
[0209] 人源化抗體是在可變區(qū)內(nèi)含有來自非人(例如鼠科)抗體的最小序列的抗體。當(dāng)施 用至人受試者時(shí)，這類抗體在治療上用于減少抗原性和人抗小鼠抗體反應(yīng)。實(shí)際上，人源化 抗體通常是具有最小直至沒有非人序列的人抗體。人抗體是由人產(chǎn)生的抗體或具有對(duì)應(yīng)于 由人產(chǎn)生的抗體的氨基酸序列的抗體。
[0210] 抗體可通過將人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)替換成具有所需特異性、親和力和能力 的非人抗體(例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠等）的互補(bǔ)決定區(qū)來人源化(Jones等人，"Replacing the Complementarity-Determining Regions in a Human Antibody With Those From a Mouse Nature 321:522-525( 1986) ;Riechmann等人，"Reshaping Human Antibodies for Therapy，"Nature 332:323-327(1988) ;Verhoeyen等人，"Reshaping Human Antibodies: Grafting an Antilysozyme Activity/'Science 239:1534-1536(1988)，其全部以引用形 式并入本文）。人源化抗體可以通過Fv構(gòu)架區(qū)中的和/或所置換的非人殘基內(nèi)的另外殘基的 取代來進(jìn)行進(jìn)一步修飾，以便改善和優(yōu)化抗體特異性、親和力和/或能力。
[0211] 人源化抗體可使用在本領(lǐng)域中已知的各種技術(shù)來產(chǎn)生?？僧a(chǎn)生在體外免疫的或從 產(chǎn)生針對(duì)目標(biāo)抗原的抗體的免疫個(gè)體分離的永生人B淋巴細(xì)胞(參見例如Reisfeld等人， MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY 77(Alan R.Liss編輯，1985)和Garrard的 美國(guó)專利號(hào)5,750,373，其全部以引用形式并入本文）。另外，人源化抗體可選自噬菌體文 庫，其中此菌體文庫表達(dá)人抗體（Vaughan等人，"Human Antibodies with Sub-Nanomolar Affinities Isolated from a Large Non-immunized Phage Display Library，" Nature Bio techno logy，14:309_314(1996) ; Sheets等人，"Ef f i c ient Construction of a Large Nonimmune Phage Antibody Library:The Production of High-Affinity Human Single-Chain Antibodies to Protein Antigens，'，Proc.Nat' l.Acad.Sci.U.S.A.95:6157_6162(1998);Hoogenboom等人，"By-passing Immunisation.Human Antibodies from Synthetic Repertoires of Germline VH Gene Segments Rearranged in vitro，'，J. Mo l.Biol.227:381 _8 (1992); Marks等人，"By-passing Immunization.Human Antibodies from V-gene Libraries Displayed on Phage，"J.Mol .Biol. 222:581-97(1991 )，其全部以引用形式并入本文）。還可以在含有人免 疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠中來制備人源化抗體，在免疫時(shí)所述小鼠能夠在不產(chǎn)生內(nèi)源 性免疫球蛋白的情況下產(chǎn)生人抗體的全部譜系。此方法描述于Surani等人的美國(guó)專利號(hào)5， 545,807江〇1^6找等人的美國(guó)專利號(hào)5,545,806 ;1^〇1^6作等人的美國(guó)專利號(hào)5,569,825; Lonberg等人的美國(guó)專利號(hào)5,625，126; Lonberg等人的美國(guó)專利號(hào)5，633,425;和Lonberg等 人的美國(guó)專利號(hào)5,661，016,其全部以引用形式并入本文。
[0212]在某些實(shí)施方案中，人源化單克隆抗體是IgGl、IgG2、IgG3類別或IgG4類別。IgG3 類別由于其減少的蛋白質(zhì)A結(jié)合而為尤其優(yōu)選的（參見Nat sume等人，"Engineered Antibodies of IgGl/IgG3 Mixed Isotype with Enhanced Cytotoxic Activities," Cancer Res 68(10) :3863-72(2008)，其全部以引用方式并入本文）。
[0213]這些抗體類別的循環(huán)半衰期可通過Fc結(jié)構(gòu)域的修飾來增強(qiáng)，諸如由Petkova等人 描述的N434A和T307A/E380A/N434A取代（"Enhanced Half-life of Genetically Engineered Human IgGlAntibodies in a Humanized FcRn Mouse Model:Potential Application in Humoral ly Mediated Autoimmune Disease，''International Immunology 18(12): 1759-1769(2006)，其全部以引用方式并入本文)或由Balsitis等人描 述的N297Q取代（"Lethal Antibody Enhancement of Dengue Disease in Mice Is Prevented by Fc Modification，"PloS Pathogens 6(2):e100 0790(2010)，其全部以引用 方式并入本文）。
[0214] 以上分別識(shí)別為SEQ ID N0:5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、 37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61和63的重鏈和輕鏈序列可用于識(shí)別密碼子優(yōu) 化DNA序列，所述序列可引入合適表達(dá)系統(tǒng)中以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的重組、嵌合抗體?；蛘?，以 上識(shí)別的DNA序列可用于制備合適表達(dá)系統(tǒng)以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的重組、嵌合抗體。
[0215] 除了完整抗體以外，本發(fā)明涵蓋這類抗體的Amd結(jié)合部分。這類Amd結(jié)合部分包括 但不限于一價(jià)Fab片段、Fv片段（例如，單鏈抗體，scFv)、單一可變Vh和Vl結(jié)構(gòu)域和二價(jià)F (ab'）2片段、Bis-scFv、雙功能抗體、三功能抗體和微抗體。這些抗體片段可通過常規(guī)程序 制成，諸如如在James Goding,MONOCLONAL ANTIBODIES:PRINCIPLES AND PRACTICE 98-118(Academic Press，1983);Ed Harlow和David Lane,ANTIB0DIES:A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laboratory，1988) ;Houston等人，"Protein Engineering of Antibody Binding Sites:Recovery of Specific Activity in an Anti-Digoxin Single-Chain Fv Analogue Produced in Escherichia coli，''Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988) ;Bird等人，"Single-Chain Antigen-Binding Proteins，"Science 242:423-426(1988)中所描述的蛋白水解斷裂程序，其全部以引用形式并入本文，或在本領(lǐng) 域中已知的其他方法。
[0216] 在一些實(shí)施方案中，抗體或其Amd結(jié)合部分包括構(gòu)架，其中在來自相應(yīng)人VH或Vl種 系序列的抗體構(gòu)架中已經(jīng)發(fā)生氨基酸取代。以下實(shí)施例6識(shí)別本文描述的許多抗體的種系 序列。
[0217]修飾抗體以增加它的血清半衰期也是所需的，尤其是在抗體片段的情況下。這可 以（例如)通過以下方式來實(shí)現(xiàn):通過經(jīng)由抗體片段中的適當(dāng)區(qū)的突變將補(bǔ)救受體結(jié)合表位 并入至所述抗體片段中，或通過將所述表位結(jié)合位點(diǎn)并入至肽標(biāo)簽中，所述肽標(biāo)簽然后與 所述抗體片段在任一端或在中間融合(例如，通過DNA或肽合成）。
[0218] 抗體模擬物也適合于根據(jù)本發(fā)明的用途。許多抗體模擬物在此項(xiàng)技術(shù)中為已知 的，包括但不限于被稱為纖維連接蛋白或單功能抗體的模擬物，其來源于第十個(gè)人類纖連 蛋白 III型結(jié)構(gòu)域（^Fr^MKoide等人，"The Fibronectin Type III Domain as a Scaffold for Novel Binding Proteins，"J.Mol.Biol.284:1141_1151(1998);Koide等 人，"Probing Protein Conformational Changes in Living Cells by Using Designer Binding Proteins:Application to the Estrogen Receptor/'Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:1253-1258(2002)，其各自全部以引用方式并入本文）；和被稱為親和體的模擬物，其來 源于葡萄球菌蛋白質(zhì)A的穩(wěn)定a螺旋細(xì)菌受體結(jié)構(gòu)域Z(Nord等人，"Binding Proteins Selected from Combinatorial Libraries of an alpha-helical Bacterial Receptor Domain，"Nature Biotechnol ? 15(8): 772-777( 1997)，其全部以引用方式并入本文）。
[0219] 在制備這些抗體模擬物的過程中，VH和/或Vl鏈的⑶R可剪接或枝接至這些抗體模 擬物的可變環(huán)區(qū)域中。接枝可涉及缺失至少兩個(gè)氨基酸殘基，直至缺失大致上所有氨基酸 殘基，除了在取代CDR序列時(shí)出現(xiàn)在特定環(huán)區(qū)域中的一個(gè)氨基酸殘基以外。插入可為例如在 一個(gè)環(huán)區(qū)域處插入一個(gè)⑶R，任選地在第二環(huán)區(qū)域處插入第二⑶R，和任選地在第三環(huán)區(qū)域 處插入第三CDR。多肽上的任何缺失、插入和置換可使用以已知核苷酸序列開始的重組技術(shù) 來實(shí)現(xiàn)(參見以下）。
[0220] 單克隆抗體產(chǎn)生方法可使用本文所述技術(shù)或在本領(lǐng)域中熟知的其他技術(shù)來實(shí)現(xiàn) (MONOCLONAL ANTIB0DIES-PR0DUCTI0N,ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATIONS(Mary A.Ritter和Heather M.Ladyman eds.,1995)，其全部以引用方式并入本文）。通常，所述方 法包括從先前已經(jīng)用目標(biāo)抗原（即，葡萄球菌N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸-酰胺酶或其肽片段） 免疫的哺乳動(dòng)物的脾中獲得免疫細(xì)胞(淋巴細(xì)胞）。
[0221] 分泌抗體的淋巴細(xì)胞隨后與能夠在細(xì)胞培養(yǎng)物中無限地復(fù)制的骨髓瘤細(xì)胞或轉(zhuǎn) 化的細(xì)胞融合，由此生成永生的分泌免疫球蛋白的細(xì)胞系。與能夠在細(xì)胞培養(yǎng)物中無限地 復(fù)制的哺乳動(dòng)物骨髓瘤細(xì)胞或其它融合搭配物融合通過標(biāo)準(zhǔn)且熟知的技術(shù)，例如通過使用 聚乙二醇（PEG)或其它融合劑實(shí)現(xiàn)（Milstein和Kohler, "Derivation of SpecificAntibody-Producing Tissue Culture and Tumor Lines by Cell Fusion," Eur.J. Immunol .6:511(1976)，其全部以引用方式并入本文）。選擇優(yōu)選為鼠科、但也可來源 于其它哺乳動(dòng)物物種的細(xì)胞的永生細(xì)胞系，以缺乏利用某些營(yíng)養(yǎng)素所必需的酶、能夠迅速 生長(zhǎng)且具有良好的融合能力。將所產(chǎn)生的融合細(xì)胞或雜交瘤培養(yǎng)，且篩選所產(chǎn)生的群落以 生成所要的單克隆抗體。將生成所述抗體的群落克隆并使其體內(nèi)或體外生長(zhǎng)以生成大量的 抗體。
