用于治療哮喘腎氣虛證藥物、動(dòng)物模型及構(gòu)建使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于治療哮喘腎氣虛證藥物、動(dòng)物模型及構(gòu)建使用方法,用于治療哮喘腎氣虛證的藥物的中藥組分由熟地黃、山萸肉、山藥、澤瀉、苦參、天漿殼、牡丹皮、茯苓各12g、五味子5g、沉香片8g、旋覆花、黛蛤散、生黃芪各15g組成。本發(fā)明前期建立腎氣虛哮喘病證結(jié)合大鼠模型，并觀察到益腎喘寧湯聯(lián)合糖皮質(zhì)激素可通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來(lái)糾正Th1/Th2失衡；本發(fā)明以T細(xì)胞亞群的特異性轉(zhuǎn)錄因子、關(guān)鍵細(xì)胞因子和微小RNA為指標(biāo)，證明腎氣虛哮喘發(fā)病與Treg/Th平衡的內(nèi)在機(jī)制，揭示中藥復(fù)方治療哮喘可能存在的多靶點(diǎn)多層次的網(wǎng)絡(luò)式調(diào)控機(jī)制。
【專利說(shuō)明】
用于治療哮喘腎氣虛證藥物、動(dòng)物模型及構(gòu)建使用方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于治療哮喘腎氣虛證藥物、動(dòng)物模型 及構(gòu)建使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 支氣管哮喘（Bronchial asthma，簡(jiǎn)稱哮喘）是全球最常見(jiàn)的慢性疾病之一，在西 方國(guó)家約有高達(dá)10%的成人和30%的兒童受此影響。全世界目前約有3億哮喘患者，患病率 以每年1 %左右的速度遞增，嚴(yán)重影響患者的日常生活和工作，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù) 擔(dān)，因此對(duì)哮喘進(jìn)行深入研究成為當(dāng)今全球性的重要課題。
[0003] 支氣管哮喘作為一種異質(zhì)性疾病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣。近年來(lái)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg) 和輔助性T細(xì)胞17(Thl7)的發(fā)現(xiàn)，修正了傳統(tǒng)的Thl/Th2失衡引起哮喘免疫應(yīng)答的致病理 論，揭示Treg與Th之間復(fù)雜關(guān)系是探索哮喘發(fā)病機(jī)制和治療方法的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。鑒于糖 皮質(zhì)激素治療哮喘的有效性和安全性等問(wèn)題，探索中西醫(yī)聯(lián)合治療哮喘的方法有望獲得更 增效低毒的治療手段。
[0004] 支氣管哮喘發(fā)病中功能失調(diào)的T淋巴細(xì)胞亞群
[0005] 支氣管哮喘作為一種異質(zhì)性疾病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，目前認(rèn)為與外周免疫耐受 機(jī)制存在缺陷有關(guān)，T淋巴細(xì)胞在哮喘免疫應(yīng)答中發(fā)揮著核心作用。
[0006] 傳統(tǒng)理論認(rèn)為輔助性T淋巴細(xì)胞亞群(Th)功能失調(diào)，即Thl/Th2失衡一一Th2型優(yōu) 勢(shì)應(yīng)答，是支氣管哮喘病理過(guò)程形成的始動(dòng)因素和維持因素。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)Thl/Th2細(xì)胞失衡 機(jī)制并不能完全闡明哮喘的發(fā)生，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)和Thl7的發(fā)現(xiàn)修正了上述觀念，認(rèn)為 Treg與Thl7可能參與了哮喘的發(fā)病進(jìn)程。Thl7關(guān)鍵分泌因子IL-17在哮喘患者肺組織、痰 液、肺泡灌洗液和血清中均增高，且和氣道高反應(yīng)性呈正相關(guān)。過(guò)敏性哮喘患兒痰液Treg低 于正常兒童;⑶4+⑶25+Treg可以抑制哮喘模型動(dòng)物氣道嗜酸粒細(xì)胞的增多，減輕氣道炎癥。 Treg是機(jī)體對(duì)T細(xì)胞活化的一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，它既能影響Thl細(xì)胞，也能作用于Th2細(xì) 胞，還與Thl7細(xì)胞之間存在復(fù)雜的相互關(guān)系，揭示Treg和Th之間復(fù)雜關(guān)系是探索哮喘發(fā)病 機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，因此近年來(lái)成為研究的熱點(diǎn)。
[0007] 中醫(yī)對(duì)哮喘病認(rèn)識(shí)很早，《內(nèi)經(jīng)》中雖無(wú)哮病，但有"喘鳴"的記載，此與哮喘相似。 中醫(yī)學(xué)認(rèn)為："肺為氣之主，腎為氣之根"、"咳嗽在肺，其根在腎"，正是由于肺氣虛弱，衛(wèi)外 不固，或自身抵抗力下降，引發(fā)哮喘。臟腑虛損，精氣不足，迀延累及于腎。虛則肺不主氣，腎 不納氣，呼吸攝納無(wú)權(quán)而發(fā)喘息。所以，哮喘是正虛邪實(shí)、虛實(shí)夾雜的復(fù)雜病證。元代朱丹溪 首創(chuàng)"哮喘"病名，提出著名的"未發(fā)以扶正氣為主，既發(fā)以攻邪氣為急"的治療原則，一直被 后世作為治療哮喘的指導(dǎo)方針。根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)在七味都?xì)馔璧幕A(chǔ)上，運(yùn)用益腎喘寧 湯(熟地黃、山萸肉、山藥、澤瀉、苦參、天漿殼、牡丹皮、茯苓、五味子、沉香片、旋覆花、黛蛤 散、生黃芪），以補(bǔ)肺腎治本，兼以化痰、行氣、活血，配合西藥治療哮喘，取得較好療效，減少 了患者對(duì)激素等的使用，加強(qiáng)了對(duì)哮喘的療效，體現(xiàn)了中醫(yī)"審證求因，治病求本"的理論， 是有效治療哮喘的根本所在。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于治療哮喘腎氣虛證藥物、動(dòng)物模型及構(gòu)建使用方 法，旨在解決目前缺少中西醫(yī)聯(lián)合治療哮喘藥物，及驗(yàn)證該藥物在增效低毒的治療手段的 方法和使用方法的問(wèn)題。
