一種靶向hedgehog通路和細(xì)胞自噬的抗腫瘤藥物組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬藥物技術(shù)領(lǐng)域，涉及靶向hedgehog通路和細(xì)胞自噬的抗腫瘤藥物組合物，該藥物組合物包含Hedgehog信號(hào)通路抑制劑和細(xì)胞自噬抑制劑，經(jīng)藥效學(xué)試驗(yàn)證明，該藥物組合物在實(shí)體瘤和非實(shí)體瘤的治療方面具有顯著的協(xié)同作用，尤其是對(duì)耐藥性的慢性髓性白血病有非常顯著的抗腫瘤效果。本發(fā)明公開(kāi)的藥物組合物具有廣泛的抗腫瘤活性，有很好的臨床應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】
一種朝向hedgehog通路和細(xì)胞自臨的抗腫瘤藥物組合物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬藥物技術(shù)領(lǐng)域,涉及祀向hedgehog通路和細(xì)胞自嗷的抗腫瘤藥物組合物，該藥物組合物包含Hedgehog信號(hào)通路抑制劑和細(xì)胞自噬抑制劑，能用于治療實(shí)體瘤和非實(shí)體瘤。
【背景技術(shù)】
[0002]研究公開(kāi)了 Hedgehog(Hh)信號(hào)通路是調(diào)節(jié)動(dòng)物胚胎發(fā)育的主要信號(hào)通路之一，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞存活、增殖和細(xì)胞命運(yùn)的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，是目前最受關(guān)注的抗腫瘤靶點(diǎn)之一(Briscoe J, Therond PP.[J].Nat Rev Mol Cell B1l 2013,14(7):418-431)。越來(lái)越多的研究表明，Hh信號(hào)通路的異常激活與基底細(xì)胞癌、白血病、淋巴瘤、肺癌、前列腺癌和消化道腫瘤等有密切關(guān)系(Briscoe J, Therond PP.[J].Nat Rev Mol Cell B1l2013,14(7):418-431 Jagani Z, Dorsch M, Warmuth M.[J] ；Cell Cycle 2010,9(17):3449-3456.Long B, Zhu H, Zhu C, Liu T, Meng ff.[J].Journal of Experimental &ClinCancer Res 2011,30(1):8.)。Vismodegib是國(guó)際上第一個(gè)被批準(zhǔn)上市的Hh通路抑制劑，口服給藥用于基底細(xì)胞癌的治療。目前，多種Hh信號(hào)通路抑制劑正在進(jìn)行癌癥治療的臨床評(píng)價(jià)，包括 CML 和骨髓瘤等(David A.1rvine and Mhairi Copland.Blood 2012,119 (10):2196-2204.)。
[0003]研究表明Hh信號(hào)通路主要由信號(hào)分子Hh配基、跨膜蛋白受體Patched(PTCHl)、跨膜蛋白Smoothened(SMO)、融合阻抑蛋白SUFU和鋅指轉(zhuǎn)錄因子GLI等組成；其中PTCHl會(huì)抑制SM0，從而關(guān)閉Hh信號(hào)通路；當(dāng)Hh與配體PTCHl結(jié)合后，PTCHl就會(huì)失去對(duì)SMO的抑制作用，從而激活Hh信號(hào)通路、阻止GLI2和GLI3的剪切；激活的GLI2與細(xì)胞核內(nèi)的GLI啟動(dòng)子結(jié)合，刺激 GLIl、PTCHl、HHIP、Bcl_2 和 Cyclin 等基因的轉(zhuǎn)錄(Dereck Amakye, ZainabJagani Mar1n Dorsch.Nature Medicine 2013,19 (11): 1410-1422.)。目前已經(jīng)上市或正處于臨床研究階段的Hedgehog信號(hào)通路抑制劑分為如下三類:(I)SMO抑制劑；包括vismodegib、環(huán)巴胺、saridegib (IP1-926)、sonidegib (LDE225)、BMS_833923、PF04449913、LEQ506、TAK-441、LY2940680 ；2)Hh 蛋白抑制劑；包括 Robotnikinin ； (3) GLI 抑制劑；包括GANT61、GANT58,HIP-U HIP-2、HIP-3、HIP-4、三氧化二砷。
