抗肌醇代謝藥在構(gòu)建神經(jīng)管畸形小鼠模型中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種獲得神經(jīng)管畸形(NTDs)小鼠模型的方法，在孕鼠胚胎發(fā)育至開(kāi)始形成神經(jīng)管時(shí)，將抗肌醇代謝藥物施加給孕鼠，從而構(gòu)建神經(jīng)管畸形小鼠模型。該小鼠模型可用于神經(jīng)管畸形的醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究，有助于了解人類NTDs的病因及發(fā)病機(jī)制，為進(jìn)一步研究肌醇代謝障礙在NTDs發(fā)生中的作用機(jī)制提供模型。并且，本發(fā)明方法神經(jīng)管畸形率高、吸收胎少、對(duì)胚胎致死率低，并且對(duì)孕鼠毒副作用小。
【專利說(shuō)明】
抗肌醇代謝藥在構(gòu)建神經(jīng)管崎形小鼠模型中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種構(gòu)建神經(jīng)管崎形小鼠模型的方法，尤其設(shè)及一種抗肌醇代謝藥物 的應(yīng)用，W及使用該藥物構(gòu)建神經(jīng)管崎形小鼠模型的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 神經(jīng)管崎形(Neural化be Defects,NTOs)是指在胚胎發(fā)育早期，由于遺傳傾向和 環(huán)境因素的影響，神經(jīng)管閉合不全而引起的一組出生缺陷，主要表型包括無(wú)腦兒、脊柱裂及 腦或腦脊膜膨出等，是胎兒和新生兒中最常見(jiàn)、最嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)先天崎形，全世界范 圍內(nèi)發(fā)病率為〇.〇5%-〇.2%"NTDs危害極大，如無(wú)腦兒，腦膨出和煩脊柱裂的胎兒常常死產(chǎn) 或出生后很快死亡;而脊柱裂患兒雖然可W存活，但會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損，設(shè)及感覺(jué)缺失、 無(wú)能力行走、尿失禁及腦積水等癥狀，嚴(yán)重影響患兒的生理發(fā)育和生活質(zhì)量，也給患者家庭 帶來(lái)稱重的經(jīng)濟(jì)與精神負(fù)擔(dān)。
[0003] 因此，建立合適的動(dòng)物模型有助于了解人類NTDs的病因及發(fā)病機(jī)制，并且對(duì)于孕 前合理的預(yù)防干預(yù)減少NT化的發(fā)生具有重要的意義。
[0004] 除葉酸外，圍孕期肌醇（inositol)缺乏與NTDs發(fā)生密切相關(guān)，目前通過(guò)限制食物 攝入肌醇直接建立肌醇缺乏的NTOs動(dòng)物模型尚未見(jiàn)成功報(bào)道，雖然Greene等在小鼠懷孕期 間進(jìn)行低肌醇飲食喂養(yǎng)已發(fā)現(xiàn)肌醇缺乏可導(dǎo)致死胎死產(chǎn)、發(fā)育遲緩及胚胎體重減輕等現(xiàn)象 產(chǎn)生，但是并未出現(xiàn)NTDs及其它出生缺陷等表型，運(yùn)是因?yàn)閯?dòng)物體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)狀況及肌醇飲食 較難控制，短時(shí)間肌醇不足，動(dòng)物可通過(guò)自身代償機(jī)制，提高體內(nèi)肌醇合成來(lái)滿足機(jī)體的需 要。而利用基因敲除構(gòu)建動(dòng)物模型，目前設(shè)及到的有關(guān)基因已有200多種，但運(yùn)些利用基因 工程技術(shù)構(gòu)建的NTDs模型有破壞基因組結(jié)構(gòu)的傾向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種獲得神經(jīng)管崎形小鼠模型的方法，該小鼠模型可用于神經(jīng)管崎 形的醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究，有助于了解人類NTDs的病因及發(fā)病機(jī)制。
