一種含中草藥的用于預(yù)防齲齒的藥物組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種含中草藥的用于預(yù)防齲齒的藥物組合物，由黃柏，大青葉按(0.9?1.1):(0.9?1.1)的重量比組成。本發(fā)明提供的藥物組合物可制成漱口液，對于致齲菌乳酸桿菌、變異鏈球菌具有良好的抑制效果，特別是二者配合比單獨使用具有更低的作用濃度，說明二者配合具有協(xié)同增效的效果。本發(fā)明使用的原料提取自植物，不含任何化學添加劑，對粘膜無刺激性、無生殖毒性、對人體安全無毒。
【專利說明】
-種含中草藥的用于預(yù)防關(guān)齒的藥物組合物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于預(yù)防醫(yī)學領(lǐng)域，設(shè)及一種含中草藥的用于預(yù)防離齒的藥物組合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 離齒是人類的常見病和多發(fā)病，是繼屯、血管疾病和癌癥之后第Ξ種需要重點防治 的疾病，全球60 %~90 %的兒童和成人都曾受過離病的困擾。2010年，全球有超過50億人患 離齒，中國離齒發(fā)病率高達70 %~80%，嬰幼兒中高達90 % W上。離齒發(fā)病的前提條件是致 離菌的生長和產(chǎn)酸，致離菌是口腔中的常駐微生物群，其中變異鏈球菌和乳酸桿菌與離齒 的關(guān)系十分密切，可發(fā)酵多種糖類產(chǎn)酸，致菌斑pH下降和釉質(zhì)脫礦溶解，造成離損。自從20 世紀50年代W來許多學者從抑制或殺滅變異鏈球菌、乳酸桿菌的藥物著手進行了大量的研 究，曾運用抗生素、消毒劑、氣化物和免疫制劑等。隨著經(jīng)濟的不斷發(fā)展，伴隨環(huán)境污染、生 態(tài)失調(diào)等問題的日益出現(xiàn)，消費者對產(chǎn)品的安全性越來越重視，W化學物質(zhì)為主要有效成 分的抗菌物質(zhì)存在環(huán)境降解周期長、長期使用會產(chǎn)生刺激性、廣譜消毒殺菌對環(huán)境與人體 微生態(tài)產(chǎn)生影響等缺點，進而可能影響機體代謝而對人類健康產(chǎn)生潛在不良影響。因此，利 用植物提取物來防治變異鏈球菌、乳酸桿菌感染是目前抗離藥物研發(fā)的一個熱點，研究較 多的有茶葉、黃巧、黃琴、厚樸、連翅、金銀花、五倍子、蜂膠、血藤和甘草等的提取物，研究較 深入的有蜂膠、五倍子、茶多酪和厚樸。但是，現(xiàn)有含有多種中草藥成分的配方復(fù)雜，有效成 分難W確定，生產(chǎn)成本高，抗菌效果不顯著，因此，需要開發(fā)抗菌效果確切，配方簡單的預(yù)防 離齒的中藥配方。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種含中草藥的用于預(yù)防離齒的藥物組合物，該組合物配 方簡單，對于致離齒的乳酸桿菌、變異鏈球菌具有良好的抑菌效果。
[0004] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0005] 本發(fā)明提供一種含中草藥的用于預(yù)防離齒的藥物組合物，其特征在于，由黃柏和 大青葉組成，所述黃柏和大青葉的重量比為(0.9-1.1): (0.9-1.1)。
[0006] 優(yōu)選地，所述黃柏和大青葉的重量比為1: 1。
[0007] 優(yōu)選地，所述藥物組合物的劑型為漱口液。
[000引更優(yōu)選地，所述漱口液中黃柏和大青葉的含量為:黃柏12.5mg/mL，大青葉12.5mg/ rnL ο