[0222] 因此，本發(fā)明的第二方面涉及表達(dá)本文公開的單克隆抗體或結(jié)合部分的細(xì)胞系。 在一個(gè)實(shí)施方案中，本文公開的單克隆抗體由稱為Amdl. 1、Amdl. 2、Amdl. 3、Amdl. 5、 Amdl.6、Amdl.7、Amdl.8、Amdl.9、Amdl.10、Amdl.ll、Amdl.12、Amdl.13、Amdl.14、Amdl.15、 Amdl. 16、Amdl. 17、Amd2.1、Amd2.2、Amd2.4和Amd2.5的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。
[0223] 或者，單克隆抗體可使用如在Cabilly等人的美國(guó)專利4,816,567中所述的重組 DNA方法制造，該專利全部以引用方式并入本文。編碼單克隆抗體的多核苷酸例如通過RT-PCR使用特異性擴(kuò)增編碼抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸引物從成熟的B細(xì)胞或雜交 瘤細(xì)胞中分離。然后將編碼重鏈和輕鏈的分離多核苷酸克隆至合適表達(dá)載體中，所述載體 在轉(zhuǎn)染至不另外產(chǎn)生免疫球蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞諸如大腸桿菌細(xì)胞、猿cos細(xì)胞、中國(guó)倉鼠卵 巢(CH0)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞中時(shí)，產(chǎn)生表達(dá)并分泌單克隆抗體的宿主細(xì)胞。另外，所需物種 的重組單克隆抗體或其片段可從菌體展示文庫分離（McCafferty等人，"Phage Antibodies:Filamentous Phage Displaying Antibody Variable Domains Nature 348:552-554(1990)；Clackson et al?，"Making Antibody Fragments using Phage Display Libraries/'Nature 352:624-628(1991);和 Marks 等人，"By-Passing Immunization.Human Antibodies from V-Gene Libraries Displayed on Phage," J.Mol.Biol.222:581-597(1991)，其全部以引用形式并入本文）。
[0224]另一個(gè)方面涉及DNA構(gòu)建體，其包括編碼本文公開的抗體或結(jié)合部分的DNA分子， 可操作地偶聯(lián)至DNA分子的5'的啟動(dòng)子效應(yīng)DNA分子，和可操作地偶聯(lián)至DNA分子的3'的轉(zhuǎn) 錄終止DNA分子。本發(fā)明還涵蓋DNA構(gòu)建體插入其中的表達(dá)載體。多肽的合成基因可被設(shè)計(jì) 成使得它包括便于誘變的便利限制位點(diǎn)并且使用有利于較高水平蛋白質(zhì)表達(dá)的特定密碼 子（Gribskov等人，"The Codon Preference Plot:Graphic Analysis of Protein Coding Sequences and Prediction of Gene Expression/'Nucl.Acids.Res.12:539-549(1984), 其全部以引用方式并入本文）。
[0225] 基因可組裝如下：首先基因序列可劃分成在設(shè)計(jì)限制位點(diǎn)處具有邊界的部分;對(duì) 于每個(gè)部分，可合成編碼相反鏈并且具有約15個(gè)堿基的互補(bǔ)重疊的一對(duì)寡核苷酸;兩個(gè)寡 核苷酸可粘接并且單鏈區(qū)域可使用DNA聚合酶的Klenow片段來填充;雙鏈寡核苷酸可使用 限制酶位點(diǎn)在片段的末端處克隆至載體諸如pET3a載體(Novagen)中并且其序列可通過DNA 測(cè)序器來證實(shí)；并且這些步驟可對(duì)于每個(gè)部分來重復(fù)以獲得完整基因。與一步聚合酶鏈反 應(yīng)(PCR)方法相比，此方法耗費(fèi)更多時(shí)間來組裝基因（Sandhu等人，"Dual Asymetrix PCR: One-Step Construction of Synthetic Genes，"BioTech.l2:14_16(1992)，其全部以引用 方式并入本文）?？赡苡捎诘捅Ｕ嫘詮?fù)制而由Taq多聚酶引入突變并且將需要進(jìn)行耗費(fèi)時(shí)間 的基因編輯。除非另外說明，否則重組DNA操作可根據(jù)SAMBR00K&RUSSELL，M0LECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL(第2版1989)來進(jìn)行，其全部以引用方式并入本文。為了在 一步PCR期間避免引入突變，可使用如在本領(lǐng)域中已知的高保真性/低誤差聚合酶。
[0226] 所需突變可使用盒式誘變、寡核苷酸定點(diǎn)誘變技術(shù)(Deng和Nickoloff, "Site-Directed Mutagenesis of Virtually any Plasmid by Eliminating a Unique Site," Anal. Biochem. 200:81_88( 1992)，其全部以引用方式并入本文）或Kunkel誘變(Kunkel等 人，"Rapid and Efficient Site-Specific Mutagenesis Without Phenotypic Selection,"Proc ? Natl ? Acad? Sci ? USA 82 :488-492(1985);Kunkel等人，"Rapid and Efficient Site-Specific Mutagenesis Without Phenotypic Selection/'Methods Enzymol. 154:367-382(1987)，其全部以引用形式并入本文)來引入多肽序列中。
[0227] 盒式誘變和定點(diǎn)誘變可用于制備特定需要的核苷酸編碼序列。盒式誘變可使用如 上所述基因構(gòu)建的相同方案來進(jìn)行并且編碼新序列的雙鏈DNA片段可克隆至合適表達(dá)載體 中。許多突變可通過將新合成的鏈(編碼突變)與用于基因合成的寡核苷酸組合來產(chǎn)生。不 論用于將突變引入編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽的核苷酸序列的方法為何，可進(jìn)行測(cè)序來證實(shí)所 設(shè)計(jì)的突變(并且沒有其他突變)通過誘變反應(yīng)來引入。
[0228] 相比之下，Kunkel誘變可用于隨機(jī)產(chǎn)生可用于制備多肽的組合文庫供篩選的多個(gè) 突變多肽編碼序列?；旧希繕?biāo)環(huán)區(qū)域(或C末端或N末端尾部區(qū)域)可使用NNK密碼子(N表 示A、T、G、C的混合物并且K表示G和T的混合物）來隨機(jī)化（Kunkel等人，"Rapid and Efficient Site-Specific Mutagenesis Without Phenotypic Selection/'Methods Enzymol ? 154:367-382( 1987)，其全部以引用方式并入本文）。
[0229] 不論用于制備編碼抗體或Amd結(jié)合部分的核酸分子的方法為何，核酸可使用常規(guī) 重組DNA技術(shù)來并入宿主細(xì)胞中?？傮w上，此涉及將DNA分子插入DNA分子對(duì)于其為異源的表 達(dá)系統(tǒng)（即，通常不存在于其中）。異源DNA分子以適當(dāng)有義方向和正確的解讀碼組插入表達(dá) 系統(tǒng)或載體中。載體含有用于轉(zhuǎn)錄和翻譯所插入蛋白質(zhì)編碼序列的必需元件(啟動(dòng)子、抑制 子、操作子、轉(zhuǎn)錄終止序列等）。重組基因或DNA構(gòu)建體可在其插入表達(dá)載體中之前制備。舉 例來說，使用常規(guī)重組DNA技術(shù)，啟動(dòng)子效應(yīng)DNA分子可操作地偶聯(lián)至編碼多肽的DNA分子的 5 '并且轉(zhuǎn)錄終止(即，多聚腺苷酸化序列）可操作地偶聯(lián)至其3 '。
[0230] 根據(jù)此方面，將多核苷酸插入分子對(duì)于其為異源的表達(dá)系統(tǒng)或載體中。將異源核 酸分子相對(duì)于啟動(dòng)子和任何其他5'調(diào)控分子的正確的有義(5'-3'）方向，和正確的解讀碼 組來插入表達(dá)系統(tǒng)或載體中。核酸構(gòu)建體的制備可使用如SAMBR00K&RUSSELL，MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL(Cold Springs Laboratory Press,2001)所描述的本領(lǐng)域 中熟知的標(biāo)準(zhǔn)克隆方法來進(jìn)行，其全部以引用方式并入本文。Cohen和Boyer的美國(guó)專利號(hào) 4，237，224，其全部以引用方式并入本文，還描述使用限制酶裂解和通過DNA連接酶的連接 來產(chǎn)生呈重組質(zhì)粒形式的表達(dá)系統(tǒng)。
[0231] 合適表達(dá)載體包括含有來源于與宿主細(xì)胞相容的物種的復(fù)制子和控制序列的載 體。舉例來說，如果大腸桿菌用作宿主細(xì)胞，可使用質(zhì)粒諸如pUC19、pUC18或pBR322。當(dāng)使用 昆蟲宿主細(xì)胞時(shí)，與昆蟲宿主細(xì)胞相容的適當(dāng)轉(zhuǎn)移載體包括pVL1392、pVL1393、pAcGP67和 pAcSecG2T，其并入融合至所需蛋白質(zhì)的分泌信號(hào)，和pAcGHLT和pAcHLT，其含有GST和6xHis 標(biāo)簽(BD Biosciences，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)。適合于在進(jìn)行此方面中使用的病毒載體包括 腺病毒載體、腺病毒相關(guān)聯(lián)病毒載體、痘苗病毒載體、nodaviral載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。其 他合適表達(dá)載體描述于SAMBR00K AND RUSSELL,MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL(Cold Springs Laboratory Press,2001)中，其全部以引用方式并入本文。例如在 制備核酸構(gòu)建體、誘變、測(cè)序、將DNA引入細(xì)胞中和基因表達(dá)以及分析蛋白質(zhì)過程中操作核 酸的許多已知技術(shù)和方案詳細(xì)描述于CURRENT PR0T0⑶LS IN MOLECULAR BI0L0GY(Fred M.Ausubel等人編，2003)中，其全部以引用方式并入本文。
[0232] 不同遺傳信號(hào)和處理事件控制許多水平的基因表達(dá)（例如，DNA轉(zhuǎn)錄和信使RNA ("mRNA"）翻譯）以及隨后由宿主細(xì)胞產(chǎn)生并表達(dá)的抗體或抗體片段的量。DNA的轉(zhuǎn)錄依賴于 啟動(dòng)子的存在，所述啟動(dòng)子是引導(dǎo)RNA聚合酶的結(jié)合，并且由此促進(jìn)mRNA合成的DNA序列。啟 動(dòng)子在其"強(qiáng)度"（即，其促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的能力)方面變化。出于表達(dá)克隆基因的目的，需要使用強(qiáng) 啟動(dòng)子以獲得高水平轉(zhuǎn)錄和由此表達(dá)。取決于所使用的宿主系統(tǒng)，可使用許多合適啟動(dòng)子 中的任何一個(gè)。例如，在使用大腸桿菌、其噬菌體或質(zhì)粒時(shí)，啟動(dòng)子諸如T7噬菌體啟動(dòng)子、 lac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、recA啟動(dòng)子、核糖體RNA啟動(dòng)子、大腸桿菌噬菌體A和其他噬菌體的 Pr和Pl啟動(dòng)子包括但是不限于1&〇群5、〇11^^、131&、化?等可用于引導(dǎo)相鄰0嫩片段的高水平轉(zhuǎn) 錄。另外，混合trp-lacUV5 (tac)啟動(dòng)子或通過重組DNA或其他合成DNA技術(shù)產(chǎn)生的其他大腸 桿菌啟動(dòng)子可用于提供插入基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)使用昆蟲細(xì)胞時(shí)，合適桿狀病毒啟動(dòng)子包括晚 期啟動(dòng)子，諸如39K蛋白質(zhì)啟動(dòng)子或堿性蛋白啟動(dòng)子，和極晚期啟動(dòng)子諸如plO和多角體啟 動(dòng)子。在一些情況下，可需要使用含有多個(gè)桿狀病毒啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)移載體。適合于在哺乳動(dòng)物 細(xì)胞中引導(dǎo)表達(dá)的常見啟動(dòng)子包括但不限于SV40、MMTV、金屬硫蛋白-1、腺病毒Ela、CMV、立 即早期、免疫球蛋白重鏈啟動(dòng)子和增強(qiáng)子和RSV-LTR。啟動(dòng)子可為組成性的或替代地組織特 異性或可誘導(dǎo)的。另外，在一些情況下可使用可誘導(dǎo)(TetOn)啟動(dòng)子。
