用于從微生物細(xì)胞獲得微生物油的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及從細(xì)胞獲得脂質(zhì)的方法，其是通過裂解該細(xì)胞以形成裂解的細(xì)胞組合物，以及從去乳化裂解的細(xì)胞組合物獲得該脂質(zhì)。本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明的方法所制備的脂質(zhì)。本發(fā)明還涉及具有特定的茴香胺值、過氧化物值，和/或磷含量的微生物脂質(zhì)。
【專利說明】用于從微生物細(xì)胞獲得微生物油的方法
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求申請日為2013年12月20日的美國臨時申請No.61/918,922的申請日權(quán) 益，其公開內(nèi)容在此通過提述并入。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 本文公開了用于從一個或多個微生物細(xì)胞獲得包含一種或多種多不飽和脂肪酸 (PUFA)的微生物油的方法，所述方法通過裂解所述細(xì)胞以形成裂解細(xì)胞組合物，然后從所 述裂解細(xì)胞組合物回收該油。本文還公開了包含一種或多種PUFA的微生物油，所述PUFA是 通過本發(fā)明所述的至少一種方法從微生物細(xì)胞回收的。
[0005] 含有一種或多種PUFA的微生物油是由微生物所生產(chǎn)，如，例如，藻類及真菌。
[0006] 從微生物細(xì)胞獲得含PUFA的油的通常方法涉及:使能夠生產(chǎn)所需的油的微生物在 發(fā)酵器、池或生物反應(yīng)器中生長以產(chǎn)生微生物細(xì)胞生物質(zhì)(biomass);從所述生物質(zhì)生長的 發(fā)酵培養(yǎng)基分離該生物質(zhì);干燥該微生物細(xì)胞生物質(zhì)，使用不與水互溶的有機溶劑(例如己 烷)從該干燥的細(xì)胞提取所述油；以及從所述油去除該有機溶劑(例如己烷）。此方法還可以 涉及用水稀釋含有所述細(xì)胞生物質(zhì)的該發(fā)酵培養(yǎng)基，然后進(jìn)行離心以從經(jīng)稀釋的發(fā)酵培養(yǎng) 基分離所述生物質(zhì)。
[0007] 從微生物細(xì)胞獲得含PUFA的油的另一種方法涉及:使能夠生產(chǎn)所需的油的微生物 在發(fā)酵器、池或生物反應(yīng)器中生長以產(chǎn)生微生物細(xì)胞生物質(zhì)；通過使用機械力（例如均質(zhì) 化）、酶處理、或化學(xué)處理破壞細(xì)胞壁而將所述含PUFA的油釋放至該細(xì)胞生長的發(fā)酵培養(yǎng)基 中；以及用與水混溶的有機溶劑(例如異丙醇)從所得的組合物(其包含含有PUFA的油、細(xì)胞 碎片和液體）回收該油?？梢詮脑摻M合物機械地分離所述油，并且必須從所述油和水性生物 質(zhì)廢物流二者去除醇。
[0008] 上述任一項從微生物細(xì)胞獲得含PUFA的油的方法的工業(yè)規(guī)模利用，需要使用大量 的揮發(fā)性且可燃的有機溶劑，這產(chǎn)生了危險的操作條件且需要使用昂貴的防爆設(shè)備。此外， 使用有機溶劑會產(chǎn)生有機溶劑廢物流，其需要執(zhí)行昂貴的溶劑回收工藝以解決對于揮發(fā)性 有機化合物(VOC)排放的嚴(yán)格環(huán)境限制，這又導(dǎo)致需要更多的人力以及昂貴的設(shè)備。
[0009] 并且，上述方法中使用熱來干燥細(xì)胞和/或從回收的油去除溶劑可降解含PUFA的 油且增加能源的使用，這可進(jìn)一步增加加工成本。當(dāng)含PUFA的油暴露于氧時(如當(dāng)微生物細(xì) 胞壁的完整性被破壞時)和/或微生物細(xì)胞暴露于熱時，發(fā)生降解。
[0010] 用于從微生物細(xì)胞獲得含PUFA的油的無溶劑方法涉及:使能夠生產(chǎn)所需的油的微 生物在發(fā)酵器、池或生物反應(yīng)器中生長，以產(chǎn)生微生物細(xì)胞生物質(zhì);通過使用機械力（例如 均質(zhì)化）、酶處理、或化學(xué)處理破壞細(xì)胞壁而將所述含PUFA的油釋放至該細(xì)胞生長的發(fā)酵培 養(yǎng)基中；以及通過提升PH、添加鹽、加熱，和/或攪拌所得的組合物而從所得的組合物（其包 含含有PUFA的油、細(xì)胞碎片和液體）回收粗制油。然而，此種從細(xì)胞獲得含PUFA的油的無溶 劑方法可需要長的油回收時間、大量的鹽，和/或許多步驟，其都能增加加工成本。
[0011]結(jié)果，仍然需要一種用于從微生物細(xì)胞獲得高質(zhì)量的含PUFA的油的方法，其不使 用揮發(fā)性有機溶劑、可以使用容易得到的設(shè)備進(jìn)行、需要最小數(shù)目的步驟、具有更短的油回 收時間，并且能提供高質(zhì)量的含PUFA的油的高產(chǎn)量/收率(yield)。
[0012] 本文公開了用于從一個或多個微生物細(xì)胞獲得包含一種或多種多不飽和脂肪酸 (PUFA)的微生物油的方法，其包括(a)裂解包含所述微生物油的細(xì)胞以形成裂解細(xì)胞組合 物；（b)將所述裂解細(xì)胞組合物去乳化(包括降低所述裂解細(xì)胞組合物的pH)以形成去乳化 的裂解細(xì)胞組合物；（c)從所述去乳化的裂解細(xì)胞組合物分離該油；以及(d)回收該油；
[0013] 本文公開了用于從一個或多個微生物細(xì)胞獲得包含一種或多種多不飽和脂肪酸 (PUFA)的微生物油的方法，其包括(a)裂解包含所述微生物油的細(xì)胞以形成裂解細(xì)胞組合 物；（b)將所述裂解細(xì)胞組合物去乳化(包括將裂解細(xì)胞組合物的pH降低至約6或更低）以形 成去乳化的裂解細(xì)胞組合物；（c)從所述去乳化的裂解細(xì)胞組合物分離該油；以及(d)回收 該油。
[0014] 本文公開了用于從一個或多個微生物細(xì)胞獲得包含一種或多種多不飽和脂肪酸 (PUFA)的微生物油的方法，其包括(a)裂解包含所述微生物油的細(xì)胞以形成裂解細(xì)胞組合 物；（b)將所述裂解細(xì)胞組合物去乳化(包括通過添加按重量計裂解細(xì)胞組合物的約0.5% 至約20%的量的酸來降低裂解細(xì)胞組合物的pH)以形成去乳化的裂解細(xì)胞組合物；（c)從所 述去乳化的裂解細(xì)胞組合物分離該油；以及(d)回收該油。
[0015] 本文公開了用于從一個或多個微生物細(xì)胞獲得包含一種或多種多不飽和脂肪酸 (PUFA)的微生物油的方法，其包括(a)裂解包含所述微生物油的細(xì)胞以形成裂解細(xì)胞組合 物；（b)將所述裂解細(xì)胞組合物去乳化(包括將裂解細(xì)胞組合物的pH降低至約6或更低）以形 成去乳化的裂解細(xì)胞組合物；（c)從所述去乳化的裂解細(xì)胞組合物分離該油；以及(d)回收 該油，其中（a)或(b)的至少一個還包括將該組合物加熱到至少70°C的溫度。