[0004]細(xì)胞自噬是真核生物細(xì)胞中一種高度遺傳保守的蛋白質(zhì)水解途徑。外界壓力如營(yíng)養(yǎng)或生長(zhǎng)因子剝奪、氧化壓力和藥物處理等均能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬(Choi AMK, RyterSff, Levine B.[J].N Engl J Med 2013,368(7) =651-662.);研究表明，細(xì)胞自噬在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和治療中起著重要的作用(Cheong H, Lu C, Lindsten T, Thompson CB.[J].NatB1technol 2012，30 (7):671-678.)。在大多數(shù)情況下，細(xì)胞自噬在抗腫瘤藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的過(guò)程中起細(xì)胞保護(hù)作用。此外，研究表明腫瘤細(xì)胞可通過(guò)上調(diào)細(xì)胞自噬水平來(lái)削弱抗腫瘤藥物的效果，引起腫瘤耐藥。因此，近年來(lái)細(xì)胞自噬在癌癥治療中的作用受到了越來(lái)越多的關(guān)注，調(diào)控細(xì)胞自噬也成為了最熱門的抗腫瘤策略之一。氯喹和羥基氯喹作為抗瘧藥物已經(jīng)在臨床上使用了幾十年之久，其安全性的諸多因素已久經(jīng)考驗(yàn)。同時(shí)，氯喹和羥基氯喹是又一種有效的細(xì)胞自噬抑制劑，已經(jīng)被美國(guó)FDA批準(zhǔn)作為細(xì)胞自噬抑制劑在臨床上使用。目前，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬來(lái)增強(qiáng)抗腫瘤藥物的療效的多項(xiàng)臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行之中(Rosenfeld MR, Ye X，Supko JG, Desideri S，Grossman SA, Brem S，et al.Autophagy2014 ；10 ；PMID:24991840 ；RangwaIa R，Leone R，Chang YC，F(xiàn)echer L, Schuchter L，KramerA，et al.Autophagy 2014；10 ;PMID:24991839 ；Vogl DT，Stadtmauer EA，Tan KS,HeitjanDF, Davis LE, Pontiggia L, et al.Autophagy 2014 ；10 ；PMID:24991834 ；Mahalingam D，Mita M，Sarantopoulos J，Wood L，Amaravadi R，Davis LE, et al.Autophagy 2014 ；10 ；PMID:24991835 ；Barnard RA，Wittenburg LA, Amaravadi RK，Gustafson DL, Thorburn A，Thamm DH.Autophagy2014 ；10 ；PMID:24991836 ；)。
[0005]研究還顯示Hh信號(hào)通路與細(xì)胞自噬具有密切聯(lián)系。例如:在Hela細(xì)胞中，激活Hh信號(hào)通路能減弱細(xì)胞自噬的程度，抑制Hh信號(hào)通路則可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬(Jimenez-Sanchez M， Menzies FM， Chang Y_Y，8imecek N， Neufeld TP, RubinszteinDC.The Hedgehog signalling pathway regulates autophagy[J].Nat Commun 2012,3:1200.)。在肝癌細(xì)胞中，Hh信號(hào)通路與細(xì)胞自噬相互調(diào)節(jié)。Hh抑制劑GANT61能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬，抑制細(xì)胞自噬則能削弱GANT61對(duì)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性(Wang Y，Han C，Lu L，Magliato S，Wu T.[J].Hepatology 2013,58(3):995-1010.)。Glil 蛋白是 Hh 信號(hào)通路里的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，抑制Glil會(huì)導(dǎo)致軟骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬(Sun YjGuo W，Ren T，Liang W，Zhou W，Lu Q，Jiao G，Yan T.[J].Cell Death Dis 2014，5 (I):e979.)；
坐坐寸寸