[0233] 原核生物中的mRNA的翻譯取決于不同于真核生物的那些信號(hào)的適當(dāng)原核生物信 號(hào)的存在。mRNA在原核生物中的有效翻譯需要mRNA上的稱為Shine-Dalgarno("SD"）序列的 核糖體結(jié)合位點(diǎn)。此序列是位于通常為AUG的起始密碼子之前的短mRNA核苷酸序列，所述起 始密碼子編碼蛋白質(zhì)的氨基末端甲硫氨酸。SD序列與16SrRNA(核糖體RNA)的3'末端互補(bǔ)并 且通過與rRNA雙重運(yùn)作以允許核糖體的正確定位來促進(jìn)mRNA結(jié)合至核糖體。關(guān)于最大化基 因表達(dá)的綜述，參見Roberts和Lauer，"Maximizing Gene Expression on a Plasmid Using Recombination in vitro/'Methods in Enzymology,68:473-82(1979)，其全部以 引用方式并入本文。
[0234] 本發(fā)明還包括以本文公開的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可為原核或真 核細(xì)胞。適合于表達(dá)本文公開多肽的宿主細(xì)胞包括更通?？色@得革蘭氏陰性細(xì)菌中的任何 一種。合適的微生物包括綠膿桿菌、大腸桿菌、胃腸炎沙門氏菌(typhimirium)、傷寒沙門氏 菌、腸炎沙門氏菌、福氏志賀氏菌、索氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌、淋病奈瑟氏菌、腦膜炎奈 瑟氏菌、流感嗜血桿菌、胸膜肺炎嗜血桿菌、溶血巴斯德氏菌、多殺巴斯德氏菌、嗜肺軍團(tuán) 菌、梅毒密螺旋體、齒垢密螺旋體、口腔密螺旋體、伯氏疏螺旋體、疏螺旋體屬、鉤端螺旋體、 肺炎克雷伯氏菌、普通變形桿菌、摩氏變形桿菌、奇異變形桿菌、普氏立克次體、傷寒立克次 體、立氏立克次體、牙齦卟啉單胞菌(類桿菌）、鸚鵡熱衣原體、肺炎衣原體、沙眼衣原體、空 腸彎曲桿菌、中間型彎曲桿菌、胚胎彎曲桿菌、幽門螺旋桿菌、土拉弗朗西斯菌、霍亂弧菌、 副溶血性弧菌、百日咳桿菌、類鼻疽伯克氏菌、流產(chǎn)布魯氏菌、豬布魯氏菌、羊布魯氏菌、犬 布魯氏菌、小螺菌、鼻疽假單胞菌、嗜水氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌和鼠疫桿菌。
[0235] 除了細(xì)菌細(xì)胞以外，動(dòng)物細(xì)胞，尤其哺乳動(dòng)物和昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞、植 物細(xì)胞或藻類細(xì)胞也是轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化負(fù)載本文公開類型的分離多核苷酸分子的重組表達(dá)載體 的合適宿主細(xì)胞。通常在本領(lǐng)域中使用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系包括中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞、宮頸癌 細(xì)胞、幼倉鼠腎細(xì)胞、C0S細(xì)胞和許多其他細(xì)胞。合適昆蟲細(xì)胞系包括易患桿狀病毒感染的 細(xì)胞，包括Sf9和Sf21細(xì)胞。
[0236] 用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域中是熟知的并且取決于所選擇的 宿主系統(tǒng)，如SAMBROOK&RUSSELL,MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL(Cold Springs Laboratory Press,2001)所描述，其全部以引用方式并入本文。對(duì)于細(xì)菌細(xì)胞，合 適技術(shù)包括氯化鈣轉(zhuǎn)化、電穿孔和使用噬菌體的轉(zhuǎn)染。對(duì)于真核細(xì)胞，合適技術(shù)包括磷酸鈣 轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染，和使用逆轉(zhuǎn)錄病毒或任何其他病毒載體的轉(zhuǎn) 導(dǎo)。對(duì)于昆蟲細(xì)胞，含有多核苷酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)移載體與桿狀病毒DNA，諸如AcNPV-起共轉(zhuǎn) 染，以促進(jìn)重組病毒的產(chǎn)生。Sf細(xì)胞的隨后重組病毒感染導(dǎo)致重組蛋白產(chǎn)生的較高速率。不 論用于促進(jìn)蛋白質(zhì)產(chǎn)生的表達(dá)系統(tǒng)和宿主細(xì)胞為何，表達(dá)抗體、抗體片段或抗體模擬物可 使用在本領(lǐng)域中已知并且在PHILIP L.R. BONNER，PR0TEIN PURIFICATIONRoutledge 2007)中描述的標(biāo)準(zhǔn)純化方法來容易地純化，其全部以引用方式并入本文。
[0237] 編碼單克隆抗體的多核苷酸可進(jìn)一步使用重組DNA技術(shù)來修飾以產(chǎn)生替代抗體。 舉例來說，小鼠單克隆抗體的輕和重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域可替換為人抗體的那些區(qū)域以產(chǎn)生人 源化(或嵌合)抗體，如以上論述。或者，小鼠單克隆抗體的輕和重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域可替換為 非免疫球蛋白多肽以產(chǎn)生融合抗體。在其他實(shí)施方案中，所述恒定區(qū)被截?cái)嗷蚍Q除以便產(chǎn) 生單克隆抗體的所需的抗體片段。可變區(qū)的定點(diǎn)或高密度組合誘變可以用于優(yōu)化單克隆抗 體的特異性和親和力。
[0238] 另一個(gè)方面涉及包括載體和根據(jù)本發(fā)明的一或多種單克隆抗體或一或多種其Amd 結(jié)合部分的藥物組合物。此藥物組合物可含有兩種或更多種抗體或結(jié)合片段，其中所有抗 體或結(jié)合片段識(shí)別相同表位?；蛘?，藥物組合物可含有抗體或結(jié)合片段混合物，其中一或多 種抗體或結(jié)合片段識(shí)別葡萄球菌Amd的一個(gè)表位并且一或多種抗體或結(jié)合片段識(shí)別葡萄球 菌Amd的不同表位。舉例來說，混合物可含有特異性結(jié)合至葡萄球菌Amd的R1或R2結(jié)構(gòu)域的 一或多種抗體與結(jié)合至Amd的任何其他抗體，諸如結(jié)合至Amd的催化結(jié)構(gòu)域的抗體。藥物組 合物可進(jìn)一步含有藥學(xué)上可接受的載體或如以下描述的其他藥學(xué)上可接受的組分。在一個(gè) 優(yōu)選實(shí)施方案中，載體是水溶液。
[0239] 含有本文公開的抗體的藥物組合物可施用至患有葡萄球菌感染或處于患有葡萄 球菌感染的風(fēng)險(xiǎn)中的受試者。各種輸送系統(tǒng)已知并且可用于施用本文公開的抗體。引入的 方法包括但不限于皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外和口服途徑。治療劑可 例如通過輸注或快速濃注、通過經(jīng)由上皮或皮膚粘膜襯里(例如，口腔粘膜、直腸和腸道粘 膜等)來吸收而施用并且可與其他生物活性劑，諸如化學(xué)治療劑、抗生素劑或其他免疫治療 劑一起施用。施用可全身或局部，即，在葡萄球菌感染位點(diǎn)或直接施用至手術(shù)或植入位點(diǎn)。
[0240] 藥物組合物還可包括施用至患者的第二治療劑，其中第二治療劑是抗生素劑或免 疫治療劑。示例性抗生素劑包括但不限于萬古霉素、妥布霉素、頭孢唑林、紅霉素、克林霉 素、利福平、慶大霉素、夫西地酸、米諾環(huán)素、復(fù)方新諾明、克林霉素、利奈唑胺、奎奴普丁-達(dá) 福普丁、達(dá)托霉素、替加環(huán)素、達(dá)巴萬星、特拉萬星、奧利萬星、頭孢比普、頭孢洛林、艾拉普 林、碳青霉烯CS-023/R0-4908463及其組合。示例性免疫治療劑包括但不限于替巴珠單抗、 BSYX-AllCKAurexis?及其組合。抗生素劑和免疫治療劑的以上列表意圖為非限制實(shí)例；因 而，還涵蓋其他抗生素劑或免疫治療劑。第二治療劑的組合或混合物也可用于這些用途。這 些劑可同時(shí)或作為單一制劑來施用。
[0241] 在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫治療劑包括特異性結(jié)合至葡萄球菌氨基葡萄糖苷酶 (Gmd)并且抑制葡萄球菌菌株的體內(nèi)生長(zhǎng)的第二單克隆抗體或其結(jié)合部分。優(yōu)選地，第二單 克隆抗體由稱為1(：11、把12、2011、348、3冊(cè)或4412的雜交瘤細(xì)胞系、其人源化變體或其結(jié)合 部分產(chǎn)生（Schwarz等人的PCT公布號(hào)W02011/140114和W02013/066876,其全部以引用形式 并入本文）。還根據(jù)此方面，第二單克隆抗體的人源化變體優(yōu)選地為IgGl、IgG2、IgG3或IgG4 類別。
[0242] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二單克隆抗體的結(jié)合部分包括Fab片段、Fv片段、單鏈抗 體、Vh結(jié)構(gòu)域或Vl結(jié)構(gòu)域。
[0243] 藥物組合物通常包括一或多種藥物載體(例如無菌液體，如水和油，包括石油、動(dòng) 物、植物或者合成來源的那些，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等）。當(dāng)藥物組合物靜脈內(nèi) 施用時(shí)，水是較典型載體。鹽水溶液和水性右旋糖和甘油溶液可用作液體載劑，尤其用于可 注射溶液。適合的藥物賦形劑還包括例如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、 白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。 如果需要，組合物還可包含少量潤(rùn)濕劑或乳化劑或pH緩沖劑。這些組合物可采用溶液、懸浮 液、乳液、片劑、丸劑、膠囊、粉末、持續(xù)釋放制劑等形式。組合物可用傳統(tǒng)粘合劑和載體(如 甘油三酯)配制成栓劑。口服制劑可包括標(biāo)準(zhǔn)載體諸如藥物等級(jí)的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬 脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。合適藥物載體的實(shí)例描述于E.W.Martin的"Remington' s Pharmaceutical Sciences"中。這些組合物將包含治療有效量的核酸或蛋白質(zhì)(通常呈 純化形式）和適合量的載體以便提供用于適當(dāng)施用至所述患者的形式。制劑應(yīng)該適合于施 用模式。
[0244] 治療上述細(xì)菌感染的組合物的有效劑量可取決于許多不同因素而變化，包括施用 模式、目標(biāo)位點(diǎn)、患者的生理狀態(tài)、施用的其他藥物，和是否治療是預(yù)防性或治療性。在預(yù)防 性的應(yīng)用中，經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間以相對(duì)低的頻率的時(shí)間間隔施用相對(duì)低的劑量。一些患者在其余生 繼續(xù)接受治療。在治療性的應(yīng)用中，有時(shí)需要以相對(duì)短的時(shí)間間隔施用相對(duì)高的劑量，直到 疾病的發(fā)展減弱或停止，并且優(yōu)選直到患者顯示病癥的部分或完全改善。此后，可向患者施 用預(yù)防性方案。對(duì)于針對(duì)葡萄球菌細(xì)菌感染的預(yù)防性治療，規(guī)定本文公開的藥物組合物可 在個(gè)體暴露于細(xì)菌之前施用并且所得免疫響應(yīng)可抑制或減少細(xì)菌感染的嚴(yán)重性以使得細(xì) 菌可從個(gè)體消除。舉例來說，單克隆抗體或藥物組合物可在手術(shù)程序，諸如關(guān)節(jié)置換或涉及 假體植入物的任何手術(shù)之前、期間和/或之后立即施用。
[0245] 對(duì)于使用本文公開的抗體或結(jié)合片段的被動(dòng)免疫，劑量在約0.0001至約100mg/ kg，并且更通常約0.01至約10mg/kg宿主體重范圍內(nèi)。舉例來說，劑量可為約lmg/kg體重或 約10mg/kg體重，或在約1至約10mg/kg范圍內(nèi)。示例性治療方案需要每?jī)芍芤淮位蛎吭乱淮?或每3至6個(gè)月一次施用。在一些方法中，可同時(shí)施用具有不同結(jié)合特異性的兩種或兩種以 上單克隆抗體，在所述狀況下，所施用每一種抗體的劑量在所指示的范圍內(nèi)。抗體通常在多 個(gè)場(chǎng)合施用。單個(gè)劑量之間的間隔可為每天、每周、每月或每年。在某些方法中，劑量被調(diào)整 到獲得l-l〇〇〇μg/ml的血漿抗體濃度，并且在某些方法中是25-300μg/ml。或者，可將抗體以 持續(xù)釋放制劑形式施用，在所述狀況下，需要較低頻率的施用。劑量和頻率視患者中抗體的 半衰期而變化。通常，人抗體展示最長(zhǎng)半衰期，隨后為人源化抗體、嵌合抗體和非人抗體。
[0246] 另一個(gè)方面涉及將矯形植入物、組織移植物或醫(yī)療裝置引入患者的方法，包括向 需要這類植入物的患者施用有效量的本文公開的單克隆抗體、結(jié)合部分或藥物組合物，并 且將矯形植入物或醫(yī)療裝置引入患者。