[0006] 本發(fā)明第一個(gè)方面是提供一種獲得神經(jīng)管崎形小鼠模型的方法，包括:提供孕鼠， 在胚胎發(fā)育至開(kāi)始形成神經(jīng)管時(shí)，對(duì)孕鼠施加抗肌醇代謝藥物。
[0007] 本發(fā)明第二個(gè)方面是提供一種抗肌醇代謝藥物在構(gòu)建神經(jīng)管崎形小鼠模型中的 應(yīng)用，更優(yōu)選為在制備構(gòu)建神經(jīng)管崎形小鼠模型試劑中的應(yīng)用，包括：
[000引在孕鼠胚胎發(fā)育至開(kāi)始形成神經(jīng)管時(shí)，將抗肌醇代謝藥物施加給孕鼠。
[0009]其中，所述抗肌醇代謝藥物優(yōu)選為裡鹽，優(yōu)選為能夠在小鼠體內(nèi)解離出Li +的裡 鹽，更優(yōu)選為包括但不限于碳酸裡、尿酸裡、構(gòu)緣酸裡、醋酸裡、漠化裡中的任意一種或幾 種，并優(yōu)選為碳酸裡。
[0010] 其中，所述孕鼠選自C57BL/6 J小鼠。
[0011] 其中，所述施加可W優(yōu)選為注射，更優(yōu)選為腹腔注射。
[0012] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施例中，在胚胎發(fā)育7.5天時(shí)將抗肌醇代謝藥物施加給孕 贏D
[0013] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施例中，抗肌醇代謝藥物的給藥劑量選自300-370mg/kg孕 鼠體重，更優(yōu)選為320-350mg/kg孕鼠體重，更優(yōu)選為330-350mg/kg孕鼠體重。
[0014] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述小鼠選自7-8周齡成年小鼠。
[0015] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述小鼠選自SPF級(jí)小鼠。
[0016] 在本發(fā)明上下文內(nèi)容中，沒(méi)有特別說(shuō)明的情況下，所述胚胎發(fā)育計(jì)算時(shí)間為:發(fā)現(xiàn) 陰栓的第二天早晨8:00定義為孕0.5天，即胚胎發(fā)育0.5天。
[0017]在本發(fā)明上下文內(nèi)容中，沒(méi)有特別說(shuō)明的情況下，劑量mg/kg或mg/kg體重均指的 是mg/kg孕鼠體重。
[0018] 本發(fā)明建立了肌醇代謝障礙NTOs出生缺陷小鼠模型，為進(jìn)一步研究肌醇代謝障礙 在NTOs發(fā)生中的作用機(jī)制提供模型。并且，本發(fā)明方法神經(jīng)管崎形率高、吸收胎少、對(duì)胚胎 致死率低，并且對(duì)孕鼠毒副作用小。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例中血清肌醇代謝檢測(cè)結(jié)果；
[0020] 圖2為L(zhǎng)i2〇)3引起的正常和發(fā)育異常胚胎；
[0021] 圖3為L(zhǎng)i2〇)3引起的正常和發(fā)育異常胚胎肥染色結(jié)果；圖3A為正常和NTOs小鼠胚胎 端腦的病理結(jié)果；圖3B為正常和NTOs小鼠胚胎后腦的病理結(jié)果;a和b分別為胚胎形態(tài)；
[0022] 圖4為L(zhǎng)i2〇)3引起的神經(jīng)管崎形照片，其中圖4A和4B為正常胚胎側(cè)面和背面神經(jīng)管 照片，4C和4D為NTDs胚胎正面和側(cè)面神經(jīng)管照片。
【具體實(shí)施方式】 [002；3] 實(shí)施例1
[0024] 實(shí)驗(yàn)材料；
