以西洋參莖葉為原料提取分離出的天然活性成分及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了以西洋參莖葉為原料提取分離出的天然活性成分及其應(yīng)用，通過如下步驟制備：步驟S1，收割新鮮西洋參莖葉，陰干；步驟S2，陰干的西洋參莖葉烘干，粉碎過20～30目篩，得莖葉細(xì)粉；步驟S3，將莖葉細(xì)粉用70～90％乙醇熱回流提取2～3次，每次1～2小時，收集濾液；步驟S4，濾液減壓濃縮至無醇味，用AB?8型大孔樹脂富集，先用10～20％乙醇洗脫6～10個柱體積，再用70～80％乙醇洗脫12～16個柱體積，收集70～80％乙醇洗脫液；步驟S5，70～80％乙醇洗脫液減壓濃縮，噴霧干燥，得西洋參莖葉提取物。本發(fā)明提取物具有較好活性，可用于制備藥品、功能食品或保健品；本發(fā)明提取物的制備原料為被遺棄的西洋參莖葉，是對植物加工廢棄物的充分利用，產(chǎn)業(yè)價值高，具有突出的實質(zhì)性特點和顯著的進(jìn)步。
【專利說明】
從西洋參莖葉為原料提取分離出的天然活性成分及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于植物提取物領(lǐng)域，設(shè)及天然活性成分的提取分離與應(yīng)用，具體設(shè)及W 西洋參莖葉為原料提取分離出的天然活性成分及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 西洋參莖葉是一種公認(rèn)的珍貴藥材，有其根部所不具備的藥用價值，但W往由于 提取設(shè)備與方法的局限一直沒有得到有效開發(fā)。
[0003] W山東省文登市的西洋參種植產(chǎn)業(yè)為例，藥農(nóng)在種植西洋參的過程中，只研究如 何增加西洋參的產(chǎn)量，卻忽視了對西洋參莖葉的開發(fā)利用。據(jù)測定，西洋參葉子中的皂武和 多糖等有效成分的含量高達(dá)10% W上，是西洋參根中含量的2倍。如果在西洋參生長的3~5 年的周期里，把莖葉中的有效成分全部提煉出來，就相當(dāng)于運(yùn)一株西洋參根中藥效成分的 含量。也就是說，在種植西洋參的過程中，因為沒有開發(fā)利用西洋參莖葉，而把生產(chǎn)出來的 藥效成分丟掉了一半。運(yùn)是一種極大的資源浪費(fèi)。
[0004] 因此，西洋參莖葉的提取分離方法研究W及提取分離出的天然產(chǎn)物的用途研究迫 在眉睫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的第一目的在于提供一種W西洋參莖葉為原料 提取分離出的提取物，該提取物中含有多種天然活性成分；
[0006] 本發(fā)明的第二目的在于提供上述提取物在制備藥品、功能食品或保健品方面的應(yīng) 用。
[0007] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得W實現(xiàn)的：
[000引一種W西洋參莖葉為原料提取分離出的提取物，通過如下步驟制備而成：
[0009] 步驟S1，收割新鮮的西洋參莖葉，陰干；
[0010] 步驟S2,將已收割回來陰干的西洋參莖葉烘干，粉碎過20~30目篩，得莖葉細(xì)粉； [00川步驟S3,將莖葉細(xì)粉用70~90%乙醇熱回流提取2~3次，每次1~2小時，過濾收集 濾液；
[0012] 步驟S4,濾液減壓濃縮至無醇味，用AB-8型大孔吸附樹脂純化富集，先用10~20% 的乙醇洗脫6~10個柱體積，再用70~80 %乙醇洗脫12~16個柱體積，收集70~80 %乙醇洗 脫液；
[0013] 步驟S5，70~80 %乙醇洗脫液減壓濃縮，噴霧干燥，得干粉狀的西洋參莖葉提取 物。
[0014] 進(jìn)一步地，步驟S2中烘干的溫度為40~60°C。
[0015] 進(jìn)一步地，步驟S3中莖葉細(xì)粉用80%乙醇熱回流提取3次，每次2小時，過濾收集濾 液。
[0016] 進(jìn)一步地，步驟S4先用15%的乙醇洗脫8個柱體積，再用75%乙醇洗脫14個柱體 積，收集75%乙醇洗脫液。
[0017] 為了充分利用西洋參莖葉提取物，本發(fā)明提供了上述W西洋參莖葉為原料提取分 離出的提取物在制備增強(qiáng)機(jī)體免疫力的藥品、功能食品或保健品方面的應(yīng)用。
[0018] 為了充分利用西洋參莖葉提取物，本發(fā)明提供了上述W西洋參莖葉為原料提取分 離出的提取物在制備增強(qiáng)機(jī)體抗疲勞缺氧的藥品、功能食品或保健品方面的應(yīng)用。