[0016] 本文公開了用于從一個或多個微生物細(xì)胞獲得包含一種或多種多不飽和脂肪酸 (PUFA)的微生物油的方法，其包括(a)裂解包含所述微生物油的細(xì)胞以形成裂解細(xì)胞組合 物；（b)將所述裂解細(xì)胞組合物去乳化(包括通過添加按重量計裂解細(xì)胞組合物的約0.5% 至約20%的量的酸來降低裂解細(xì)胞組合物的pH)以形成去乳化的裂解細(xì)胞組合物；（c)所述 去乳化的裂解細(xì)胞組合物分離該油；以及(d)回收該油，其中(a)或(b)的至少一個還包括將 該組合物加熱到至少70°C的溫度。
[0017] 本文公開了用于從一個或多個微生物細(xì)胞獲得包含一種或多種多不飽和脂肪酸 (PUFA)的微生物油的方法，其包括(a)裂解包含所述微生物油的細(xì)胞以形成裂解細(xì)胞組合 物；（b)將所述裂解細(xì)胞組合物去乳化(包括添加酸以降低裂解細(xì)胞組合物的pH至約6或更 低并攪拌所述裂解細(xì)胞組合物）以形成去乳化的裂解細(xì)胞組合物；（c)從所述去乳化的裂解 細(xì)胞組合物分離該油；以及(d)回收該油。
[0018] 本文公開了用于從一個或多個微生物細(xì)胞獲得包含一種或多種多不飽和脂肪酸 (PUFA)的微生物油的方法，其包括(a)裂解包含所述微生物油的細(xì)胞以形成裂解細(xì)胞組合 物；（b)將所述裂解細(xì)胞組合物去乳化(包括降低裂解細(xì)胞組合物的pH)以形成去乳化的裂 解細(xì)胞組合物；（c)從所述去乳化的裂解細(xì)胞組合物分離該油；以及(d)回收該油，其中將 (a)及(b)組合在一起以形成一步裂解及去乳化步驟。
[0019] 本文公開了用于從一個或多個微生物細(xì)胞獲得包含一種或多種多不飽和脂肪酸 (PUFA)的微生物油的方法，其包括(a)裂解包含所述微生物油的細(xì)胞以形成裂解細(xì)胞組合 物；（b)將所述裂解細(xì)胞組合物去乳化以形成去乳化的裂解細(xì)胞組合物；（C)從所述去乳化 的裂解細(xì)胞組合物分離該油；以及(d)回收該油，其中將(a)及(b)組合在一起以形成一步裂 解及去乳化步驟，其包括提升pH。
[0020]本文公開了用于從一個或多個微生物細(xì)胞獲得包含一種或多種多不飽和脂肪酸 (PUFA)的微生物油的方法，其包括(a)在適于形成去乳化的裂解細(xì)胞組合物的pH處裂解包 含所述微生物油的細(xì)胞；（b)從所述去乳化的裂解細(xì)胞組合物分離該油；以及(C)回收該油， 其中所述去乳化的裂解細(xì)胞組合物是在裂解過程中獲得的。
[0021 ]本文公開了通過本文所述方法的任一種獲得的微生物油。
[0022]多不飽和脂肪酸(PUFA)是根據(jù)距脂肪酸的甲基端的第一個雙鍵的位置來分類的； ω -3 (n-3)脂肪酸在第三個碳上含有第一個雙鍵，而ω -6 (n-6)脂肪酸在第六個碳上含有第 一個雙鍵。例如，二十二碳六烯酸（"DHA"）是一種鏈長為22個碳并有6個雙鍵的ω -3長鏈多 不飽和脂肪酸(LC-PUFA)，通常稱為"22: 6η-3"。在一個實施方案中，PUFA選自ω -3脂肪酸、 ω-6脂肪酸，及其混合物。在另一個實施方案中，PUFA選自LC-PUFA。在又一個實施方案中， PUFA選自二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)、花生四烯酸 (ARA)、γ -亞麻酸(GLA)、二高-γ -亞麻酸(DGLA)、十八碳四稀酸（stearidonic acid,SDA)， 及其混合物。在另一個實施方案中，PUFA選自DHA、ARA，及其混合物。在又一個實施方案中， PUFA是DHA。在又一個實施方案中，PUFA是ARA。
[0023] LC-PUFA是含有至少3個雙鍵且具有18個或更多個碳或是20個或更多個碳的鏈長 的脂肪酸。ω-6系列的LC-PUFA包括但不限于二高-γ-亞麻酸（C20:3n-6)、花生四烯酸 (C20:4n-6)( "ARA"）、二十二碳四稀酸或腎上腺酸(adrenic acid) (C22:4n-6)，以及二十二 碳五烯酸(C22: 5n-6) ( "DPA n-6"）。ω-3系列的LC-PUFA包括但不限于二十碳三烯酸(C20: 311-3)、二十碳四烯酸（020:411-3)、二十碳五烯酸（020 :511-3)(1?^)、二十二碳五烯酸 (C22:5n-3)，以及二十二碳六烯酸(CSSin-S)13LC-PUFA還包括具有大于22個碳以及4個或 更多個雙鍵的脂肪酸，包括但不限于C24:6(n-3)與C28:8(n-3)。
[0024] PUFA可以為如下形式：游離脂肪酸、鹽、脂肪酸酯（例如甲酯或乙酯）、單酰甘油 (MAG)、二酰甘油(DAG)、三酰甘油(TAG)，和/或磷脂(PL)。
[0025] 高度不飽合脂肪酸(HUFA)是含有4個或更多個不飽和碳-碳鍵的ω -3和/或ω -6多 不飽和脂肪酸。
[0026] 如本文所用的，"細(xì)胞"意指一種含油生物材料，如源自油質(zhì)微生物的生物材料。由 微生物生產(chǎn)的或從微生物細(xì)胞獲得的油稱為"微生物油"。由藻類和/或真菌所生產(chǎn)的油還 分別稱為藻類油和/或真菌油。
[0027] 如本文所用的，"微生物細(xì)胞"或"微生物"意指生物體，例如藻類、細(xì)菌、真菌、原生 生物、酵母，及其組合，例如單細(xì)胞生物。在一些實施方案中，微生物細(xì)胞是真核細(xì)胞。微生 物細(xì)胞包括但不限于金藻(例如不等鞭毛類(Stramenopi Ies)界的微生物]、綠藻、娃藻類、 溝鞭藻類（dinof lagel Iates)(例如溝鞭藻（Dinophyceae)目的微生物，包括隱甲藻 (Crypthecodinium)屬的成員，如例如，寇氏隱甲藻（Crypthecodini um cohnii或 C.cohnii));破囊壺菌目（Thraustochytriales)的微藻類;酵母(子囊菌類或擔(dān)子菌類），以 及毛霉屬（Mu cor)和被孢霉屬（Mortierella)的真菌，包括但不限于高山被孢霉 (Mortierella alpina)及施穆克被抱霉（Mortierella sect · schmuckeri )，以及腐霉屬 (Pythium)，包括但不限于詭譎腐霉(Pythium insidiosum) 〇
[0028] 在一個實施方案中，微生物細(xì)胞來自被孢霉屬、隱甲藻屬，或是破囊壺菌目。在又 一個實施方案中，微生物細(xì)胞來自寇氏隱甲藻。在又一個實施方案中，微生物細(xì)胞選自寇氏 隱甲藻、高山被孢霉、破囊壺菌屬、裂殖壺菌(Sch i z 〇 chy tr i um)屬，及其混合物。