[0009] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種用于治療哮喘腎氣虛證的藥物，所述用于治療哮喘腎 氣虛證的藥物的中藥組分由熟地黃、山萸肉、山藥、澤瀉、苦參、天漿殼、牡丹皮、茯苓各12g、 五味子5g、沉香片8g、旋覆花、黛蛤散、生黃苗各15g組成；西藥米用必可酮?dú)忪F劑，每撳50μ 區(qū)，200欺/瓶。
[0010]本發(fā)明另一目的在于提供一種用于驗(yàn)證用于治療哮喘腎氣虛證的藥物療效的哮 喘腎氣虛證動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，該哮喘腎氣虛證動(dòng)物模型的構(gòu)建方法為：清潔級(jí)雄性 Wistar大鼠540只，體重200~250g。動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組，哮喘模型對(duì)照組，腎氣虛哮 喘模型組，西藥組，中藥組，中西藥聯(lián)合組；
[0011]哮喘造模:除正常對(duì)照組外，各組大鼠采用卵清蛋白致敏法進(jìn)行哮喘造模；
[0012]腎氣虛造模:除正常對(duì)照組、B孝喘模型對(duì)照組外，各組大鼠復(fù)合腎氣虛證造模。
[0013] 進(jìn)一步，所述哮喘造模方法為：實(shí)驗(yàn)第1天，用含有卵清蛋白lmg、氫氧化鋁凝膠 IOmg及滅活百日咳桿菌疫苗5 X IO8個(gè)的混合液Iml注入腹腔內(nèi)，令其致敏。正常組以生理鹽 水腹腔內(nèi)注射，2周后備用；第15天開(kāi)始，將上述造模大鼠置于65cm X 45cm X 45cm大小的玻 璃罩內(nèi)，以1%的卵清蛋白超聲霧化吸入30min，激發(fā)哮喘，日1次，連續(xù)激發(fā)直至處死;正常 對(duì)照組用生理鹽水替代霧化吸入。
[0014] 進(jìn)一步，所述腎氣虛造模：除正常對(duì)照組、哮喘模型對(duì)照組外，各組大鼠復(fù)合腎氣 虛證造模，具體方法:①實(shí)驗(yàn)第1天開(kāi)始，每日上午于同一時(shí)間置一安靜房間進(jìn)行驚恐刺激， 每次lOmin，即放送有貓叫聲的磁帶，同時(shí)用梅花針叩擊大鼠20次/min，模擬貓抓拿攻擊大 鼠的情景，同時(shí)振動(dòng)鼠籠;②每日下午將動(dòng)物負(fù)重游泳:于大鼠尾根部纏繞重量為該大鼠體 重10%的保險(xiǎn)絲，放入水深50cm、水溫20°C的水槽中游泳，以力竭為度一一大鼠鼻尖沒(méi)入水 面10s。日1次，共14天，即激發(fā)前一天。
[0015] 本發(fā)明另一目的在于提供一種利用哮喘腎氣虛證動(dòng)物模型的構(gòu)建方法建立的動(dòng) 物模型。
[0016] 本發(fā)明另一目的在于提供一種利用哮喘腎氣虛證動(dòng)物模型的構(gòu)建方法建立的動(dòng) 物模型的使用方法，所述使用方法包括：
[0017] 給藥及處理:西藥組、中藥組和中西藥聯(lián)合組大鼠于實(shí)驗(yàn)第15天開(kāi)始給藥；日給藥 劑量為：西藥組給必可酮50yg/只；中藥組給中藥2.0g/kg;中西藥組給相應(yīng)中藥2.0g/kg、必 可酮50yg/;正常對(duì)照組、哮喘模型組、腎虛哮喘模型組給生理鹽水灌胃；各組大鼠分別干預(yù) 15天處理，稱體重，眼球取血;腎氣虛哮喘模型組進(jìn)行四診計(jì)量化指標(biāo)進(jìn)行氣虛程度評(píng)判；
[0018] 癥狀、體征觀察:觀察各組大鼠食量、皮毛、體重、活動(dòng)量、懸尾抵抗力、游泳時(shí)間、 雙肺表現(xiàn)；
[0019]血清檢測(cè):檢測(cè)甲狀腺素(T4)、皮質(zhì)醇(Cor)、睪酮⑴水平。
[0020] 病理學(xué)觀察:取部分肺組織行蘇木精--伊紅(HE)染色觀察。
[0021]支氣管肺泡灌洗液(BALF)檢測(cè)白細(xì)胞分類和計(jì)數(shù):并采用EL ISA法檢測(cè)MLF離心 后上清液中細(xì)胞因子11-4、幾-5、11^-6、幾-1〇、幾-13、幾-17、正^丫、了6?-0等的含量。
[0022]肺組織檢測(cè)：取出肺臟組織的1/3,采用逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測(cè)定法檢 測(cè)肺組織中T-bet、GATA-3、ROR γ t、Foxp3、IL-6、TGF-β等因子mRNA的表達(dá)水平；用免疫印跡 法(Western blot)檢測(cè)肺組織T-bet、GATA-3、ROR γ t、Foxp3、IL-6、TGF-β蛋白的表達(dá)水平。 取出另外肺組織的1/3，用于miRNA相關(guān)檢測(cè)；
[0023]脾組織檢測(cè)：分離脾臟中單個(gè)核細(xì)胞，固定，染FITC-CD4，然后破膜，分別加 Thl、 1112、11117和1'代8細(xì)胞的特異性抗體11^-4、正^丫、幾-174和?(《?3。孵育后重懸、上機(jī)檢測(cè)。
[0024] microRNA微陣列基因檢測(cè):大鼠處死，肺臟被迅速分離置于凍存管，直接放入液氮 中冷凍，短時(shí)間內(nèi)完成整個(gè)操作。用MirVana microRNAisoIation kit按照說(shuō)明書(shū)收集總 RNA。取適量RNA溶液，經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量測(cè)定RNA樣品0D260和0D280值，計(jì)算RNA濃度。 1 %瓊脂糖電泳觀察總RNA，取2_5yg用Microcon centrifugal filter微離心過(guò)濾柱過(guò)濾， 得到片段小于300個(gè)核苷酸的小RNA。應(yīng)用Poly(A)聚合酶將小RNA的3'端加上poly(A)尾巴， 再連接一個(gè)寡聚核苷酸標(biāo)記，用于后續(xù)的熒光標(biāo)記。完成yParafloTM microRNA微陣列基因 表達(dá)實(shí)驗(yàn)和分析:通過(guò)微循環(huán)栗雜交儀器在yParaf IoTM微流體芯片上過(guò)夜，使用含甲酸胺 SSPE緩沖液進(jìn)行雜交，漂洗甩干，用激光掃描儀采集雜交圖象，Array-Pro軟件對(duì)雜交圖像 進(jìn)行數(shù)字化轉(zhuǎn)換、數(shù)據(jù)處理和分析。計(jì)算兩組檢測(cè)到信號(hào)的比值和t檢驗(yàn)的p值，以p〈0.01定 義為信號(hào)有顯著差異性，分析差異表達(dá)的位點(diǎn)。大鼠微陣列芯片包括目前報(bào)道的所有454個(gè) microRNA，包含數(shù)據(jù)庫(kù)中所有的成熟microRNA和部分成熟microRNA的互補(bǔ)鏈;芯片上的檢 測(cè)探針均進(jìn)行9個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行2次。