[0019] 為了充分利用西洋參莖葉提取物，本發(fā)明提供了上述W西洋參莖葉為原料提取分 離出的提取物在制備降血糖的藥品、功能食品或保健品方面的應(yīng)用。
[0020] 為了充分利用西洋參莖葉提取物，本發(fā)明提供了上述W西洋參莖葉為原料提取分 離出的提取物在制備降血壓的藥品、功能食品或保健品方面的應(yīng)用。
[0021] 為了充分利用西洋參莖葉提取物，本發(fā)明提供了上述W西洋參莖葉為原料提取分 離出的提取物在制備降血脂的藥品、功能食品或保健品方面的應(yīng)用。
[0022] 為了充分利用西洋參莖葉提取物，本發(fā)明提供了上述的W西洋參莖葉為原料提取 分離出的提取物在制備抗腫瘤的藥品、功能食品或保健品方面的應(yīng)用。
[0023] 本發(fā)明的優(yōu)點：
[0024] (1)本發(fā)明提供的W西洋參莖葉為原料提取分離出的提取物經(jīng)過充分的工藝優(yōu) 化，具有較好的增強(qiáng)機(jī)體免疫力、增強(qiáng)機(jī)體抗疲勞缺氧能力、降血糖、降血壓、降血脂和抗腫 瘤功能，可W用于制備具有上述功能的藥品、功能食品或保健品；
[0025] (2)本發(fā)明提取物的制備原料為被遺棄的西洋參莖葉，是對植物加工廢棄物的充 分利用，產(chǎn)業(yè)價值高，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有突出的實質(zhì)性特點和顯著的進(jìn)步。
【具體實施方式】
[0026] 下面結(jié)合實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不W此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可W對 本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。
[0027] 實施例1:西洋參莖葉提取物的制備 [00%]本實施例提取物通過如下步驟制備而成：
[0029] 步驟S1，收割新鮮的西洋參莖葉，陰干；
[0030] 步驟S2,將已收割回來陰干的西洋參莖葉50°C烘干，粉碎過20目篩，得莖葉細(xì)粉；
[0031] 步驟S3,將莖葉細(xì)粉用80%乙醇熱回流提取3次，每次2小時，過濾收集濾液；
[0032] 步驟S4,濾液減壓濃縮至無醇味，用AB-8型大孔吸附樹脂純化富集，先用15%的乙 醇洗脫8個柱體積，再用75 %乙醇洗脫14個柱體積，收集75 %乙醇洗脫液；
[0033] 步驟S5,75%乙醇洗脫液減壓濃縮，噴霧干燥，得干粉狀的西洋參莖葉提取物。
[0034] 實施例2:西洋參莖葉提取物的制備
[0035] 本實施例提取物通過如下步驟制備而成：
[0036] 步驟S1，收割新鮮的西洋參莖葉，陰干；
[0037] 步驟S2,將已收割回來陰干的西洋參莖葉50°C烘干，粉碎過20目篩，得莖葉細(xì)粉；
[0038] 步驟S3,將莖葉細(xì)粉用80%乙醇熱回流提取3次，每次2小時，過濾收集濾液；
[0039] 步驟S4,濾液減壓濃縮至無醇味，用AB-8型大孔吸附樹脂純化富集，先用10%的乙 醇洗脫8個柱體積，再用75 %乙醇洗脫14個柱體積，收集75 %乙醇洗脫液；
[0040] 步驟S5,75%乙醇洗脫液減壓濃縮，噴霧干燥，得干粉狀的西洋參莖葉提取物。
[0041] 實施例3:西洋參莖葉提取物的制備
[0042] 本實施例提取物通過如下步驟制備而成：
[0043] 步驟S1，收割新鮮的西洋參莖葉，陰干；
[0044] 步驟S2,將已收割回來陰干的西洋參莖葉50°C烘干，粉碎過20目篩，得莖葉細(xì)粉；
[0045] 步驟S3,將莖葉細(xì)粉用80%乙醇熱回流提取3次，每次2小時，過濾收集濾液；
[0046] 步驟S4,濾液減壓濃縮至無醇味，用AB-8型大孔吸附樹脂純化富集，先用20%的乙 醇洗脫8個柱體積，再用75 %乙醇洗脫14個柱體積，收集75 %乙醇洗脫液；
[0047] 步驟S5,75%乙醇洗脫液減壓濃縮，噴霧干燥，得干粉狀的西洋參莖葉提取物。
[004引實施例4:對比實施例，步驟S4先用8%的乙醇洗脫8個柱體積
[0049] 本實施例提取物通過如下步驟制備而成：
[0050] 步驟S1，收割新鮮的西洋參莖葉，陰干；
[0051] 步驟S2,將已收割回來陰干的西洋參莖葉50°C烘干，粉碎過20目篩，得莖葉細(xì)粉；
[0052] 步驟S3,將莖葉細(xì)粉用80%乙醇熱回流提取3次，每次2小時，過濾收集濾液；
[0053] 步驟S4,濾液減壓濃縮至無醇味，用AB-8型大孔吸附樹脂純化富集，先用8%的乙 醇洗脫8個柱體積，再用75 %乙醇洗脫14個柱體積，收集75 %乙醇洗脫液；
