白術(shù)內(nèi)酯iii在制備增強免疫功能的藥物及保健品中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了白術(shù)內(nèi)酯III在制藥領(lǐng)域及保健品領(lǐng)域中的新用途。具體為白術(shù)內(nèi)酯III在制備增強免疫功能的藥物及保健品中的應(yīng)用。白術(shù)內(nèi)酯III能夠促進淋巴細胞的增殖，在制備增強淋巴細胞免疫功能藥物中的應(yīng)用，具有潛在價值。此外，白術(shù)內(nèi)酯III能夠通過促進免疫相關(guān)分子白細胞介素?2、白細胞介素?12、γ?干擾素的分泌，來增強機體的免疫能力，在制備促進免疫相關(guān)分子的分泌、治療免疫缺陷疾病的藥物或保健品中，具有實際應(yīng)用價值。
【專利說明】
白術(shù)內(nèi)醋Μ I在制備増強免疫功能的藥物及保健品中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，設(shè)及白術(shù)內(nèi)醋ΙΠ 在制備增強免疫功能的藥 物及保健品中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 白術(shù)屬菊科植物，其藥用部位為白術(shù)Atractylodes macroce地ala Koidz的干燥 根莖，主產(chǎn)于浙江、安徽、湖北等省。白術(shù)性味甘、苦、溫，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安 胎等功效，是常用的補益中藥，有"南術(shù)北參"的美稱?，F(xiàn)代藥理學研究表明，白術(shù)有利尿、抗 腫瘤、抗炎、抗糖尿病和抗衰老等活性。
[0003] 白術(shù)主要的化學成分為多糖、白術(shù)內(nèi)醋類成分、氨基酸、樹脂和揮發(fā)油類等物質(zhì)。 多糖類成分含有白術(shù)多糖、甘露聚糖等;揮發(fā)油在白術(shù)根莖中約含1.4%，其主要成分為蒼 術(shù)酬(a化atylon)、蒼術(shù)醇等；內(nèi)醋類成分有白術(shù)內(nèi)醋I、白術(shù)內(nèi)醋II、白術(shù)內(nèi)醋III、白術(shù)內(nèi) 醋IV等。
[0004] 白術(shù)內(nèi)醋III是白術(shù)的主要活性成分，是白術(shù)發(fā)揮其抗炎、抑瘤、調(diào)節(jié)胃腸道功能 和促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收等作用的重要成分。白術(shù)內(nèi)醋ΙΠ 是一種倍半祗類化合物，其化學結(jié)構(gòu) 式如下：
[0005]
[0006] 免疫系統(tǒng)由免疫器官、免疫細胞和免疫分子組成，是機體執(zhí)行免疫應(yīng)答及免疫功 能的重要系統(tǒng)。其中，免疫細胞是免疫系統(tǒng)發(fā)揮免疫功能的基礎(chǔ)。淋己細胞是免疫細胞的重 要組成部分，在體內(nèi)分布廣泛，包括T細胞、B細胞和NK細胞等亞類，分別介導機體的細胞免 疫、體液免疫及對腫瘤細胞和病毒感染細胞的殺傷作用等重要免疫學功能。機體免疫功能 的高低直接影響機體的抗病能力。提高機體免疫力在很多疾病的治療中發(fā)揮重要作用。許 多疾病都需要通過增加免疫細胞數(shù)量來提高機體免疫力。研究表明，一些免疫復(fù)方可W通 過激活免疫細胞而增強機體免疫力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供白術(shù)內(nèi)醋ΙΠ 的新用途，即白術(shù)內(nèi)醋ΙΠ 在制備與免疫功能 相關(guān)的藥物中的應(yīng)用。
[000引本發(fā)明設(shè)及白術(shù)內(nèi)醋ΙΠ 在制備增強免疫功能的藥物中的應(yīng)用。