[0029] 在又一個實施方案中，微生物細(xì)胞包括但不限于屬于以下的微生物:被孢霉屬、耳 霉屬(Conidiobolus)、腐霉屬、疫霉屬(Phytophthora)、青霉屬(PeniciIlium)、枝孢霉屬 (Cladospori um)、毛霉屬、鐮孢屬（Fusar ium)、曲霉屬（Aspergillus)、紅酵母屬 (Rhodotorula)、蟲霉屬（Entomophthora)、刺抱囊霉屬（Echinosporangium)，以及水霉屬 (Saprolegnia)。在另一個實施方案中，ARA獲取自微生物細(xì)胞，所述微生物細(xì)胞來自被孢霉 屬，包括但不限于長孢被孢霉（MortiereIla elongata)、微小被孢霉（Mortierel Ia exigua)、喜濕被孢霉（Mortierella hygrophila)、高山被孢霉、施穆克被孢霉 (Mortierella schmuckeri)，以及小被抱霉(Mortierella minutissima)。在另一個實施方 案中，ARA獲取自微生物細(xì)胞，所述微生物細(xì)胞來自：長孢被孢霉IF08570、微小被孢霉 IF08571、喜濕被孢霉 IF05941、高山被孢霉 IF08568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、 CBS219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS529.72、CBS608.70、和 CBS754.68,及其突變體。在又一個實施方案中，微生物細(xì)胞來自高山被孢霉。
[0030] 于更進(jìn)一步中，微生物細(xì)胞是來自破囊壺菌目（Thraustochytriales)的微藻，其 包括但不限于破囊壺菌屬(Thraustochytrium)(物種包括arudimentale、金黃色破囊壺菌 (aureum)、benthicola、球破囊壺菌(globosum)、金尼破囊壺菌(kinnei)、動孢破囊壺菌 (111〇1：；^11111)、多增殖性破囊壺菌(1]11111：；[1'11(1；[11161^316)、厚皮破囊壺菌(。3(3117(161'1]111111)、層出破 囊壺菌(proliferum)、粉紅破囊壺菌(roseum)，以及紋帶破囊壺菌（striatum));裂殖壺菌 屬（Schizochytrium)(物種包括聚生裂殖壺菌（aggregatum)、limnaceum、紅樹林裂殖壺菌 (mangrovei )、微小裂殖壺菌（minutum)、八孢裂殖壺菌（octosporum));吾肯氏壺菌屬 (Ulkenia)(物種包括變形吾肯氏壺菌(amoeboidea)、克格倫吾肯氏壺菌(kerguelensis)、 小吾肯氏壺菌（mi nuta)、深海吾肯氏壺菌（profunda)、福射吾肯氏壺菌（radiate)、 sailens、沙氏吾肯氏壺菌（sarkariana)、schizochytrops、威瑟氏吾肯氏壺菌 (visurgensis)、約肯氏吾肯氏壺菌（yorkensis));Aurantiacochytrium 屬； Ob Iongichytrium屬、Sicyoidochytium屬、Parientichytrium屬、Botryochytrium屬，及其 組合。在吾肯氏壺菌屬(Ulkenia)內(nèi)所描述的物種會視為裂殖壺菌屬的成員。在另一個實施 方案中，微生物細(xì)胞來自破囊壺菌目。在又一個實施方案中，微生物細(xì)胞來自破囊壺菌屬。 在又一個實施方案中，微生物細(xì)胞來自裂殖壺菌屬。在又一個實施方案中，微生物細(xì)胞選自 破囊壺菌屬、裂殖壺菌屬，或其混合物。
[0031 ]在一個實施方案中，該方法包括裂解包含微生物油的微生物細(xì)胞以形成裂解細(xì)胞 組合物。術(shù)語"裂解(lyse)"及"裂解(lysing)"意指使微生物細(xì)胞的壁和/或膜破裂的方法。 在一個實施方案中，通過至少一種選自下組的處理來裂解微生物細(xì)胞:機械處理、化學(xué)處 理、酶處理、物理處理，及其組合。在另一個實施方案中，所述方法包括裂解包含微生物油的 微生物細(xì)胞以形成裂解細(xì)胞組合物，其中所述裂解選自機械處理、化學(xué)處理、酶處理、物理 處理，及其組合。
[0032]在一些實施方案中，在裂解細(xì)胞之前，可以對所述細(xì)胞進(jìn)行洗滌和/或巴氏消毒 (pasteurize)。在一些實施方案中，洗滌細(xì)胞包括使用水溶液(例如水)來去除任何細(xì)胞外 的水溶性或水分散性化合物。在一些實施方案中，可以將細(xì)胞洗滌一次、二次、三次，或更多 次。在一些實施方案中，對細(xì)胞進(jìn)行巴氏消毒包括加熱該細(xì)胞以使任何不合意的酶(例如任 何可能降解該油或降低PUFA產(chǎn)量/收率的酶)失活。在一些實施方案中，可以洗滌該細(xì)胞然 后在裂解該細(xì)胞之前對其進(jìn)行巴氏消毒。在一些實施方案中，要裂解的細(xì)胞包含于發(fā)酵液 中。
[0033]在一些實施方案中，所述方法包括裂解包含微生物油的未洗滌的微生物細(xì)胞以形 成裂解細(xì)胞組合物。在一些實施方案中，用例如水首先洗滌含有包含微生物油的微生物細(xì) 胞的發(fā)酵液，然后裂解該細(xì)胞以形成裂解細(xì)胞組合物。在其他實施方案中，所述方法包括裂 解發(fā)酵液中未洗滌的細(xì)胞以形成裂解細(xì)胞組合物。
[0034]機械處理包括但不限于均質(zhì)化、超聲、冷壓、碾磨，及其組合。在一些實施方案中， 所述方法包括通過均質(zhì)化來裂解細(xì)胞。在一些實施方案中，所述方法包括用均質(zhì)機來裂解 該細(xì)胞。
[0035] 均質(zhì)化包括但不限于使用下列設(shè)備的方法：弗氏細(xì)胞壓碎器（French cell press)、超聲破碎器、均質(zhì)機，微流化器(microfluidizer)、球磨機、棒磨機、爍磨機(pebble mill)、珠磨機(bead mill)、高壓碾磨輯、立軸式?jīng)_擊機(vertical shaft impactor)、工業(yè) 共混機、高剪切混合機、槳式混合機、polytron均質(zhì)機、工業(yè)均質(zhì)機(例如Niro Soavi VHP均 質(zhì)機及APV Rannie和APV Gaulin均質(zhì)機）、工業(yè)高剪切流體處理器(high shear fluid processors)(例如微流體高剪切流體處理器）、細(xì)胞裂解/珠磨均質(zhì)機(例如Dyno-Mill和 Buhler)，及其組合。在一些實施方案中，細(xì)胞流經(jīng)任選加熱的均質(zhì)機。在一些實施方案中， 合適的均質(zhì)化可以包括1次至3次通過處于高壓和/或低壓的均質(zhì)機。
