一種基于絲素蛋白的三維細(xì)胞支架的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于絲素蛋白的三維細(xì)胞支架的制備方法，所述三維細(xì)胞支架是一種內(nèi)部含有均一的孔隙的絲素蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；其使用微流控裝置制備尺寸均一的單分散微球，然后利用單分散微球的自組裝功能制備蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的模板，再將絲素蛋白溶液灌注到模板中，冷凍干燥后去除模板得到這種內(nèi)部具有均一孔隙的網(wǎng)絡(luò)狀絲素蛋白三維細(xì)胞支架。本發(fā)明提供的三維細(xì)胞支架構(gòu)建方法，操作簡單，成本低廉，制備的三維細(xì)胞支架具有優(yōu)異的機(jī)械性能，生物相容性，生物可降解性。
【專利說明】
一種基于絲素蛋白的三維細(xì)胞支架的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于三維細(xì)胞支架材料研究技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于絲素蛋白的三維細(xì)胞支架的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在再生、替換、維持或修復(fù)受損組織的功能方面，尋找和開發(fā)合適的生物是組織工程中一種非常有前景的方法，而這其中所涉及到的各種課題中，細(xì)胞支架的研究則具有重要的意義。
[0003]細(xì)胞支架的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)已經(jīng)在材料科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)工程背景下得到廣泛的研究，對于支架的要求包括:(I)用于制備細(xì)胞支架的材料必須具有生物相容行和生物可降解性，同時(shí)對于連同接種的細(xì)胞存在陽性反應(yīng);(2)該細(xì)胞支架應(yīng)該包括空腔的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，并且最后能夠在三維上形成相互連接的體系；(3)該細(xì)胞支架應(yīng)該具有一定的機(jī)械性能以適應(yīng)特定的應(yīng)用，包括在生成軟骨、骨頭、人造血管等方面的應(yīng)用要求。
[0004]為了得到一個(gè)優(yōu)良的三維細(xì)胞支架，研究者們提出了很多的方法，包括冷凍干燥、高溫高壓、相分離、靜電紡絲等。然而大多數(shù)的方法都有一定的局限性，比如靜電紡絲得到的材料難以擴(kuò)展到真正的三維支架上，其他的方法還有尺寸不規(guī)則，空腔不均一，連通性差等諸多缺點(diǎn)。
[0005]細(xì)胞支架的孔徑和結(jié)構(gòu)關(guān)系到細(xì)胞的粘附、迀移和分布，以及營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的交換，所以其對于細(xì)胞的培養(yǎng)具有非常重要的意義。目前針對支架中空腔的直徑和結(jié)構(gòu)，研究者們做出了大量的努力和嘗試，然而空腔的均一性和空腔間的相互連通性還是亟待解決的難點(diǎn)?；谶@一問題，反蛋白石結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是一種理想的模型，因?yàn)榉吹鞍资Y(jié)構(gòu)具有非常一致的空腔，并且內(nèi)部具有非常規(guī)則的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。盡管已經(jīng)有一些基于反蛋白石結(jié)構(gòu)的三維細(xì)胞支架被發(fā)明出來，但是他們所使用的材料都不是具有生物可降解性的，這就限制了其在臨床中的應(yīng)用。
[0006]蠶絲是最早被利用的天然蛋白質(zhì)之一，人類利用蠶絲作為織物的歷史已有五千多年.近年來蠶絲因其優(yōu)異的力學(xué)性能和良好的生物相容性使它在生物醫(yī)藥等高新技術(shù)領(lǐng)域日益受到重視，蠶絲由兩種蛋白組成，內(nèi)層為絲素蛋白，外層被絲膠蛋白包覆。其中絲素蛋白含量約為70%-80%。絲素蛋白含有18種氨基酸，其中甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸的含量約占87 %，多以-甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸-絲氨酸-的多肽形式存在。絲素蛋白具有兩性荷電的特殊性能、無毒、良好的人體親和性、生物降解性和生物相容性等優(yōu)良性能，可制備成多種形態(tài)，如多孔狀，膜狀和管狀等，是一種開發(fā)醫(yī)用材料比較理想的素材。