[0247] 如本文使用，"引入"醫(yī)療裝置定義為第一次引入或安裝裝置或移植物，以及將以 前安裝的裝置或移植物重修表面或以其他方式修整，全部或部分地替換以前安裝的裝置或 移植物，或另外手術(shù)修整以前安裝的裝置或移植物。
[0248] 在一個(gè)實(shí)施方案中，引入矯形植入物、醫(yī)療裝置或移植物的方法包括向需要矯形 植入物、醫(yī)療裝置或移植物的患者全身性施用有效量的單克隆抗體或結(jié)合片段或含有所述 抗體或其結(jié)合片段的藥物組合物，或直接施用至植入位點(diǎn)。替代地或附加地，矯形植入物、 醫(yī)療裝置或移植物可在將其植入于植入位點(diǎn)之前、期間或之后立即用單克隆抗體或結(jié)合片 段或含有所述抗體或結(jié)合片段的藥物組合物涂布或處理。
[0249] 矯形植入物可為易于葡萄球菌感染的任何類型的植入物，諸如關(guān)節(jié)假體、移植物 或合成植入物。示例性關(guān)節(jié)假體包括不限于膝蓋假體、髖假體、手指假體、肘假體、肩假體、 顳下頌假體和踝假體。也可使用其他假體。示例性移植物或合成植入物包括但不限于血管 移植物、心瓣植入物、人工椎間板、半月板植入物，或合成或同種異體移植物前十字韌帶、內(nèi) 側(cè)副韌帶、外側(cè)副韌帶、后十字韌帶、阿基里斯腱，和旋轉(zhuǎn)肌群。也可使用其他移植物或植入 物。
[0250] 醫(yī)療裝置可為易于葡萄球菌感染的任何醫(yī)療裝置。示例性醫(yī)療裝置包括但不限于 心臟起搏器、腦脊液分流器、透析導(dǎo)管或假體心瓣。
[0251] 根據(jù)此方面，第二治療劑也可施用至患者。第二治療劑可為抗生素劑或免疫治療 劑。示例性抗生素劑和免疫治療劑如上所述。
[0252] 在一個(gè)實(shí)施方案中，引入矯形植入物或醫(yī)療裝置的方法規(guī)定包括安裝翻修全關(guān)節(jié) 置換物的過程。當(dāng)發(fā)生感染，尤其原始關(guān)節(jié)置換的葡萄球菌屬感染時(shí)，唯一可行的治療是翻 修全關(guān)節(jié)置換。在此實(shí)施方案中，感染關(guān)節(jié)假體首先移除然后治療患者的潛在感染。感染的 治療在較長(zhǎng)時(shí)間（即6個(gè)月）內(nèi)發(fā)生，在此時(shí)間期間患者不能移動(dòng)的（或只具有有限活動(dòng)性） 并且接收治療潛在感染的高劑量抗生素和任選地本文公開的一或多種單克隆抗體或結(jié)合 部分或藥物組合物。在治療潛在感染后，安裝新的關(guān)節(jié)假體。在安裝新的關(guān)節(jié)假體之前立即 (即，安裝新的關(guān)節(jié)假體之前兩周內(nèi)）和任選地在所述安裝之后，向患者施用本文公開的一 或多種單克隆抗體或結(jié)合部分，或藥物組合物。此治療可在安裝后時(shí)段期間重復(fù)一次或多 次?？股刂委熆膳c本文公開的一或多種單克隆抗體或結(jié)合部分或藥物組合物組合或同時(shí) 施用。這些治療有效預(yù)防翻修全關(guān)節(jié)置換期間的感染或再感染。
[0253] 另一個(gè)方面涉及治療或預(yù)防葡萄球菌感染的方法，涉及向易患或患有葡萄球菌感 染的患者施用有效量的本文公開的單克隆抗體、單克隆抗體結(jié)合部分或藥物組合物或其組 合。
[0254] 在治療葡萄球菌感染的一個(gè)實(shí)施方案中，重復(fù)施用單克隆抗體、單克隆抗體結(jié)合 部分、藥物組合物或其組合。初始和重復(fù)施用可相對(duì)于其他治療同時(shí)或依序進(jìn)行并且全身 進(jìn)行或直接進(jìn)行施用至葡萄球菌感染位點(diǎn)，或兩種情況都有。
[0255] 治療葡萄球菌感染的方法可用于治療包括但不限于皮膚、肌肉、心臟、呼吸道、胃 腸道、眼睛腎和泌尿道感染和骨骼或關(guān)節(jié)感染的位點(diǎn)處的葡萄球菌感染。
[0256] 在一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)行此方法以通過向患有葡萄球菌骨骼或關(guān)節(jié)感染的患者施 用有效量的單克隆抗體或其結(jié)合片段或藥物組合物來治療骨髓炎。施用這些藥劑或組合物 可使用上述任何途徑來進(jìn)行;在某些實(shí)施方案中，可進(jìn)行直接施用至骨骼或關(guān)節(jié)感染位點(diǎn)。
[0257] 在每個(gè)前述實(shí)施方案中，第二治療劑也可施用至患者。第二治療劑可為抗生素劑 或免疫治療劑。示例性抗生素劑和免疫治療劑如上所述。
[0258] 如本文公開的治療方法可用于治療有需要的任何患者，包括人和非人哺乳動(dòng)物， 然而，所述方法尤其適用于任何年齡的免疫受損患者，以及年長(zhǎng)于50歲齡的患者。
[0259] 在前述實(shí)施方案中，預(yù)防性或治療性治療方法可減少感染率、感染嚴(yán)重性、感染持 續(xù)時(shí)間或其任何組合。在某些實(shí)施方案中，預(yù)防性或治療性治療方法可減少或完全地消除 全部數(shù)量的SRC或膿腫，和/或增加無菌SRC或膿腫的數(shù)量(假定SRC或膿腫存在）。在某些實(shí) 施方案中，設(shè)想骨質(zhì)溶解病變的部分或完全愈合，如病灶大小或體積的減少所指示。
[0260] 另一個(gè)方面涉及確定樣品中存在葡萄球菌的方法，其涉及使樣品暴露于本文公開 的單克隆抗體或結(jié)合部分并且檢測(cè)是否在單克隆抗體或結(jié)合部分與存在于樣品中的葡萄 球菌或葡萄球菌酰胺酶之間形成免疫復(fù)合物，由此所述暴露之后的免疫復(fù)合物的存在指示 樣品中的葡萄球菌的存在。
[0261] 樣品可為血液樣品、血清樣品、血漿樣品、粘膜相關(guān)聯(lián)淋巴組織(MALT)樣品、腦脊 液樣品、關(guān)節(jié)液樣品、胸膜液樣品、唾液樣品、尿樣或組織活檢樣品。
[0262] 檢測(cè)免疫復(fù)合物的形成可通過在本領(lǐng)域中熟知的方法來進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案 中，檢測(cè)使用免疫測(cè)定來進(jìn)行。所用免疫測(cè)定方法可為已知免疫測(cè)定方法，并且例如，可提 及常見免疫測(cè)定方法諸如膠乳凝集方法，濁度方法，放射免疫測(cè)定方法(例如，RIA和RIMA)， 酶免疫測(cè)定方法(例如，ELI SA和El A )，凝膠擴(kuò)散沉淀反應(yīng)，流式細(xì)胞術(shù)，免疫電泳(例如蛋白 質(zhì)印跡），斑點(diǎn)印跡方法，免疫擴(kuò)散測(cè)定，蛋白質(zhì)A免疫測(cè)定，熒光免疫測(cè)定（例如，F(xiàn)IA和 IFMA)，免疫色譜方法和抗體陣列方法，但是不限于這些方法。這些免疫測(cè)定方法本身在此 領(lǐng)域中是已知的，并且可容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行。
[0263] 單克隆抗體或結(jié)合部分可通過在本領(lǐng)域中已知的各種方法來直接標(biāo)記。標(biāo)記充當(dāng) 確定單克隆抗體或結(jié)合部分在免疫測(cè)定中由分析物結(jié)合的程度的試劑手段。標(biāo)記可為不限 于放射性同位素、酶、發(fā)色團(tuán)、熒光團(tuán)、光吸收或折射顆粒。優(yōu)選地，標(biāo)記是放射性同位素標(biāo) 記、熒光團(tuán)或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記。優(yōu)選盡可能廣泛地標(biāo)記抗體或結(jié)合部分而不破壞其免疫反應(yīng) 性。 實(shí)施例
[0264] 以下實(shí)例意欲例示實(shí)施要求保護(hù)的標(biāo)的，但是決不意欲限制其范圍。
[0265] 實(shí)施例1-制備抗原
[0266] 制備金黃色葡萄球自溶素菌的整個(gè)酰胺酶結(jié)構(gòu)域的重組形式，其包括其N末端附 近的六組氨酸序列(His-AmdhHis-Amd的開放解讀碼組通過收集金黃色葡萄球菌自溶素的 已知序列、使用Geneious?軟件來確定共有蛋白質(zhì)序列，然后優(yōu)化用于在大腸桿菌中表達(dá)的 密碼子來設(shè)計(jì)。His-Amd的編碼共有蛋白質(zhì)和編碼開放解讀碼組序列識(shí)別為以下SEQ ID N0:1和2。
[0267] SEQ ID NO: 1 (Hex-組氨酸前導(dǎo)序列加上自溶素aa 198-775)
[0271] 編碼His-Amd的DNA分子通過DNA2.0(Menlo Park，CA)重新合成，然后插入 pjexpress大腸桿菌表達(dá)載體中。
[0272] 在大腸桿菌中表達(dá)的His-Amd蛋白質(zhì)主要呈不溶性包含體形式，其收獲并溶解于 具有8M尿素的PBS中。在TALON樹脂上的金屬螯合色譜來進(jìn)一步純化之后，His-Amd通過相對(duì) 于含有ImM Zn2+和逐步減小水平尿素的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)的廣泛透析過程來復(fù)性。
[0273] Amd催化結(jié)構(gòu)域(His-Amd-cat)以相同方式制備，除了編碼R1和R2結(jié)構(gòu)域的開放解 讀碼組部分省略以外(參見圖l)』iS-Amd-cat的編碼共有蛋白質(zhì)和編碼開放解讀碼組序列 識(shí)別為以下SEQ ID N0:3和4。
[0274] SEQ ID NO:3(Hex_組氨酸前導(dǎo)序列加上自溶素aa 198-441)
[0278]實(shí)施例2-接種小鼠和制備雜交瘤
[0279]對(duì)于初始雜交瘤融合(融合#1)，六個(gè)雌性Balb/c小鼠通過腹膜內(nèi)注射以七周間隔 用Sigma Adjuvant System(Sigma，Cat.No.S6322)中的 75ug His_AmdRlR2 免疫兩次。選擇 在固定His-AmdRlR2上的ELISA中具有最高滴度的兩只小鼠用于雜交瘤融合。在處死和雜交 瘤融合之前四天，每只小鼠接受350yg His-AmdRlR2的腹膜內(nèi)最終免疫。
[0280]對(duì)于第二雜交瘤融合（融合#2)，Balb/c小鼠免疫兩次：第一次給予Sigma Adjuvant System(Sigma，Cat .No ? S6322)中的 120iig來自GenScript的His-AmdRlR2_B(批號(hào) 222933S05/P20011303)，并且以十二周間隔第二次用lOOyg的與匙孔血藍(lán)蛋白（KLH)綴合的 His-AmdRlR2_B(Imject EDC mcKLH Spin Kit;Thermo Scientific;Cat#77671)免疫。選擇 在固定His-AmdRlR2上的ELISA中具有最高滴度的兩只小鼠用于雜交瘤融合。處死和雜交瘤 融合之前四天，每只小鼠接受1 〇〇yg的Hi s-AmdRlR2的腹膜內(nèi)最終免疫。
[0281 ]雜交瘤通過常規(guī)方法從脾細(xì)胞制備。
[0282] 實(shí)施例3-單株抗體的表征
[0283] 新的單克隆抗體在多個(gè)相關(guān)蛋白質(zhì)上篩選以確定其識(shí)別原生Amd(并非僅重組形 式)和是否其表位存在于催化(C)或細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域(R1、R2或R3)上。用于篩選單克隆抗 體的蛋白質(zhì)在下表1中識(shí)別。
[0284] 表1:用于篩選單株抗體的蛋白質(zhì)
[0286]篩選測(cè)定使用在表1中識(shí)別為捕獲抗原的蛋白質(zhì)通過ELISA來進(jìn)行。ELISA測(cè)試使 用廣泛實(shí)施規(guī)范來進(jìn)行。具體來說，將抗原吸附至NUNC Maxisorp微量滴定板的孔上。每個(gè) 抗原在2yg/mL下制備為磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的溶液并且lOOyL添加至指定微量滴定孔 并且允許抗原在RT下吸附1小時(shí)或在4 °C下吸附過夜?？淄ㄟ^添加200此的3%牛血清清蛋白 (BSA)來阻斷，而不移除涂布抗原，并且在RT下孵育1小時(shí)或在4°C下孵育過夜。然后，涂布并 阻斷的板用補(bǔ)充〇.〇5%Tween 20的PBS(PBS-T)沖刷3X并且直接使用或存儲(chǔ)在4°C下。
[0287] 將無細(xì)胞雜交瘤培養(yǎng)上清液添加至指定孔并且在RT下孵育1小時(shí)，然后用PBS-T沖 刷六次。然后在〇. l-o. 5yg/mL下在PBS-T中以100yL/孔來添加二次抗體，辣根過氧物酶-綴 合山羊抗小鼠IgG(Southern Biotechnology)，并且在RT下孵育1小時(shí)。微量滴定板再次用 PBS-T沖刷六次，然后通過添加100yL的3,3'，5,5'_四甲基聯(lián)苯胺(TMB)或2，2 ' -連氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）(ABTS)來顯影。這些ELISA的結(jié)果在下表2中示出。
[0288] 表2.成功克隆并表征抗Amd mAb的概述
[0290] ND =未確定。
[0291 ] 實(shí)施例4-體外抑制Amd催化活性
[0292] 可有助于治療性單克隆抗體的效力的特性是其直接抑制細(xì)菌生長(zhǎng)和存活必需的 酶諸如酰胺酶的活性。通過測(cè)量一些抗Amd mAb抑制酰胺酶使金黃色葡萄球菌肽聚糖的混 濁懸浮液澄清的能力的程度來測(cè)試其對(duì)于酰胺酶活性的抑制。來自融合#1的八種抗體的結(jié) 果呈現(xiàn)于圖2中。MAb Amdl .6是酰胺酶活性的有效抑制劑，而其他抗體不是有效抑制劑，并 且似乎是低親和力抑制劑的Amdl. 16可能是例外。所有抗體的結(jié)果在表2中總結(jié)。