[0054] 步驟S5,75%乙醇洗脫液減壓濃縮，噴霧干燥，得干粉狀的西洋參莖葉提取物。
[0055] 實施例5:對比實施例，步驟S4先用22 %的乙醇洗脫8個柱體積
[0056] 本實施例提取物通過如下步驟制備而成：
[0057] 步驟S1，收割新鮮的西洋參莖葉，陰干；
[005引步驟S2,將已收割回來陰干的西洋參莖葉50°C烘干，粉碎過20目篩，得莖葉細(xì)粉；
[0059] 步驟S3,將莖葉細(xì)粉用80%乙醇熱回流提取3次，每次2小時，過濾收集濾液；
[0060] 步驟S4,濾液減壓濃縮至無醇味，用AB-8型大孔吸附樹脂純化富集，先用22%的乙 醇洗脫8個柱體積，再用75 %乙醇洗脫14個柱體積，收集75 %乙醇洗脫液；
[0061] 步驟S5,75%乙醇洗脫液減壓濃縮，噴霧干燥，得干粉狀的西洋參莖葉提取物。
[0062] 實施例6:效果實施例(增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用）
[0063] 1、材料與方法
[0064] 1.1 動物
[0065] 純系BALB/C小鼠，由遵義醫(yī)學(xué)院病生教研室傳代繁殖。鼠齡2~3月，體重20~24邑。
[0066] 1.2試劑與樣品
[0067] 分別按實施例1~5方法制備提取物1~5。氨化可的松(揚(yáng)州制藥廠）。
[006引1.3儀器
[0069] 一次性使用無菌注射器(揚(yáng)州市長城醫(yī)療器械廠），巧光顯微鏡(X71，日本化YPUS 公司），紫外分光光度計(美國化pendorf公司）。
[0070] 1.4小鼠分組及模型制備
[0071 ] 取小鼠70只，雌雄不拘，隨機(jī)分為7組，每組10只，隨機(jī)將7組動物定為分別為正常 對照組、模型對照組、提取物1~5組。模型對照組、提取物1~5組采用每天每只肌注氨化可 的松(5mg/100ml )0.2ml的方法復(fù)制免疫力低下模型；同時，提取物1~5組每天灌胃給藥提 取物1~5,每只0.2g/kg，其余組則分別給同體積的生理鹽水，每天1次，連續(xù)Iwk，末次給藥 后化，將小鼠稱重處死，摘取肝、胸腺及脾臟稱重，計算器官系數(shù)(mg/lOOg)。
[0072] 1.5統(tǒng)計學(xué)方法
[0073] 用SPSS18.0版統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗，WP<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué) 意義。
[0074] 2、實驗結(jié)果
[0075] 2.1對免疫功能低下模型小鼠免疫器官系數(shù)(器官重量/體重)的影響
[0076] 模型組動物的肝、胸腺系數(shù)、脾系數(shù)均明顯低于正常對照組，說明模型復(fù)制成功(P <0.05);與模型對照組比較，提取物1~3組肝、脾和胸腺的重量明顯增加(P<0.01);與模 型對照組比較，提取物4、5組肝、脾和胸腺的重量無明顯增加(P>0.05)。結(jié)果見表1。
[0077] 表1對免疫功能低下模型小鼠免疫器官系數(shù)(器官重量/體重)的影響 [007引
[0079] 上述試驗結(jié)果表明，本發(fā)明提供的提取物可W增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，運(yùn)與AB-8型大 孔吸附樹脂純化富集方法有關(guān)。
[0080] 實施例7:效果實施例(增強(qiáng)機(jī)體抗疲勞缺氧能力的作用）
[0081 ]本實施例使用游泳實驗和常壓耐缺氧實驗制備疲勞缺氧小鼠模型，觀察藥物改善 小鼠的無負(fù)重游泳時間和常壓耐缺氧時間等方面的抗疲勞缺氧作用。
[0082] 1、材料與方法
[0083] 1.1 動物
[0084] 封閉群昆明種小鼠，方，8周齡，體質(zhì)量18~22g，購自沈陽醫(yī)學(xué)院動物實驗中屯、。動 物飼養(yǎng)在溫度(22±irC、相對濕度55%~65%、1化光照周期的通風(fēng)干燥環(huán)境中，采用大小 鼠維持料1022飼養(yǎng)。
[0085] 1.2試劑與樣品
[0086] 分別按實施例1~5方法制備提取物1~5。
[0087] 1.3 儀器
[0088] 選用規(guī)格為60cm X 30cm X 50cm恒溫玻璃缸作游泳槽，用于測定無負(fù)重游泳時間， 用250ml密閉容器測定常壓耐缺氧時間。
[0089] 1.4小鼠分組及疲勞模型制備