[0007]作為生物醫(yī)藥材料，其生物降解性是一項(xiàng)很重要的性能指標(biāo)。例如，組織工程中的支架材料，不僅要求生物相容性好，更希望其降解速度與組織的再長速度相匹配，方可達(dá)到良好的修復(fù)效果。因此，如何能夠控制絲素蛋白材料在體內(nèi)的降解速度是許多研究者關(guān)心的問題。由于天然蠶絲在植入人體內(nèi)60 d以后仍保留50%以上的力學(xué)性能，根據(jù)通常人們對“可降解”材料的定義，蠶絲不屬于可生物降解的材料。但隨后的研究證明，蠶絲作為一種蛋白質(zhì)，是可以被某些酶降解，并且植入人體內(nèi)也會(huì)最終被吸收，只是所需要的時(shí)間比一般意義上的可降解材料要長。影響材料降解性能的因素有很多，如材料的結(jié)構(gòu)、形態(tài)、降解條件、生理化學(xué)環(huán)境等，只有對降解的過程、機(jī)理、影響因素等有充分的了解，才能達(dá)到有效控制材料降解行為和降解速度的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明目的在于提供了一種基于絲素蛋白的三維細(xì)胞支架的制備方法，解決目前的技術(shù)難以實(shí)現(xiàn)具有一致直徑空腔的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)三維細(xì)胞支架，同時(shí)滿足對細(xì)胞支架在生物相容性和生物可降解性方面的要求。
[0009]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的這些問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是:
一種基于絲素蛋白的三維細(xì)胞支架的制備方法，所述三維細(xì)胞支架是一種內(nèi)部含有均一孔隙的絲素蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu);其特征在于所述方法包括以下步驟:
(I)絲素蛋白溶液的提取:
對生蠶繭進(jìn)行清洗，利用鹽析、透析、濃縮等方法從生蠶繭中提取從3%到15%不同濃度梯度的絲素蛋白水溶液。
[0010](2)微米級單分散性微球的制備步驟:
選擇合適的材料分別作為微流控過程中的連續(xù)相和非連續(xù)相，利用微流控裝置(圖1a所示)制備粒徑可控的單分散微球。對制備的單分散微球進(jìn)行清洗并收集。
[0011 ] (3)單分散微球的模板制備和復(fù)制:
利用化學(xué)氣相沉積法，將單分散的微球自然沉降，經(jīng)緩慢揮發(fā)溶液等步驟(2)中制備的單分散微球自組裝成蛋白石結(jié)構(gòu)模板，再將步驟(I)中提取的絲素蛋白溶液灌注到蛋白石結(jié)構(gòu)的模板中，最后通過超聲凝膠或冷凍干燥等方式將其固化。
[0012](4)三維細(xì)胞支架的收集處理:
將固化后的絲素蛋白收集并清洗，去除模板中的單分散微球，并最終形成內(nèi)部含相通空腔的網(wǎng)絡(luò)狀三維結(jié)構(gòu)支架。
[0013]優(yōu)選的，所述方法步驟(2)中微流控裝置非連續(xù)相包括二氧化硅、聚苯乙烯、聚己內(nèi)酯、氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、苯、二氯甲烷中的一種或兩種以上的材料。
[0014]優(yōu)選的，所述方法步驟(2)中微流控裝置連續(xù)相包括甲基硅油、正十六烷、聚乙烯醇中的一種或兩種以上的材料。
[0015]優(yōu)選的，所述方法步驟(4)中去除模板中單分散微球的去除劑選自氫氟酸、氫氧化鈉、丙酮、正己烷或二氯甲烷。
[0016]優(yōu)選的，所述方法步驟(I)中絲素蛋白溶液濃度在3%?15%之間。
[0017]優(yōu)選的，所述方法中步驟(2)中單分散性微球粒徑在30μπι-300μπι之間。
[0018]本發(fā)明所述的三維細(xì)胞支架相比較于其他材料，優(yōu)點(diǎn)在于將在內(nèi)部具有尺寸一致的空腔，空腔的直徑在30-300μπι之間可控，適宜不同類型的細(xì)胞的培養(yǎng)。同時(shí)空腔之間相互連通形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，能夠有助于細(xì)胞在培養(yǎng)過程中的粘附、迀移、已經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸。