[0006]目前，尚未見(jiàn)任何關(guān)于hedgehog信號(hào)通路抑制劑和細(xì)胞自嗷抑制劑為活性成分的組合物或二者聯(lián)合用于抗腫瘤的臨床研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是為了解決目前臨床上現(xiàn)有的腫瘤治療藥物或策略的缺點(diǎn)如毒副作用大、耐藥性和治療成本高等，提出一種毒副作用較小、能逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性和較為廉價(jià)的治療腫瘤的藥物組合物，具體涉及一種靶向hedgehog通路和細(xì)胞自噬的抗腫瘤藥物組合物。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本申請(qǐng)通過(guò)一系列的設(shè)計(jì)并經(jīng)科學(xué)試驗(yàn)驗(yàn)證，提出了含有如下組分的腫瘤治療藥物組合物:I) Hedgehog信號(hào)通路抑制劑；2)細(xì)胞自噬抑制劑。
[0009]具體而言，本發(fā)明提供了一種靶向hedgehog通路和細(xì)胞自噬的抗腫瘤藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物由Hedgehog信號(hào)通路抑制劑和細(xì)胞自噬抑制劑組成。
[0010]本發(fā)明中，所述的Hedgehog信號(hào)通路抑制劑包括但不限于如下三類:(I) SMO抑制劑；(2) Hh蛋白抑制劑；(3) GLI抑制劑；
[0011]具體的，所述的Hedgehog信號(hào)通路抑制劑選自vismodegib、環(huán)杷明(cyclopamine)、sonidegib (LDE225)、BMS-833923、PF04449913、LEQ506、TAK-441、LY2940680、Robotnikinin, GANT61、GANT58、HIP-1, HIP-2、HIP-3、HIP-4、三氧化二砷或其組合物。
[0012]本發(fā)明中，所述的細(xì)胞自噬抑制劑選自氯喹(Chloroquine)和羥基氯喹(hydroxychloroquine) >3-MA (3-Methyladenine)、渥曼青霉素(wortmannin)、LY294002、放線菌酮、巴伐洛霉素Al (Bafilomycin Al)、NH4C1或其組合物；本發(fā)明的實(shí)施例中，優(yōu)選的細(xì)胞自噬抑制劑為氯喹、羥基氯喹或巴伐洛霉素Al。
[0013]本發(fā)明所述的藥物組合物中,Hedgehog信號(hào)通路抑制劑與細(xì)胞自嗷抑制劑的給藥劑量比為 I: 0.001-1000。
[0014]本發(fā)明所述的藥物組合物可制成為口服制劑或注射制劑，在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述的藥物組合物以選自以下一組中的形式進(jìn)行配方:固體、溶液、分散劑、膠束、乳劑、月旨質(zhì)體、納米微球等。
[0015]本發(fā)明的另一目的是提供所述的組合物在治療實(shí)體瘤和非實(shí)體瘤中的用途。
[0016]本發(fā)明經(jīng)藥效學(xué)試驗(yàn)證明，所述的藥物組合物在實(shí)體瘤和非實(shí)體瘤的治療方面具有顯著的協(xié)同作用，尤其是對(duì)耐藥性的慢性髓性白血病有非常顯著的抗腫瘤效果。
[0017]本發(fā)明的藥物組合物具有廣泛的抗腫瘤活性，可用于治療各種實(shí)體瘤和非實(shí)體瘤，所述實(shí)體瘤包括肝癌、肺癌、胃癌、直腸癌、黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、基底細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、宮頸癌、大腸癌、前列腺癌或頭頸癌等惡性腫瘤；所述非實(shí)體瘤包括白血病、淋巴瘤和骨髓瘤等惡性腫瘤。
【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1.Hedgehog信號(hào)通路抑制劑vismodegib對(duì)淋巴瘤和白血病腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。
[0019]圖2.顯示vismodegib和CQ聯(lián)合使用能顯著降低CML細(xì)胞活力，
[0020]其中，*p< 0.05，**p < 0.01。
[0021]圖3.顯示vismodegib和Bafi Al聯(lián)合使用能顯著降低CML細(xì)胞活力，
[0022]其中，*p< 0.05，**p < 0.01。
[0023]圖4.vismodegib和CQ聯(lián)合使用能顯著降低淋巴瘤細(xì)胞活力，其中，***p< 0.0Olo
[0024]圖5.通過(guò)基因沉默抑制Hedgehog信號(hào)通路與CQ聯(lián)合應(yīng)用能顯著降低CML細(xì)胞活力，其中，**p < 0.01.
[0025]圖6.通過(guò)基因沉默抑制細(xì)胞自嗷與vismodegib聯(lián)合應(yīng)用能顯著降低CML細(xì)胞活力，其中，林P < 0.01.