[0036] 在一些實施方案中，均質(zhì)化過程中的壓強為150巴（bar)至1，400巴；150巴至1，200 巴；150巴至900巴；150巴至300巴；300巴至1,400巴；300巴至1,200巴；300巴至900巴；400巴 至800巴；500巴至700巴；或600巴。在一些實施方案中，均質(zhì)化過程中的壓強為2，000psi至 20,000卩8；[;2,000卩8；[至18,000卩8；[;2,000卩8；[至16,000卩8；[;2,000卩8；[至14,000卩8；[;2， OOOpsi至12，000psi;2,OOOpsi至10，000psi;2，OOOpsi至8，000psi;2,OOOpsi至6,OOOpsi; 2,000卩8；[至4,000卩8；[;4,000卩8；[至20,000卩8；[;4,000卩8；[至18,000卩8；[;4,000卩8；[至16， OOOpsi;4，000psi至14,000psi;4，000psi至12，000psi;4,OOOpsi至10，000psi;4,OOOpsi至 8，000psi;4,OOOpsi至6，000psi;6,OOOpsi至20，000psi;6,OOOpsi至18，000psi;6,OOOpsi 至16，OOOpsi;6，OOOpsi至14，OOOpsi;6，OOOpsi至12，OOOpsi;6，OOOpsi至10，OOOpsi;6， OOOpsi至8，000psi;8,OOOpsi至20，000psi;8,OOOpsi至18，000psi;8,OOOpsi至16,OOOpsi; 8，OOOpsi至14，OOOpsi;8，OOOpsi至12，OOOpsi;8，OOOpsi至10，OOOpsi;10,OOOpsi至20， OOOpsi;10,OOOpsi至18，000psi;10,OOOpsi至16，000psi;10,OOOpsi至14，000psi; 10， OOOpsi至12，000psi;12,OOOpsi至20，000psi;12,OOOpsi至18，000psi;12,OOOpsi至16， OOOpsi;12,OOOpsi至14，000psi;14,OOOpsi至20，000psi;14,OOOpsi至18，000psi; 14， OOOpsi至16，000psi;16,OOOpsi至20，000psi;16,OOOpsi至18，000psi;或18,OOOpsi至20， OOOpsi0
[0037]在一些實施方案中，在均質(zhì)化前將微生物細(xì)胞在高剪切混合機中混合。在一些實 施方案中，所述高剪切混合機以如下范圍的轉(zhuǎn)速操作：至少5，OOOrpm;至少7，500rpm;至少 10，OOOrpm;至少12，500rpm;至少15，OOOrpm; 5，OOOrpm至15，OOOrpm; 5，OOOrpm至12， 500rpm;5,OOOrpm至10,OOOrpm;5,OOOrpm至7，500rpm;7，500rpm至15,OOOrpm;7，500rpm至 12，500rpm;7，500rpm至10,OOOrpm;10,OOOrpm至15,OOOrpm;10,OOOrpm至12，500rpm;或12， 500rpm至15，OOOrpm。
[0038] 物理處理包括但不限于:加熱，其包括但不限于，電阻式(resistive)、對流、蒸汽、 流體浴、太陽能，及其組合。在一些實施方案中，在釜中加熱細(xì)胞，所述釜在其壁之內(nèi)/之上 具有電阻線圈。在一些實施方案中，在液體浴中加熱細(xì)胞，所述液體浴具有穿過其間的管 子。
[0039]化學(xué)處理包括但不限于：提高細(xì)胞的pH;降低細(xì)胞的pH;使細(xì)胞接觸化學(xué)品；及其 組合。
[0040] 在一些實施方案中，通過提高細(xì)胞的pH來裂解細(xì)胞。在一些實施方案中，通過添加 堿來提高pH。堿包括但不限于氫氧化物（例如1^0!1、似0!1、1(0!1工&(0!1)2，及其組合）、碳酸鹽 類（例如，Na 2CO3，K2CO3，MgCO3，及其組合）、碳酸氫鹽類（例如，LiHCO 3，NaHCO3，KHCO3，及其組 合），及其組合。堿可以是固體形式(例如晶體，顆粒，與小丸）；液體形式(例如水溶液）；及其 組合。
[0041 ] 在一些實施方案中，該堿具有1至12、1至10、1至8、1至6、1至5、2至12、2至10、2至8、 2至6、2至5、3至10、3至6、3至5、4至10、4至8、4至6、5至10、或5至8的pKb。本文所用的術(shù)語 "pK b"意指堿的堿締合常數(shù)(Kb)的負(fù)對數(shù)。Kb意指堿在水中的離子化的平衡常數(shù)，其中：
[0042] B + mo ^ HB+ + Off-;并且堿B的Kb定義為:= [ΗΒ「]』?Η ] ~ [Β]
[0043] 在一些實施方案中，pH選自約8或以上;約9或以上；約10或以上;約11或以上；以及 約12或以上。在其他實施方案中，pH選自如下pH:7至13;7至12;7至11;7至10;7至9;8至13;8 至12 ;8至11;8至10;8至9;9至12;9至11 ;9至10;10至12;以及10至11。
[0044] 在一些實施方案中，細(xì)胞的pH可以通過氯堿法來提升。在一些實施方案中，對含氯 化鈉和細(xì)胞的發(fā)酵液進(jìn)行電解，其導(dǎo)致形成氫氧化鈉，這使該細(xì)胞的PH提高。在一些實施方 案中，發(fā)酵液包含氯化鈣或氯化鉀代替氯化鈉，或是除氯化鈉之外還有氯化鈣或氯化鉀，并 且電解分別導(dǎo)致形成氫氧化鈣或氫氧化鉀，由此提高該細(xì)胞的pH。
[0045] 在一些實施方案中，通過降低細(xì)胞的pH來裂解細(xì)胞。在一些實施方案中，通過添加 酸來降低pH。酸包括但不限于:硫酸;磷酸;鹽酸;氫溴酸;氫碘酸;次氯酸;亞氯酸;氯酸;高 氯酸;氟硫酸;硝酸;氟銻酸;氟硼酸;六氟磷酸;鉻酸;硼酸；乙酸;檸檬酸；甲酸;及其組合。 在一些實施方案中，pH選自約7或更低;約6.5或更低;約6或更低;約5.5或更低;約5或更低； 約4.5或更低；約4或更低；約3.5或更低；約3或更低；約2.5或更低；約2或更低；約1.5或更 低；約1或更低;和約〇 . 5或更低。在其他實施方案中，pH選自約0.5至約7;約0.5至約6.5;約 0.5至約6;約0.5至約5.5;約0.5至約5;約0.5至約4.5;約0.5至約4;約0.5至約3.5;約0.5至 約3;約0.5至約2.5;約0.5至約2;約0.5至約1.5;約0.5至約1;約1至約7;約1至約6.5;約1至 約6;約1至約5.5;約1至約5;約1至約4.5;約1至約4;約1至約3.5;約1至約3;約1至約2.5;約 1至約2;約1至約1.5;約1.5至約7;約1.5至約6.5;約1.5至約6;約1.5至約5.5;約1.5至約5; 約1.5至約4.5;約1.5至約4;約1.5至約3.5;約1.5至約3;約1.5至約2.5;約1.5至約2;約2至 約7;約2至約6.5;約2至約6;約2至約5.5;約2至約5;約2至約4.5;約2至約4;約2至約3.5;約 2至約3;約2至約2.5;約2.5至約7;約2.5至約6.5;約2.5至約6;約2.5至約5.5;約2.5至約5; 約2.5至約4.5;約2.5至約4;約2.5至約3.5;約2.5至約3;約3至約7;約3至約6.5;約3至約6; 約3至約5.5;約3至約5;約3至約4.5;約3至約4;約3至約3.5;約3.5至約7;約3.5至約6.5;約 3.5至約6;約3.5至約5.5;約3.5至約5;約3.5至約4.5;約3.5至約4;約4至約7;約4至約6.5; 約4至約6;約4至約5.5;約4至約5;約4至約4.5;約4.5至約7;約4.5至約6.5;約4.5至約6;約 4.5至約5.5;約4.5至約5;約5至約7;約5至約6.5;約5至約6;約5至約5.5;約5.5至約7;約 5.5至約6.5;約5.5至約6;約6至約7;約6至約6.5;和約6.5至約7。