[0293] 實(shí)施例5-大多數(shù)抗Amd mAb使金黃色葡萄球菌沉淀
[0294] 治療性單克隆抗體的效力可能至關(guān)重要的另一個(gè)特性是識(shí)別可從完整細(xì)菌細(xì)胞 的外部接近的抗原性結(jié)構(gòu)(表位）。此識(shí)別的可見表現(xiàn)是抗體介導(dǎo)的個(gè)別細(xì)菌群聚至較大聚 集體，所述聚集體從懸浮液沉淀，產(chǎn)生富含細(xì)胞的球團(tuán)和不太混濁的上清液。許多候選mAb 形成明顯沉淀物，如圖3描繪。來自融合1和2的候選mAb的沉淀活性的概述是在表2中。
[0295] 實(shí)施例6-每個(gè)mAb的獨(dú)特性和基于測(cè)序來識(shí)別種系指定
[0296] 基因指定通過將抗Amd重鏈和輕鏈的核苷酸序列與國(guó)家生物技術(shù)信息中心的 IgBLAST中的已知鼠科V-區(qū)域序列的文件匹配來識(shí)別。該分析的結(jié)果呈現(xiàn)于下圖3中。來自 融合#1的每個(gè)抗體是唯一的，除了可能Amdl.l和1.4來自于相同種系V H基因片段以外。來自 融合#2的兩種抗體與在融合#1中分離的mAb共有重鏈VH和J H基因片段(mAb Amd2.4與mAb Amdl.ll;mAb Amd2.2與mAb Amdl.7)。在每個(gè)情況下，輕鏈?zhǔn)遣煌摹?br>[0297] 表3:最很可能的種系VH、JH、VL和JL基因片段
[0300] 圓括號(hào)中的數(shù)字是抗Amd序列與假定種系前體之間觀察到的非同義堿基變化的數(shù) 目。NA =測(cè)序是不成功的。
[0301] 實(shí)施例7-測(cè)量抗Amd mAb對(duì)于金黃色葡萄球菌酰胺酶的親和力
[0302]抗細(xì)菌抗體的必需特性是對(duì)于細(xì)菌抗原的高親和力。親和力越高，預(yù)防或治療所 需要?jiǎng)┝吭降?。雖然一些治療性抗體具有HMUKazIOI1)范圍內(nèi)的表達(dá)為Kd的親和力，但 是總體上需要具有Kd~1 nM ( Ka~109M-1)的抗體。固定抗Amd mAb對(duì)于可溶性Hi s -AmdR 1R2-B 的親和力使用BiacoreT-200上的表面等離子體共振技術(shù)來測(cè)量。mAbAmdl.6的代表性數(shù)據(jù) 呈現(xiàn)于圖4中。雖然其對(duì)于Amd的平均親和力是約2. InM，圖4示出約InM的測(cè)量親和力。對(duì)于 其他候選mAb的測(cè)量親和力在表2中列出。
[0303] 實(shí)施例8-抗Amd mAb Amdl.6抑制金黃色葡萄球菌菌株UAMS-1的體外生物膜形成 [0304] 已經(jīng)報(bào)告Amd參與生物膜的形成（Bose等人，"Contribution of the Staphylococcus aureus Atl AM and GL Murein Hydrolase Activities in Cell Division, Auto lysis ,and Biofilm Formation j^PLoS One 7:e42244(2012) ;Chen 等人， "Secreted Proteases Control Autolysin-mediated Biofilm Growth of Staphylococcus aureus，"J Biol Chem. 288: 29440-29452(2013) ;Houston等人， "Essential Role for the Major Autolysin in the Fibronectin-binding Protein-mediated Staphylococcus aureus Biofilm Phenotype，'，Infect Immun.79:1153-1165 (2011)，其各自全部以引用方式并入本文）。生物膜形成是被認(rèn)為對(duì)于體內(nèi)金黃色葡萄球菌 感染，尤其與矯形植入物相關(guān)聯(lián)的感染的持續(xù)性起根本作用的過程(Ehrlich和Arciola, "From Koch's Postulates to Biofilm Theory:The Lesson of Bill Costerton," Internat'l J Artificial Organs 35:695-699(2012)，其全部以引用方式并入本文）。為 了測(cè)量抗Amd mAbl .6抑制生物膜形成的能力，金黃色葡萄球菌菌株UAMS-1在專門設(shè)計(jì)用于 測(cè)量生物膜形成的卡爾加里板中生長(zhǎng)（Ceri等人，"The Calgary Biofilm Device:New Technology for Rapid Determination of Antibiotic Susceptibilities of Bacterial Biofilms，"J Clin Microbiol.37:1771-1776(1999)，其全部以引用方式并入 本文）。自溶素基因（△ atl)和在其Amd( A amd)和Gmd( A gmd)子結(jié)構(gòu)域中的缺失突變體各自 形成與WT UAMS-1相比大致上更小的生物膜(WT的20-35%)。單獨(dú)或與抗Gmd mAb 1C11組合 的Amdl.6(參見Schwarz等人的PCT公布號(hào)W02011/140114，其全部以引用方式并入本文)減 少生物膜形成超過50%，而具有不相關(guān)特異性的同種型匹配mAb沒有效應(yīng)（圖5)。通過外源 性抗Amd mAb來抑制細(xì)胞外Amd與缺失自溶素基因幾乎一樣有效。
[0305] 實(shí)施例9-抗Amd mAb Amdl.6減少植入物相關(guān)聯(lián)骨髓炎的體內(nèi)模型中的生物膜形 成
[0306] 因?yàn)橹踩胛锵嚓P(guān)聯(lián)生物膜被認(rèn)為是矯形適應(yīng)癥中的持續(xù)感染的主要來源，減少模 型植入物上的生物膜形成程度的能力可理解為抗Amd預(yù)防法的潛在臨床益處的量度。使用 植入物相關(guān)聯(lián)骨髓炎的鼠科模型，其中模型植入物在植入物上具有〇.5x 2.0mm平面的限定 關(guān)注區(qū)域，測(cè)量在用金黃色葡萄球菌感染14天期間以生物膜覆蓋的面積。最大感染程度是 如圖6A所觀察到的感染程度的約40-50%，其中小鼠用不相關(guān)特異性的同種型匹配抗體處 理。相對(duì)于對(duì)照，單獨(dú)或與抗Gmd mAb 1C11組合的mAb Amdl.6減少生物膜的形成約50% (圖 6B、6C、6E)。生物膜形成的此減少程度與自溶素基因（A atl)的遺傳缺陷導(dǎo)致的減少程度是 類似的（圖6B、6D、6E)，指示在生物膜形成方面，內(nèi)部遺傳缺失和通過外源性抗Amd抗體的干 擾在功能上是等效的。
[0307]實(shí)施例10-用抗Amd mAb Amdl.6被動(dòng)免疫減少由金黃色葡萄球菌感染導(dǎo)致的骨骼 溶解的體積
[0308]骨骼中的金黃色葡萄球菌感染的一種特有特征是由感染細(xì)菌引起的炎癥性響應(yīng) 所導(dǎo)致的骨骼溶解。因此，溶解的骨骼的體積(骨質(zhì)溶解體積）的減少被視為限制感染的量 度。為了獲知是否抗Amd mAbAmdl.6將限制骨骼破壞，將五只6-10周齡、雌性Balb/c小鼠的 群組用4〇11^/1^總劑量的？133(未處理的對(duì)照）、抗61]1(111^13 1(]11、抗41]1(111^41]1(11.6或組合 (lCll+Amdl.6)來腹膜內(nèi)免疫。二十四小時(shí)后，每個(gè)小鼠在其右脛骨中插入用USA300LAC:: lux，一種生物發(fā)光CA-MRSA菌株污染的銷釘。
[0309] 所有小鼠的生物發(fā)光成像在第0、3、5、7、10和14天使用XenogenIVIS Spectrum成 像系統(tǒng)(Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA)來進(jìn)行，并且第3天的峰BLI如前所述來量 化（Li等人，"Quantitative MouseModel of Implant-associated Osteomyelitis and the Kinetics of MicrobialGrowth,Osteolysis,and Humoral Immunity，''J Orthop Res 26:96-105(2008)，其全部以引用方式并入本文）。來自每個(gè)治療組的代表性BLI在圖7A中示 出，其指示細(xì)菌負(fù)載存在于每個(gè)治療組中。
[0310]允許所得感染發(fā)展十四天，此時(shí)將動(dòng)物處死并且將感染脛骨收獲以供通過顯微CT 來分析，如前所述（Li等人，"Effects of Antiresorptive Agents on Osteomyelitis : Novel Insights into the Pathogenesis of Osteonecrosis of the Jaw/'Ann NY Acad Sci 1192:84-94(2010)，其全部以引用方式并入本文）。在未處理的對(duì)照中，內(nèi)側(cè)和外 側(cè)端面上的骨骼溶解是廣泛的（圖7B);骨質(zhì)溶解體積在0.4mm 3內(nèi)取平均值。骨質(zhì)溶解體積 的減少在抗體處理小鼠的所有三個(gè)群組中測(cè)量（圖7C)。在接受組合療法的一個(gè)個(gè)體中，骨 質(zhì)溶解體積計(jì)算為〇,指示感染植入物位點(diǎn)的完全愈合。此個(gè)體中的組合抗體療法的效應(yīng)與 無菌銷釘和用有效抗生素療法治愈的感染銷釘?shù)刃В?，Li等人，"Quantitative Mouse Model of Implant-Associated Osteomyelitis and the Kinetics of Microbial Growth，0steolysis，and Humoral Immunity，"J Orthop Res 26:96-105(2008)中的慶大 霉素療法，其全部以引用方式并入本文）。認(rèn)為此個(gè)體代表在不存在抗生素療法的情況下感 染植入物位點(diǎn)的第一例成功愈合。
[0311] 實(shí)施例1卜用抗Amd mAb Amdl.6被動(dòng)免疫顯著減少細(xì)菌擴(kuò)散
[0312] 膿腫的形成是感染嚴(yán)重性的另一個(gè)適應(yīng)癥。所形成的膿腫的數(shù)目在實(shí)施例10中檢 查的相同小鼠中測(cè)量。組織學(xué)切片用橙黃G/阿爾新藍(lán)(ABG/0H)染色，其揭示由未染色區(qū)域 劃定界限的呈圓形炎癥性宿主細(xì)胞區(qū)域形式的膿腫，并且有時(shí)其中心具有深紅色染色病 灶。典型地，病灶是葡萄球菌膿腫群落(SAC);炎癥細(xì)胞是嗜中性白細(xì)胞，在中心附近大部分 死亡并且在周界附近大部分存活并且未染色區(qū)域是由纖維蛋白形成的包膜。在未處理的小 鼠中，形成多個(gè)膿腫（圖8A)，并且每個(gè)脛骨平均有幾乎4.5個(gè)膿腫（圖8C)。相比之下，mAb Amd 1.6處理小鼠平均只有兩個(gè)膿腫，與用抗Gmd mAb 1C11或用組合處理的小鼠一樣（圖8B、 8C)〇
[0313] 實(shí)施例12-用單獨(dú)或與抗Gmd 1C11組合的抗Amd mAb Amdl.6被動(dòng)免疫促進(jìn)形成無 菌膿腫并且加速骨骼愈合
[0314] 圖8B呈現(xiàn)的相同組織學(xué)切片的詳細(xì)檢查揭示意外的發(fā)現(xiàn)。一致地，髓內(nèi)革蘭氏染 色膿腫僅發(fā)現(xiàn)于PBS處理小鼠的脛骨中（圖9A-B)，而抗Atl處理小鼠的脛骨中的病灶是不含 有革蘭氏陽性細(xì)菌的無菌膿腫的特征（圖9C-H)。此外，雖然安慰劑處理小鼠的脛骨中的病 灶具有葡萄球菌膿腫群落（SAC)的明顯組織學(xué)特征（Cheng等人，"Genetic Requirements for Staphylococcus aureus Abscess Formation and Persistence in Host Tissues," FASEB J 23(10) :3393-3404(2009);Cheng等人，"Contribution of Coagulases Towards Staphylococcus aureus Disease and Protective ImmunityPLoS Pathog 6(8): e100 1036(2010)，其各自全部以引用方式并入本文），但是在抗Atl處理小鼠的脛骨中未觀 察到SAC(將圖10A-B與圖10C-H比較）。最后，并且最意外地，發(fā)現(xiàn)組合抗Amd和抗Gmd被動(dòng)免 疫不僅到第14天清除MRSA感染(證實(shí)在第3天是代謝活性的；圖7A)，而且允許骨骼愈合，已 經(jīng)證明這在植入物相關(guān)聯(lián)骨髓炎的此鼠科模型中從未發(fā)生過(比較圖11A-C)。具體來說，金 黃色葡萄球菌污染植入物的骨整合在圖11B中得到記錄，其顯示與在無菌銷釘對(duì)照中所觀 察到的水平類似水平的圍繞銷釘和皮質(zhì)的新骨骼形成（圖11C)。還使用精氨酸酶-1-陽性染 色來分析組織愈合M2巨噬細(xì)胞的存在或不存在。不能進(jìn)入PBS處理小鼠的脛骨中的SAC(圖 11D)的M2巨噬細(xì)胞廣泛侵入組合抗Amd和抗Gmd處理小鼠的脛骨中的無菌膿腫以促進(jìn)典型 組織愈合（圖 llE)(Murray 和 Wynn, "Protective and Pathogenic Functions of Macrophage Subsets,"Nat Rev Immunol 11 (11):723-737(2011 )，其全部以引用方式并入 本文）。
[0315] 實(shí)施例13-產(chǎn)生人源化抗Amd mAb Amdl.6