[0009] 設(shè)及白術(shù)內(nèi)醋ΙΠ 在制備增強淋己細胞免疫功能的藥物中的應(yīng)用。
[0010] 設(shè)及白術(shù)內(nèi)醋ΙΠ 在制備增強脾臟淋己細胞免疫功能的藥物中的應(yīng)用。
[0011] 設(shè)及白術(shù)內(nèi)醋ΙΠ 在制備治療免疫缺陷疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0012] 設(shè)及白術(shù)內(nèi)醋HI在制備促進淋己細胞增殖的藥物中的應(yīng)用。
[0013] 設(shè)及白術(shù)內(nèi)醋ΙΠ 在制備促進脾臟淋己細胞增殖的藥物中的應(yīng)用。
[0014] 設(shè)及白術(shù)內(nèi)醋ΙΠ 在制備促進免疫相關(guān)分子的分泌的藥物中的應(yīng)用。
[0015] 設(shè)及白術(shù)內(nèi)醋ΙΠ 在制備增強免疫功能保健品中的應(yīng)用。
[0016] 其中，免疫相關(guān)分子包括白細胞介素-2(化-2)、白細胞介素-12(IL-12)、丫-干擾 素(WN-丫）。
[0017] 其中，增強免疫功能藥物中還可W包括輔料，輔料選自增溶劑、助溶劑、乳化劑、粘 合劑、崩解劑、填充劑、潤滑劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、矯味劑、助懸劑、滲透促進劑、增塑 劑、表面活性劑、發(fā)泡劑、包合劑、包衣材料中的任意一種或幾種。
[0018] 淋己細胞在免疫系統(tǒng)中有著極其重要的作用，是機體免疫功能的主要承擔者。檢 測中藥單體或相關(guān)化合物是否具有促進淋己細胞增殖的能力是評價該化合物是否具有增 強免疫功能性質(zhì)的重要依據(jù)。MTT實驗是檢測淋己細胞體外增殖的經(jīng)典實驗，是一種可靠、 簡便的檢測細胞增殖的技術(shù)，在判定藥物影響機體免疫功能的研究中被廣泛應(yīng)用。本發(fā)明 用白術(shù)內(nèi)醋ΠI體外直接作用于脾臟淋己細胞進行藥理活性研究。
[0019]采用MTT法研究白術(shù)內(nèi)醋ΠI對小鼠淋己細胞增殖的影響發(fā)現(xiàn)，在濃度為扣g/mL 時，白術(shù)內(nèi)醋III促進小鼠脾臟淋己細胞增殖的作用與陽性對照刀豆蛋白A巧yg/mU和脂多 糖(20yg/mU的作用相似。其中，刀豆蛋白A，為促細胞有絲分裂素，主要對T淋己細胞有激發(fā) 作用；脂多糖脂是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分，對人體免疫反應(yīng)極其重要。由此可見，白 術(shù)內(nèi)醋ΠI能夠促進脾臟淋己細胞的增殖，并有劑量依賴性。
[0020] 采用化ISA法研究白術(shù)內(nèi)醋III對小鼠脾臟淋己細胞中免疫相關(guān)分子化-2、化-12 和IFN- 丫分泌的影響發(fā)現(xiàn)，白術(shù)內(nèi)醋ΙΠ 對運Ξ種免疫相關(guān)分子的分泌均有促進作用。
[0021] 其中，化-2主要由活化的T淋己細胞產(chǎn)生，是機體免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中重要的調(diào)節(jié)分 子，在抑制腫瘤細胞生長及免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要的作用?；?2具有促進T細胞增殖分 化、活化B淋己細胞、增強T細胞和NK細胞活性、誘導干擾素生成的作用。小鼠脾臟淋己細胞 經(jīng)白術(shù)內(nèi)醋III作用后，小鼠脾臟淋己細胞分泌IL-2的能力顯著增強，說明白術(shù)內(nèi)醋III能 夠增強機體的免疫功能。