[0046] 在一些實施方案中，添加如下量的酸來降低pH:按細(xì)胞培養(yǎng)液(cell broth)的重 量（或體積）計約2 %至約10 %，約2 %至約9 %，約2 %至約8 %，約2 %至約7 %，約2 %至約 6%，約3%至約6%，約4%至約6%，約5%至約6%，約2%至約5%，約2%至約4%，約2%至 約3%，約3%至約5%，約3%至約4%，或約4%至約5%。
[0047]酶處理意指使細(xì)胞接觸一種或多種酶。酶包括但不限于：蛋白酶、纖維素酶、半纖 維素酶、殼多糖酶、果膠酶，及其組合。蛋白酶的非限制性實例包括絲氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋 白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、Alacase，及其組合。 纖維素酶的非限制性實例包括蔗糖酶、麥芽糖酶、乳糖酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、淀粉 酶、溶菌酶、神經(jīng)氨酸酶、半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、透明質(zhì)酸酶、普魯蘭 酶（pul Iulanase )、葡糖腦苷脂酶、半乳糖基神經(jīng)酰胺酶、乙?；肴樘前访?(&06丨7]^3]^〇1：083111；[11丨(^86)、巖藻糖苷酶、己糖胺酶、艾杜糖醛酸糖苷酶（丨(1111'011丨(1386)、 麥芽糖酶-葡糖淀粉酶，及其組合。殼多糖酶的非限制性實例包括殼三糖苷酶 (chitotriosidase)。果膠酶(pectinase)的非限制性實例包括果膠裂合酶(pectolyase)、 Pectozyme、聚半乳糖醛酸酶，及其組合。在一些實施方案中，一些酶通過加熱來活化。在一 些實施方案中，裂解不包括酶的使用。
[0048] 如本文所用的，"裂解細(xì)胞組合物"意指包含一個或多個裂解的細(xì)胞(包括細(xì)胞碎 片和細(xì)胞的其他內(nèi)容物）、與微生物油(來自所述裂解的細(xì)胞)和任選的培養(yǎng)液(其含有液體 (如水）、營養(yǎng)素、和微生物細(xì)胞)組合的組合物。在一些實施方案中，微生物細(xì)胞包含于含水 的發(fā)酵液或培養(yǎng)基中。在一些實施方案中，裂解細(xì)胞組合物意指這樣的組合物，其包含一個 或多個裂解的細(xì)胞、細(xì)胞碎片、微生物油、該細(xì)胞的天然內(nèi)容物，以及來自發(fā)酵液的水組份。 在一個實施方案中，該裂解細(xì)胞組合物包含液體、細(xì)胞碎片以及微生物油。在一些實施方案 中，裂解細(xì)胞組合物呈水包油乳液形式，其包含連續(xù)水相和分散油相的混合物。在一些實施 方案中，分散油相以按乳化的裂解細(xì)胞組合物的重量(或體積)計約1 %至約60 % ;約1 %至 約50% ;約1 %至約40% ;約1 %至約30% ;約1 %至約20%;約5%至約60% ;約5%至約50% ; 約5%至約40% ;約5 %至約30% ;約5%至約20% ;約10 %至約60% ;約10%至約50% ;約 10%至約40% ;約20%至約60% ;20%至50% ;20%至約40% ;約30%至約60%;約30%至約 50% ;或約40%至約60%的濃度存在。
[0049] 在一些實施方案中，裂解微生物細(xì)胞導(dǎo)致自細(xì)胞或細(xì)胞生物質(zhì)中的內(nèi)源性材料形 成乳液，所述內(nèi)源性材料包括但不限于蛋白質(zhì)、磷脂、碳水化合物，及其組合。雖然不被任何 的具體理論的束縛，據(jù)信本發(fā)明的方法能將乳化的裂解細(xì)胞組合物破碎或去乳化，允許微 生物油從該裂解細(xì)胞組合物分離。術(shù)語"乳液"和"乳化的"意指兩個或更多個不互溶相或?qū)?的混合物，其中一個相或?qū)臃稚⒂诹硪粋€相或?qū)又小Ｐg(shù)語"破碎(break)"、"破碎(break-up)"、"去乳化（demulsify)"、"去乳化作用（demulsification)"、"去乳化 (demulsifying)"，以及"破碎(breaking)"意指分離乳液的不互溶相或?qū)拥姆椒?。例如，?乳化的裂解細(xì)胞組合物進(jìn)行破碎或去乳化是意指這樣的方法，通過該方法，乳化的裂解細(xì) 胞組合物從具有一個或多個相或?qū)拥娜橐恨D(zhuǎn)變?yōu)榫哂袃蓚€或更多個相或?qū)拥慕M合物。例 如，在一些實施方案中，本發(fā)明的方法使乳化的裂解細(xì)胞組合物從單相破碎成二相或更多 相。在一些實施方案中，所述二相或更多相包括油相和水相。在一些實施方案中，本發(fā)明的 方法使乳化的裂解細(xì)胞組合物破碎成至少三相。在一些實施方案中，所述三相選自油相、水 相，以及固相。在一些實施方案中，所述相選自油相、乳化相、水相，以及固相。