[0025] 實(shí)時(shí)焚光定量PCR檢測(cè)：用MirVana microRNAisolation kit按照說(shuō)明書(shū)收集總 RNA，計(jì)算RNA濃度。特異逆轉(zhuǎn)錄引物從Taqman Mi croRNAAssays獲得，并用Taqman MicroRNAReverseTranscription Kit將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)焚光定量PCR檢測(cè)，反應(yīng) 結(jié)束后用ABI Prism7900軟件分析結(jié)果。PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次，用比較閾值循環(huán)方法分析數(shù)據(jù)， 得到Ct值，即熒光達(dá)到閾值所需的PCR循環(huán)數(shù)，并分析基因相對(duì)表達(dá)量。
[0026] 生物信息學(xué)預(yù)測(cè):應(yīng)用miRanda、TargetScan和PicTar 3個(gè)生物信息學(xué)祀基因預(yù)測(cè) 軟件，對(duì)microRNA芯片結(jié)果中挑選出來(lái)的microRNA的革El基因做出預(yù)測(cè)；
[0027]統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:根據(jù)資料的性質(zhì)、分布和設(shè)計(jì)特點(diǎn)，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn) 行分析。
[0028]進(jìn)一步，microRNA芯片的數(shù)據(jù)分析方法：
[0029] 使用GenePix Pro 6.0讀取芯片掃描圖像，并提取探針的信號(hào)值；
[0030] 相同的探針取中值合并，保留在所有樣品中均> = 30.0的探針，對(duì)全部芯片進(jìn)行中 值標(biāo)準(zhǔn)化，篩選差異表達(dá)探針；
[0031 ] 使用Fold change和P-value篩選兩組樣品間的差異表達(dá)miRNA;
[0032] 使用Fold change篩選兩個(gè)樣品間的差異表達(dá)miRNAs;
[0033] 最后，對(duì)差異表達(dá)miRNAs進(jìn)行聚類并繪制聚類圖。
[0034] 使用Fold change和P-value篩選兩組樣品間的差異表達(dá)miRNA中兩組樣品間有重 復(fù);使用Fold change篩選兩個(gè)樣品間的差異表達(dá)miRNAs中兩個(gè)樣品間沒(méi)有重復(fù)。
[0035] 本發(fā)明另一目的在于提供一種1111、1112、11117、1'代8測(cè)定方法，所述1111、1112、11117、 Treg測(cè)定方法為：
[0036] 采用流式細(xì)胞儀測(cè)定脾組織中的1111、1112、11117、1^叫的含量，對(duì)各用藥組1111/1112 和Thl7/Treg均值統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
[0037] 本發(fā)明前期建立腎氣虛哮喘病證結(jié)合大鼠模型，并觀察到益腎喘寧湯聯(lián)合糖皮質(zhì) 激素可通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來(lái)糾正Thl/Th2失衡，本發(fā)明在前期工作基礎(chǔ)上，以T細(xì)胞 亞群(1111、1112、11117、1>叩）的特異性轉(zhuǎn)錄因子、關(guān)鍵細(xì)胞因子和微小1?^為指標(biāo)，證明腎氣 虛哮喘發(fā)病與Treg/Th平衡的內(nèi)在機(jī)制，揭示中藥復(fù)方治療哮喘可能存在的多靶點(diǎn)多層次 的網(wǎng)絡(luò)式調(diào)控機(jī)制。
[0038] 本發(fā)明通過(guò)篩選、預(yù)測(cè)腎氣虛哮喘模型組與哮喘模型對(duì)照組肺部差異化表達(dá)miRs 和靶因子及其相互關(guān)系，揭示了分子水平上腎氣虛證本質(zhì)的部分科學(xué)內(nèi)涵。證明了證候的 宏觀表型與微觀生物分子之間的復(fù)雜關(guān)系。
[0039]目前尚未見(jiàn)在哮喘發(fā)病分析中對(duì)1111、1112、11117、1>叩進(jìn)行多角度通盤考慮。因此 本發(fā)明從Treg/Th失衡分析了哮喘發(fā)病機(jī)制。
[0040] 模型上:成功的哮喘動(dòng)物模型對(duì)哮喘病因及發(fā)病機(jī)理研究中有十分重要的意義。 在中醫(yī)理論指導(dǎo)下建立了接近臨床癥候的腎氣虛哮喘病證結(jié)合模型，比目前單純哮喘模型 更符合中醫(yī)理論，也更利于在腎氣虛哮喘模型上探索方證相對(duì)的益腎喘寧湯治療哮喘的機(jī) 理；
[0041] 探索方法上:microRNA廣泛參與祀mRNA的沉默調(diào)控，并且是多靶點(diǎn)多層次網(wǎng)絡(luò)式 調(diào)控，常在生長(zhǎng)發(fā)育和疾病過(guò)程中呈現(xiàn)時(shí)空式表達(dá)。適合對(duì)中醫(yī)證型的研究。本發(fā)明應(yīng)用 miR技術(shù)對(duì)腎氣虛證本質(zhì)的科學(xué)內(nèi)涵作一些有益的探索，為多種疾病的診斷和治療提供新 的思路。
【附圖說(shuō)明】
[0042] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的哮喘腎氣虛證動(dòng)物模型的構(gòu)建方法流程圖。
[0043]圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的大鼠肺組織HE染色結(jié)果正常組圖。
[0044] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的大鼠肺組織HE染色結(jié)果哮喘模型組圖。
[0045] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的大鼠肺組織HE染色結(jié)果腎氣虛哮喘模型組圖。