[0022] 比-12是一種具有多種生物學活性的免疫細胞生長刺激分子，主要由樹突狀細胞、 巨隧細胞和B淋己細胞產(chǎn)生?；?12能促進T淋己細胞和NK細胞的分化與增殖，促進T淋己細 胞分泌IL-2、IFN-丫等細胞分子，調(diào)控細胞免疫。由此可見，白術(shù)內(nèi)醋III通過促進脾臟淋己 細胞分泌IL-12，能夠增強機體的免疫功能。
[0023] IFN-丫主要由活化的T淋己細胞產(chǎn)生，是機體免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中重要的調(diào)節(jié)分子，在 抑制腫瘤細胞生長及免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要的作用。IFN-丫可增強抗原提呈細胞與T淋 己細胞的相互作用，進而增強T淋己細胞輔助抗體產(chǎn)生。IFN-丫水平的高低是機體細胞免疫 的重要標志。由此可見，白術(shù)內(nèi)醋III通過促進脾臟淋己細胞分泌IFN-丫，能夠增強機體的 免疫功能。
[0024] 由此可見，適宜劑量的白術(shù)內(nèi)醋ΙΠ 有利于提高機體免疫能力，在免疫缺陷相關(guān)疾 病的治療和保健藥物的應(yīng)用中，具有實際應(yīng)用價值。
[0025] 從W上結(jié)論可W得出本發(fā)明的有益效果為：
[0026] (1)本發(fā)明對已知化合物白術(shù)內(nèi)醋ΠΙ發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開拓了白術(shù)內(nèi)醋III 在增強免疫功能的藥物中的新的應(yīng)用領(lǐng)域。
[0027] (2)本發(fā)明的白術(shù)內(nèi)醋ΙΠ 安全無毒，藥理活性強，具有很好的藥用前景。
[0028] (3)本發(fā)明的產(chǎn)品原料菊科植物白術(shù)，來源豐富、價格價廉、在《本草綱目》中被列 為"上品"，是常用的補益中藥，未見毒副作用，其中白術(shù)內(nèi)醋ΠΙ的含量高。白術(shù)內(nèi)醋III的 制備工藝簡單，且可采用現(xiàn)代制藥工藝做成口服劑型、注射劑型、片劑、膠囊劑、顆粒劑等， 使用方便，療效好。
[0029] (4)包含白術(shù)內(nèi)醋ΙΠ 的藥物能夠通過促進小鼠脾臟淋己細胞的增殖，來激活脾臟 淋己細胞的免疫功能，進一步來提高機體的免疫能力。
[0030] (5)包含白術(shù)內(nèi)醋III的藥物能夠通過促進免疫相關(guān)分子化-2、化-12和IFN- 丫的 分泌，來增強機體的免疫能力。
[0031] 此外，由白術(shù)內(nèi)醋III制成的免疫增強劑有助于提高患有免疫缺陷病的患者的免 疫能力，同時，也可作為保健品用于增強機體的免疫能力。
【附圖說明】
[0032] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，W下將對實施例中所 需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0033] 圖1為白術(shù)內(nèi)醋111對小鼠脾臟淋己細胞增殖的影響；圖中：*P < 0.0 5 ; * *P < 0.01 ; **沖<0.001 與對照組相比（X ± S，η = 5);
[0034] 圖2為白術(shù)內(nèi)醋ΠI對小鼠脾臟淋己細胞分泌IL-2的影響；圖中：沖<0.05 ; *巧< 0.01與對照組相比?！?，11=3):;
[0035] 圖3為白術(shù)內(nèi)醋ΠI對小鼠脾臟淋己細胞分泌IL-12的影響；圖中：沖<0.05 ; *沖< 0.01與對照組相比（別S, 11=3);
[0036] 圖4為白術(shù)內(nèi)醋III對小鼠脾臟淋己細胞分泌IFN- 丫的影響；圖中：沖<0.05;*沖< 0.01與對照組相比（^±S，η二3)。
【具體實施方式】