[0090] 測定清潔級昆明種小鼠60只，按體重隨機(jī)分為6組，即模型對照組、提取物1~5組， 每組10只；提取物1~5組每天灌胃給藥提取物1~5,每只0.2g/kg，其余組則分別給同體積 的生理鹽水，每天1次，連續(xù)灌胃3天，于實驗的第4天行常溫?zé)o負(fù)重力竭游泳。于實驗的第4 天早別寸，將每組小鼠分別投入40cm水溫為（25±2)°C的水槽中行無負(fù)重力竭游泳實驗，游 泳過程用專人不斷輕輕攬動水面，使之不停運(yùn)動。當(dāng)小鼠沉沒水中超過10s，拱出后不能完 成反正翻射時預(yù)示體力已處于耗竭狀態(tài)，故可記錄小鼠從入水到疲勞時所需時間。
[0091] 1.5常壓耐缺氧時間的測定
[0092] 提取物1~5組每天灌胃給藥提取物1~5,每只0.2g/kg，其余組則分別給同體積的 生理鹽水，每天1次，連續(xù)灌胃3天，于實驗的第4天，將每組小鼠分別置于預(yù)先加有l(wèi)Og鋼石 灰的250ml密閉容器中，瓶口用凡±林涂封，W死亡為指標(biāo)，用秒表記錄存活時間。
[0093] 1.6統(tǒng)計學(xué)方法
[0094] 實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，應(yīng)用SPSS12.0版統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差 分析和t檢驗，WP<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0095] 2、實驗結(jié)果
[0096] 2.1對疲勞模型小鼠抗疲勞能力的影響
[0097] 與模型對照組比較，提取物1~3組小鼠實驗后，游泳時間均延長，差異均有統(tǒng)計學(xué) 意義(P<0.05);與模型對照組比較，提取物4、5組游泳時間無顯著變化，抗疲勞能力無明顯 增強(qiáng)。結(jié)果見表2。
[0098] 2.2對缺氧模型小鼠耐缺氧能力的影響
[0099] 與模型對照組比較，提取物1~3組小鼠實驗后，缺氧時間均延長，差異均有統(tǒng)計學(xué) 意義(P<0.05);與模型對照組比較，提取物4、5組缺氧時間無顯著變化，小鼠的耐缺氧能力 無顯著增強(qiáng)。結(jié)果見表2。
[0100] 表2對疲勞模型小鼠游泳時間和缺氧模型小鼠缺氧時間的影響
[0101]
[0102] 上述試驗結(jié)果表明，本發(fā)明提供的提取物具有抗疲勞抗缺氧作用，運(yùn)與AB-8型大 孔吸附樹脂純化富集方法有關(guān)。
[0103] 實施例8:效果實施例(降血糖、降血壓和降血脂作用）
[0104] 1、材料與方法 [01化]1.1試驗儀器
[0106] Thermo6500二氧化碳培養(yǎng)箱，Eos化avow全自動生化分析儀，金凈JJ-CJ-2F潔凈工 作臺，BioTe陸LX800酶標(biāo)儀，ZEISSAxiovert40C化倒置顯微鏡。
[0107] 1.2材料與試劑
[010引分別按實施例1~5方法制備提取物1~5。人肝癌胚胎瘤細(xì)胞化pG2購自中國典型 培養(yǎng)物保藏中屯、。特級胎牛血清，RPMI1640培養(yǎng)基，Gibco公司。葡萄糖酶法測定試劑盒，購 自南京建成生物工程研究所。膜蛋白酶，購自Sigma公司。人注射用膜島素，購自萬邦生化醫(yī) 藥公司。清潔級昆明種小鼠，體質(zhì)量18~22g，第Ξ軍醫(yī)大學(xué)動物室提供。
[0109] 1.3細(xì)胞降糖試驗
[0110] 將消化并稀釋好的化pG2細(xì)胞加入到96孔板中，待細(xì)胞鋪滿率達(dá)80%，換掉原培養(yǎng) 基，用PBS緩沖液清洗1次，將96孔板隨機(jī)分組，分別為正常對照組和提取物1~5組(5mg · L -1)。每組每孔加入25化1含藥或不含藥的培養(yǎng)液。24h后利用葡萄糖酶法測定試劑盒于全自 動生化分析儀中利用終點法，在505nm波長下檢測培養(yǎng)液中葡萄糖剩余量。
[0111] 1.4動物降血糖實驗
[0112] 清潔級昆明種小鼠，體質(zhì)量18~22g，購自第Ξ軍醫(yī)大學(xué)動物室。小鼠平衡飼養(yǎng)3d 后，饑餓12h，然后尾部靜脈注射四氧喀晚（70mg · kg-i)D3d后，檢測血糖。取血糖為10~ 25mmol/L的小鼠作為高血糖模型小鼠，按照血糖分為8組，每組10只。分別為正常對照組、模 型對照組、陽性對照組（胃鹽酸脈，lOOmg · kg^)和提取物1~5組（lOOmg · kg^)。高糖模型 對照組灌胃蒸饋水，灌胃藥物7d，饑餓12h，測定空腹血糖值。
[0113] 1.5統(tǒng)計方法
[0114] 用SPSS19.0做顯著性檢驗。
[0115] 2、實驗結(jié)果