[0046] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的大鼠肺組織HE染色結(jié)果中西藥組圖。
[0047]圖6是本發(fā)明實(shí)施例提供的大鼠肺組織HE染色結(jié)果西藥組圖。
[0048]圖7是本發(fā)明實(shí)施例提供的大鼠肺組織HE染色結(jié)果中藥組圖。
【具體實(shí)施方式】
[0049] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明 進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0050] 下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。
[0051 ] 一種用于治療哮喘腎氣虛證的藥物，所述用于治療哮喘腎氣虛證的藥物的中藥組 分由熟地黃、山萸肉、山藥、澤瀉、苦參、天衆(zhòng)殼、牡丹皮、茯苳各12g、五味子5g、沉香片8g、旋 覆花、黛蛤散、生黃芪各15g組成;西藥采用必可酮?dú)忪F劑，每撳50yg，200撳/瓶。
[0052]本發(fā)明另一目的在于提供一種用于驗(yàn)證用于治療哮喘腎氣虛證的藥物療效的哮 喘腎氣虛證動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，如圖1所示，該哮喘腎氣虛證動(dòng)物模型的構(gòu)建方法為：
[0053] S101:清潔級(jí)雄性Wistar大鼠540只，體重200~250g，動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組， 哮喘模型對(duì)照組，腎氣虛哮喘模型組，西藥組，中藥組，中西藥聯(lián)合組；
[0054] S102:哮喘造模:除正常對(duì)照組外，各組大鼠采用卵清蛋白致敏法進(jìn)行哮喘造模；
[0055] S103:腎氣虛造模：除正常對(duì)照組、哮喘模型對(duì)照組外，各組大鼠復(fù)合腎氣虛證造 模。
[0056] 進(jìn)一步，所述哮喘造模方法為：實(shí)驗(yàn)第1天，用含有卵清蛋白lmg、氫氧化鋁凝膠 IOmg及滅活百日咳桿菌疫苗5 X IO8個(gè)的混合液Iml注入腹腔內(nèi)，令其致敏。正常組以生理鹽 水腹腔內(nèi)注射，2周后備用；第15天開(kāi)始，將上述造模大鼠置于65cm X 45cm X 45cm大小的玻 璃罩內(nèi)，以1%的卵清蛋白超聲霧化吸入30min，激發(fā)哮喘，日1次，連續(xù)激發(fā)直至處死;正常 對(duì)照組用生理鹽水替代霧化吸入。
[0057]進(jìn)一步，所述腎氣虛造模：除正常對(duì)照組、哮喘模型對(duì)照組外，各組大鼠復(fù)合腎氣 虛證造模，具體方法:①實(shí)驗(yàn)第1天開(kāi)始，每日上午于同一時(shí)間置一安靜房間進(jìn)行驚恐刺激， 每次lOmin，即放送有貓叫聲的磁帶，同時(shí)用梅花針叩擊大鼠20次/min，模擬貓抓拿攻擊大 鼠的情景，同時(shí)振動(dòng)鼠籠;②每日下午將動(dòng)物負(fù)重游泳:于大鼠尾根部纏繞重量為該大鼠體 重10%的保險(xiǎn)絲，放入水深50cm、水溫20°C的水槽中游泳，以力竭為度一一大鼠鼻尖沒(méi)入水 面10s。日1次，共14天，即激發(fā)前一天。
[0058]本發(fā)明另一目的在于提供一種利用哮喘腎氣虛證動(dòng)物模型的構(gòu)建方法建立的動(dòng) 物模型。
[0059]本發(fā)明另一目的在于提供一種利用哮喘腎氣虛證動(dòng)物模型的構(gòu)建方法建立的動(dòng) 物模型的使用方法，所述使用方法包括：
[0060] 給藥及處理:西藥組、中藥組和中西藥聯(lián)合組大鼠于實(shí)驗(yàn)第15天開(kāi)始給藥；日給藥 劑量為：西藥組給必可酮50yg/只；中藥組給中藥2.0g/kg;中西藥組給相應(yīng)中藥2.0g/kg、必 可酮50yg/;正常對(duì)照組、哮喘模型組、腎虛哮喘模型組給生理鹽水灌胃；各組大鼠分別干預(yù) 15天處理，稱體重，眼球取血;腎氣虛哮喘模型組進(jìn)行四診計(jì)量化指標(biāo)進(jìn)行氣虛程度評(píng)判；
[0061] 癥狀、體征觀察:觀察各組大鼠食量、皮毛、體重、活動(dòng)量、懸尾抵抗力、游泳時(shí)間、 雙肺表現(xiàn)；
[0062] 指標(biāo)檢測(cè)：四診計(jì)量化所觀察的指標(biāo)及氣虛判定：用電腦播放曠場(chǎng)錄像，記錄各個(gè) 動(dòng)物水平跨格數(shù)和前肢離地站立次數(shù)。用YLS-13A型大、小鼠抓力測(cè)定儀檢測(cè)抓力。氣虛程 度=各動(dòng)物水平移動(dòng)實(shí)測(cè)值/正常組均數(shù)X 〇. 3+各動(dòng)物直立次數(shù)/正常組均數(shù)X 0.2+各動(dòng) 物抓力實(shí)測(cè)值/正常組均數(shù)X 〇 . 5。辨證標(biāo)準(zhǔn)：與正常組比較，大于1.25為氣盛，小于0.75為 氣虛。
[0063] 血清檢測(cè):檢測(cè)甲狀腺素(T4)、皮質(zhì)醇(Cor)、睪酮(T)水平。
[0064]病理學(xué)觀察:取部分肺組織行蘇木精一伊紅(HE)染色觀察。
[0065]支氣管肺泡灌洗液(BALF)檢測(cè)白細(xì)胞分類和計(jì)數(shù):并采用EL ISA法檢測(cè)MLF離心 后上清液中細(xì)胞因子11-4、幾-5、11^-6、幾-1〇、幾-13、幾-17、正^丫、了6?-0等的含量。
[0066]肺組織檢測(cè)：取出肺臟組織的1/3,采用逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測(cè)定法檢 測(cè)肺組織中T-bet、GATA-3、ROR γ t、Foxp3、IL-6、TGF-β等因子mRNA的表達(dá)水平；用免疫印跡 法(Western blot)檢測(cè)肺組織T-bet、GATA-3、ROR γ t、Foxp3、IL-6、TGF-β蛋白的表達(dá)水平。 取出另外肺組織的1/3，用于miRNA相關(guān)檢測(cè)；
[0067]脾組織檢測(cè)：分離脾臟中單個(gè)核細(xì)胞，固定，染FITC-CD4，然后破膜，分別加 Thl、 1112、11117和1'代8細(xì)胞的特異性抗體11^-4、正^丫、幾-174和?(《?3。孵育后重懸、上機(jī)檢測(cè)。