[0037] 下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會 理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體 條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為 可W通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0038] 白術(shù)內(nèi)醋ΠI能夠通過促進淋己細胞增殖、W及促進包括白細胞介素-2、白細胞介 素-12和丫-干擾素在內(nèi)的免疫相關(guān)分子的分泌，來進一步增強機體的免疫功能，因此，白術(shù) 內(nèi)醋ΠΙ可W用來制備增強免疫功能的藥物。
[0039] 白術(shù)內(nèi)醋III能夠促進包括白細胞介素-2、白細胞介素-12和丫-干擾素在內(nèi)的免 疫相關(guān)分子的分泌，而運些免疫相關(guān)因子是機體免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中重要的調(diào)節(jié)分子。因此，白 術(shù)內(nèi)醋ΠΙ可W用來制備增強淋己細胞免疫功能的藥物或者保健品。
[0040] 淋己細胞主要分布于全身各處的淋己結(jié)中，而脾臟是機體重要的免疫器官，含有 大量免疫細胞，具有調(diào)節(jié)機體細胞免疫和體液免疫的作用。因此，白術(shù)內(nèi)醋III可W用來制 備增強脾臟淋己細胞免疫功能的藥物或者保健品。
[0041] 免疫缺陷疾病是一組由于免疫系統(tǒng)發(fā)育不全或遭受損害所致的免疫功能缺陷引 起的疾病。而經(jīng)發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn)，白術(shù)內(nèi)醋III能夠通過促進淋己細胞增殖、W及促進包 括白細胞介素-2(比-2)、白細胞介素-12(IL-12)、丫-干擾素（IFN-丫）在內(nèi)的免疫相關(guān)分子 的分泌，運就說明白術(shù)內(nèi)醋ΠΙ對免疫缺陷疾病也有一定的治療作用，可用來制備治療免疫 缺陷疾病的藥物或者保健品。
[0042] 實施例1
[0043] 采用菊科植物白術(shù)的干燥根莖1kg，粉碎后，用90%的甲醇提取，提取物溶于水后 分別W石油酸、氯仿和正下醇萃取得到石油酸部分、氯仿部分和正下醇部分。氯仿部分經(jīng)娃 膠柱色譜分離純化得到白術(shù)內(nèi)醋III 500mg，經(jīng)HPLC檢測，純度為98% W上，經(jīng)UV、IR、MS、 NMR等表征技術(shù)測得其波譜數(shù)據(jù)與現(xiàn)有技術(shù)一致。
[0044] 取lOOmg的白術(shù)內(nèi)醋III，加入到lOOOmL的抑為7.4的憐酸鹽緩沖溶液(PBS)中，加 熱溶解，制成濃度為0.1 mg/mL的PBS緩沖溶液，用0.22微米濾膜過濾后，裝入藥瓶中密封，審U 成產(chǎn)品。
[0045] 實施例2
[0046] 用實施例1的方法得到白術(shù)內(nèi)醋III，取500mg的白術(shù)內(nèi)醋III，加入到lOOOmL的pH 為7.4的PBS緩沖溶液中，加熱溶解，混合均勻后，用0.22微米濾膜過濾后，分裝成濃度為 lmg/2mL/支的注射液于藥瓶中密封，制成產(chǎn)品。
[0047] 實施例3
[004引用實施例1的方法得到白術(shù)內(nèi)醋III，取500mg的白術(shù)內(nèi)醋III，加入到250血的抑為 7.4的PBS緩沖溶液中，加熱溶解，混合均勻后，用0.22微米濾膜過濾后，分裝成濃度為4mg/ 2mL/支的注射液于藥瓶中密封，制成產(chǎn)品。
[0049] 實施例4