[0050] 在一些實施方案中，所述方法包括通過降低裂解細(xì)胞組合物的pH將該裂解細(xì)胞組 合物去乳化。在一些實施方案中，通過添加酸來降低pH。所述酸包括但不限于:硫酸;磷酸； 鹽酸;氫溴酸;氫碘酸;次氯酸;亞氯酸;氯酸;高氯酸;氟硫酸;硝酸;氟銻酸;氟硼酸;六氟磷 酸;鉻酸;硼酸；乙酸;檸檬酸；甲酸;及其組合。在一些實施方案中，PH選自7或更低;約6.5或 更低；約6或更低;約5.5或更低；約5或更低;約4.5或更低；約4或更低；約3.5或更低；約3或 更低;約2.5或更低;約2或更低;約1.5或更低;約1或更低;和約0.5或更低。在一些實施方案 中，所述方法包括將裂解細(xì)胞組合物的PH降低至約6或更低。在其他實施方案中，pH選自約 0.5至約7;約0.5至約6.5;約0.5至約6;約0.5至約5.5;約0.5至約5;約0.5至約4.5;約0.5至 約4;約0.5至約3.5;約0.5至約3;約0.5至約2.5;約0.5至約2;約0.5至約1.5;約0.5至約1; 約1至約7;約1至約6.5;約1至約6;約1至約5.5;約1至約5;約1至約4.5;約1至約4;約1至約 3.5;約1至約3;約1至約2.5;約1至約2;約1至約1.5;約1.5至約7;約1.5至約6.5;約1.5至約 6;約1.5至約5.5;約1.5至約5;約1.5至約4.5;約1.5至約4;約1.5至約3.5;約1.5至約3;約 1.5至約2.5;約1.5至約2;約2至約7;約2至約6.5;約2至約6;約2至約5.5;約2至約5;約2至 約4.5;約2至約4;約2至約3.5;約2至約3;約2至約2.5;約2.5至約7;約2.5至約6.5;約2.5至 約6;約2.5至約5.5;約2.5至約5;約2.5至約4.5;約2.5至約4;約2.5至約3.5;約2.5至約3; 約3至約7;約3至約6.5;約3至約6;約3至約5.5;約3至約5;約3至約4.5;約3至約4;約3至約 3.5;約3.5至約7;約3.5至約6.5;約3.5至約6;約3.5至約5.5;約3.5至約5;約3.5至約4.5; 約3.5至約4;約4至約7;約4至約6.5;約4至約6;約4至約5.5;約4至約5;約4至約4.5;約4.5 至約7;約4.5至約6.5;約4.5至約6;約4.5至約5.5;約4.5至約5;約5至約7;約5至約6.5;約5 至約6;約5至約5.5;約5.5至約7;約5.5至約6.5;約5.5至約6;約6至約7;約6至約6.5;以及 約6.5至約7。在一些實施方案中，所述方法包括將裂解細(xì)胞組合物的pH降低到約0.5至約6。
[0051] 在一些實施方案中，所述方法包括通過添加酸將裂解細(xì)胞組合物去乳化，所述添 加的酸的量為：按細(xì)胞培養(yǎng)液或裂解細(xì)胞組合物的重量(或體積)計約〇 . 5 %至約20 %、約 0.5%至約15%、約0.5%至約10%、約0.5%至約9%、約0.5%至約8%、約0.5%至約7%、約 0.5%至約6%、約0.5%至約5%、約0.5%至約4%、約0.5%至約3%、約0.5%至約2%、和約 0.5 %至約1 %。在一個實施方案中，所述方法包括通過添加酸將裂解細(xì)胞組合物去乳化，所 述添加的酸的量按重量計是裂解細(xì)胞組合物的約0.5 %至約20 %。
[0052]在一些實施方案中，所述方法還包括在裂解細(xì)胞之前、過程中、或之后對其加熱。 在一些實施方案中，所述方法包括將裂解細(xì)胞組合物和/或細(xì)胞加熱到至少l〇°C，至少20 °C，至少25°C，至少30°C，至少35°C，至少40°C，至少45°C，至少50°C，至少55°C，至少60°C，至 少65°C，至少70°C，至少75°C，至少80°C，至少85°C，至少90°C，至少95°C，或至少100°C。在其 他實施方案中，所述方法包括將裂解細(xì)胞組合物和/或細(xì)胞加熱到約10°C至約100°C、約10 。(:至約90°C、約 10 °C至約80°C、約 10°C至約70°C、約20°C 至約 100°C、約20 °C至約90°C、約20 。(:至約80°C、約20 °C至約70°C、約30°C至約 100 °C、約30°C至約90°C、約30 °C至約80°C、約30 。(:至約70°C、約40 °C至約 100 °C、約40 °C 至約90°C、約40 °C至約80 °C、約50 °C 至約 100°C、約50 。(:至約90°C、約50 °C至約80°C、約50°C至約70°C、約60°C 至約 100°C、約60 °C至約90°C、約60 。(:至約80 °C、約70 °C至約100 °C、約70 °C至約90 °C、約80 °C至約100 °C、約80 °C至約90 °C，或約 90 °C至約100 °C。在又一個實施方案中，所述方法包括將裂解細(xì)胞組合物加熱到約70 °C至約 100 °C、約70°C至約90°C、約80 °C至約100°C、約80 °C至約90°C，或約90°C至約100°C。在又一 個實施方案中，所示方法包括將裂解細(xì)胞組合物加熱到至少70°C，至少75°C，至少80°C，至 少85 °C，至少90 °C，至少95°C，或至少100 °C。在又一個實施方案中，所述方法還包括將裂解 細(xì)胞組合物加熱到至少70°C。在又一個實施方案中，該方法還包括將裂解細(xì)胞組合物加熱 到約70°C至約100°C。
[0053] 在一些實施方案中，所述方法還包括加熱裂解細(xì)胞組合物直到該裂解細(xì)胞組合物 含有選自下組的平均粒度為止:5微米至25微米;5微米至20微米;5微米至15微米;10微米至 25微米；10微米至20微米；10微米至15微米；15微米至25微米；15微米至20微米;和20微米至 25微米。在另一個實施方案中，所述裂解細(xì)胞組合物的平均粒度選自：25微米或更低、20微 米或更低、15微米或更低、10微米或更低、和5微米或更低。在另一個實施方案中，所述裂解 細(xì)胞組合物的平均粒度是25微米或更低。在一些實施方案中，平均粒度可以使用，例如 Beckman Coulter LS 13 320粒度分析儀(Beckman Coulter,Brea,CA)來測量。在一些實施 方案中，平均粒度可以使用例如Malvern MS2000粒度分析儀(Malvern Instruments Ltd·, Worcestershire ,United Kingdom)來測量。在一些實施方案中，將裂解細(xì)胞組合物加熱足 夠的時間以將所述裂解細(xì)胞組合物去乳化。
[0054] 在一些實施方案中，細(xì)胞和/或裂解細(xì)胞組合物可以在密閉系統(tǒng)中或具有蒸發(fā)器 的系統(tǒng)中進(jìn)行加熱。在一些實施方案中，細(xì)胞和/或裂解細(xì)胞組合物可以在具有蒸發(fā)器的系 統(tǒng)中進(jìn)行加熱，從而通過蒸發(fā)來去除該細(xì)胞和/或該裂解細(xì)胞組合物中存在的一部分水。在 一些實施方案中，方法包括在具有蒸發(fā)器的系統(tǒng)中加熱細(xì)胞和/或裂解細(xì)胞組合物以去除 按重量(或體積)計多至1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%重量 (或體積)的該細(xì)胞和/或裂解細(xì)胞組合物中存在的水。在一些實施方案中，方法包括在具有 蒸發(fā)器的系統(tǒng)中加熱細(xì)胞和/或裂解細(xì)胞組合物，以去除按重量(或體積)計1%至50%、1% 至45%、1 %至40%、1 %至35%、1 %至30%、1 %至 25%、1 %至20%、1 %至 15%、1 %至 10%、 1%至5%、5%至50%、5%至45%、5%至40%、5%至35%、5%至30%、5%至25%、5%至 20%、5 % 至15 %、5% 至10 %、10 %至 50%、10 % 至 45 %、10% 至 40 %、10 %至 35%、10 % 至 30%、10%至 25%、10%至 20%、10%至 15%、15%至 50%、15%至 45%、15%至 40%、15%至 35%、15%至30%、15%至25%、15%至20%、20%至50%、20%至45%、20%至40%、20%至 35%、20%至30%、20%至25%、25%至50%、25%至45%、25%至40%、25%至35%、25%至 30%、30%至50%、30%至45%、30%至40%、30%至35%、35%至50%、35%至45%、35%至 40%、40%至50%、40%至45%、或45%至50% 的水。