[0116] 2.1對化pG2降糖實驗的影響
[0117] 與正常對照組比，提取物1~3組對葡萄糖消耗量明顯增加(P<0.01);與正常對照 組比，提取物4、5組對葡萄糖的消耗量無明顯增加(P>0.05)，無明顯的降糖作用。結(jié)果見表 3。
[011引2.2對糖尿病模型小鼠血糖的影響
[0119] 小鼠給予四氧喀晚后，可W觀察到小鼠血糖增加。與正常對照組比較，模型對照組 小鼠血糖升高(P<〇.01);與模型對照組比較，提取物1~3組和陽性藥對照組血糖顯著降低 (P<0.01);與模型對照組比較，提取物4、5組血糖無明顯降低(P>0.05)。試驗結(jié)果見表3。
[0120] 表3對化pG2葡萄糖消耗量及糖尿病小鼠血糖的影響
[0121]
[0122]上述結(jié)果表明，本發(fā)明提供的提取物具有明顯的降血糖作用，降血糖效果與AB-8 型大孔吸附樹脂純化富集方法有關(guān)。試驗表明，本發(fā)明提供的提取物還具有降血壓、降血脂 作用，也與AB-8型大孔吸附樹脂純化富集方法有關(guān)。
[0123] 因此，本發(fā)明提取物可W用于高"的治療和預(yù)防。
[0124] 實施例9:效果實施例(抗腫瘤作用）
[0125] 1、材料與方法
[0126] 人廝靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞系由湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院婦產(chǎn)科取得新鮮新生兒 廝帶，采用酶消化法分離人廝靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞化UVECs)，傳代培養(yǎng)，冊VECs 2~4代用于 實驗。
[0127] 1.2試劑與樣品
[0128] 分別按實施例1~5方法制備提取物1~5。酸性成纖維細(xì)胞生長因子、血管內(nèi)皮生 長因子、MTT:Sigma公司；肝素、胸巧：Sigma公司；胎牛血清（FBS)、M199:Gibco公司；DMEM/ F12培養(yǎng)基：Invitrogen生命技術(shù)有限公司；0.25%膜蛋白酶：1]1￥；[1：1'0旨日]1生命技術(shù)有限公 司；EDTA:美國AMRESC0公司；二甲基亞諷(Dimethyl sulfoxide，DMS0):美國SIGMA公司；青 鏈霉素混合液:美國AMRESC0公司；鏈霉素:上海先鋒藥業(yè)公司。
[0129] 1.3 儀器
[0130] 10mm圓形細(xì)胞培養(yǎng)皿及T-25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶:康寧生命科學(xué)有限公司；6孔、12孔、 24孔及96孔細(xì)胞培養(yǎng)板:北京賽因坦科技有限公司；15ml、50ml離屯、管、槍頭、細(xì)胞計數(shù)板、 蓋玻片:康寧生命科學(xué)有限公司；酶聯(lián)免疫測定儀:芬蘭化ermo Labsystems公司；倒置光學(xué) 顯微鏡及拍照系統(tǒng)：日本Olympus Coloration Transwell小室、1.5ml EP管、2ml凍存管： Coster公司；37°C恒溫5%C〇2細(xì)胞培養(yǎng)箱：美國化ermo Fisher公司；超凈工作臺：上海博迅 實業(yè)公司；常溫臺式離屯、機(jī):Beckman Coulter商貿(mào)有限公司；-4°C、-20°C恒溫冰箱：西口子 股份公司；電熱恒溫水浴箱:北京中西遠(yuǎn)大公司純水機(jī):瑞iMillipore公司；電子天平：上 海天平儀器技術(shù)有限公司；液氮存儲罐:美國化ermo Scientific公司；蛋白電泳及轉(zhuǎn)移設(shè) 備:美國Bio-Rad公司；移液器:美國化ermo Electron公司。
[0131] 1.4實驗分組
[0132] ①對照組(control組）：用無血清、無生長因子的M199基礎(chǔ)培養(yǎng)液。
[0133] ②VEGF組(模型組）：在M199培養(yǎng)基中加入VEGF(20ng/ml)。
[0134] ③提取物1組:在VEGF組基礎(chǔ)上加入提取物1 (15化g/ml)。
[01巧]④提取物2組:在VEGF組基礎(chǔ)上加入提取物2( 15化g/ml)。
[0136] ⑤提取物3組:在VEGF組基礎(chǔ)上加入提取物3(15化g/ml)。
[0137] ⑥提取物4組:在VEGF組基礎(chǔ)上加入提取物4( 15化g/ml)
[0138] ⑦提取物5組:在VEGF組基礎(chǔ)上加入提取物5 (15化g/ml)