[0316] Amdl.6抗體的輕和重鏈的可變區(qū)使用引物來PCR擴(kuò)增以允許克隆至人抗體表達(dá)載 體中，Tiller等人所描述（"Efficient Generation of Monoclonal Antibodies from Single Human B Cells by Single Cell RT-PCR and Expression Vector Cloning," J. Immunol .Methods 329(1-2) : 112-24(2008)，其全部以引用方式并入本文）。將含有 Amdl.6輕和重鏈可變區(qū)和人k和IgGl恒定區(qū)的質(zhì)粒制備并且共轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中。3天之 后，將培養(yǎng)基從細(xì)胞移除并且通過ELISA來測(cè)定人IgG的存在和結(jié)合至固定Amd蛋白質(zhì)。結(jié)合 抗體使用偶聯(lián)至辣根過氧物酶和3，3 '，5，5 '四甲基聯(lián)苯胺底物的山羊抗人IgG抗體來檢測(cè)。 [0317] 為了證實(shí)人:小鼠嵌合Amdl .6與親本小鼠Amdl .6-樣與Amd反應(yīng)，將每一種抗體針 對(duì)其抑制Hi s-Amd的酶活性的能力來測(cè)試。
[0318]人源化Amdl.6抗體可用于經(jīng)歷初次全關(guān)節(jié)置換的老年患者（>65歲）的I期臨床試 驗(yàn)。人源化Amdl.6抗體單獨(dú)使用和與人源化1C11抗Gmd抗體組合使用，如美國(guó)專利申請(qǐng)公布 號(hào)20130110249所描述，其全部以引用方式并入本文。
[0319] 實(shí)施例14-產(chǎn)生人源化抗Amd mAb Amd2.1
[0320] Amd2.1抗體的輕和重鏈的可變區(qū)使用引物來PCR擴(kuò)增以允許克隆至人抗體表達(dá)載 體中，Tiller等人所描述（"Efficient Generation of Monoclonal Antibodies from Single Human B Cells by Single Cell RT-PCR and Expression Vector Cloning," J. Immunol .Methods 329(1-2) : 112-24(2008)，其全部以引用方式并入本文）。將含有 Amd2.1輕和重鏈可變區(qū)和人k和IgGl恒定區(qū)的質(zhì)粒制備并且共轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中。3天之 后，將培養(yǎng)基從細(xì)胞移除并且通過ELISA來測(cè)定人IgG的存在和結(jié)合至固定Amd蛋白質(zhì)。結(jié)合 抗體使用偶聯(lián)至辣根過氧物酶和3，3 '，5，5 '四甲基聯(lián)苯胺底物的山羊抗人IgG抗體來檢測(cè)。 [0321] 為了證實(shí)人:小鼠嵌合Amd2.1與親本小鼠Amd2.1-樣與Amd反應(yīng)，將每一種抗體針 對(duì)其抑制Hi s-Amd的酶活性的能力來測(cè)試。
[0322]人源化Amd2.1抗體可用于經(jīng)歷初次全關(guān)節(jié)置換的老年患者（>65歲）的I期臨床試 驗(yàn)。人源化Amd2.1抗體單獨(dú)使用和與人源化1C11抗Gmd抗體組合使用，如美國(guó)專利申請(qǐng)公布 號(hào)20130110249所描述，其全部以引用方式并入本文。
[0323]盡管本文已經(jīng)詳細(xì)示出和描述了優(yōu)選實(shí)施方案，相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是 可在不脫離本發(fā)明的精神的情況下進(jìn)行各種修改、添加、替換等，因此，這些修改、添加、替 換等被認(rèn)為在如以下權(quán)利要求書中定義的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種單克隆抗體或其結(jié)合部分，其特異性結(jié)合至葡萄球菌屬自溶素共有N-乙酰胞壁 酰-L-丙氨酸酰胺酶(Amd)催化結(jié)構(gòu)域和/或細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域。2. 如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或其Amd結(jié)合部分，其中所述單克隆抗體或Amd結(jié)合 部分抑制葡萄球菌菌株的體內(nèi)生長(zhǎng)和/或金屬、塑料和有機(jī)表面上的生物膜建立。3. 如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或其Amd結(jié)合部分，其中所述葡萄球菌菌株包括金黃 色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、路鄧葡萄球菌、腐生葡萄球菌、溶血葡萄球菌、山羊葡萄球菌或 猿葡萄球菌。4. 如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或其Amd結(jié)合部分，其中所述葡萄球菌菌株是甲氧西 林抗性或萬古霉素抗性的。5. 如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或其Amd結(jié)合部分，其中所述抗體或Amd結(jié)合部分結(jié) 合至所述Amd催化結(jié)構(gòu)域的表位。6. 如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或其Amd結(jié)合部分，其中所述抗體或Amd結(jié)合部分結(jié) 合至全部或部分在所述Amd R1或R2細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)的表位。7. 如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或其Amd結(jié)合部分，其中所述抗體或Amd結(jié)合部分以 大于10-8Μ的親和力結(jié)合至所述Amd催化結(jié)構(gòu)域或細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域。8. 如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或其Amd結(jié)合部分，其中所述抗體或Amd結(jié)合部分以 約1至約6nM的Kd結(jié)合至所述Amd催化結(jié)構(gòu)域或細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域。9. 如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或其Amd結(jié)合部分，其中所述抗體或Amd結(jié)合部分包 括包含以下氨基酸序列之一的Vh結(jié)構(gòu)域： SEQ ID N0：5(Amd 1.2)： PELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYIMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTS DKSSTTAYMELSSLTSEDXAVYYCARLDGYYDCFDYWGQGTTLTVSS SEQ ID N0：7(Amd 1.1)： QQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGITNYDPKFQGRA TITADTSSNIAYLQLTSLTSEGTAVYYCARGGYLSPYAMDYWGQGTSVTVSS SEQ ID N0：9(Amd 1.5)： QQSGAELVRPGALVKLSCKASGFNIQDYYLHffMKQRPEQGLEffIGffIDPENDNTVYDPKFRDRA SLTADTFSNTAYLQLSGLTSEDTAVYYCARRDGITTATRAMDYWGQGTSVTVSS SEQ ID NO：I l(Amd 1.6)： QSGTVLARPGTSVKMSCKASGYSFTNYWMHWVRQRPGQGLEWIGSIYPGNSDTTYNQKFKDKAK LTAVTSASTAYMELSSLTNEDSAVYYCTCDDYSRFSYWGQGTLVTVSA SEQ ID N0：13(Amd 1.7)： QQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYNMHWVKQSHGKSLEWIGYIFPYNGDTDYNQKFKNKA TLTVDNSSSTAYMDLRSLTSEDSAVYYCSRWGSYFDYWGQGTTLTVSS SEQ ID N0：15(Amd 1.9)： VESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPKKSLEWVASITSGGSAYYPDSVKGRFT ISRDNARNILNLQMSSLRSEDTAMYYCARDDGYFDYWGQGTTLTVSS SEQ ID N0：17(Amd 1.11)： QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADDF KGRFAFSLETSASTAYLLINNLKNEDTATYFCARRDGYFDAMDYWGQGTSVTVSS SEQ ID N0：19(Amd 1.12)： QQSGAELVRPGTSVKVSCKTSGYAFTNYLIEWVNQRPGQGLEWIGVINPGSGGTNYNEKFKAKA TLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCARSERGYYGNYGAMDYWGQGTSVTVSS SEQ ID NO:21(Amd 1.13): QQPGPELVKPGASLKISCKASGYSFSSSWMNWVKQRPGQGLEWIGRIYPVD⑶TNYNGKFKGKA TLTTDKSSSTAYMQLSSLTSVDSAVYFCARTGPYAMDYWGRGTSVTVSS SEQ ID NO：23(Amd 1.16)： GAELVRPGSSVKISCKASGYTFSTYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYP ⑶⑶ TNYNGKFKGKATLT ADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCARSMVTNYYFAMDYWGQGTSVTVSS SEQ ID NO：25(Amd 1.17)： GGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYYMYWVRQTPEKKLEWVATISDGGSYTYYPDSVKGRFTISR DNAKNNLYLQMSSLKSEDTAMYYCVRGLLGFDYWGQGTTLTVSS 和/或其中所述抗體或Amd結(jié)合部分包括包含以下氨基酸序列之一的1結(jié)構(gòu)域： SEQ ID N0：33(Amd 1.1)： ENVLTQSPAIMSASLGEKVTMTCRASSSVNYMFWFQQKSDASPKLWIYYTSNLAPGVPARFSGS GSGNSYSLTISSMEGEDAATYYCQEFTSFPYTFG SEQ ID N0：35(Amd 1.2)： DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISNNLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSG SGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPQYTF SEQ ID N0：37(Amd 1.6)： SIVMTQTPKFLLVSAGDRLTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLIYYTSNRYTGVPDRFTG SGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDYNSPffTFGGGTK SEQ ID N0：39(Amd 1.7)： SIVMTQTPKFLLVSAGDRLTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLIYYTSNRYTGVPDRFTG SGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDYNSPffTFGGGTK SEQ ID N0：41(Amd 1.8)： DIVMTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISDYLHWYQQRSHESPRLLIKYVSQSISGIPSRFSG SGSGSDFTLSINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPYTFG SEQ ID N0：43(Amd 1.9)： DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRTSENIFSNFAWYQQQPGKSPQLLVYGATNLADGVPSRFSG SGSGTQYSLKITSLQSEDFGSYYCQHFWGSPWTF SEQ ID N0：45(Amd 1.10)： QIVLTQSPALMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWYQQKPRSSPKPWIYLTSNLASGVPARFSGS GSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPPYTFG SEQ ID N0：47(Amd 1.11)： DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQSIGTSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSG SGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNSWPALTFG SEQ ID N0：49(Amd 1.12)： DIQMTQSPASLSASVGDTVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTFAEGVRSRFSG SGSGTQFSLQITSLQPEDFGSYYCQHHYGSPYTF SEQ ID N0：51(Amd 1.13)： DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGV PDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPFTFG SEQ ID N0：53(Amd 1.15)： DIAMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVRDRFXG SRCGTDFTFPISSVQGEDLAVYYCQQHYSIHSRS SEQ ID N0：55(Amd 1.17)： DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVP DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPWTFGGGT10. 