[0025] 7-8周齡SPF級(jí)成年巧7BL/6J小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后，將雌鼠與雄鼠按1:1或2:1的比例 合籠過(guò)夜。
[0026] 第二天清晨檢查雌鼠陰道口有無(wú)陰栓，存在陰栓表示有過(guò)交配行為，將發(fā)現(xiàn)陰栓 的第二天早晨8:00定為孕0.5天巧0.5天），然后孕鼠分籠飼養(yǎng)，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)處理組和對(duì)照 組。
[0027] 在孕7.5天化7.5天)時(shí)，給予實(shí)驗(yàn)組雌鼠不同劑量（l〇〇mg/kg-400mg/kg)的Li2C〇3 腹腔注射，正常對(duì)照組雌鼠給予等體積的生理鹽水。
[00%]懷孕13.5化13.5天)天時(shí)，對(duì)孕鼠進(jìn)行摘眼球采血;采血后的小鼠 W頸椎脫白法處 死，腹部向上置于手術(shù)臺(tái)上，75%酒精消毒。沿腹中線剖腹取出妊娠子宮，將子宮成串取下 置于盛有預(yù)冷PBS的培養(yǎng)皿中，體視顯微鏡下小屯、取出胚胎，并仔細(xì)觀察每窩胚胎，記錄活 胎數(shù)、死胎數(shù)、吸收胎數(shù)、崎形胎數(shù)，觀察體視顯微鏡下可見(jiàn)的崎形情況。
[0029] 一、Li2〇3 劑量實(shí)驗(yàn)
[0030] 在100mg/kg-400mg/kg區(qū)間進(jìn)行劑量條件實(shí)驗(yàn)。表1，表2反映了交配后E7.5天腹腔 注射不同劑量Li2C〇3,在E13.5天取材時(shí)觀察到的胚胎發(fā)育情況。
[0031] 表1結(jié)果顯示Li2C〇3劑量在250mg/kg、300mg/kg和400mg/kg均出現(xiàn)崎形胚胎，崎形 表型包括無(wú)眼崎形和NTDs，其中300mg/kg劑量的崎形比率最高為12.1%DLi2C〇3劑量在 250mg/kg和300mg/kg體重小鼠的存活率差異不大，分別為69.6%和63.6%，而在400mg/kg 劑量的小鼠存活率有上升的趨勢(shì)，因此最佳建模劑量應(yīng)在250mg/kg和400mg/kg之間。
[0032] 表1，Li2〇)3劑量對(duì)構(gòu)建NTOs模型的影響(括號(hào)內(nèi)為百分比）
[0033]
[0034] ~表1中，*表示無(wú)眼崎形，#表示神經(jīng)管崎形(NTOs) ' '
[0035] 表2,建立小鼠模型最佳劑量(括號(hào)內(nèi)為百分比）
[0036]
[0037] 表2中，*表示眼部崎形;#表示唇裂;§表示發(fā)育遲緩;&表示顏面崎形
[003 引表 2 結(jié)果顯示 Li2C03 劑量在 250mg/kg、300mg/kg、330mg/kg 和 350mg/kg 體重時(shí)，隨著 藥物劑量增加，胚胎崎形率的比率出現(xiàn)增高的趨勢(shì)，350mg/kg體重組崎形率的比率明顯增 高，達(dá)到了50 %。然而，Li2C03劑量在370mg/kg和400mg/kg體重時(shí)，崎形率的比率卻出現(xiàn)下降 趨勢(shì)。350111旨/1^體重組^化的發(fā)生率最高，達(dá)到了26.7%，其他崎形的發(fā)生率也高于其他實(shí) 驗(yàn)組，且無(wú)死胎。
[0039] 選擇Li2〇)3 350mg/kg體重劑量作為造模劑量，并進(jìn)行了重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果如表3所 示，各批次之間差異不顯著(P〉〇.05)。說(shuō)明此劑量的重復(fù)性好。
[0040] 表3，Li2〇)3 350mg/kg體重劑量誘導(dǎo)NTD重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(括號(hào)內(nèi)為百分比）
[0041]
[0042] 表3中，*表示眼部崎形;#表示唇裂;§表示發(fā)育遲緩;&表示顏面崎形