[0055] 在一些實施方案中，所述方法還包括向裂解細(xì)胞組合物添加乳化劑。在一些實施 方案中，所述乳化劑是去污劑。在一些實施方案中，所述乳化劑為表面活性劑。在一些實施 方案中，在裂解之前、過程中，或之后添加該乳化劑。在一個實施方案中，在裂解之后添加該 乳化劑。在一些實施方案中，將該乳化劑添加至裂解細(xì)胞組合物。本文中所用的術(shù)語"乳化 劑"意指使乳液穩(wěn)定的物質(zhì)。乳化劑選自離子性乳化劑、非離子性乳化劑，及其組合。在一些 實施方案中，所述乳化劑是離子性乳化劑。
[0056]在一些實施方案中，離子性乳化劑選自陰離子乳化劑、陽離子乳化劑，及其組合。 在一些實施方案中，陰離子乳化劑可以是陰離子硫酸鹽乳化劑，例如烷基硫酸鹽(例如月桂 基硫酸銨、月桂基硫酸鈉(SLS)/十二烷基硫酸鈉(SDS)，及其組合），烷基醚硫酸鹽(例如月 桂醇聚醚（Iaureth)硫酸鈉/月桂基醚硫酸鈉、肉豆蔻醇聚醚硫酸鈉，及其組合），及其組合； 陰離子磺酸鹽乳化劑，例如多庫酯鹽(docusate)(例如磺基琥珀酸二辛酯鈉、磺酸鹽氟表面 活性劑(例如全氟辛烷磺酸鹽和全氟丁烷磺酸鹽）、烷基苯磺酸鹽，及其組合）；陰離子磷酸 鹽乳化劑(例如烷基芳基醚磷酸鹽、烷基醚磷酸鹽，及其組合）；陰離子羧酸鹽乳化劑(例如 烷基羧酸鹽(如硬脂酸鈉、月桂酰肌氨酸鈉 (sodium lauroyl sarcosinate)、羧酸鹽氟表面 活性劑(例如全氟壬酸鹽、全氟辛酸鹽，及其組合），及其組合）；及其組合。在一些實施方案 中，乳化劑是陰離子乳化劑。在一個實施方案中，陰離子乳化劑選自陰離子硫酸鹽乳化劑、 陰離子磺酸鹽乳化劑、陰離子磷酸鹽乳化劑、陰離子羧酸鹽乳化劑，及其組合。在另一個實 施方案中，陰離子乳化劑是陰離子硫酸鹽乳化劑。在又一個實施方案中，陰離子硫酸鹽乳化 劑選自月桂基硫酸銨、十二烷基硫酸鈉、月桂醇聚醚硫酸鈉、月桂基醚硫酸鈉、肉豆蔻醇聚 醚硫酸鈉，及其組合。在又一個實施方案中，陰離子硫酸鹽乳化劑是十二烷基硫酸鈉。
[0057]在一些實施方案中，陽離子乳化劑可以是pH依賴性伯胺;pH依賴性仲胺;pH依賴性 叔胺;奧替尼啶二鹽酸鹽(octenidine dihydrochloride);永久性帶電荷季銨陽離子(例如 烷基三甲基銨鹽（例如鯨錯基三甲基溴化銨（cetyl trimethylammonium bromide)(CTAB)/ 十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide)、鯨錯基三甲基氯化銨 (CTAC)，及其組合），鯨錯基氯化吡啶（pyr id in ium) (CPC)、苯扎氯銨（benza Ikonium chloride，BAC)、節(jié)索氯銨（benzethonium chloride，BZT)、5_溴-5-硝基-1，3_二噁燒、二甲 基雙十八烷基氯化銨、雙十八烷基二甲基溴化銨(DODAB)，及其組合）；及其組合。
[0058]在一些實施方案中，乳化劑的分子量選自500克/摩爾或更低、450克/摩爾或更低、 400克/摩爾或更低、350克/摩爾或更低、和300克/摩爾或更低。在進(jìn)一步的實施方案中，乳 化劑的分子量選自250克/摩爾至500克/摩爾、250克/摩爾至450克/摩爾、250克/摩爾至400 克/摩爾、250克/摩爾至350克/摩爾、250克/摩爾至300克/摩爾、300克/摩爾至500克/摩爾、 300克/摩爾至450克/摩爾、300克/摩爾至400克/摩爾、300克/摩爾至350克/摩爾、350克/摩 爾至500克/摩爾、350克/摩爾至450克/摩爾、350克/摩爾至400克/摩爾、400克/摩爾至500 克/摩爾、400克/摩爾至450克/摩爾、和450克/摩爾至500克/摩爾。例如，SDS的分子量是288 克/摩爾，而CTAB的分子量是364克/摩爾。在又一個實施方案中，乳化劑的分子量選自250 克/摩爾至450克/摩爾、250克/摩爾至400克/摩爾、250克/摩爾至350克/摩爾，以及250克/ 摩爾至300克/摩爾。
[0059]在一些實施方案中，乳化劑作為粉末添加。在一些實施方案中，乳化劑在溶液中添 加，所述溶液具有如下量的乳化劑濃度:5%至50%、5%至45%、5%至40%、5%至35%、5% 至 30%、10%至 50%、10%至 45%、10%至 40%、10%至 35%、10%至 30%、15%至 50%、15% 至 45%、15%至40%、15%至35%、15%至30%、20%至50%、20%至45%、20%至40%、20% 至 35%、20%至30%、25%至50%、25%至45%、25%至40%、25%至35%、25%至30%、30% 至 50%、30%至45%、30%至40%、和30%至35%。
[0060] 在一些實施方案中，乳化劑(例如以粉末形式或于溶液中）以選自如下的量添加： 按重量(或體積)計發(fā)酵液或裂解細(xì)胞組合物的〇 .2%至10%、0.2%至9.5%、0.2%至9%、 0.2%至8.5%、0.2%至8%、0.2%至7.5%、0.2%至7%、0.2%至6.5%、0.2%至6%、0.2% 至5.5%、0.2%至5%、0.2%至4.5%、0.2%至4%、0.2%至3.5%、0.2%至3%、0.2%至 2.5%、0.2%至2%、0.2%至1.5%、0.2%至1%、0.2%至0.5%、0.5%至10%、0.5%至 9.5%、0.5%至9%、0.5%至8.5%、0.5%至8%、0.5%至7.5%、0.5%至7%、0.5%至 6.5%、0.5%至6%、0.5%至5.5%、0.5%至5%、0.5%至4.5%、0.5%至4%、0.5%至 3.5%、0.5%至3%、0.5%至2.5%、0.5%至2%、0.5%至1.5%、0.5%至1%、1%至10%、 1% 至9.5%、1% 至9%、1% 至8.5%、1% 至8%、1% 至 7.5%、1% 至7%、1% 至6.5%、1% 至 6%、1%至5.5%、1%至5%、1%至4.5%、1%至4%、1%至3.5%、1%至3%、1%至2.5%、 1 %至2%、1 %至 1.5%、1.5%至 10%、1.5%至 9.5%、1.5% 至 9%、1.5%至 8.5%、1.5% 至 8%、1.5%至 7.5%、1.5%至7 %、1.5%至6.5%、1.5%至6%、1.5%至 