[0068] microRNA微陣列基因檢測(cè):大鼠處死，肺臟被迅速分離置于凍存管，直接放入液氮 中冷凍，短時(shí)間內(nèi)完成整個(gè)操作。用MirVana microRNAisoIation kit按照說(shuō)明書(shū)收集總 RNA。取適量RNA溶液，經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量測(cè)定RNA樣品0D260和0D280值，計(jì)算RNA濃度。 1 %瓊脂糖電泳觀察總RNA，取2_5yg用Microcon centrifugal filter微離心過(guò)濾柱過(guò)濾， 得到片段小于300個(gè)核苷酸的小RNA。應(yīng)用Poly(A)聚合酶將小RNA的3'端加上poly(A)尾巴， 再連接一個(gè)寡聚核苷酸標(biāo)記，用于后續(xù)的熒光標(biāo)記。完成yParafloTM microRNA微陣列基因 表達(dá)實(shí)驗(yàn)和分析:通過(guò)微循環(huán)栗雜交儀器在yParaf IoTM微流體芯片上過(guò)夜，使用含甲酸胺 SSPE緩沖液進(jìn)行雜交，漂洗甩干，用激光掃描儀采集雜交圖象，Array-Pro軟件對(duì)雜交圖像 進(jìn)行數(shù)字化轉(zhuǎn)換、數(shù)據(jù)處理和分析。計(jì)算兩組檢測(cè)到信號(hào)的比值和t檢驗(yàn)的p值，以p〈0.01定 義為信號(hào)有顯著差異性，分析差異表達(dá)的位點(diǎn)。大鼠微陣列芯片包括目前報(bào)道的所有454個(gè) microRNA，包含數(shù)據(jù)庫(kù)中所有的成熟microRNA和部分成熟microRNA的互補(bǔ)鏈;芯片上的檢 測(cè)探針均進(jìn)行9個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行2次。
[0069] 實(shí)時(shí)焚光定量PCR檢測(cè)：用MirVana microRNAisolation kit按照說(shuō)明書(shū)收集總 RNA，計(jì)算RNA濃度。特異逆轉(zhuǎn)錄引物從Taqman Mi croRNAAssays獲得，并用Taqman MicroRNAReverseTranscription Kit將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)焚光定量PCR檢測(cè)，反應(yīng) 結(jié)束后用ABI Prism7900軟件分析結(jié)果。PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次，用比較閾值循環(huán)方法分析數(shù)據(jù)， 得到Ct值，即熒光達(dá)到閾值所需的PCR循環(huán)數(shù)，并分析基因相對(duì)表達(dá)量。
[0070] 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)：應(yīng)用miRanda、TargetScan和PicTar 3個(gè)生物信息學(xué)革E基因預(yù)測(cè) 軟件，對(duì)microRNA芯片結(jié)果中挑選出來(lái)的microRNA的革El基因做出預(yù)測(cè)；
[0071] 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:根據(jù)資料的性質(zhì)、分布和設(shè)計(jì)特點(diǎn)，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn) 行分析。
[0072] microRNA芯片的數(shù)據(jù)分析方法：
[0073]使用GenePix Pro 6.0讀取芯片掃描圖像，并提取探針的信號(hào)值；
[0074] 相同的探針取中值合并，保留在所有樣品中均> = 30.0的探針，對(duì)全部芯片進(jìn)行中 值標(biāo)準(zhǔn)化，篩選差異表達(dá)探針；
[0075] 使用Fold change和P-value篩選兩組樣品間（有重復(fù)）的差異表達(dá)miRNA;
[0076] 使用Fold change篩選兩個(gè)樣品間（沒(méi)有重復(fù))的差異表達(dá)miRNAs;
[0077] 最后，對(duì)差異表達(dá)miRNAs進(jìn)行聚類并繪制聚類圖。
[0078] 本發(fā)明前期建立腎氣虛哮喘病證結(jié)合大鼠模型，并觀察到益腎喘寧湯聯(lián)合糖皮質(zhì) 激素可通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來(lái)糾正Thl/Th2失衡，本發(fā)明在前期工作基礎(chǔ)上，以T細(xì)胞 亞群(1111、1112、11117、1>叩）的特異性轉(zhuǎn)錄因子、關(guān)鍵細(xì)胞因子和微小1?^為指標(biāo)，證明腎氣 虛哮喘發(fā)病與Treg/Th平衡的內(nèi)在機(jī)制，揭示中藥復(fù)方治療哮喘可能存在的多靶點(diǎn)多層次 的網(wǎng)絡(luò)式調(diào)控機(jī)制。
[0079] 本發(fā)明通過(guò)篩選、預(yù)測(cè)腎氣虛哮喘模型組與哮喘模型對(duì)照組肺部差異化表達(dá)miRs 和靶因子及其相互關(guān)系，揭示了分子水平上腎氣虛證本質(zhì)的部分科學(xué)內(nèi)涵。證明了證候的 宏觀表型與微觀生物分子之間的復(fù)雜關(guān)系。
[0080] 本發(fā)明理論上:近年來(lái)發(fā)現(xiàn)Thl/Th2細(xì)胞失衡機(jī)制并不能完全闡明哮喘的發(fā)生，自 從發(fā)現(xiàn)Treg和Thl7后，提示Treg/Thl7細(xì)胞失衡可能在其中扮演了重要角色，但目前尚未見(jiàn) 在哮喘發(fā)病研究中對(duì)!111、1112、11117、1^叫進(jìn)行多角度通盤考慮。因此本發(fā)明從1^叩/111失衡 探討了哮喘發(fā)病機(jī)制；
[0081] 模型上:成功的哮喘動(dòng)物模型對(duì)哮喘病因及發(fā)病機(jī)理研究中有十分重要的意義。 在中醫(yī)理論指導(dǎo)下建立了接近臨床癥候的腎氣虛哮喘病證結(jié)合模型，比目前單純哮喘模型 更符合中醫(yī)理論，也更利于在腎氣虛哮喘模型上探索方證相對(duì)的益腎喘寧湯治療哮喘的機(jī) 理；
[0082] 探索方法上:microRNA廣泛參與祀mRNA的沉默調(diào)控，并且是多靶點(diǎn)多層次