[0026]圖7.vismodegib和CQ聯(lián)合使用能顯著逆轉(zhuǎn)CML的耐藥性。
[0027]圖8.Vismodegib與CQ聯(lián)合使用能顯著地誘導(dǎo)了 CML細(xì)胞凋亡，
[0028]其中，**p< 0.01,與 vismodegib 單獨(dú)給藥組相比；***p < 0.001,與 vismodegib單獨(dú)給藥組相比。
【具體實(shí)施方式】
[0029]為了更好地理解本發(fā)明，下面通過(guò)對(duì)本發(fā)明中典型的具體實(shí)施例的描述，詳細(xì)解釋說(shuō)明本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0030]實(shí)施例1.腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)
[0031]體外試驗(yàn)中所用的腫瘤細(xì)胞包括淋巴瘤細(xì)胞(Raji)和慢性髓性白血病(CML)細(xì)胞(K562、BaF3-BCR-ABL、BaF3_BCR_ABLT3151 和 BaF3_BCR_ABL Y253F)。
[0032]需要做出特別說(shuō)明的是:K562是CML研究中使用最普遍的細(xì)胞模型，對(duì)CML的現(xiàn)有臨床治療一線用藥伊馬替尼(Imatinib)敏感；而B(niǎo)aF3_BCR_ABL、BaF3_BCR_ABLT3151和BaF3-BCR-ABLY253F細(xì)胞是CML耐藥性研究中使用最普遍的細(xì)胞模型，所述三株細(xì)胞分別由如下本領(lǐng)域已知的方法獲得:向BaF3細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)入野生型BCR-ABL基因、T315I位點(diǎn)突變的BCR-ABL基因和Y253F位點(diǎn)突變的BCR-ABL基因，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株而得；其中，BaF3-BCR-ABL細(xì)胞為伊馬替尼敏感型細(xì)胞株，BaF3_BCR_ABLT3151和BaF3_BCR_ABL Y253F為伊馬替尼耐藥性細(xì)胞株；
[0033]所述的Raj1、K562、BaF3-BCR-ABL、BaF3_BCR_ABLT3151 和 BaF3_BCR_ABL Y253F細(xì)胞均使用含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的PRM1-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37°C、含5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。
[0034]實(shí)施例2.體外藥效研究中自嗷抑制劑的配制方法
[0035](I)氯喹的配制:取適量氯喹溶于雙蒸水配成10mmol/L的儲(chǔ)存液，用0.1 μ m的濾器過(guò)濾除菌后保存于4°C，體外實(shí)驗(yàn)臨用時(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋500-1000倍用于抑制細(xì)胞自嗤；
[0036](2)羥基氯喹的配制:取適量羥基氯喹溶于雙蒸水配成lOmmol/L的儲(chǔ)存液，用
0.1um的濾器過(guò)濾除菌后保存于4°C，體外實(shí)驗(yàn)室稀釋500-1000倍用于抑制細(xì)胞自噬；
[0037](3)巴伐洛霉素Al的配制:取適量巴伐洛霉素Al干粉配制成0.5 μ g/ml的儲(chǔ)存液，用0.1 μπι的濾器過(guò)濾除菌后保存于-20°C，體外實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋1000倍用于抑制細(xì)胞自嗤；
[0038](4)自嗷抑制劑與Hedgehog信號(hào)通路抑制劑聯(lián)合應(yīng)用于體內(nèi)或體外抗腫瘤時(shí)，自噬抑制劑CQ的使用濃度范圍為0-50mol/L，羥基氯喹的使用濃度范圍為0-50mol/L，巴伐洛霉素Al的使用濃度范圍為0-10mol/L。
[0039]實(shí)施例3.Hedgehog信號(hào)通路抑制劑vismodegib對(duì)淋巴瘤和白血病腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用實(shí)驗(yàn)
[0040]分別將2.5、5、10、20 和 40 μ M 的 vismodegib 與 Raj1、K562、BaF3_BCR_ABL、BaF3-BCR-ABLT3151和BaF3_BCR_ABL Y253F細(xì)胞共孵育48h，用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，vismodegib能有效降低5種腫瘤細(xì)胞的活力，且這種生長(zhǎng)抑制效果呈現(xiàn)一定的劑量依賴性(如圖1所示)。
[0041]實(shí)施例4.Hedgehog信號(hào)通路抑制劑vismodegib和細(xì)胞自嗷抑制劑氯喹(CQ)聯(lián)合使用能顯著降低CML細(xì)胞活力
