一種脂質(zhì)體載藥方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種脂質(zhì)體載藥的方法。操作步驟是：a、制備包封環(huán)糊精的空白脂質(zhì)體，所述包封環(huán)糊精的空白脂質(zhì)體是指沒有包封待包封藥物但包封有環(huán)糊精的脂質(zhì)體，包封環(huán)糊精的量按質(zhì)量比為環(huán)糊精：脂質(zhì)體膜材料﹦1：5～15；b、去除游離環(huán)糊精；c、待包封藥物與包封環(huán)糊精的空白脂質(zhì)體共同孵育，即得到載藥脂質(zhì)體。本發(fā)明的方法除具備離子梯度法所有優(yōu)勢(shì)外，還具有適用范圍廣，不受藥物解離或絡(luò)合性質(zhì)限制；穩(wěn)定性高，溶液pH為中性，利于維持磷脂等易水解成分的穩(wěn)定性；環(huán)糊精為多糖化合物，有利于維護(hù)實(shí)現(xiàn)凍干過程磷脂膜的完整性。
【專利說明】
_種脂質(zhì)體載藥方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是一種新的脂質(zhì)體主動(dòng)載藥方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂質(zhì)體是由磷脂雙分子層形成的閉合囊泡。脂質(zhì)體根據(jù)其結(jié)構(gòu)的不同分為單層脂質(zhì)體(unilame 1 lar vesicles)、多層脂質(zhì)體(multilame 1 lar vesicles)和多囊脂質(zhì)體 (multivesicular liposomes)。脂質(zhì)體由英國(guó)人Alec D.Bangham在1960年代初首先發(fā)現(xiàn)。 此后，人們發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體作為物質(zhì)載體，尤其是藥物載體，有著巨大的應(yīng)用價(jià)值，隨即對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行了大規(guī)模的系統(tǒng)研究。
[0003] 經(jīng)過了六十余年探索，科研人員已經(jīng)發(fā)展了許多很有價(jià)值的脂質(zhì)體制備方法。目前，脂質(zhì)體制備方法主要基于磷脂分散技術(shù)(dispers1n technique)，可歸納為以下三大類:(1)基于溶劑或共溶劑(cosolvent)分散技術(shù)例如，薄膜分散法將磷脂溶于有機(jī)溶媒中， 之后在減壓除去溶媒形成干燥的磷脂膜，水化即可形成多層脂質(zhì)體，是最經(jīng)典、應(yīng)用最廣的方法。逆相蒸發(fā)法對(duì)水溶性藥物的包封率及載藥量相對(duì)較高；而復(fù)乳法能夠用于大規(guī)模制備微米級(jí)具有緩釋功能的多囊脂質(zhì)體。乙醇注入法簡(jiǎn)便、快速，且避免了毒性有機(jī)溶劑。(2) 基于表面活性劑分散技術(shù)如去污劑透析法，優(yōu)點(diǎn)是不使用有機(jī)溶劑，適于蛋白、肽類生物藥物，除了以靜電結(jié)合外，難以包封水溶性藥物。(3)基于機(jī)械分散技術(shù)這種技術(shù)主要是通過機(jī)械做功，以降低或控制脂質(zhì)體粒徑大小，例如超聲分散，擠出過膜分散，微射流沖擊等。
[0004] 以上脂質(zhì)體制備方法，對(duì)于多數(shù)藥物而言，包封率普遍較低。為了提高脂質(zhì)體包封率，研究人員發(fā)展了主動(dòng)載藥法。該方法是先制備空白脂質(zhì)體，再通過藥物擴(kuò)散透膜，將藥物捕獲于脂質(zhì)體內(nèi)部。目前，主動(dòng)載藥法主要為離子梯度法，即先制備載有離子(H+，0H+， Cu2+，Mn2+等)空白脂質(zhì)體，再除去未包封離子，形成內(nèi)外離子梯度，隨后與待包封藥物在高于膜相變溫度條件下孵育，藥物透過磷脂膜進(jìn)入脂質(zhì)體內(nèi)部，隨即與離子結(jié)合，形成離子化物或絡(luò)合物，從而無法透膜而被捕獲于脂質(zhì)體，實(shí)現(xiàn)載藥。這種方法能夠成功包封兩性藥物，例如，已經(jīng)上市的Doxil即為采用離子梯度法(S卩(NH4)2S04梯度法)將阿霉素幾近100%包入脂質(zhì)體。