[0050] 按本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的方法制備白術(shù)內(nèi)醋III片劑，其中片劑中所含白術(shù) 內(nèi)醋ΠΙ的含量為5%-10%，也可按實際需要加大或者減少白術(shù)內(nèi)醋ΙΠ 的含量。
[0051 ]用實施例1的方法制得白術(shù)內(nèi)醋III，取70g白術(shù)內(nèi)醋III、500g纖維素、400g無水乳 糖、200g硬脂酸儀和30g氧化娃，按公知的制片技術(shù)和設(shè)備進行制片，即取上述配方中的白 術(shù)內(nèi)醋III、纖維素、無水乳糖和氧化娃在混合機內(nèi)充分混合，再篩入硬脂酸儀繼續(xù)混合，隨 后用壓片機將上述原料沖壓成片。
[0化2] 實驗例
[0053] 淋己細胞在免疫系統(tǒng)中有著極其重要的作用，T淋己細胞主要介導細胞免疫，B淋 己細胞主要介導體液免疫。可W通過研究淋己細胞的增殖活性反映機體的免疫狀態(tài)。脾臟 是機體重要的免疫器官，含有大量免疫細胞，主要為T淋己細胞和B淋己細胞，具有調(diào)節(jié)機體 細胞免疫和體液免疫的作用。檢測脾臟淋己細胞體外增殖反應(yīng)，可間接反映機體細胞免疫 功能，作為一種可靠、簡便的檢測技術(shù)，在判定藥物對機體免疫功能影響的研究中被廣泛應(yīng) 用。本發(fā)明用實施例1中的白術(shù)內(nèi)醋ΠΙ體外直接作用于脾臟淋己細胞，結(jié)果顯示，白術(shù)內(nèi)醋 III可W顯著促進淋己細胞的增殖、W及促進淋己細胞免疫相關(guān)分子的分泌。
[0054] 為了更好的了解本發(fā)明的實質(zhì)，下面將用白術(shù)內(nèi)醋III在增強脾臟淋己細胞免疫 功能方面的藥理實驗及結(jié)果來說明其在制藥領(lǐng)域中的新用途。
[0055]本實驗所用的主要試劑、細胞和儀器：
[0化6] 白術(shù)內(nèi)醋IlKAtractylenolide 111)，2〇111邑，冊11：>98%，購自上海瑤韻生物科技 有限公司。刀豆蛋白A(ConA)、脂多糖化PS)購自Sigma公司。RPMI1640培養(yǎng)基購于Gibco公 司。青霉素硫酸鏈霉素(雙抗）、3-(4,5-二甲基嚷挫-2)-2,5-二苯基四氮挫漠鹽(MTT)均購 自北京索萊寶科技有限公司。胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司。其它試劑 均為分析純。用于測定小鼠白細胞介素-2(化-2)、白細胞介素-12(IL-12)、丫干擾素（IFN- 丫）的酶聯(lián)免疫吸附測定法化LISA)試劑盒購自Elabscience公司。
[0057]無特定病原體(SPF)級昆明種小鼠，雌、雄性，3日齡，體重20-25g，購自河南省實驗 動物中屯、，合格證號為SCXK(豫)2010-0002。
[005引倒置顯微鏡，E化IPSE TS100-F，日本NIKON公司。酶標儀（SUNRISE-BASIC TECAN Tecan Austria GmbH)。96 孔板離屯、機（Thermo Fisher Scientific)。
[0059] 做實驗前先制備含小鼠脾臟淋己細胞的脾細胞懸液備用，具體制備方法如下：
[0060] 小鼠摘眼球放血后脫頸處死，置于75%酒精中浸泡約5min，于超凈臺中無菌取出 脾臟，用憐酸鹽(PBS)緩沖溶液除去表面血潰和纖維組織，放入已加 PBS緩沖溶液的培養(yǎng)皿 中，將脾臟剪成小塊，用針桶栓充分研磨后經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過濾，W轉(zhuǎn)速為lOOOrpm/s離屯、 5min，收集細胞;棄去上清液，裂解紅細胞(加入9mL滅菌雙蒸水重懸細胞，作用15s，再加入 lmL9%化C1溶液重懸細胞），W轉(zhuǎn)速為1000巧m/s離屯、5min，收集細胞;棄去上清液，用完全 RPMI-1640細胞培養(yǎng)液(含10%滅活的胎牛血清，青霉素、硫酸鏈霉素）重懸細胞，輕輕吹勻 制成脾細胞懸液，并調(diào)整脾細胞懸液的細胞濃度至5.ΟΧΙΟ6個/mL，置于4°C冰箱中，冷藏備 用。