如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或其Amd結(jié)合部分，其中所述抗體或Amd結(jié)合部分包 括包含以下氨基酸序列之一的Vh結(jié)構(gòu)域： SEQ ID N0：27(Amd 2.1)： GFVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEMRLEWVASISSGGSXTYYPDSVMGRF TISRDNARNILNLQMSSLRSEDTAMYYCARVGLYYDYYYSMDYWGQGTSVTVSS SEQ ID N0：29(Amd 2.2)： ESGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYNMHWVRQSHGKSLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKS KATLTVDNSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAREDGYYGYFDYWGQGTTLTGSS SEQ ID N0：31(Amd 2.4)： QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDF KGRFAFSLETSASAAYLQINNLKNEDTATYFCARDYDGYYYYAMDYWGQGTSVTVSS 和/或其中所述抗體或Amd結(jié)合部分包括包含以下氨基酸序列之一的1結(jié)構(gòu)域： SEQ ID N0：57(Amd 2.1)： DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLYSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKMLIYWASTRESGV PDRFTGSGSGTHFTLTISSVQAEDLAIYYCQNDYSYPVTFGAGTKLELK SEQ ID N0：59(Amd 2.2)： EIVLTQSPAITAASLGQKVTITCSASSSVNYMHWYQQKSGTSPKPWIYEISKLASGVPARFSSS GSGTSYSLTTSSMEAEDAAIYYCQQWNYPLITFGAGTKLELK SEQ ID N0：61(Amd 2.4)： ENALTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSSMSPKLWIYDTSKLASGVPGRFSGS GSGNSYSLTISSMEAEEVATYYCFQGSGFPVHVRRGDQVGNKT SEQ ID N0：63(Amd 2.5)： DIQMTQSPASLSASVGETITITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPHLLVFHARSLADGVPSRFSG SGSGTQYSLNINSLQPEDFGIYYCQHFWYTPYTFGGGTKLEIK11. 如權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或其Amd結(jié)合部分，其中所述單克隆 抗體或Amd結(jié)合部分是部分人源化或完全人抗體或結(jié)合部分。12. 如權(quán)利要求11所述的單克隆抗體或其Amd結(jié)合部分，其中所述人源化單克隆抗體是 IgGl、IgG2、IgG3 或 IgG4 類別。13. 如權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的Amd結(jié)合部分。14. 如權(quán)利要求13所述的Amd結(jié)合部分，其中所述Amd結(jié)合部分包括Fab片段、Fv片段、單 鏈抗體、Vh結(jié)構(gòu)域或九結(jié)構(gòu)域。15. -種單克隆抗體或其結(jié)合部分，其特異性結(jié)合至葡萄球菌屬N-乙酰胞壁酰-L-丙氨 酸醜胺酶(Amd)并且與選自 Amdl · 1、Amdl · 2、Amdl · 5、Amdl · 6、Amdl · 7、Amdl · 8、Amdl · 9、 Amdl·10、Amdl·11、Amdl·12、Amdl·13、Amdl·14、Amdl·15、Amdl·16、Amdl·17、Amd2·1、 Amd2.2、Amd2.4和Amd2.5的抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)。16. 如權(quán)利要求15所述的單克隆抗體或其Amd結(jié)合部分，其結(jié)合至Amd并且抑制Amd催化 活性。17. 如權(quán)利要求15所述的單克隆抗體或其Amd結(jié)合部分，其特異性結(jié)合至Amd并且與抗 體Amdl. 6交叉競(jìng)爭(zhēng)。18. 如權(quán)利要求15所述的單克隆抗體或其Amd結(jié)合部分，其特異性結(jié)合至Amd并且與抗 體Amd2.1交叉競(jìng)爭(zhēng)。19. 如權(quán)利要求15至18中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或其Amd結(jié)合部分，其中所述單克隆 抗體或Amd結(jié)合部分是部分人源化或完全人抗體或結(jié)合部分。20. 如權(quán)利要求15至19中任一項(xiàng)所述的Amd結(jié)合部分。21. -種單克隆抗體或其結(jié)合部分，其特異性結(jié)合至葡萄球菌屬N-乙酰胞壁酰-L-丙氨 酸酰胺酶(Amd)并且與結(jié)合所述Amd催化結(jié)構(gòu)域的抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)。22. 如權(quán)利要求21所述的單克隆抗體或其Amd結(jié)合部分，其特異性結(jié)合至Amd并且抑制 Amd催化活性。23. 如權(quán)利要求21所述的單克隆抗體或其Amd結(jié)合部分，其特異性結(jié)合至Amd并且與選 自Amdl .6、Amdl · 10、Amdl · 13、Amdl · 16、Amdl · 17、Amd2.1 和Amd2.2的抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)。24. 如權(quán)利要求21至23中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或其Amd結(jié)合部分，其中所述單克隆 抗體或Amd結(jié)合部分是部分人源化或完全人抗體或結(jié)合部分。25. 如權(quán)利要求21至24中任一項(xiàng)所述的Amd結(jié)合部分。26. -種單克隆抗體或其結(jié)合部分，其與選自以下的抗體一樣結(jié)合至葡萄球菌屬N-乙 酰胞壁酰丙氨酸酰胺酶(Amd)的相同表位:Amdl. l、Amdl .2、Amdl .5、Amdl .6、Amdl .7、 Amd1·8、Amd1·9、Amd1·10、Amd1·11、Amd1·12、Amd1·13、Amd1·14、Amd1·15、Amd1·16、 Amdl · 17、Amd2. l、Amd2.2、Amd2.4^[]Amd2.5D27. 如權(quán)利要求26所述的單克隆抗體或其Amd結(jié)合部分，其結(jié)合至Amd并且抑制Amd催化 活性。28. 如權(quán)利要求26所述的單克隆抗體或其Amd結(jié)合部分，其與抗體Amdl. 6-樣結(jié)合至相 同表位。29. 如權(quán)利要求26所述的單克隆抗體或其Amd結(jié)合部分，其與抗體Amd2.1-樣結(jié)合至相 同表位。30. 如權(quán)利要求26至30中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或其Amd結(jié)合部分，其中所述單克隆 抗體或Amd結(jié)合部分是部分人源化或完全人抗體或結(jié)合部分。31. 如權(quán)利要求26至30中任一項(xiàng)所述的Amd結(jié)合部分。32. -種細(xì)胞系，其表達(dá)如權(quán)利要求1至12、15至19、21至24和26至30中任一項(xiàng)所述的單 克隆抗體，或如權(quán)利要求13、14、20、25和31中任一項(xiàng)所述的Amd結(jié)合部分。33. 如權(quán)利要求32所述的細(xì)胞系，其中所述細(xì)胞系是雜交瘤。34. 如權(quán)利要求32所述的細(xì)胞系，其中所述細(xì)胞系是重組細(xì)胞系。35. -種藥物組合物，其包含載體和一或多種如權(quán)利要求1至12、15至19、21至24和26至 30中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體，或一或多種如權(quán)利要求13、14、20、25和31中任一項(xiàng)所述的 Amd結(jié)合部分。36. 如權(quán)利要求35所述的藥物組合物，其中所述載體是水溶液。37. 如權(quán)利要求35所述的藥物組合物，其進(jìn)一步包含抗生素劑或免疫治療劑。38. 如權(quán)利要求37所述的藥物組合物，其中所述抗生素劑選自由以下組成的組:萬古霉 素、妥布霉素、頭孢唑林、紅霉素、克林霉素、利福平、慶大霉素、夫西地酸、米諾環(huán)素、復(fù)方新 諾明、克林霉素、利奈唑胺、泰地唑胺、奎奴普丁-達(dá)福普丁、達(dá)托霉素、替加環(huán)素、達(dá)巴萬星、 特拉萬星、奧利萬星、頭孢比普、頭孢洛林、艾拉普林和碳青霉烯CS-023/R0-4908463。39. 如權(quán)利要求37所述的藥物組合物，其中所述免疫治療劑是替巴珠單抗或帕基昔單 抗。40. 如權(quán)利要求37所述的藥物組合物，其中所述免疫治療劑是特異性結(jié)合至葡萄球菌 氨基葡萄糖苷酶(Gmd)并且抑制葡萄球菌菌株的體內(nèi)生長(zhǎng)的第二單克隆抗體或其結(jié)合部 分。41. 如權(quán)利要求40所述的藥物組合物，其中所述第二單克隆抗體是1C11、1E12、2D11、 3A8、3H6或4A12、其人源化變體或其Gmd結(jié)合部分。42. 如權(quán)利要求41所述的藥物組合物，其中所述第二單克隆抗體的所述人源化變體是 IgGl、IgG2、IgG3 或 IgG4 類別。43. 如權(quán)利要求41所述的藥物組合物，其中所述第二單克隆抗體的所述Gmd結(jié)合部分包 含F(xiàn)ab片段、Fv片段、單鏈抗體、Vh結(jié)構(gòu)域或Vl結(jié)構(gòu)域。44. 如權(quán)利要求40所述的藥物組合物，其中所述單克隆抗體是Amdl. 6或包含Amdl. 6的 相同可變結(jié)構(gòu)域或互補(bǔ)決定區(qū)的人源化變體，并且所述第二單克隆抗體是1C11或包含1C11 的相同可變結(jié)構(gòu)域或互補(bǔ)決定區(qū)的人源化變體。45. -種將矯形植入物、移植物或醫(yī)療裝置引入患者體內(nèi)的方法，其包括： 向需要矯形植入物、移植物或醫(yī)療裝置的患者施用有效量的如權(quán)利要求1至12、15至 19、21至24和26至30中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體，一或多種如權(quán)利要求13、14、20、25和31中 任一項(xiàng)所述的Amd結(jié)合部分，或如權(quán)利要求35至44中任一項(xiàng)所述的藥物組合物； 將所述矯形植入物、移植物或醫(yī)療裝置引入所述患者體內(nèi)。46. 如權(quán)利要求45所述的方法，其進(jìn)一步包括在所述引入之前重復(fù)所述施用。47. 如權(quán)利要求45所述的方法，其進(jìn)一步包括在所述引入之后重復(fù)所述施用。48. 如權(quán)利要求45至47中任一項(xiàng)所述的方法，其中全身性進(jìn)行所述施用。49. 如權(quán)利要求45至47中任一項(xiàng)所述的方法，其中直接在植入位點(diǎn)進(jìn)行所述施用。50. 