很明顯，離子梯度法適用范圍有限，僅適于部分可解離的兩性藥物或能夠與離子絡(luò)合的藥物，且不適于對(duì)酸、堿、金屬離子敏感的藥物；同時(shí)，脂質(zhì)體內(nèi)部偏高或偏低的pH 值，也容易引發(fā)性質(zhì)不穩(wěn)定的磷脂發(fā)生分解、變質(zhì)，甚至導(dǎo)致脂質(zhì)體解體。因此，對(duì)多數(shù)藥物而言，目前仍缺乏有效的載藥方法，無法發(fā)展為具有臨床使用價(jià)值的脂質(zhì)體制劑。本發(fā)明提供一種新的技術(shù)，能夠?qū)⒉煌愋退幬镉行У剌d入脂質(zhì)體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決部分藥物脂質(zhì)體包封率低問題，彌補(bǔ)離子主動(dòng)載藥法缺陷，本發(fā)明發(fā)展了一種新的脂質(zhì)體主動(dòng)載藥方法，稱為環(huán)糊精介導(dǎo)主動(dòng)載藥法(cyclodextrin-mediated remote loading, CRL)〇
[0006] 該方法依據(jù)原理是，將分子量較大、親水性強(qiáng)、磷脂膜通透性低的環(huán)糊精包封于脂質(zhì)體，隨后與待包封藥物在高于脂質(zhì)體相變溫度下孵育，藥物進(jìn)入脂質(zhì)體即與環(huán)糊精形成包合物，失去膜通透性而被包封于脂質(zhì)體。本發(fā)明包括以下步驟:a、制備包封環(huán)糊精的空白脂質(zhì)體;b、去除游離環(huán)糊精;c、待包封藥物與載環(huán)糊精脂質(zhì)體在適當(dāng)溫度下共同孵育，即得到載藥脂質(zhì)體。本工藝過程簡(jiǎn)單，容易實(shí)施。
[0007] 本發(fā)明一種脂質(zhì)體載藥方法操作步驟如下:
a、 制備包封環(huán)糊精的空白脂質(zhì)體，所述包封環(huán)糊精的空白脂質(zhì)體是指沒有包封待包封藥物但包封有環(huán)糊精的脂質(zhì)體，包封環(huán)糊精的量按質(zhì)量比為環(huán)糊精:脂質(zhì)體膜材料>1:100;
b、 去除游離環(huán)糊精；
C、待包封藥物與包封環(huán)糊精的空白脂質(zhì)體共同孵育，即得到載藥脂質(zhì)體。
[0008] 進(jìn)一步限定的技術(shù)條件如下:
步驟a中所述包封環(huán)糊精的空白脂質(zhì)體的制備方法為薄膜分散法或乙醇注入法或逆向蒸發(fā)法或乳化法或去污劑透析法。
[0009] 步驟a中所述環(huán)糊精為α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ -環(huán)糊精、聚乙二醇PEG化環(huán)糊精、糖基化環(huán)糊精。
[0010] 步驟a中所述空白脂質(zhì)體的材料為不同磷脂、不同磷脂混合或磷脂與膽固醇混合為膜材制備的脂質(zhì)體、司盤類制備的囊泡、GHONI表面活性劑制備的囊泡、磷脂酰膽堿(PC) 與膽固醇(cholesterol)制備的包封環(huán)糊精的中性脂質(zhì)體、環(huán)境條件敏感材料制備的敏感脂質(zhì)體。
[00?1 ]所述PC與膽固醇(cho 1 e stero 1)制備的包封環(huán)糊精的中性脂質(zhì)體為不同荷電狀態(tài)的單層中性脂質(zhì)體。
[0012] 步驟a所述包封環(huán)糊精的空白脂質(zhì)體的粒徑為20-1000納米。
[0013] 步驟b中所述去除游離環(huán)糊精的方法為離心法、柱層析法、透析法、超濾法。
[0014] 步驟c中所述待包封藥物為非解離藥物、化學(xué)藥物和小分子肽。
[0〇15]步驟c中的孵育溫度為高于脂質(zhì)體脂質(zhì)材料相變溫度3°C以上，孵育時(shí)間小于2 h。
[0016] 本發(fā)明的有益技術(shù)效果體現(xiàn)在:除具備離子梯度法所有優(yōu)勢(shì)外，還具有適用范圍廣，不受藥物解離或絡(luò)合性質(zhì)限制;穩(wěn)定性高，溶液pH為中性，利于維持磷脂等易水解成分的穩(wěn)定性;環(huán)糊精為多糖化合物，有利于維護(hù)實(shí)現(xiàn)凍干過程磷脂膜的完整性。
【附圖說明】