[0083]網(wǎng)絡(luò)式調(diào)控，常在生長(zhǎng)發(fā)育和疾病過(guò)程中呈現(xiàn)時(shí)空式表達(dá)。適合對(duì)中醫(yī)證型的發(fā) 明。本發(fā)明應(yīng)用HliR技術(shù)對(duì)腎氣虛證本質(zhì)的科學(xué)內(nèi)涵作一些有益的探索，為多種疾病的診斷 和治療提供新的思路。
[0084] 本發(fā)明提供一種1111、1112、11117、1^8測(cè)定方法，所述1111、1112、11117、1^8測(cè)定方法 為：
[0085] 采用流式細(xì)胞儀測(cè)定脾組織中的1111、1112、11117、1^叫的含量，對(duì)各用藥組1111/1112 和Thl7/Treg均值統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
[0086]下面結(jié)合具體分析對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。
[0087] 一、篩選micRNA的結(jié)果
[0088] 1.哮喘模型組、腎哮組、正常組之間的miRNA篩查結(jié)果
[0089] 1.1哮喘組與正常組比較，F(xiàn)old chang大于3倍或小于0.33倍，且P-value
[0090] 小于0 · 05的micRNA有13項(xiàng)，見(jiàn)下表1，3個(gè)上調(diào)，10個(gè)下調(diào)，其中rn〇-miR-370-3p下 調(diào)達(dá)7倍以上。
[0091] 表1哮喘組與正常組比較
[0092] Name Fold change P-value
[0093] rn〇-miR-450a-5p 3.672907474 0.030700678
[0094] rn〇-miR-181c-5p 3.180354232 0.008559343
[0095] rn〇-let-7a-1-3p/rn〇-let-7c-2-3p 3.263503027 0.018867658
[0096] rn〇-miR-291a-5p 0.253366323 0.001651507
[0097] rn〇-miR-652-5p 0.276631295 0.002304921
[0098] rn〇-miR-370-3p 0.129882271 0.029640336
[0099] rn〇-miR-292-5p 0.302037645 0.007247725
[0100] rn〇-miR-465-3p 0.278758669 0.008775467
[0101] rn〇-miR-667-3p 0.276021935 0.045812777
[0102] rn〇-miR-331-5p 0.276273909 0.006955694
[0103] rn〇-miR-487b-5p 0.319087445 0.039504933
[0104] rno-miR-2985 0.223001768 0.000262881
[0105] rn〇-miR-3573-3p 0.292860106 0.037137704
[0106] 1.2腎哮組與正常組比較，F(xiàn)old chang大于3倍或小于0.33倍，且P-value小于0.05 的micRNA有2項(xiàng)，見(jiàn)下表2，2個(gè)上調(diào)，其中rn〇-miR-450a-5p與哮喘組相似，均上調(diào)。
[0107] 表2腎哮組與正常組比較
[0108] Name Fold change P-value
[0109] rn〇-miR-27b-3p 2.195809383 0.013101224
[0110] rn〇-miR-450a-5p 3.339141265 0.012433015
[0111] 3.腎哮組與哮喘組比較，F(xiàn)old chang大于3倍或小于0.33倍的micRNA有8項(xiàng)，見(jiàn)下 表3,6個(gè)上調(diào)，2個(gè)下調(diào)，其中111〇-111丨1?-488-5口上調(diào)13倍以上，1'11〇-111丨1?-1-3口下調(diào)達(dá)28倍。
[0112] 表3腎哮組與哮喘組比較
[0113] Name Fold change P-value
[0114] rn〇-miR-3596d 3.372381099 0.329809835
[0115] rn〇-miR-653-3p 6.099956147 0.343530206
[0116] rn〇-miR-370-3p 3.732235481 0.403736101
[0117] rn〇-miR-3557-5p 4.210096767 0.307129158
[0118] rn〇-miR-344a-5p 3.646240471 0.292299088
[0119] rn〇-miR-488-5p 13.2511768 0.298227266
[0120] rn〇-miR-133a-3p 0.35730468 0.346101851
[0121] rn〇-miR-1-3p 0.035765059 0.367075199
[0122] 由于樣本含量較少，腎哮組與哮喘組盡管P值均大于0.05，但生物學(xué)差異明顯，可 做進(jìn)一步分析。
[0123] 2.西藥組、中藥組、中西藥組之間miRNA篩查結(jié)果：
[0124] 2 · 1中藥組與西藥組比較，F(xiàn)old chang大于3倍或小于0 · 33倍，且P-value小于0 · 05 的micRNA中有23個(gè)上調(diào)，19個(gè)下調(diào)（略），其中rn〇-miR-487b-3p高達(dá)300多倍，rno-miR-376b-3p高達(dá)60倍，還有7個(gè)miRNA差異表達(dá)高達(dá)10倍以上。
[0125] 2.2中西藥組與西藥組比較，F(xiàn)old chang大于3倍或小于0.3倍，且P-value小于 0 · 05的micRNA有3項(xiàng)，見(jiàn)表4，其中rn〇-miR-487b-3p上調(diào)達(dá)42倍。
[0126] 表4中西藥組與西藥組比較
[0127] Name Fold change P-value
[0128] rn〇-miR-487b-3p 41.99498626 0.000343931
[0129] rn〇-miR-450a-5p 0.19895338 0.000388542
[0130] rn〇-miR-181c-5p 0.186421241 0.001652361
[0131 ] 2.3中西藥與中藥比較，F(xiàn)old chang大于3倍或小于0.33倍，且P-value小于0.05的 micRNA 有20項(xiàng)（略），6項(xiàng)上調(diào)，12 項(xiàng)下調(diào)，其中rn〇-miR-376b-3p 下調(diào)達(dá) 40倍，rno-miR-138- 2-3p下調(diào)達(dá)10倍。