[0139] 1.5MTT 法檢測 HUVECs 增殖
[0140] 1.5.1所需試劑及其配制
[0141] ① PBS緩沖液:化C1 8.0g、KCl 0.2g、Na2HP〇4 · 12出0 2.89g、KH2P〇4〇.226g、雙蒸水 800ml，定容至1000ml。調(diào)整pH值至7.4，4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0142] ②MTT溶液：電子天平稱取lOOmg MTT，加入20mlPBS溶液中攬拌溶解，即達(dá)到目的 濃度5mg/ml;待MTT完全溶解后，經(jīng)0.22WI1硝化纖維素濾膜過濾除菌，最后放置在錫錐紙包 裹的避光環(huán)境中于4°C冰箱內(nèi)保存(2周內(nèi)有效）。
[0143] ③無水二甲基亞諷(DMSO)。
[0144] 1.5.2操作步驟
[0145] ①取對數(shù)生長期冊VECs，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為IX 105個/ml后接種到96孔板上，每孔 10化1，細(xì)胞貼壁后所有細(xì)胞換液為未添加 aFGF的5 %FBSM199基礎(chǔ)培養(yǎng)液，放置于37°C，5% C〇2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2天后按分組實驗進(jìn)行實驗。
[0146] ②除control組外，其余各實驗組均加入VEGF(20ng/ml)，提取物1~5組在加入 VEGF基礎(chǔ)上再加入提取物1~5(15化g/ml)，同時設(shè)置調(diào)零組(全為培養(yǎng)液不含細(xì)胞），每組 設(shè)5個復(fù)孔。
[0147] ③37 °C，5 % C〇2恒溫箱培養(yǎng)24小時后，每孔加入5mg/mlMTT10yl，繼續(xù)培養(yǎng)地。
[014引④棄上清，每孔加入DMS0 10化1，搖床混勻15min。
[0149] ⑤在酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測儀上490nm處測定各孔光吸收值(0D值），記錄各組所 得0D值結(jié)果。
[0150] 1.6統(tǒng)計學(xué)處理
[0151] 文中數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差差（x±s)表示。兩組間數(shù)據(jù)的差異統(tǒng)計分析用 S化dent ' S t檢驗或AN0VA進(jìn)行比較分析，SPSS17.0軟件計算P值，WP<0.05為差異具有統(tǒng)計 學(xué)意義。
[0152] 2、實驗結(jié)果
[0153] 2.1對VEGF誘導(dǎo)的HUVECs增殖的影響
[0154] 加入VEGF解育2地后，VEGF明顯促進(jìn)冊VECs的增殖，VEGF組0D值較control組相比 明顯增高(p<0.01)。提取物1~3明顯抑制皿VECs增殖，與VEGF組比均有顯著差異(P<0.01)。 提取物4、5無明顯抑制作用，與VEGF組比無顯著差異(P>0.05)。
[01W]具體試驗結(jié)果見表4。
[0156] 表4提取物對VEGF誘導(dǎo)的HUVECs增殖的影響
[0157]
[0158] 通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖可W抑制腫瘤血管生成，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。提 取物1~3均可W顯著抑制VEGF誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，提取物4、5不能明顯抑制VEGF誘 導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。上述試驗表明，本發(fā)明提供的提取物可W抑制腫瘤血管生成進(jìn)而 發(fā)揮抗腫瘤作用，運(yùn)種作用可能與AB-8型大孔吸附樹脂純化富集方法有關(guān)。
[0159] 在對實施例1~3制備的提取物進(jìn)行進(jìn)一步分離純化過程中，發(fā)現(xiàn)了一種結(jié)構(gòu)新穎 的Ξ祗類化合物A。藥理作用研究表明，該化合物A單體的藥理活性(增強(qiáng)機(jī)體免疫力、增強(qiáng) 機(jī)體抗疲勞缺氧能力、降血糖、降血壓、降血脂和抗腫瘤)為提取物(提取物組所含化合物A 與單體組化合物A的作用濃度和劑量相等)藥理活性的80~90%。運(yùn)表明，該Ξ祗類化合物A 是本發(fā)明提取物的主要藥效物質(zhì)。該Ξ祗類化合物A的結(jié)構(gòu)式如下：