[0017] 圖1為本發(fā)明的CRL脂質(zhì)體主動(dòng)載藥原理示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地詳細(xì)說明。實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
[0〇19] 實(shí)施例1
以300 mM α-環(huán)糊精(α-⑶)為水相，以磷脂酰膽堿及磷脂酰絲氨酸(SPC/SPS = 10:1， mole rat1)為膜材，米用乳化-凍干法制備包封α-⑶脂質(zhì)體，尚心去除游尚(1-⑶，得到包封環(huán)糊精的空白脂質(zhì)體(環(huán)糊精:脂質(zhì)體膜材料=1:5,質(zhì)量比)；隨后加入黃芩素，藥物/磷脂 (1:20，w/w)，40 ° C孵育lh，完成主動(dòng)載藥；以電鏡觀察脂質(zhì)體為球形納米粒，DLS檢測(cè)平均粒徑為220納米，PDI = 0.36，ζ = -30 mV，HLPC檢測(cè)包封率分別為92%，95%，99%。(5?(:，豆磷脂酰膽堿;SPS，豆磷脂酰絲氨酸;DLS，動(dòng)態(tài)光散射；PDI，多分散指數(shù))。
[0020] 實(shí)施例2
CRL法制備載兩性藥物脂質(zhì)體
以 100 mM PEG2OO〇-hydroxypropyl-0-cyclodext;rin(PEG-HP-0-CD)為水相，以磷脂及膽固醇(DPPC/CHO = l:l，m〇le rat1)為膜材，采用逆向蒸發(fā)法法制備包封ΗΡ-β-CD脂質(zhì)體，柱層析去除游離PEG-HP-β-⑶，得到包封環(huán)糊精的空白脂質(zhì)體(環(huán)糊精:脂質(zhì)體膜材料= 1:10,質(zhì)量比)；隨后加入F〇late-PEG2000-DSPE(FPD)與拓?fù)涮婵?FPD/DPPC = 1:20，mole rat1，drug/DPPC = 1:20, w/w)，45 °C孵育lh，同時(shí)完成脂質(zhì)體表面葉酸修飾及主動(dòng)載藥；以電鏡觀察脂質(zhì)體為球形納米粒，DLS檢測(cè)平均粒徑為300納米，分布較均勻(PDI =
0.23)，ζ = -5mV，(高效液相)HLPC檢測(cè)包封率分別為87%。荷瘤小鼠靜脈注射脂質(zhì)體阿霉素，與對(duì)照組比較(給予同劑量無葉酸修飾脂質(zhì)體)，4 h后腫瘤部位藥物分布顯著增加，說明葉酸修飾脂質(zhì)體具有腫瘤靶向作用。(C Η 0，膽固醇；D P P C， dipalmitoylphosphatidylcholine)〇
[0021] 實(shí)施例3
CRL法制備載寡肽囊泡
以300 mM hydroxypropyl-0-cyclodext:rin(HP-0-CD)及5%鹿糖為水相，以司盤80 (SPAN80)及D0TAP(SPAN/D0TAP = 20:l，mole rat1)為膜材，采用薄膜分散-擠出法制備包封ΗΡ-β-CD荷正電囊泡，透析去除游離ΗΡ-β-CD，得到包封環(huán)糊精的空白脂質(zhì)體(環(huán)糊精:月旨質(zhì)體膜材料=1:15,質(zhì)量比)；隨后加入谷胱甘肽(Glutath1ne/SPAN = 1:30，w/w)，40 °C 孵育0.5 h，完成主動(dòng)載藥；以電鏡觀察脂質(zhì)體為球形納米粒，DLS檢測(cè)平均粒徑為200納米， 分布均勻(Ρ?Ι=0.23)，ζ = 35mV，HLPC檢測(cè)包封率分別為75%。進(jìn)一步將載藥囊泡凍干，凍干品4 °C保存6月，水化后恢復(fù)囊泡，粒徑、包封率無明顯變化。
[0022] (D0TAP,N-[1-(2,3-d1leoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium methy1-sulfate)〇
[0023] 實(shí)施例4
凍干脂質(zhì)體使用前以CRL載藥
以 100 mM PEG2OO〇-hydroxypropyl-0-cyclodext;rin(PEG-HP-0-CD)及5%鹿糖為水相， 以磷脂及膽固醇(DPPC/CH0 = l:l，mole rat1)為膜材，采用逆向蒸發(fā)法法制備包封ΗΡ-β-CD脂質(zhì)體，柱層析去除游離PEG-HP-13-CD，得到包封環(huán)糊精的空白脂質(zhì)體(環(huán)糊精:脂質(zhì)體膜材料=1:5,質(zhì)量比)；隨后凍干；凍干品4 °C保存6月，水化后恢復(fù)脂質(zhì)體，與拓?fù)涮婵?(drug/DPPC = 1:20, w/w)，45 °C孵育lh，完成主動(dòng)載藥；以電鏡觀察脂質(zhì)體為球形納米粒，DLS檢測(cè)平均粒徑為360納米，分布較均勻(PDI = 0.33)，ζ = -3mV，HLPC檢測(cè)包封率分別為83%。