[0042]分另Ij將 2.5、5 或 10 μ M 的 CQ 與 20 μ M 的 vismodegib 聯(lián)合使用與 K562、BaF3-BCR-ABL、BaF3_BCR_ABLT3151 和 BaF3_BCR_ABL Y253F細(xì)胞共培養(yǎng) 48h，用 CCK-8 方法檢測(cè)細(xì)胞活力或在倒置相差顯微鏡先觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照，結(jié)果，與單獨(dú)使用vismodegib相t匕，各個(gè)濃度的CQ與vismodegib聯(lián)合使用均能顯著降低腫瘤細(xì)胞活力(如圖2(A)所示)；圖2(B)顯示了具有代表性的相差顯微鏡圖片，其中vismodegib和CQ的使用濃度分別為20 μ M 和 10 μ Μ。
[0043]實(shí)施例5.Hedgehog信號(hào)通路抑制劑vismodegib和細(xì)胞自嗷抑制劑巴伐洛霉素Al (Bafi Al)聯(lián)合使用能顯著降低CML細(xì)胞活力
[0044]分別將1.25,2.5 或 5nM 的 Bafi Al 與 20 μ M 的 vismodegib 聯(lián)合使用與 K562、BaF3-BCR-ABL、BaF3_BCR_ABLT3151 和 BaF3_BCR_ABL Y253F細(xì)胞共培養(yǎng) 48h，用 CCK-8 方法檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，與單獨(dú)使用vismodegib相比,各個(gè)濃度的Bafi Al與vismodegib聯(lián)合使用均能顯著降低腫瘤細(xì)胞活力(如圖3所示)。
[0045]實(shí)施例6.Hedgehog信號(hào)通路抑制劑vismodegib和細(xì)胞自嗷抑制劑氯喹(CQ)和巴伐洛霉素Al (Bafi Al)聯(lián)合使用能顯著降低淋巴瘤細(xì)胞活力
[0046]分別將CQ或Bafi Al和20 μ M的vismodegib聯(lián)合使用與淋巴瘤Raji細(xì)胞共孵育48h，用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，或在倒置相差顯微鏡先觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照，結(jié)果顯示，與單獨(dú)使用vismodegib相比,各個(gè)濃度的CQ或Bafi Al與vismodegib聯(lián)合使用均能顯著降低腫瘤細(xì)胞活力，聯(lián)用組細(xì)胞非常稀少且形態(tài)異常(如圖4所示)，圖中還顯示了具有代表性的相差顯微鏡圖片，其中vismodegib、CQ和Bafi Al的使用濃度分別為20 μ Μ、10 μ M和 2.5ηΜ。
[0047]實(shí)施例7.通過(guò)基因沉默抑制Hedgehog信號(hào)通路與細(xì)胞自噬抑制劑氯喹(CQ)聯(lián)合應(yīng)用能顯著降低CML細(xì)胞活力
[0048]采用小干擾RNA(SiRNA)技術(shù)沉默Hedgehog信號(hào)通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因SM0，從而使腫瘤細(xì)胞中Hedgehog信號(hào)通路受到抑制；與此同時(shí)，給予腫瘤細(xì)胞CQ處理，用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力:運(yùn)用Iipofactamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將對(duì)照siRNA或SMOsiRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)入K562細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24h后，用1yMKCQ處理細(xì)胞48h，用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力；或者轉(zhuǎn)染siRNA48h后，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SMO基因的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果如圖5(A)所示，與轉(zhuǎn)染對(duì)照siRNA的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染SMO siRNA的細(xì)胞內(nèi)SMO基因的mRNA表達(dá)水平顯著降低，表明本試驗(yàn)中運(yùn)用的siRNA技術(shù)成功地抑制了 K562細(xì)胞的SMO的表達(dá)，表明著Hedgehog信號(hào)通路被成功抑制；結(jié)果還顯示，與單獨(dú)轉(zhuǎn)染SMO siRNA組相比，SMO siRNA轉(zhuǎn)染和CQ聯(lián)用組的細(xì)胞活力顯著下降，表明Hedgehog信號(hào)通路抑制與細(xì)胞自噬抑制劑同時(shí)運(yùn)用能顯著降低腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞活力(如圖5(B)所示)；