[0160]
[0161] 分離純化步驟：（a)實施例1~3任一方法制備的提取物用正相硅膠分離，依次用體 積比為120:1、60:1、30:1和15:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到4個組分；（b)步驟(a)中組 分3用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為40:1、30:1和10:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫 得到3個組分；（C)步驟(b)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度 為85 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集14~18個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物 A。
[0162] 結(jié)構(gòu)確證:冊斗51-18顯示[1+山+為111八453.3675，結(jié)合核磁特征可得分子式為 C3化802，不飽和度為8。核磁共振氨譜數(shù)據(jù)δκ(卵m，CDC13，600MHz):H-1 (1.62，dd，J= 12.4， 8.9Hz)，H-l(2.11，dd，J=12.4,3.6Hz)，H-2(5.82，ddd J=10.9,8.9,3.6Hz)，H-3(5.68，d， J = 10.9Hz)，H-5(0.77，d，J=11.2Hz)，H-6(1.48，m)，H-6(1.63，m)，H-7(1.68，m)，H-7 (1.87，m)，H-9(l.89，d，J= 10.5Hz)，H-11 (4.27，d，J= 10.5Hz)，H-15巧.43，d，J= 10.3Hz)， H-16(5.52，d，J=10.3Hz)，H-18(2.46，d，J = 8.4Hz)，H-19(1.41，m)，H-20(1.10，m)，H-21 (1.28，m)，H-21(1.48，m)，H-22(1.36，m)，H-22(1.51，m)，H-23(1.02，s)，H-24(0.82，s)，H- 25a.l9，s)，H-26(1.22，s)，H-27(1.36，s)，H-28(0.87，s)，H-29(0.85，d J = 6.3Hz)，H-30 (0.93，(1^ = 6.1化），11-016(3.18,3)，12-0化4.69,3);核磁共振碳譜數(shù)據(jù)6。（卵111，〔0(：13， 125MHz):40.2(C此，1-C)，122.6(CH，2-C)，138.3(CH，3-C)，36.8(C，4-C)，55.2(CH，5-C)， 19.7(CH2,6-C)，38.9(CH2,7-C)，50.7(C，8-C)，46.8(CH，9-C)，35.7(C，10-C)，76.2(CH，11- C)，143.3(C，12-C)，121.2(C，13-C)，37.4(C，14-C)，131.6(CH，15-C)，143.1(CH，16-C)， 41.3(C，17-C)，48.0(CH，18-C)，39.9(CH，19-C)，40.5(CH，20-C)，30.8(Ol2,21-C)，38.8 (C 此，22-C)，26.6(CH3,23-C)，15.7(Ol3,24-C)，13.7(CH3,25-C)，19.7(ai3,26-C)，14.3 (CH3，27-C)，19.3 (CH3，28-C)，17.2 ( CH3，29-C)，20.4 (CH3，30-C)，51.7 (CH3，11 -OMe)。紅外波 譜表明該化合物含有雙鍵（1663cm-i)和偕二甲基（1380cm-i)基團(tuán)。Uc-NMR、DEPT和服QC譜中 顯示有31個碳信號，包括九個甲基（一個甲氧基），五個亞甲基，十個次甲基（一個連氧碳和 四個締控碳），W及屯個季碳，W上功能結(jié)構(gòu)再結(jié)合不飽和數(shù)表明該化合物為五環(huán)Ξ祗結(jié) 構(gòu)。1h-M1R譜結(jié)合HSQC譜顯示的六個單峰甲基質(zhì)子信號δκ 1.02(3H，s)，0.82(3H，s)，1.19 (3H，s)，1.22(3H，s)，1.36(3H，s)和0.87(3H，s)和兩個雙峰甲基質(zhì)子信號δH0.85(3H，d，J = 6.3Hz)，0.93(3H，d，J = 6.1Hz)W及l(fā)H-NMR數(shù)據(jù)表明該化合物為烏蘇燒型Ξ祗類化合物。 