[0024] 本發(fā)明所述CRL載藥法，是針對(duì)脂質(zhì)體對(duì)于多數(shù)藥物包封率較低及離子梯度法適用范圍窄等不足所建立的脂質(zhì)體主動(dòng)載藥新方法，能夠?qū)⒉煌愋退幬镉行лd入脂質(zhì)體， 是適用范圍廣、產(chǎn)品穩(wěn)定性的脂質(zhì)體技術(shù)平臺(tái)。
[0025] 以上所述僅為本發(fā)明的部分實(shí)施例，并不用以此限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種脂質(zhì)體載藥的方法，其特征在于操作步驟如下: a、 制備包封環(huán)糊精的空白脂質(zhì)體，所述包封環(huán)糊精的空白脂質(zhì)體是指沒有包封待包封 藥物但包封有環(huán)糊精的脂質(zhì)體，包封環(huán)糊精的量按質(zhì)量比為環(huán)糊精:脂質(zhì)體膜材料=1:0.1 ?10; b、 去除游離環(huán)糊精； C、待包封藥物與包封環(huán)糊精的空白脂質(zhì)體共同孵育，即得到載藥脂質(zhì)體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脂質(zhì)體載藥的方法，其特征在于:步驟a中所述包封環(huán)糊 精的空白脂質(zhì)體的制備方法為薄膜分散法或乙醇注入法或逆向蒸發(fā)法或乳化法或去污劑 透析法。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脂質(zhì)體載藥的方法，其特征在于:步驟a中所述環(huán)糊精為 α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ -環(huán)糊精、聚乙二醇PEG化環(huán)糊精、糖基化環(huán)糊精。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脂質(zhì)體載藥的方法，其特征在于:步驟a中所述空白脂質(zhì) 體的材料為不同磷脂、不同磷脂混合或磷脂與膽固醇混合為膜材制備的脂質(zhì)體、司盤類制 備的囊泡、GHONI表面活性劑制備的囊泡、磷脂酰膽堿(PC)與膽固醇(cholesterol)制備的 包封環(huán)糊精的中性脂質(zhì)體、環(huán)境條件敏感材料制備的敏感脂質(zhì)體。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種脂質(zhì)體載藥的方法，其特征在于:所述PC與膽固醇 (cholesterol)制備的包封環(huán)糊精的中性脂質(zhì)體為不同荷電狀態(tài)的單層中性脂質(zhì)體。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脂質(zhì)體載藥的方法，其特征在于:步驟a所述包封環(huán)糊精 的空白脂質(zhì)體的粒徑為20-1000納米。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脂質(zhì)體載藥的方法，其特征在于:步驟b中所述去除游離 環(huán)糊精的方法為離心法、柱層析法、透析法、超濾法。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脂質(zhì)體載藥的方法，其特征在于:步驟c中所述待包封藥 物為非解離藥物、化學(xué)藥物和小分子肽。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脂質(zhì)體載藥的方法，其特征在于:步驟c中的孵育溫度為 高于脂質(zhì)體脂質(zhì)材料相變溫度3°C以上，孵育時(shí)間小于2 h。
【文檔編號(hào)】A61K47/26GK105943502SQ201610420945
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年6月16日
【發(fā)明人】王汀, 王寧
【申請(qǐng)人】安徽醫(yī)科大學(xué)