[0132] 3.由上可知，在此基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步：
[0133] 3.1擴(kuò)大樣本含量，篩選腎哮組與哮喘組micRAN表達(dá)的差異；
[0134] 3.2驗(yàn)證:中藥與西藥在作用與哮喘和腎哮模型中micRNA表達(dá)的差異。
[0135] 3.3了解差異表達(dá)強(qiáng)的miRNA位點(diǎn)的功能。
[0136] 二、測(cè)定 Thl、Th2、Thl7、Treg
[0137] 采用流式細(xì)胞儀測(cè)定脾組織中的1111、1112、11117、1^叫的含量，從六個(gè)組1111/1112和 Thl7/Treg均值的柱狀看出，趨勢(shì)較為理想，但樣本含量較少，各用藥組之間尚未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義。下一步可繼續(xù)擴(kuò)大樣本含量，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。分組Thl/Th2(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）Thl7/ Treg (均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差） 正常組 2.97士0.44 2.263士0.96 哮喘組 0.53土0.36 3.975士 1.12 腎哮組 0.44士0_31 3.705士 1.24
[0138] 中藥組 0.84士0J2 3,093士2.01 西藥組 0.7U0.62 2.917士0.66 中醫(yī)藥姐 l、41i〇.68. 2.82:0士.1.33:。
[0139] 三、模型中肺泡灌洗液各相關(guān)因子的ELI SA檢測(cè)結(jié)果：
[0140] 各組大鼠各指標(biāo)水平比較(jc±S)
[0142] 注：*與正常組比較Ρ〈0.05，Λ與腎氣虛哮喘模型組比較P〈0.05。
[0144] 注：*與正常組比較Ρ〈0.05，Λ與腎氣虛哮喘模型組比較P〈0.05。
[0145] 各組大鼠肺組織HE染色結(jié)果：
[0146] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的大鼠肺組織HE染色結(jié)果正常組圖；
[0147] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的大鼠肺組織HE染色結(jié)果哮喘模型組圖；
[0148] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的大鼠肺組織HE染色結(jié)果腎氣虛哮喘模型組圖；
[0149] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的大鼠肺組織HE染色結(jié)果中西藥組圖；
[0150] 圖6是本發(fā)明實(shí)施例提供的大鼠肺組織HE染色結(jié)果西藥組圖；
[0151] 圖7是本發(fā)明實(shí)施例提供的大鼠肺組織HE染色結(jié)果中藥組圖。
[0152] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于治療哮喘腎氣虛證的藥物，其特征在于，所述用于治療哮喘腎氣虛證的藥 物的中藥組分由熟地黃、山萸肉、山藥、澤瀉、苦參、天漿殼、牡丹皮、茯苓各12g、五味子5g、 沉香片8g、旋覆花、黛蛤散、生黃芪各15g組成；西藥采用必可酮?dú)忪F劑，每撳50yg，200撳/ 瓶。2. -種用于驗(yàn)證權(quán)利要求1所述藥物療效的哮喘腎氣虛證動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，其特 征在于，該哮喘腎氣虛證動(dòng)物模型的構(gòu)建方法為： 清潔級(jí)雄性Wistar大鼠540只，體重200~250g;動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組，哮喘模型對(duì) 照組，腎氣虛哮喘模型組，西藥組，中藥組，中西藥聯(lián)合組； 哮喘造模:除正常對(duì)照組外，各組大鼠采用卵清蛋白致敏法進(jìn)行哮喘造模； 腎氣虛造模:除正常對(duì)照組、哮喘模型對(duì)照組外，各組大鼠復(fù)合腎氣虛證造模。3. 如權(quán)利要求2所述的哮喘腎氣虛證動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述哮喘造模 方法為:實(shí)驗(yàn)第1天，用含有卵清蛋白lmg、氫氧化鋁凝膠IOmg及滅活百日咳桿菌疫苗5 X IO8 個(gè)的混合液Iml注入腹腔內(nèi)，令其致敏； 正常組以生理鹽水腹腔內(nèi)注射，2周后備用；第15天開(kāi)始，將上述造模大鼠置于65cmX 45cm X 45cm大小的玻璃罩內(nèi)，以1 %的卵清蛋白超聲霧化吸入30min，激發(fā)哮喘，日1次，連續(xù) 激發(fā)直至處死； 正常對(duì)照組用生理鹽水替代霧化吸入。4. 如權(quán)利要求2所述的哮喘腎氣虛證動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述腎氣虛造 模:除正常對(duì)照組、哮喘模型對(duì)照組外，各組大鼠復(fù)合腎氣虛證造模，具體方法： 實(shí)驗(yàn)第1天開(kāi)始，每日上午于同一時(shí)間置一安靜房間進(jìn)行驚恐刺激，每次lOmin，即放送 有貓叫聲的磁帶，同時(shí)用梅花針叩擊大鼠20次/min，模擬貓抓拿攻擊大鼠的情景，同時(shí)振動(dòng) 鼠籠； 每日下午將動(dòng)物負(fù)重游泳:于大鼠尾根部纏繞重量為該大鼠體重10%的保險(xiǎn)絲，放入 水深50cm、水溫20°C的水槽中游泳，以力竭為度一一大鼠鼻尖沒(méi)入水面10s，每日1次，共14 天。5. -種如權(quán)利要求2~4任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的構(gòu)建方法建立的動(dòng)物模型。