如權(quán)利要求45至49中任一項(xiàng)所述的方法，其中引入所述矯形植入物。51. 如權(quán)利要求50所述的方法，其中所述矯形植入物是關(guān)節(jié)假體、移植物或合成植入 物。52. 如權(quán)利要求51所述的方法，其中所述關(guān)節(jié)假體是全部或部分膝蓋假體、髖假體、手 指假體、肘假體、肩假體、顳下頌假體或踝假體。53. 如權(quán)利要求51所述的方法，其中所述移植物或合成植入物是血管移植物、心瓣植入 物、人工椎間板、半月板植入物，或合成或同種異體移植物前十字韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶、外側(cè)副 韌帶、后十字韌帶、阿基里斯腱或旋轉(zhuǎn)肌群。54. 如權(quán)利要求45至49中任一項(xiàng)所述的方法，其中引入所述移植物或醫(yī)療裝置。55. 如權(quán)利要求54所述的方法，其中所述醫(yī)療裝置是心臟起搏器、腦脊液分流器、透析 導(dǎo)管或假體心瓣。56. 如權(quán)利要求45至50或54中任一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括將第二治療劑施用至 所述患者，其中所述第二治療劑是抗生素劑或免疫治療劑。57. 如權(quán)利要求56所述的方法，其中所述抗生素劑選自由以下組成的組:萬古霉素、妥 布霉素、頭孢唑林、紅霉素、克林霉素、利福平、慶大霉素、夫西地酸、米諾環(huán)素、復(fù)方新諾明、 克林霉素、利奈唑胺、特地唑胺、奎奴普丁-達(dá)福普丁、達(dá)托霉素、替加環(huán)素、達(dá)巴萬星、特拉 萬星、奧利萬星、頭孢比普、頭孢洛林、艾拉普林和所述碳青霉烯CS-023/R0-4908463。58. 如權(quán)利要求56所述的方法，其中所述免疫治療劑是替巴珠單抗或帕基昔單抗。59. 如權(quán)利要求56所述的方法，其中所述免疫治療劑是特異性結(jié)合至葡萄球菌氨基葡 萄糖苷酶(Gmd)并且抑制葡萄球菌菌株的體內(nèi)生長(zhǎng)的第二單克隆抗體或其結(jié)合部分。60. 如權(quán)利要求59所述的方法，其中所述第二單克隆抗體是1C11、1E12、2D11、3A8、3H6 或4A12、其人源化變體或其Gmd結(jié)合部分。61. 如權(quán)利要求59所述的方法，其中所述單克隆抗體是Amdl. 6或包含Amdl. 6的相同可 變結(jié)構(gòu)域或互補(bǔ)決定區(qū)的人源化變體，并且所述第二單克隆抗體是1C11或包含1C11的相同 可變結(jié)構(gòu)域或互補(bǔ)決定區(qū)的人源化變體。62. 如權(quán)利要求59所述的方法，其中所述第二單克隆抗體的所述人源化變體是IgGl、 1862、1863或1 864類別。63. 如權(quán)利要求59所述的方法，其中所述第二單克隆抗體的所述Gmd結(jié)合部分包括Fab 片段、Fv片段、單鏈抗體、VH結(jié)構(gòu)域或九結(jié)構(gòu)域。64. 如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述矯形植入物是用于翻修全關(guān)節(jié)置換的關(guān)節(jié)假 體，所述方法進(jìn)一步包括： 將感染關(guān)節(jié)假體從所述患者體內(nèi)移除并且在所述將所述矯形植入物引入所述患者體 內(nèi)之前，針對(duì)所述感染對(duì)所述患者進(jìn)行治療。65. 如權(quán)利要求64所述的方法，其中所述治療包括施用有效量的抗生素劑、所述施用或 其組合。66. 如權(quán)利要求64或65所述的方法，其中所述方法在所述翻修全關(guān)節(jié)置換期間有效預(yù) 防感染或再感染。67. 如權(quán)利要求45至66中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述患者是人。68. 如權(quán)利要求45至66中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述患者是非人哺乳動(dòng)物。69. -種治療或預(yù)防葡萄球菌感染的方法，其包括： 向易患或患有葡萄球菌感染的患者施用有效量的如權(quán)利要求1至12、15至19、21至24和 26至30中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體，一或多種如權(quán)利要求13、14、20、25和31中任一項(xiàng)所述 的Amd結(jié)合部分，如權(quán)利要求35至44中任一項(xiàng)所述的藥物組合物或其組合。70. 如權(quán)利要求69所述的方法，其進(jìn)一步包括重復(fù)所述施用。71. 如權(quán)利要求69或70所述的方法，其中全身性進(jìn)行所述施用。72. 如權(quán)利要求69或70所述的方法，其中直接在葡萄球菌感染位點(diǎn)進(jìn)行所述施用。73. 如權(quán)利要求72所述的方法，其中所述葡萄球菌感染位點(diǎn)包括神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚、肌肉、 心臟、呼吸道、胃腸、眼睛、腎和泌尿道或骨骼和關(guān)節(jié)感染。74. 如權(quán)利要求69至73中任一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括將第二治療劑施用至所述 患者，其中所述第二治療劑是抗生素劑或免疫治療劑。75. 如權(quán)利要求74所述的方法，其中所述抗生素劑選自由以下組成的組:萬古霉素、妥 布霉素、頭孢唑林、紅霉素、克林霉素、利福平、慶大霉素、夫西地酸、米諾環(huán)素、復(fù)方新諾明、 克林霉素、利奈唑胺、特地唑胺、奎奴普丁-達(dá)福普丁、達(dá)托霉素、替加環(huán)素、達(dá)巴萬星、特拉 萬星、奧利萬星、頭孢比普、頭孢洛林、艾拉普林和所述碳青霉烯CS-023/R0-4908463。76. 如權(quán)利要求74所述的方法，其中所述免疫治療劑是替巴珠單抗或帕基昔單抗。77. 如權(quán)利要求74所述的方法，其中所述免疫治療劑是特異性結(jié)合至葡萄球菌氨基葡 萄糖苷酶(Gmd)和/或抑制葡萄球菌菌株的體內(nèi)生長(zhǎng)的第二單克隆抗體或其結(jié)合部分。78. 如權(quán)利要求77所述的方法，其中所述第二單克隆抗體是1C11、1E12、2D11、3A8、3H6 或4A12、其人源化變體或其Gmd結(jié)合部分。79. 如權(quán)利要求77所述的方法，其中所述單克隆抗體是Amdl. 6或包含Amdl. 6的相同可 變結(jié)構(gòu)域或互補(bǔ)決定區(qū)的人源化變體，并且所述第二單克隆抗體是1C11或包含1C11的相同 可變結(jié)構(gòu)域或互補(bǔ)決定區(qū)的人源化變體。80. 如權(quán)利要求77所述的方法，其中所述第二單克隆抗體的所述人源化變體是IgGl、 1862、1863或1 864類別。81. 如權(quán)利要求77所述的方法，其中所述第二單克隆抗體的所述Gmd結(jié)合部分包括Fab 片段、Fv片段、單鏈抗體、VH結(jié)構(gòu)域或九結(jié)構(gòu)域。82. 如權(quán)利要求69至81中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述患者是人。83. 如權(quán)利要求69至81中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述患者是非人哺乳動(dòng)物。84. 如權(quán)利要求69至83中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述葡萄球菌菌株是金黃色葡萄球 菌、表皮葡萄球菌、路鄧葡萄球菌、腐生葡萄球菌、溶血葡萄球菌、山羊葡萄球菌或猿葡萄球 菌。85. 如權(quán)利要求69至84中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述施用有效減少感染率、感染嚴(yán)重 性、感染持續(xù)時(shí)間或其任何組合;減少或完全消除全部數(shù)量的膿腫，和/或增加無菌膿腫的 數(shù)量。86. -種治療骨髓炎的方法，其包括： 向患有葡萄球菌骨骼或關(guān)節(jié)感染的患者施用有效量的如權(quán)利要求1至12、15至19、21至 24和26至30中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體，一或多種如權(quán)利要求13、14、20、25和31中任一項(xiàng) 所述的Amd結(jié)合部分，如權(quán)利要求35至44中任一項(xiàng)所述的藥物組合物或其組合。87. 如權(quán)利要求86所述的方法，其進(jìn)一步包括重復(fù)所述施用。88. 如權(quán)利要求86或87所述的方法，其中全身性進(jìn)行所述施用。89. 如權(quán)利要求86或87所述的方法，其中直接在金黃色葡萄球菌骨骼或關(guān)節(jié)感染位點(diǎn) 進(jìn)行所述施用。90. 如權(quán)利要求86至89中任一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括將第二治療劑施用至所述 患者，其中所述第二治療劑是抗生素劑或免疫治療劑。91. 如權(quán)利要求90所述的方法，其中所述抗生素劑選自由以下組成的組：萬古霉素、妥 布霉素、頭孢唑林、紅霉素、克林霉素、利福平、慶大霉素、夫西地酸、米諾環(huán)素、復(fù)方新諾明、 克林霉素、利奈唑胺、特地唑胺、奎奴普丁-達(dá)福普丁、達(dá)托霉素、替加環(huán)素、達(dá)巴萬星、特拉 萬星、奧利萬星、頭孢比普、頭孢洛林、艾拉普林和所述碳青霉烯CS-023/R0-4908463。92. 如權(quán)利要求90所述的方法，其中所述免疫治療劑是替巴珠單抗或帕基昔單抗。93. 如權(quán)利要求90所述的藥物組合物，其中所述免疫治療劑是特異性結(jié)合至葡萄球菌 氨基葡萄糖苷酶(Gmd)且抑制葡萄球菌菌株的體內(nèi)生長(zhǎng)的第二單克隆抗體或其結(jié)合部分。94. 如權(quán)利要求93所述的方法，其中所述第二單克隆抗體是1C11、1E12、2D11、3A8、3H6 或4A12、其人源化變體或其Gmd結(jié)合部分。95. 如權(quán)利要求93所述的方法，其中所述單克隆抗體是Amdl. 6或包含Amdl. 6的相同可 變結(jié)構(gòu)域或互補(bǔ)決定區(qū)的人源化變體，并且所述第二單克隆抗體是1C11或包含1C11的相同 可變結(jié)構(gòu)域或互補(bǔ)決定區(qū)的人源化變體。96. 如權(quán)利要求95所述的方法，其中所述第二單克隆抗體的所述人源化變體是IgGl、 1862、1863或1 864類別。97. 如權(quán)利要求95所述的方法，其中所述第二單克隆抗體的所述Gmd結(jié)合部分包括Fab 片段、Fv片段、單鏈抗體、VH結(jié)構(gòu)域或九結(jié)構(gòu)域。98. 如權(quán)利要求86至97中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述患者是人。99. 如權(quán)利要求86至97中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述患者是非人哺乳動(dòng)物。100. 如權(quán)利要求86至99中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述葡萄球菌菌株是金黃色葡萄球 菌、表皮葡萄球菌、路鄧葡萄球菌、腐生葡萄球菌、溶血葡萄球菌、山羊葡萄球菌或猿葡萄球 菌。101. 如權(quán)利要求86所述的方法，其中所述施用可有效地使骨質(zhì)溶解病灶部分地或完全 地愈合。102. -種確定樣品中的葡萄球菌的存在的方法，所述方法包括： 使樣品暴露于如權(quán)利要求1至12、15至19、21至24和26至30中任一項(xiàng)所述的單克隆抗 體，或如權(quán)利要求13、14、20、25和31中任一項(xiàng)所述的Amd結(jié)合部分；以及 檢測(cè)是否在所述單克隆抗體或結(jié)合部分與存在于所述樣品中的葡萄球菌或葡萄球菌 酰胺酶之間形成免疫復(fù)合物，由此所述暴露之后的所述免疫復(fù)合物的存在指示所述樣品中 的葡萄球菌的所述存在。103. 如權(quán)利要求102所述的方法，其中使用免疫測(cè)定來進(jìn)行所述檢測(cè)。104. 如權(quán)利要求103所述的方法，其中所述免疫測(cè)定是ELISA、放射免疫測(cè)定、凝膠擴(kuò)散 沉淀反應(yīng)測(cè)定、免疫擴(kuò)散測(cè)定、凝集測(cè)定、熒光免疫測(cè)定、蛋白質(zhì)A免疫測(cè)定或免疫電泳測(cè) 定。105. 如權(quán)利要求102所述的方法，其中所述單克隆抗體或結(jié)合部分包括標(biāo)記。106. 如權(quán)利要求104所述的方法，其中所述標(biāo)記是放射性同位素標(biāo)記、熒光團(tuán)或化學(xué)發(fā) 光標(biāo)記。107. 如權(quán)利要求102所述的方法，其中所述樣品是流體樣品或組織樣品。
【文檔編號(hào)】A61K39/40GK105873609SQ201480067873
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2014年12月15日
【發(fā)明人】J·L·戴斯, E·施瓦茲, J·J·瓦羅, J·布羅德爾, S·N·貝洛-伊里薩瑞
【申請(qǐng)人】羅切斯特大學(xué)