[0061] 實驗例1
[0062] 本實驗例采用MTT法檢測白術(shù)內(nèi)醋ΙΠ 對小鼠脾臟淋己細胞增殖的影響。
[0063] (1)實驗過程
[0064] 取制備好的脾細胞懸液（5.ΟΧΙΟ6個/mL)，按照10化L/孔加入到96孔板中，于37 °C、5 % C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2地。然后分別加入終濃度為160yg/mL，80yg/mL，40yg/mL，20yg/ mL，1 Oyg/血，5yg/mL，2.化邑/血，1.2扣g/血的白術(shù)內(nèi)醋III;同時W終濃度為扣g/mL的ConA、 20yg/mL的LPS為陽性對照，W等量的PBS作為陰性對照。每組重復(fù)5孔，于37°C、5 % C02培養(yǎng) 箱中繼續(xù)培養(yǎng)4她。
[0065] 每孔加入20μ1，5mg/mL的MTT溶液，置于37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中再次解育地，然后 在3000巧m/s的轉(zhuǎn)速下離屯、20min，棄去上清液;每孔加入DMS0 10化L，振蕩lOmin使紫色結(jié) 晶物完全溶解，用酶標儀于波長為570nm處測定每個孔的吸光度(A)值，并按照下式計算脾 臟淋己細胞的增殖率：
[0066] 細胞增殖率=各組細胞A日7日/正常細胞A日70 X 100%
[0067] 本實驗例所有數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0進行處理，WMean± SEM表示，兩組之間比較采 用t檢驗分析。
[0068] (2)實驗結(jié)果
[00例如圖1所示，白術(shù)內(nèi)醋III在1.25yg/mL時可促進小鼠脾臟淋己細胞增殖，但是與陰 性對照組的差異并不顯著(P〉0.05);白術(shù)內(nèi)醋III在2.扣g/mk80yg/mL濃度范圍內(nèi)可明顯 促進小鼠脾臟淋己細胞的增殖，并且存在劑量依賴性(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，隨著白術(shù) 內(nèi)醋III的濃度增高，小鼠脾臟淋己細胞的增殖率逐漸增大。其中，在濃度為扣g/mL時，促進 小鼠脾臟淋己細胞增殖的作用與陽性對照ConA巧yg/血)和LPS(20yg/mL)的作用相似。白術(shù) 內(nèi)醋III濃度在80yg/mL時，對小鼠脾臟淋己細胞增殖的促進作用最顯著(P<0.01)。結(jié)果表 明，白術(shù)內(nèi)醋ΠΙ能夠促進脾臟淋己細胞的增殖，并有劑量依賴性?？梢?，適宜劑量的白術(shù)內(nèi) 醋III有利于促進脾臟淋己細胞的增殖，白術(shù)內(nèi)醋ΠΙ在制備促進脾臟淋己細胞增殖的藥物 和保健品的應(yīng)用中，具有實際應(yīng)用價值。
[0070] 實驗例2
[0071] 本實驗例采用化ISA法檢測白術(shù)內(nèi)醋ΙΠ 對小鼠脾臟淋己細胞中免疫相關(guān)分子IL- 2、比-12和IFN- 丫分泌的影響。
[0072] (1)實驗過程