[0019]本發(fā)明所述的三維細(xì)胞支架基于絲素蛋白材料，能夠具有良好的機(jī)械性能，在應(yīng)用與生物體中能夠維持一定的穩(wěn)定性，并且在具有優(yōu)異的生物相容性和生物可降解性，實(shí)用性非常廣泛。其具體制備方法包括以下步驟:
①絲素蛋白溶液的提取:
對生蠶繭進(jìn)行清洗，通過加熱煮沸去除絲膠。然后利用LiBr (0.9-1.1 mol/L)的鹽溶液將絲素進(jìn)行溶解，裝入透析袋中于去離子水中透析、透析之后得到的溶液需要去除雜質(zhì)，然后根據(jù)不同的需要濃縮成從3%到15%的不同濃度的絲素蛋白水溶液。
[0020]②微米級單分散性微球的制備步驟:
選擇合適的材料分別作為微流控過程中的連續(xù)相和非連續(xù)相，連續(xù)相和非連續(xù)性分別由油相或者水相構(gòu)成。這樣在微流控裝置中不同分散相在交匯是形成剪切力，連續(xù)相將非連續(xù)相切割成尺寸均一的乳液。利用自制微流控芯片及裝置的尺寸均一的乳液在經(jīng)過固化可以形成微球，通過精確的計(jì)算，乳液在固化成微球后直徑可以按照需要控制在30-300μπι之間的單分散性微球。對制備的單分散微球進(jìn)行清洗并收集。其中所述的非連續(xù)相包括二氧化硅、聚苯乙烯、聚己內(nèi)酯、氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、苯、二氯甲烷中的一種或兩種以上的材料;所述的連續(xù)相包括甲基硅油、正十六烷、聚乙烯醇中的一種或兩種以上的材料。[0021 ]③單分散微球的模板制備和復(fù)制:
利用化學(xué)氣相沉積法等將步驟②中制備的單分散微球自組裝成蛋白石結(jié)構(gòu)模板，再將步驟①中提取的絲素蛋白溶液灌注到蛋白石結(jié)構(gòu)的模板中，最后通過超聲凝膠或冷凍干燥等方式將絲素蛋白成形。
[0022]④三維細(xì)胞支架的收集處理:
將成形后的絲素蛋白收集并清洗，去除模板中的單分散微球，并最終形成內(nèi)部含相通空腔的網(wǎng)絡(luò)狀三維結(jié)構(gòu)支架。去除模板中單分散微球的去除劑選自氫氟酸、氫氧化鈉、丙酮、正己烷或二氯甲烷。
【附圖說明】
[0023]圖1.一種基于絲素蛋白的三維細(xì)胞支架的制備方法示意圖(a)和實(shí)物圖(b):1)利用微流控裝置制備摸版微球，2)將微球自組裝形成蛋白石結(jié)構(gòu)，3)將絲素蛋白填充到蛋白石結(jié)構(gòu)中，4)將摸版中的微球去除，得到反蛋白石結(jié)構(gòu)三維細(xì)胞支架。
[0024]具體實(shí)施方法
以下結(jié)合具體實(shí)施例對上述方案做進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例是用于說明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中采用的實(shí)施條件可以根據(jù)具體廠家的條件做進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實(shí)施條件通常為常規(guī)實(shí)驗(yàn)中的條件。
[0025]實(shí)施例1一種基于絲素蛋白的三維細(xì)胞支架制備方法
(1)單分散聚苯乙烯乳液的制備:
我們制備微米級聚苯乙烯(PS，Sigma)乳液的微流控裝置(圖1a所示)內(nèi)相選擇的是PS/苯/二氯乙烷，質(zhì)量體積比為0.8 g: 10 mL: 10 mL.外相為聚乙烯醇(PVA，Sigma)的水溶液，質(zhì)量體積比為5%。利用穩(wěn)定的液體流速(內(nèi)向流速0.5 mL/h )和剪切力(外向流速5 mL/h)，PVA的水相將PS的油相切成直徑一致的水包油單乳液結(jié)構(gòu)，然后乳液通過收集管進(jìn)入裝滿PVA水相的收集池中。作為表面活性劑，PVA的存在可以有效的防止在收集的過程中乳液相互融合的現(xiàn)象；
(2)聚苯乙烯乳液的固化: 將制得的乳液滴轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的燒瓶上，從室溫開始，每5分鐘升高5°C，直至600C，旋轉(zhuǎn)速度控制為40 rpm;溫度到達(dá)60°C后，升溫速度降為每30分鐘2°C，至70°C后停止升溫;溫度超過64°C后，轉(zhuǎn)速增至SOrpm;停止升溫后I小時(shí)檢查是否固化。將固化的PS微米球用超純水反復(fù)清洗，60 0C烘箱干燥；
(3)復(fù)制并去除模板微球得到細(xì)胞支架