6. -種如權(quán)利要求5所述的動(dòng)物模型的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括： 給藥及處理:西藥組、中藥組和中西藥聯(lián)合組大鼠于實(shí)驗(yàn)第15天開(kāi)始給藥；日給藥劑量 為：西藥組給必可酮50yg/只；中藥組給中藥2.0g/kg;中西藥組給相應(yīng)中藥2.0g/kg、必可酮 50yg/； 正常對(duì)照組、哮喘模型組、腎虛哮喘模型組給生理鹽水灌胃；各組大鼠分別干預(yù)15天處 理，稱體重，眼球取血;腎氣虛哮喘模型組進(jìn)行四診計(jì)量化指標(biāo)進(jìn)行氣虛程度評(píng)判； 癥狀、體征觀察:觀察各組大鼠食量、皮毛、體重、活動(dòng)量、懸尾抵抗力、游泳時(shí)間、雙肺 表現(xiàn)； 血清檢測(cè):檢測(cè)甲狀腺素、皮質(zhì)醇、睪酮水平； 病理學(xué)觀察:取部分肺組織行蘇木精一伊紅染色觀察； 支氣管肺泡灌洗液檢測(cè)白細(xì)胞分類和計(jì)數(shù):并采用ELISA法檢測(cè)MLF離心后上清液中 細(xì)胞因子11^-4、幾-5、11^-6、幾-10、幾-13、幾-17、正^丫、丁6卩-邱勺含量； 肺組織檢測(cè)：取出肺臟組織的1/3,采用逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)定法檢測(cè)肺組織中T- 匕6伙64了六-3、1?〇1?丫扒？(《?3、11^6、了6?-0因子11^祖的表達(dá)水平；用免疫印跡法檢測(cè)肺組織1'-bet、GATA-3、R0Ry t、Foxp3、IL-6、TGF-0蛋白的表達(dá)水平，取出另外肺組織的1/3,用于 miRNA相關(guān)檢測(cè)； 脾組織檢測(cè)：分離脾臟中單個(gè)核細(xì)胞，固定，染FITC-CD4，然后破膜，分別加 Thl、Th2、 11117和1'代8細(xì)胞的特異性抗體11^-4、正^丫、幾-174和?(《?3，孵育后重懸、上機(jī)檢測(cè)； microRNA微陣列基因檢測(cè):大鼠處死，肺臟被迅速分離置于凍存管，直接放入液氮中冷 凍，短時(shí)間內(nèi)完成整個(gè)操作；用MirVana microRNA isolation kit按照說(shuō)明書(shū)收集總RNA; 取適量RNA溶液，經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量測(cè)定RNA樣品0D260和0D280值，計(jì)算RNA濃度，1 %瓊 脂糖電泳觀察總RNA，取2_5yg用Microcon centrifugal filter微離心過(guò)濾柱過(guò)濾，得到片 段小于300個(gè)核苷酸的小RNA;應(yīng)用Poly聚合酶將小RNA的3'端加上poly(A)尾巴，再連接一 個(gè)寡聚核苷酸標(biāo)記，用于后續(xù)的熒光標(biāo)記，完成yParafIoTM microRNA微陣列基因； 表達(dá)實(shí)驗(yàn)和分析:通過(guò)微循環(huán)栗雜交儀器在yParaf IoTM微流體芯片上過(guò)夜，使用含甲 酸胺SSPE緩沖液進(jìn)行雜交，漂洗甩干，用激光掃描儀采集雜交圖象，Array--Pro軟件對(duì)雜交 圖像進(jìn)行數(shù)字化轉(zhuǎn)換、數(shù)據(jù)處理和分析，計(jì)算兩組檢測(cè)到信號(hào)的比值和t檢驗(yàn)的p值，以p〈 0.01定義為信號(hào)有顯著差異性，分析差異表達(dá)的位點(diǎn)，大鼠微陣列芯片包括454個(gè) microRNA，包含數(shù)據(jù)庫(kù)中成熟的microRNA和部分成熟microRNA的互補(bǔ)鏈;芯片上的檢測(cè)探 針均進(jìn)行9個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行2次； 實(shí)時(shí)焚光定量PCR檢測(cè)：用MirVana microRNA isolation kit按照說(shuō)明書(shū)收集總RNA， 計(jì)算RNA濃度；特異逆轉(zhuǎn)錄引物從Taqman MicroRNA Assays獲得，并用Taqman MicroRNA ReverseTranscription Kit將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)焚光定量PCR檢測(cè)，反應(yīng)結(jié)束后用 ABI Prism7900軟件分析結(jié)果，PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次，用比較閾值循環(huán)方法分析數(shù)據(jù)，得到Ct值， 即熒光達(dá)到閾值所需的PCR循環(huán)數(shù)，并分析基因相對(duì)表達(dá)量； 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)：應(yīng)用miRanda、Target Scan和PicTar 3個(gè)生物信息學(xué)祀基因預(yù)測(cè)軟 件，對(duì)microRNA芯片結(jié)果中挑選出來(lái)的microRNA的革El基因做出預(yù)測(cè)； 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:根據(jù)資料的性質(zhì)、分布和設(shè)計(jì)特點(diǎn)，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分 析。7. 如權(quán)利要求6所述的動(dòng)物模型的使用方法，其特征在于，microRNA芯片的數(shù)據(jù)分析方 法： 使用GenePix Pro 6.0讀取芯片掃描圖像，并提取探針的信號(hào)值； 相同的探針取中值合并，保留在所有樣品中均> = 30.0的探針，對(duì)全部芯片進(jìn)行中值標(biāo) 準(zhǔn)化，篩選差異表達(dá)探針； 使用Fold change和P-value篩選兩組樣品間的差異表達(dá)miRNA; 使用Fold change篩選兩個(gè)樣品間的差異表達(dá)miRNAs; 最后，對(duì)差異表達(dá)miRNAs進(jìn)行聚類并繪制聚類圖。8. 如權(quán)利要求7所述的動(dòng)物模型的使用方法，其特征在于，使用Fold change和P-value 篩選兩組樣品間的差異表達(dá)miRNA中兩組樣品間有重復(fù);使用Fold change篩選兩個(gè)樣品間 的差異表達(dá)miRNAs中兩個(gè)樣品間沒(méi)有重復(fù)。
【文檔編號(hào)】A61K35/618GK105943787SQ201610420083
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年6月15日
【發(fā)明人】鄭小偉, 孔麗婭, 余王琴, 劉曉谷
【申請(qǐng)人】浙江中醫(yī)藥大學(xué)