[0073] 取制備好的脾細胞懸液（5.ΟΧΙΟ6個/mL)，按照50化L/孔加入到24孔板中，于37 °C、5 % C〇2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2地。然后分別加入終濃度為160yg/mL，80yg/mL，40yg/mL，20yg/ mL，1 Oyg/mL，5yg/mL，2.扣g/mL，1.2扣g/mL的白術(shù)內(nèi)醋III;同時W終濃度為扣g/mL的ConA 和20yg/mL的LPS為陽性對照，W等量的PBS緩沖溶液作為陰性對照。每組重復(fù)3孔，于37°C、 5 % C〇2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h。然后收集細胞培養(yǎng)上清液，于4 °C下、在lOOOrpm/s的轉(zhuǎn)速下 離屯、20min。離屯、后，再次收集上清液，使用商品化的化ISA試劑盒檢測第二次收集的上清液 中免疫相關(guān)分子IL-2、比-12、IFN-丫的含量。具體操作步驟按照試劑盒說明書進行，采用酶 聯(lián)免疫檢測儀在波長為450nm處檢測吸光度值，并按照說明書計算出不同組別中化-2、化- 12、IFN-丫運Ξ種分子的含量。實驗重復(fù)3次。
[0074] 本實驗例所有數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0進行處理，WMean± SEM表示，兩組之間比較采 用t檢驗分析。
[0075] (2)實驗結(jié)果
[0076] 如圖2所示，白術(shù)內(nèi)醋III在扣g/mk 16化g/mL的濃度范圍內(nèi)可明顯提高小鼠脾臟 淋己細胞分泌IL-2的水平，并存在劑量依賴性(P<0.05，P<0.01)，但是白術(shù)內(nèi)醋ΙΠ 濃度超 過80yg/mL后對比-2分泌的影響增加并不明顯，比-2的表達量并沒隨著濃度升高繼續(xù)上升。
[0077] IL-2主要由活化的T淋己細胞產(chǎn)生，是機體免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中重要的調(diào)節(jié)分子，在抑 制腫瘤細胞生長及免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要的作用?；?2具有促進T細胞增殖分化、活化B 淋己細胞、增強T細胞和NK細胞活性、誘導干擾素生成的作用。小鼠脾臟淋己細胞經(jīng)白術(shù)內(nèi) 醋III作用后，小鼠脾臟淋己細胞分泌IL-2的能力顯著增強，進一步證實白術(shù)內(nèi)醋III能夠 增強機體的免疫功能。
[0078] 如圖3所示，白術(shù)內(nèi)醋III在扣g/mL-80yg/mL的濃度范圍內(nèi)可顯著提高小鼠脾臟淋 己細胞分泌IL-12的水平，并存在劑量依賴性(P<0.05，P<0.01)，IL-12的濃度在白術(shù)內(nèi)醋 III作用量為80yg/mL時最高(P<0.01)。當白術(shù)內(nèi)醋ΙΠ 的濃度超過80yg/mL后化-12的表達 水平并沒有繼續(xù)上升。
[0079] 比-12是一種具有多種生物學活性的免疫細胞生長刺激分子，主要由樹突狀細胞、 巨隧細胞和B淋己細胞產(chǎn)生。化-12能促進T淋己細胞和NK細胞的分化與增殖，促進T淋己細 胞分泌IL-2、IFN-丫等細胞分子，調(diào)控細胞免疫。由此可見，白術(shù)內(nèi)醋III通過促進脾臟淋己 細胞分泌IL-12，能夠增強機體的免疫功能。
[0080] 如圖4所示，白術(shù)內(nèi)醋III在扣g/mk 16化g/mL濃度范圍內(nèi)可顯著提高小鼠脾臟淋 己細胞分泌IFN-丫的水平(P<0.05，P<0.01)，并在濃度80yg/mL時IFN-丫表達水平達到最高 值。
[0081] IFN-丫主要由活化的T淋己細胞產(chǎn)生，是機體免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中重要的調(diào)節(jié)分子，在 抑制腫瘤細胞生長及免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要的作用。IFN-丫可增強抗原提呈細胞與T淋 己細胞的相互作用，進而增強T淋己細胞輔助抗體產(chǎn)生。IFN-丫水平的高低是機體細胞免疫 的重要標志。由此可見，白術(shù)內(nèi)醋III通過促進脾臟淋己細胞分泌IFN-丫，能夠增強機體的 免疫功能。