[0043] 另外，孕鼠未發(fā)現(xiàn)毒副作用導(dǎo)致死亡。
[0044] 實(shí)施例2
[0045] 參照實(shí)施例1，CD-1孕鼠在孕8天巧8天)時(shí)，注射Li2〇)3，300mg/kg體重劑量W下，未 發(fā)現(xiàn)對(duì)孕鼠的明顯毒副作用，給藥劑量350mg/kg體重時(shí)，孕鼠出現(xiàn)毒副作用導(dǎo)致死亡率 13.3%，如表4所示。
[0046] 表4，不同劑量Li2C〇3對(duì)CD-1孕鼠毒副作用
[0047]
[0化0] 表5也證明了裡鹽能夠用于構(gòu)建神經(jīng)管崎形模型，但是相比于實(shí)施例1中的巧7BL/ 6J小鼠，CD-1小鼠神經(jīng)管崎形發(fā)生率明顯更低一些，而且吸收胎比例相對(duì)較高。另外，裡鹽 對(duì)CD-1孕鼠毒副作用更強(qiáng)。
[0051 ] 二、小鼠模型鑒定
[0052] 為了確定Li2〇)3抑制IMPase活性后肌醇的代謝水平，本研究應(yīng)用GC-MS技術(shù)檢測(cè)了 實(shí)施例1中E7.5天母鼠在腹腔注射Li2C化350mg/kg體重劑量之后，不同時(shí)間點(diǎn)母鼠血清中 肌醇含量的改變。即檢測(cè)母鼠血清在注射Li2〇)3后0(注射Li2〇)3前）、4、8、1化時(shí)肌醇的水 平，結(jié)果如圖1顯示:肌醇水平在4-化后降到最低，僅為正常血清的1/2,之后開(kāi)始恢復(fù)，但在 注射Li2〇)3 1化后，肌醇水平仍低于正常水平。
[0053] 體視顯微鏡下觀察小鼠胚胎外部發(fā)育情況，結(jié)果如圖2顯示。E13.5天正常小鼠胚 胎（圖2A為正常胚胎脊柱、B為正常胚胎側(cè)面)外觀較為飽滿圓滑，頭部前、中、后腦室均已形 成，脊柱表面完整無(wú)裂口，神經(jīng)管閉合完全，可見(jiàn)明顯的耳泡、眼泡，尾部彎曲細(xì)長(zhǎng)。此外，正 ?；钆咛ピ阽R下可W觀察到屯、臟搏動(dòng)。崎形胚胎均有不同程度的發(fā)育遲緩，表現(xiàn)為身長(zhǎng)比 正常胚胎短，體重比正常胚胎低，發(fā)育遲滯，僅相當(dāng)于E12.5左右的發(fā)育狀態(tài)。NTOs崎形胚胎 中，露腦(前腦和全腦)崎形（圖2C為神經(jīng)管未閉合前腦崎形、D為神經(jīng)管未閉合全腦崎形）的 發(fā)生率最高，可見(jiàn)少數(shù)NTOs表現(xiàn)為脊柱裂（圖沈?yàn)樯窠?jīng)管未閉合脊柱崎形）；除了 NTOs外，還 觀察到無(wú)眼崎形（圖2F)、顏面部(煩面部)崎形（圖2G)和發(fā)育遲緩（圖2H)。
[0054] Li2〇)3引起胚胎神經(jīng)管發(fā)育異常的病理改變結(jié)果見(jiàn)圖3。低倍鏡(40X)下，正常對(duì) 照組小鼠神經(jīng)管發(fā)育良好，管腔形狀規(guī)則，神經(jīng)上皮的內(nèi)、外界膜平整，神經(jīng)管均閉合，已經(jīng) 分化為明顯的端腦、中腦和后腦，且神經(jīng)管周圍的間充質(zhì)細(xì)胞分布均勻密集(圖3A中a-1、圖 3B中a-1)。露腦崎形小鼠胚胎端腦雖然已經(jīng)分化發(fā)育，但是端腦神經(jīng)管完全沒(méi)有閉合，神經(jīng) 腔面不平整，管壁薄厚不一致，各腦室形狀不規(guī)則，同時(shí)中腦神經(jīng)管也未閉合(圖3A中b-1); 正常胚胎后腦室為規(guī)則菱形，而露腦崎形胚胎的后腦頂板未融合，呈"一字"腔室形狀，僅被 一層羊膜和間質(zhì)所包裹(圖3B中b-1)。