[0009] 黃柏為蕓香科植物黃葉、黃樹皮的干燥樹皮，臨床上廣泛用于濕熱頻疾、腹瀉、黃 痘、皮膚濕疹等?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃柏具有抗菌、抗真菌、鎮(zhèn)咳、降壓、抗?jié)僕及免疫抑 制作用。文獻記載，黃柏對金黃色葡萄球菌、白喉桿菌、綠色鏈球菌、頻疾桿菌、溶血性鏈球 菌、百日咳桿菌、破傷風桿菌、腦膜炎球菌、霍亂弧菌、炭痘桿菌、白色葡萄球菌、綠脈桿菌均 有抑制作用，但未見有對乳酸桿菌、變異鏈球菌抑菌作用的報道。
[0010] 大青葉為十字花科植物蔣藍的干燥葉。二年生草本植物，外皮灰黃色味苦、性寒。 主要有清熱解毒、涼血消斑的功效。中醫(yī)用于高熱神昏、黃痘、頻疾、巧腮、喉搏、丹毒、脈腫 等。已有的研究表明，大青葉水煎劑在體外對金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、甲型鏈球菌、 乙型鏈球菌均有明顯抑制作用，對沙口氏菌、李斯特氏菌、炭痘桿菌均有較強的抑制效應(yīng)， 未見有對乳酸桿菌、變異鏈球菌抑菌作用的報道。
[0011] 變異鏈球菌（S化eptococ州S mutans)是口腔主要的致離齒菌之一，常見于牙菌斑 中，可通過代謝產(chǎn)生的酸性物質(zhì)導(dǎo)致離齒的發(fā)生。
[0012] 乳酸桿菌化acticacid bacteria)為革蘭氏陽性細菌，可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大 量乳酸，在自然界分布廣泛，是動物和人腸道等處的重要正常菌群之一，對動物和人類無害 并有重要的生理功能。但是，當其通過飲食滯留于口腔時，易與唾液中的黏蛋白和食物殘屑 混合在一起，牢固地粘附在牙齒表面形成菌斑，容易造成牙齒釉質(zhì)表面脫巧、溶解，形成離 齒，因此也是口腔致離齒菌。
[0013] 本發(fā)明通過在10余種中草藥中篩選出有抑菌作用的黃柏、W其與大青葉配制成復(fù) 方合劑，對其進行最小抑菌濃度和毒理學研究，研制出的一種具有有效抑菌作用、使用濃度 低、無毒性、無粘膜刺激作用的新型預(yù)防離齒的配方。
[0014] 其中黃柏為1:12提取物，大青葉為1:5提取物，具體方法均為:采用熱回流低溫提 取濃縮機提取，制成粉末，溶劑均為乙醇，乙醇溫度《85°C，提取溫度為65-85°C，濃縮溫度 為50-7(TC、重金屬、農(nóng)藥殘留及微生物指標符合國家標準要求，使用時用量折成原藥計算。
[0015] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0016] 本發(fā)明提供一種預(yù)防離齒的組合物配方，該配方由黃柏和大青葉組成，對于致離 菌乳酸桿菌、變異鏈球菌具有良好的抑制效果，特別是二者配合比單獨使用具有更低的作 用濃度，說明二者配合具有協(xié)同增效的效果。本發(fā)明使用的原料提取自植物，不含任何化學 添加劑，對粘膜無刺激性、無生殖毒性、對人體安全無毒。
【附圖說明】
[0017] 圖1為本發(fā)明提供的藥物組合物復(fù)方漱口液對乳酸桿菌的抑菌環(huán)。
[0018] 圖2為本發(fā)明提供的藥物組合物復(fù)方漱口液對變異鏈球菌的抑菌環(huán)。
【具體實施方式】
[0019] W下僅W實施例說明本發(fā)明可能的實施形式，但并非用W限制本發(fā)明所要保護的 范疇。
[0020] 實施例：
[0021] 1試驗材料與試劑
[0022] 1.1黃柏購自深圳華潤Ξ九醫(yī)藥股份有限公司，原藥抗菌有效成分鹽酸小葉堿含 量4.81%，使用時制成1:12提取物。
[0023] 1.2大青葉提取物購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，主要有效成分說玉紅含量為 1.05%，使用時制成1:5提取物。
[0024] 1.3離齒的指示菌變異鏈球菌(ATCC35668)、乳酸桿菌(ATCC4546)購自北京豫鼎蠢 捷科技有限公司。
[0025] 1.4腦屯、浸液瓊脂培養(yǎng)基購買自青島高科園海博生物科技有限公司、MRS培養(yǎng)基購 買自由青島尼賽欣合生物技術(shù)有限公司。