將聚苯乙烯微球置于離心管底部，加入純水后在60°C烘箱中干燥，可以在離心管底部得到規(guī)則排列的聚苯乙烯模板。將絲素蛋白溶液(15%)加入其中并進(jìn)行冷凍干燥，即得到成形后的細(xì)胞支架，最后使用丙酮去除聚苯乙烯；
所述的絲素蛋白溶液由如下步驟制得:
對生蠶繭進(jìn)行清洗，通過加熱煮沸去除絲膠。然后利用LiBr (0.9-1.1 mol/L)的鹽溶液將絲素進(jìn)行溶解，裝入透析袋中于去離子水中透析、透析之后得到的溶液需要去除雜質(zhì)，然后根據(jù)不同的需要濃縮成從3%到15%的不同濃度的絲素蛋白水溶液。
實(shí)施例2 —種基于絲素蛋白的三維細(xì)胞支架制備方法
(1)單分散聚己內(nèi)酯(PCL)乳液的制備
我們制備微米級PCL乳液的微流控裝置內(nèi)相選擇的是PCL/二氯甲烷，PCL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%wt。外相為PVA的水溶液，質(zhì)量體積比為5%。利用穩(wěn)定的液體流速(內(nèi)向流速0.8 mL/h)和剪切力(外向流速8 mL/h)，PVA的水相將PCL的油相切成直徑一致的水包油單乳液結(jié)構(gòu)，然后乳液通過收集管進(jìn)入裝滿PVA水相的收集池中。作為表面活性劑，PVA的存在可以有效的防止在收集的過程中乳液相互融合的現(xiàn)象；
(2)PCL乳液滴的固化
使用I OOml裝滿PVA溶液的藍(lán)口瓶對PCL進(jìn)行收集，然后在通風(fēng)櫥中并保持30 V恒溫加熱過夜，使二氯甲烷能夠充分揮發(fā)，最后將固化的PCL溶液用大量超純水清洗，即可得到PCL微球；
(3)復(fù)制并去除模板微球得到細(xì)胞支架
將聚己內(nèi)酯微球置于離心管底部，加入純水后在搖床上以80rpm振蕩過夜，隨著水分的揮發(fā)可以在離心管底部得到規(guī)則排列的聚己內(nèi)脂模板，然后將其在50°C烘箱中加入lh，出去水分的同時(shí)使得聚己內(nèi)酯模板固定下來。最后將絲素蛋白溶液加入其中并進(jìn)行冷凍干燥，即得到成形后的細(xì)胞支架，最后使用二氯甲烷去除聚己內(nèi)酯，然后在通風(fēng)櫥中讓二氯甲烷充分揮發(fā)得到所要的細(xì)胞支架。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種基于絲素蛋白的三維細(xì)胞支架的制備方法，其特征在于所述方法按以下步驟實(shí)現(xiàn): (1)絲素蛋白溶液的提取: 對生蠶繭進(jìn)行清洗，利用鹽析、透析、濃縮，從生蠶繭中提取從3wt%-15wt%的絲素蛋白水溶液； (2)微米級單分散性微球的制備步驟: 利用微流控裝置、非連續(xù)相和連續(xù)相制備粒徑可控的單分散微球，對制備的單分散微球進(jìn)行清洗并收集； (3)單分散微球的模板制備和復(fù)制: 利用化學(xué)氣相沉積法將步驟(2)中制備的單分散微球自組裝成蛋白石結(jié)構(gòu)模板，再將步驟(I)中提取的絲素蛋白溶液灌注到蛋白石結(jié)構(gòu)的模板中，最后通過超聲凝膠或冷凍干燥將其固化； (4)三維細(xì)胞支架的收集處理: 將固化后的絲素蛋白收集并清洗，利用去除劑去除模板中的單分散微球，并最終形成內(nèi)部含相通空腔的網(wǎng)絡(luò)狀三維細(xì)胞支架。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法步驟(2)中非連續(xù)相為二氧化硅、聚苯乙烯、聚己內(nèi)酯、氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、苯、二氯甲烷中的一種或兩種以上的材料。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法步驟(2)中微流控裝置連續(xù)相為甲基硅油、正十六烷、聚乙烯醇中的一種或兩種以上的材料。4.據(jù)據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法步驟(4)中去除模板中單分散微球的去除劑為氫氟酸、氫氧化鈉、丙酮、正己烷或二氯甲烷。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中步驟(2)中單分散性微球粒徑在30μηι-300μηι 之間。
【文檔編號】A61L27/56GK105879113SQ201610438113
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年6月17日
【發(fā)明人】趙遠(yuǎn)錦, 付繁繁, 陳卓玥, 湯棟梁, 顧忠澤
【申請人】東南大學(xué)