[00對(duì)在100 X和200 X放大倍數(shù)下，正常神經(jīng)管的神經(jīng)上皮細(xì)胞和間質(zhì)層細(xì)胞排列整齊 緊密，且神經(jīng)上皮室管膜邊緣整齊，未見(jiàn)有脫落的細(xì)胞（圖3A和3B中的a-2、a-3)。而NTDs神 經(jīng)上皮細(xì)胞和間質(zhì)層細(xì)胞排列素亂，細(xì)胞核小，神經(jīng)上皮室管膜邊緣不整齊，可見(jiàn)有脫落的 細(xì)胞，并且存在多處血管破裂，血細(xì)胞外滲進(jìn)入中胚層結(jié)構(gòu)，運(yùn)種病理變化在端腦表現(xiàn)的尤 為顯著，且端腦神經(jīng)管未閉合程度更嚴(yán)重（圖3A和3B中的b-2、b-3)。病理結(jié)果顯示，肌醇缺 乏可能影響神經(jīng)管Closed或前后腦神經(jīng)孔融合更嚴(yán)重，導(dǎo)致崎形表型多為露腦崎形。
[0056] 為了進(jìn)一步驗(yàn)證，采用體式顯微鏡觀察胚胎發(fā)育第9.5天時(shí)神經(jīng)管發(fā)育狀態(tài)，結(jié)果 如圖4所示。相比于正常胚胎（圖4A和B)，NTOs胚胎神經(jīng)管發(fā)育明顯出現(xiàn)崎形（圖4C和D)。
[0057] 綜上所述，本發(fā)明構(gòu)建神經(jīng)管崎形小鼠模型的方法，能夠獲得理想的小鼠模型，崎 形率高、重復(fù)性好，對(duì)孕鼠毒副作用小，對(duì)胚胎致死率低。
[0058] W上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限 制于W上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和 替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和 修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種獲得神經(jīng)管畸形小鼠模型的方法，其特征在于，包括： 提供孕鼠，在胚胎發(fā)育至開(kāi)始形成神經(jīng)管時(shí)，對(duì)孕鼠施加抗肌醇代謝藥物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在孕鼠胚胎發(fā)育至開(kāi)始形成神經(jīng)管時(shí)，將 抗肌醇代謝藥物施加給孕鼠。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在胚胎發(fā)育7.5天時(shí)將抗肌醇代謝藥物施 加給孕鼠。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述孕鼠選自C57BL/6 J小鼠。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗肌醇代謝藥物為能夠在小鼠體內(nèi)解 離出Li+的鋰鹽。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述鋰鹽為碳酸鋰。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述施加為腹腔注射。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于， 抗肌醇代謝藥物的給藥劑量選自300-370mg/kg孕鼠體重。9. 一種抗肌醇代謝藥物在構(gòu)建神經(jīng)管畸形小鼠模型中的應(yīng)用，其特征在于，包括:在孕 鼠胚胎發(fā)育至開(kāi)始形成神經(jīng)管時(shí)，將抗肌醇代謝藥物施加給孕鼠。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述鋰鹽為碳酸鋰，并且在胚胎發(fā)育7.5 天時(shí)施加給C57BL/6J小鼠；抗肌醇代謝藥物的給藥劑量選自300-370mg/kg孕鼠體重。
【文檔編號(hào)】A61K45/06GK105920605SQ201610407640
【公開(kāi)日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年6月12日
【發(fā)明人】王建華, 郭金, 石英飛, 王芳, 劉賽, 官臻, 王秀偉, 張?chǎng)? 牛勃, 安彥新
【申請(qǐng)人】王建華