[0082] 本實驗例通過檢測白術(shù)內(nèi)醋ΙΠ 作用后脾臟淋己細胞培養(yǎng)上清中IL-2、化-12、 IFN- 丫的含量，發(fā)現(xiàn)經(jīng)白術(shù)內(nèi)醋III作用后，小鼠脾臟淋己細胞分泌比-2、化-12、IFN- 丫的 能力顯著增強，進一步證實白術(shù)內(nèi)醋III能提高機體的免疫功能。可見，適宜劑量的白術(shù)內(nèi) 醋III有利于提高機體免疫能力，白術(shù)內(nèi)醋ΠI在制備免疫缺陷相關(guān)疾病的藥物和保健品的 應(yīng)用中，具有實際應(yīng)用價值。
[0083] 本發(fā)明對已知化合物白術(shù)內(nèi)醋III發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開拓了白術(shù)內(nèi)醋III在增 強免疫功能、治療免疫缺陷疾病的藥物或保健品中的新的應(yīng)用領(lǐng)域。白術(shù)內(nèi)醋ΠΙ通過促進 小鼠脾臟淋己細胞的增殖，來激活脾臟淋己細胞的免疫功能，可見白術(shù)內(nèi)醋ΠΙ在制備增強 淋己細胞免疫功能藥物中的應(yīng)用中，具有潛在價值。白術(shù)內(nèi)醋ΠΙ能夠通過促進免疫相關(guān)分 子IL-2、比-12和IFN- 丫的分泌，來增強機體的免疫能力，可見白術(shù)內(nèi)醋ΠI在制備促進免疫 相關(guān)分子的分泌、治療免疫缺陷疾病的藥物或保健品中，具有實際應(yīng)用價值。此外，白術(shù)內(nèi) 醋III的制備工藝簡單，原料來源豐富，且可采用現(xiàn)代制藥工藝做成口服劑型、注射劑型、片 劑、膠囊劑、顆粒劑等，使用方便，療效好，應(yīng)用價值廣泛。
[0084] 盡管已用具體實施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識到，在不背離本發(fā)明的 精神和范圍的情況下可W作出許多其它的更改和修改。因此，運意味著在所附權(quán)利要求中 包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有運些變化和修改。
【主權(quán)項】
1. 白術(shù)內(nèi)酯III在制備增強免疫功能的藥物中的應(yīng)用。2. 白術(shù)內(nèi)酯III在制備增強淋巴細胞免疫功能的藥物中的應(yīng)用。3. 白術(shù)內(nèi)酯III在制備增強脾臟淋巴細胞免疫功能的藥物中的應(yīng)用。4. 白術(shù)內(nèi)酯III在制備治療免疫缺陷疾病的藥物中的應(yīng)用。5. 白術(shù)內(nèi)酯III在制備促進淋巴細胞增殖的藥物中的應(yīng)用。6. 白術(shù)內(nèi)酯III在制備促進脾臟淋巴細胞增殖的藥物中的應(yīng)用。7. 白術(shù)內(nèi)酯III在制備促進免疫相關(guān)分子的分泌的藥物中的應(yīng)用。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述免疫相關(guān)分子包括白細胞介素-2和白 細胞介素-12。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述免疫相關(guān)分子包括γ -干擾素。10. 白術(shù)內(nèi)酯III在制備增強免疫功能保健品中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K31/365GK105919994SQ201610389997
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月2日
【發(fā)明人】萬紹貴, 劉永真, 鮑登克, 劉紅亮
【申請人】河南大學