[0026] 2試驗方法與結(jié)果
[0027] 2.1單一抑菌物質(zhì)抑菌環(huán)試驗
[0028] 取黃柏提取物、大青葉提取物，分別配制成含原藥400mg/mL的溶液進行抑菌試驗。 用雙倍稀釋法將黃柏提取物、大青葉提取物按原藥濃度分別配制成5個濃度梯度溶液： 400mg/血、200mg/mL、lOOmg/mL、50mg/mL、25mg/mL，并煮沸滅菌。取配制好的溶液各 20μ1，滴 加于無菌干燥的圓形濾紙片(d = 5mm)上，同時W滴加20μ1無菌蒸饋水的濾紙片作為陰性對 照，將濾紙片驚干備用。
[0029] 分別將變異鏈球菌、乳酸桿菌配制成濃度為5 X 105c化/mL~5 X 106c化/mL的試驗 菌液。用無菌棉拭子薩取菌液，均勻涂抹變異鏈球菌于腦屯、浸液瓊脂培養(yǎng)基、乳酸桿菌于 MRS培養(yǎng)基表面，室溫下干燥5min。在染菌平板上貼放制備好的濾紙片及陰性對照，置于厭 氧缸中37°C恒溫箱培養(yǎng)，乳酸桿菌18-24h后觀察結(jié)果、變異鏈球菌40-4化后觀察結(jié)果，試驗 平行做3組。
[0030] 試驗結(jié)果：用游標卡尺測量并記錄抑菌環(huán)直徑，結(jié)果如表1和表2所示。其中，陰性 對照組應(yīng)無抑菌環(huán)產(chǎn)生，否則試驗無效。抑菌環(huán)直徑大于7mm者，為有抑菌作用，小于或等于 7mm者，為無抑菌作用，結(jié)果為3組試驗的平均數(shù)。
[0031 ]表1黃柏、大青葉對乳酸桿菌抑菌環(huán)試驗結(jié)果
[0032]
[0035] 由表1和表2結(jié)果可見，黃柏、大青葉對乳酸桿菌和變異鏈球菌均有抑菌作用。
[0036] 2.2單一抑菌物質(zhì)最小抑菌濃度試驗
[0037] 黃柏、大青葉分別應(yīng)用400mg/mL、200mg/血、1 OOmg/mL、50mg/mL、25mg/mL、12.5mg/ mL 6個濃度梯度，將配制好經(jīng)煮沸消毒的抗菌物質(zhì)溶液分別混合溶解于腦屯、浸液瓊脂培養(yǎng) 基、MR培養(yǎng)基中，點種變異鏈球菌和乳酸桿菌，W無菌蒸饋水作為陰性對照組，置于厭氧缸 中37 °C恒溫箱培養(yǎng)，乳酸桿菌18-24h后觀察結(jié)果、變異鏈球菌40-4化后觀察記錄各組平皿 菌落生長情況。
[0038] 試驗結(jié)果:黃柏對乳酸桿菌的最小抑菌濃度為1 OOmg/mL、對變異鏈球菌的最小抑 菌濃度為25mg/mL大青葉對乳酸桿菌和變異鏈球菌的最小抑菌濃度均為lOOmg/mL。
[0039] 2.3藥物組合物的篩選
[0040] 根據(jù)抑菌環(huán)試驗和單一抑菌成分最小抑菌濃度篩選試驗結(jié)果，選取抑菌效果較好 的黃柏、大青葉按照不同比例配制成溶液1-16號。具體方法為：將上述成分分別溶解于 lOOmL蒸饋水中，煮沸滅菌后，冷卻備用，各組組合物中有效成分濃度見表3。
[0041 ] 表3不同濃度配比的組合物
[0042]
[0044] 2.4各組合物抑菌試驗結(jié)果
[0045] 將表3中組合物，采用濾紙片擴散法分別對乳酸桿菌、變異鏈球菌進行抑菌試驗。 具體方法為:取配制好的溶液各20μ1，滴加于無菌干燥的圓形濾紙片(d = 5mm)上，同時W滴 加20μ1無菌蒸饋水的濾紙片作為陰性對照，將濾紙片驚干備用。
[0046] 分別將變異鏈球菌、乳酸桿菌配制成濃度為5Χ 105cfu/mL~5Χ 106c化/mL的試驗 菌液。用無菌棉拭子薩取菌液，均勻涂抹變異鏈球菌于腦屯、浸液瓊脂培養(yǎng)基、乳酸桿菌于 MRS培養(yǎng)基表面，室溫下干燥5min。在染菌平板上貼放制備好的濾紙片及陰性對照，置于厭 氧缸中37°C恒溫箱培養(yǎng)，乳酸桿菌18-24h后觀察結(jié)果、變異鏈球菌40-4化后觀察結(jié)果，實驗 平行做3組。