在該烏蘇燒型化合物中，還存在一個甲氧基，并且C-2與C-3、C-12與C-13、C-15與C-16形成 雙鍵結(jié)構(gòu)。HMBC譜中H-9和H-18與C-12，H-18和Me-27與C-13W及12-OH與C-12相關(guān)信號W及 它們的碳化學(xué)位移表明該化合物存在締醇式結(jié)構(gòu)，徑基連接在C-12位與C-12和C-13形成的 雙鍵構(gòu)成締醇式結(jié)構(gòu)。此外，HMB村普中11-OMe與C-11的相關(guān)信號W及碳化學(xué)位移表明C-11 位連有一個甲氧基。N犯SY譜中H-11、Me-25和Me-26之間的交叉峰表明H-11為β構(gòu)型。綜合氨 譜、碳譜、ΗΜΒ幻普和NOESY譜，W及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如下所 示，立體構(gòu)型進(jìn)一步通過ECD試驗確定，理論值與實驗值基本一致。
[0163] Ξ祗類化合物A的碳原子編號如下式所示：
[0164]
[0165] 上述實施例的作用在于說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不W此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可W對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和保護(hù)范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種以西洋參莖葉為原料提取分離出的提取物，其特征在于，通過如下步驟制備而 成： 步驟Sl，收割新鮮的西洋參莖葉，陰干； 步驟S2,將已收割回來陰干的西洋參莖葉烘干，粉碎過20~30目篩，得莖葉細(xì)粉； 步驟S3,將莖葉細(xì)粉用70~90%乙醇熱回流提取2~3次，每次1~2小時，過濾收集濾 液； 步驟S4,濾液減壓濃縮至無醇味，用AB-8型大孔吸附樹脂純化富集，先用10~20%的乙 醇洗脫6~10個柱體積，再用70~80%乙醇洗脫12~16個柱體積，收集70~80 %乙醇洗脫 液； 步驟S5，70~80 %乙醇洗脫液減壓濃縮，噴霧干燥，得干粉狀的西洋參莖葉提取物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以西洋參莖葉為原料提取分離出的提取物，其特征在于:步驟 S2中烘干的溫度為40~60°C。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以西洋參莖葉為原料提取分離出的提取物，其特征在于:步驟 S3中莖葉細(xì)粉用80 %乙醇熱回流提取3次，每次2小時，過濾收集濾液。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以西洋參莖葉為原料提取分離出的提取物，其特征在于:步驟 S4先用15 %的乙醇洗脫8個柱體積，再用75 %乙醇洗脫14個柱體積，收集75 %乙醇洗脫液。5. 權(quán)利要求1~4任一所述的以西洋參莖葉為原料提取分離出的提取物在制備增強(qiáng)機(jī) 體免疫力的藥品、功能食品或保健品方面的應(yīng)用。6. 權(quán)利要求1~4任一所述的以西洋參莖葉為原料提取分離出的提取物在制備增強(qiáng)機(jī) 體抗疲勞缺氧的藥品、功能食品或保健品方面的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求1~4任一所述的以西洋參莖葉為原料提取分離出的提取物在制備降血糖 的藥品、功能食品或保健品方面的應(yīng)用。8. 權(quán)利要求1~4任一所述的以西洋參莖葉為原料提取分離出的提取物在制備降血壓 的藥品、功能食品或保健品方面的應(yīng)用。9. 權(quán)利要求1~4任一所述的以西洋參莖葉為原料提取分離出的提取物在制備降血脂 的藥品、功能食品或保健品方面的應(yīng)用。10. 權(quán)利要求1~4任一所述的以西洋參莖葉為原料提取分離出的提取物在制備抗腫瘤 的藥品、功能食品或保健品方面的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P37/04GK105920064SQ201610265810
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月26日
【發(fā)明人】姜軍亭
【申請人】威海品禾生物科技有限公司