[0049]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)基因敲除手段抑制Hedgehog信號(hào)通路的同時(shí)，聯(lián)合使用細(xì)胞自噬抑制劑能顯著殺傷CML細(xì)胞。
[0050]實(shí)施例8.通過(guò)基因沉默抑制細(xì)胞自嗷與Hedgehog信號(hào)通路抑制劑vismodegib聯(lián)合應(yīng)用能顯著降低CML細(xì)胞活力
[0051]采用小干擾RNA(SiRNA)技術(shù)沉默細(xì)胞自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因ATG5或ATG7，從而使腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞自噬受到抑制。與此同時(shí)，給予腫瘤細(xì)胞Hedgehog信號(hào)通路抑制劑處理，用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力:運(yùn)用Iipofactamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將對(duì)照siRNA或ATG5 siRNA或 ATG7 siRNA 瞬時(shí)轉(zhuǎn)入 K562 (圖 6A、B 和 C 所示)或 BaF3_BCR_ABLT3151 (圖 6D、E 和 F 所示)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24h后，用20μΜ的vismodegib處理細(xì)胞48h，用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力或者提取細(xì)胞總蛋白檢測(cè)細(xì)胞自噬標(biāo)志性蛋白MAP1LC3B-1I的表達(dá)情況，結(jié)果如圖6 (A、B、D和E)所示，與轉(zhuǎn)染對(duì)照siRNA的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染ATG5 siRNA或ATG7 siRNA的細(xì)胞內(nèi)ATG5或ATG7、MAP1LC3B-1I的蛋白表達(dá)水平顯著降低，表明本試驗(yàn)中運(yùn)用的siRNA技術(shù)成功地抑制了 K562細(xì)胞的細(xì)胞自噬水平；如圖6(C和F)所示，與單獨(dú)轉(zhuǎn)染ATG5 siRNA(或ATG7siRNA)組相比，ATG5 siRNA(或ATG7 siRNA)轉(zhuǎn)染和vismodegib聯(lián)用組的細(xì)胞活力顯著下降，表明Hedgehog信號(hào)通路抑制劑與細(xì)胞自嗷抑制同時(shí)運(yùn)用能顯著降低腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞活力；
[0052]實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了抑制細(xì)胞自嗷在Hedgehog信號(hào)通路與細(xì)胞自嗷抑制劑聯(lián)合使用抗腫瘤中的關(guān)鍵作用。
[0053]實(shí)施例9.Hedgehog信號(hào)通路抑制劑vismodegib和細(xì)胞自嗷抑制劑氯喹(CQ)聯(lián)合使用能顯著逆轉(zhuǎn)CML的耐藥性
[0054]分別將ΙΟμΜ的CQ與10或20μ M的vismodegib聯(lián)合使用與伊馬替尼敏感型白血病細(xì)胞(K562、BaF3-BCR-ABL)或伊馬替尼耐藥性白血病細(xì)胞(BaF3_BCR_ABLT3151和BaF3-BCR-ABLY253F)細(xì)胞共培養(yǎng)48h。以上四株細(xì)胞用0.1或I μΜ的伊馬替尼處理相同時(shí)間作為對(duì)陽(yáng)性照組，用CCK-8方法檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果如圖7所示，vismodegib與CQ聯(lián)用能顯著降低伊馬替尼敏感型白血病細(xì)胞(K562、BaF3-BCR-ABL)，此時(shí)伊馬替尼作為陽(yáng)性藥物也能達(dá)到相似的效果；對(duì)于伊馬替尼耐藥性白血病細(xì)胞(BaF3-BCR-ABLT3151和BaF3-BCR-ABLY253F), vismodegib與CQ聯(lián)用依然能顯著降低其細(xì)胞活力，而陽(yáng)性藥物伊馬替尼則不具有類似效果，圖中的相差顯微鏡圖片將實(shí)驗(yàn)結(jié)果更直觀地呈現(xiàn)了出來(lái)；
[0055]實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明Hedgehog信號(hào)通路抑制劑和細(xì)胞自嗷抑制劑聯(lián)合使用能有效逆轉(zhuǎn)CML的耐藥性，具有非常重要的臨床意義。
[0056]實(shí)施例10.Hedgehog信號(hào)通路抑制劑vismodegib和細(xì)胞自嗷抑制劑氯喹(CQ)聯(lián)合使用能顯著誘導(dǎo)CML細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡
[0057]將10 μ M 的 CQ 與 20 μ M 的 vismodegib 聯(lián)合使用與 K562、BaF3_BCR_ABL 和BaF3-BCR-ABLT3151細(xì)胞共培養(yǎng)12h、24h或48h。提取細(xì)胞總蛋白用western blot方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡關(guān)鍵蛋白PARP、CASP3和CASP9的激活狀態(tài)，或用Annexin V/PI雙染色法標(biāo)記細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡比率，其中Annexin V+/P1-的細(xì)胞計(jì)為凋亡細(xì)胞，AnnexinV+/PI+的細(xì)胞計(jì)為壞死細(xì)胞；結(jié)果如圖8(A)所示,單獨(dú)使用vismodegib的細(xì)胞中PARP、CASP3和CASP9均無(wú)明顯激活；而CQ與vismodegib聯(lián)合使用則明顯地導(dǎo)致了 PARP、CASP3和CASP9的激活；結(jié)果如圖8(B)所示,單獨(dú)使用vismodegib誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率較??；而CQ與vismodegib聯(lián)合使用則顯著地誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞凋亡。
[0058]本發(fā)明的上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CQ與vismodegib聯(lián)合使用能顯著地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種革巴向hedgehog通路和細(xì)胞自嗷的抗腫瘤藥物組合物,其特征在于，由Hedgehog信號(hào)通路抑制劑和細(xì)胞自噬抑制劑組成；所述的Hedgehog信號(hào)通路抑制劑與細(xì)胞自噬抑制劑的給藥劑量比為1: 0.001-1000。2.按權(quán)利要求1所述的祀向hedgehog通路和細(xì)胞自嗷的抗腫瘤藥物組合物，其特征在于，所述的Hedgehog信號(hào)通路抑制劑選自如下三類抑制劑:(I) SMO抑制劑；(2) Hh蛋白抑制劑；(3) GLI抑制劑。3.按權(quán)利要求1所述的革巴向hedgehog通路和細(xì)胞自嗷的抗腫瘤藥物組合物，其特征在于，所述的Hedgehog信號(hào)通路抑制劑選自選自vismodegib、環(huán)杷明(cyclopamine)、sonidegib (LDE225)、BMS-833923、PF04449913、LEQ506、TAK-441、LY2940680、Robotnikinin, GANT61、GANT58、HIP-1、HIP-2、HIP-3、HIP-4、三氧化二砷或其組合物。4.按權(quán)利要求1所述的祀向hedgehog通路和細(xì)胞自嗷的抗腫瘤藥物組合物，其特征在于，所述的細(xì)胞自嗷抑制劑選自氯喹(Chloroquine)和輕基氯喹(hydroxychloroquine)、3-MA(3_Methyladenine)、渥曼青霉素(wortmannin)、LY294002、放線菌酮、巴伐洛霉素Al (Bafilomycin Al)、NH4C1 或其組合物。5.按權(quán)利要求1所述的祀向hedgehog通路和細(xì)胞自嗷的抗腫瘤藥物組合物,其特征在于，所述的細(xì)胞自噬抑制劑選自氯喹、羥基氯喹或巴伐洛霉素Al。6.按權(quán)利要求1所述的革巴向hedgehog通路和細(xì)胞自嗷的抗腫瘤藥物組合物,其特征在于，所述的藥物組合物制成口服制劑或注射制劑。7.按權(quán)利要求6所述的祀向hedgehog通路和細(xì)胞自嗷的抗腫瘤藥物組合物,其特征在于，所述的藥物組合物選自以下一組中的形式進(jìn)行配方:固體、溶液、分散劑、膠束、乳劑、月旨質(zhì)體或納米微球。8.權(quán)利要求1所述的靶向hedgehog通路和細(xì)胞自噬的抗腫瘤藥物組合物在制備治療實(shí)體瘤或非實(shí)體瘤藥物中的用途。9.按權(quán)利要求8所述的用途，其中，所述的實(shí)體瘤為肝癌、肺癌、胃癌、直腸癌、黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、基底細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、宮頸癌、大腸癌、前列腺癌或頭頸癌；所述的非實(shí)體瘤是白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。10.權(quán)利要求1所述的靶向hedgehog通路和細(xì)胞自噬的抗腫瘤藥物組合物在制備治療耐藥性慢性髓性白血病藥物中的用途。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK105879034SQ201410521485
【公開(kāi)日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2014年9月30日
【發(fā)明人】鞠佃文, 曾賢, 趙薈, 李玉彬, 范佳君, 王子玉, 王紹飛, 宋平
【申請(qǐng)人】復(fù)旦大學(xué)