[0047] 試驗結(jié)果：用游標卡尺測量并記錄抑菌環(huán)直徑，結(jié)果如表4所示。其中，陰性對照組 應(yīng)無抑菌環(huán)產(chǎn)生，否則試驗無效。抑菌環(huán)直徑大于7mm者，為有抑菌作用，小于或等于7mm者， 為無抑菌作用，結(jié)果為3組試驗的平均數(shù)。
[004引表4各組合物抑菌試驗結(jié)果
[0049]
[0051] W上研究已得出黃柏對乳酸桿菌和變異鏈球菌的最小抑菌濃度分別為lOOmg/血、 25mg/mL，大青葉對乳酸桿菌和變異鏈球菌的最小抑菌濃度均為lOOmg/mL。黃柏和大青葉配 伍使用時，在表4試驗結(jié)果中，各配方均有抑菌作用，根據(jù)有抑菌作用時使用最低劑量的原 貝1J，選用黃柏和大青葉均為12.5mg/mL的16號配方為乳酸桿菌和變異鏈球菌的最小抑菌環(huán) 濃度，故W16號配方進一步進行最小抑菌濃度試驗，各組濃度見表5。試驗結(jié)果乳酸桿菌的 最小抑菌濃度為1號組、變異鏈球菌的最小抑菌濃度均為2號組。
[0052] 表5各組配方有效抑菌成分濃度 [0化3]
[0化4] 3毒理學試驗 [0化日]3.1急性經(jīng)口毒性試驗
[0056] 選體重18-22g小鼠20只，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)。試驗前預(yù)飼7d，試驗前禁食過夜，不 限制飲水，采用一次最大限度試驗方法，一次灌胃劑量SOOOmgAkg · bw)。按黃柏:大青葉的 比例1:1配制溶液，用經(jīng)口灌胃方式將上述配好的復(fù)方漱口液合劑給予小鼠。每只小鼠稱重 后，按每次30mLAkg · bw)劑量分2次灌胃，中間間隔12h。染毒后14d內(nèi)觀察動物中毒表現(xiàn)、 有無死亡、死亡數(shù)量及時間。
[0057] 結(jié)果：14d內(nèi)實驗動物均無中毒表現(xiàn)，無死亡。根據(jù)判斷標準，可判定復(fù)方漱口液合 劑LDsq大于5000mg/kg體重，為實際無毒級物質(zhì)。
[0058] 3.2小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗
[0059] 因本復(fù)方合劑LD日〇>5000mg/Kg體重，故試驗分為5組。選體重25-30g小鼠50只，隨 機分成5組，每組10只雌雄各半。試驗設(shè)高、中、低劑量組，W5000mg/kg體重為高劑量組、 lOOOmg/kg體重為中劑量組、250mg/kg體重為低劑量組，陽性對照組用環(huán)憐酷胺(40mg/kg體 重），陰性對照組用蒸饋水。動物染毒采用經(jīng)口灌胃30h染毒法，兩次染毒間隔2地，第二次染 毒后化取材。處死小鼠后W5mL生理鹽水沖洗骨髓腔，將骨髓細胞沖入離屯、管中。所得細胞 懸浮液lOOOrpm離屯、lOmin，滴懸液于載玻片的一端，按常規(guī)涂片法涂片，驚干。將載玻片置 于固定液（甲醇和冰乙酸按3:1混合）中固定lOmin。置于Giemsa染色液（10%)染色lOmin- 15min，然后用流水沖洗掉浮色，驚干。選擇細胞形態(tài)完整、分布均勻、著色適當?shù)膮^(qū)域，在油 鏡下按一定順序計數(shù)嗜多染紅細胞(PCE)和微核。PCE呈灰藍色，微核多數(shù)為圓形、邊緣光 滑、整齊，質(zhì)地均勻，呈紫紅色或藍紫色。直徑通常為紅細胞主核的1/20-1/5。每只動物計數(shù) 1000個PCE，微核細胞率W千分率表示。
[0060] 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗結(jié)果：
[0061] 通過檢測復(fù)方漱口液合劑對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核形成的影響，評價其染色 體損傷毒性。微核試驗結(jié)果見表6,陰性對照組、陽性對照組微核細胞率分別為4.1%。、 25.0%。，試驗1組化化〇)、試驗2組（1/50)5〇)和試驗3組（1/2化〇5〇)微核細胞率分別為5.1曰/〇〇、 5.5%。、5.4%。，將微核細胞率經(jīng)平方根轉(zhuǎn)換后進行單因素方差分析，結(jié)果顯示，試驗組與陰 性對照組比較，無顯著性差異(F = 0.121，P> 0.05);試驗組與陽性對照組比較，有顯著性差 異巧=12.071，？<0.05);各劑量組之間比較，無顯著性差異巧=0.012，？>0.05)。說明該 復(fù)方漱口液合劑對小鼠無體內(nèi)染色體損傷作用。
[0062] 表6小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗結(jié)果
[0063]
[0064] 注a: x±S為微核率進行平方根數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后的結(jié)果；
[00化]3.3粘膜刺激試驗
[0066] 應(yīng)用3月齡的雄性大鼠，用乙酸將大鼠麻醉、W艦伏消毒口腔內(nèi)外組織，用滅菌棉 試子薩取含黃柏12.5mg/mL、大青葉12.5mg/mL的復(fù)方中草藥漱口液合劑在口腔兩側(cè)頰粘膜 表面涂抹，一側(cè)為試樣、另一側(cè)為無菌生理鹽水對照，24h內(nèi)觀察結(jié)果。
[0067] 試驗結(jié)果:3只大鼠口腔粘膜試樣側(cè)、對照側(cè)均無紅斑形成，記分為0分，為無刺激 反應(yīng)。
[0068] 本發(fā)明提供的W黃柏和大青葉復(fù)配的藥物組合物，對于引起離齒最常見的變異鏈 球菌和乳酸桿菌為指標菌進行抑菌作用研究，是在多種中草藥提取物中篩選出的對變異鏈 球菌和乳酸桿菌有抑菌作用的組方，進一步進行最小抑菌濃度試驗，結(jié)果:黃柏對乳酸桿菌 和變異球菌鏈的最小抑菌濃度分別為100mg/mL、25mg/mL，大青葉對乳酸桿菌和變異鏈球菌 的最小抑菌濃度均為lOOmg/mL。
[0069] 為了減少藥物的使用濃度增強藥物的抑菌效果，將黃柏提取物和大青葉提取物制 成復(fù)方合劑，最佳配方比例為16號，即含黃柏12.5mg/mL、大青葉12.5mg/mL，進一步對該配 方合劑進行最小抑菌濃度試驗，結(jié)果為含黃柏12.5mg/mL、大青葉12.5mg/mL組可有效抑制 乳酸桿菌、含黃柏6.25mg/mL、大青葉6.25mg/mL組可有效抑制變異鏈球菌。因此，黃柏和大 青葉Wl:l的比例混合，對于引起離齒的細菌-乳酸桿菌、變異鏈球菌的抑菌作用有明顯增 效作用。為了對乳酸桿菌、變異鏈球菌均有抑菌作用，W含黃柏12.5mg/mL、大青葉12.5mg/ mL組為本預(yù)防離齒的復(fù)方中草藥漱口液配方。
[0070] 從上述實施例可W看出，本發(fā)明提供的預(yù)防離齒藥物組合物，原料提取自天然植 物，動物實驗表明，該復(fù)方漱口液為實際無毒級物質(zhì)，無生殖毒性、對粘膜無刺激性、對人體 安全無毒。
【主權(quán)項】
1. 一種含中草藥的用于預(yù)防齲齒的藥物組合物，其特征在于，由黃柏和大青葉組成，所 述黃柏和大青葉的重量比為(0.9-1.1):(0.9-1.1)。2. 如權(quán)利要求1所述的含中草藥的用于預(yù)防齲齒的藥物組合物，其特征在于，所述黃柏 和大青葉的重量比為1:1。3. 如權(quán)利要求1所述的含中草藥的用于預(yù)防齲齒的藥物組合物，其特征在于，所述藥物 組合物的劑型為漱口液。4. 如權(quán)利要求3所述的含中草藥的用于預(yù)防齲齒的藥物組合物，其特征在于，所述漱口 液中黃柏和大青葉的含量為:黃柏12.5mg/mL，大青葉12.5mg/mL。
【文檔編號】A61K36/756GK105878511SQ201610439435
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年6月16日
【發(fā)明人】王斌, 魯曉晴, 李萬通, 王海濤, 閆志勇
【申請人】青島大學