5.5%、1.5%至5 %、 1.5%至4.5%、1.5%至4%、1.5%至3.5%、1.5%至3%、1.5%至2.5%、1.5%至2%、2%至 10%、2%至9.5%、2%至9%、2%至8.5%、2%至8%、2%至7.5%、2%至7%、2%至6.5%、 2% 至6 %、2% 至5.5%、2% 至5 %、2% 至4.5%、2% 至4%、2% 至3.5%、2% 至3 %、2% 至 2.5%、2.5% 至 10 %、2.5% 至9.5%、2.5% 至9 %、2.5% 至8.5%、2.5% 至8 %、2.5% 至 7.5%、2.5% 至7 %、2.5% 至6.5%、2.5% 至6 %、2.5% 至5.5%、2.5% 至5 %、2.5% 至 4.5%、2.5%至4%、2.5%至3.5%、2.5%至3%、3%至10%、3%至9.5%、3%至9%、3%至 8.5%、3%至8%、3%至7.5%、3%至7%、3%至6.5%、3%至6%、3%至5.5%、3%至5%、 3%至4.5%、3%至4%、和3%至3.5%。在另一個實施方案中，乳化劑(例如以粉末形式或于 溶液中）以選自如下的量添加:按重量(或體積)計選自發(fā)酵液或裂解細(xì)胞組合物的〇. 2 %至 5%、0.5%至5%、1 %至5%、1.5%至5%、2%至5%、2.5%至5%、和3%至5%。在又一個實 施方案中，乳化劑以如下的量添加:按重量計是裂解細(xì)胞組合物的〇. 2%至10%。
[0061] 在一些實施方案中，乳化劑降低發(fā)酵液或裂解細(xì)胞組合物的界面張力（即表面張 力）。如本文所使用的，術(shù)語"界面張力"或"表面張力"意指作用于二相之間的界面處一米長 的假想的線（imaginary line one meter in length)上的力。在一些實施方案中，由乳化 劑所形成的乳液的界面張力比由內(nèi)源性材料所形成的乳液更低。在一些實施方案中，界面 張力可以按達(dá)因/厘米(dynes/cm)來測量。
[0062] 在一些實施方案中，乳化劑增加發(fā)酵液或裂解細(xì)胞組合物的ζ電位 (zetapotential)絕對值（即提高正ζ電位或是降低負(fù)ζ電位）。在一些實施方案中，添加陰離 子乳化劑能導(dǎo)致發(fā)酵液或裂解細(xì)胞組合物的ζ電位下移（即降低正ζ電位或是提高負(fù) 位）。在一些實施方案中，添加陽離子乳化劑能導(dǎo)致發(fā)酵液或裂解細(xì)胞組合物的ζ電位上移 (即提高正ζ電位或是降低負(fù)ζ電位）。如本文所用的，術(shù)語"ζ電位"意指乳液中粒子之間的電 動電位。在一些實施方案中，ζ電位可以按mV來測量。在一些實施方案中，由乳化劑所形成的 乳液的ζ電位的絕對值比內(nèi)源性材料形成的乳液更高。
[0063] 在一些實施方案中，添加離子性乳化劑產(chǎn)生水包油乳液。在一些實施方案中，水包 油乳液包括但不限于油、水、以及離子性乳化劑。
[0064] 在一些實施方案中，所述方法還包括向裂解細(xì)胞組合物添加鹽。術(shù)語"鹽"意指離 子性化合物，其通過用金屬(例如，堿金屬、堿土金屬，及過渡金屬)或帶正電荷的化合物(例 如NH4+)代替來自酸的氫離子而形成。在一些實施方案中，鹽類可以是堿金屬鹽、堿土金屬 鹽、硫酸鹽，或其組合。鹽中存在的帶負(fù)電荷的離子的種類包括但不限于：鹵化物、硫酸根、 硫酸氫根、亞硫酸根，磷酸根、磷酸氫根、磷酸二氫根、碳酸根、碳酸氫根，及其組合。在一些 實施方案中，鹽選自：氯化鈉、硫酸鈉、碳酸鈉、氯化鈣、硫酸鉀、硫酸鎂、谷氨酸一鈉、硫酸 銨、氯化鉀、氯化鐵、硫酸鐵、硫酸鋁、乙酸銨，及其組合。在一些實施方案中，鹽不包括NaOH。 鹽可以作為固體(例如以結(jié)晶、無定形的、團(tuán)狀的(pelletized)，和/或顆粒形式)和/或含例 如水的溶液(例如稀釋溶液、飽和溶液，或過飽和溶液)添加。
[0065] 在一些實施方案中，以如下量添加鹽:5g/l至25g/l、5g/l至10g/l、10g/l至15g/l、 15g/l至20g/l、20g/l至25g/l、或10g/l至20g/l。
[0066] 在其他實施方案中，鹽以如下量添加至裂解細(xì)胞組合物:按重量(或體積)計是裂 解細(xì)胞組合物的20 %或更少，15 %或更少，10 %或更少，7.5 %或更少，5 %或更少，或2 %或 更少。在一些實施方案中，鹽以如下量添加至該裂解細(xì)胞組合物:按重量(或體積)計細(xì)胞裂 解組合物（例如總培養(yǎng)液重量(或體積））的約0.05 %至約20 %、約0.1 %至約20 %、約0.1 % 至約15 %、約0.1 %至約10 %、約0.5%至約20%、約0.5 %至約15 %、約0.5%至約10 %、約 0.5%至約5%、約0.5%至約4%、約0.5%至約3%、約0.5%至約2.5%、約0.5%至約2%、約 0.5%至約1.5%、約0.5%至約1 %、約1 %至約20%、約1 %至約15%、約1 %至約10%、約1 % 至約5%、約1 %至約4%、1 %至約3%、約1 %至約2.5%、約1 %至約2%、約1 %至約1.5%、約 1.5%至約5%、約1.5%至約4%、約1.5%至約3%、約1.5%至約2.5%、約1.5%至約2%、約 2%至20%、約2%至約15%、約2%至約10%、約2%至約5%、約2%至約4%、約2%至約3%、 約2 %至約2.5%、約2.5%至約5%、約2.5 %至約4%、約2.5 %至約3%、約3%至約5 %、約 3 %至約4%、約4%至約5 %、約5 %至約20 %、約5 %至約15 %、約5 %至約10 %、約10 %至約 20 %、約10 %至約15 %、或約15 %至約20 %。例如，當(dāng)裂解細(xì)胞組合物重量為I，OOOkg時，以 按重量(或體積)計0.5%至20%的量添加的鹽需要添加5kg至200kg的鹽至該裂解細(xì)胞組合 物。在一些實施方案中，鹽以如下量添加至該裂解細(xì)胞組合物:按重量(或體積)計所述裂解 細(xì)胞組合物的約〇 . 05 %至約20 %、按重量（或體積）約0.1 %至約20 %、按重量（或體積）約 0.5 %至約15 %，或按重量(或體積)約2 %至約10 %。
[0067] 在一些實施方案中，所述方法還包括（i)在裂解細(xì)胞之前、過程中、或之后進(jìn)行攪 拌；（i)在將裂解細(xì)胞組合物去乳化之前、過程中、或之后進(jìn)行攪拌;或其組合。術(shù)語"攪拌 (agitating)"和"攪拌(agitation)"是指通過施加力來影響細(xì)胞和/或裂解細(xì)胞組合物內(nèi) 的運動的方法。在一些實施方案中，該方法包括通過攪動、混合、共混、振蕩、振動，或其組合 而攪拌細(xì)胞和/或裂解細(xì)胞組合物。
[0068] 在一些實施方案中，攪拌器是分散型攪拌器，其將堿和/或鹽分散于該細(xì)胞組合物 或裂解細(xì)胞組成物之中。在一些實施方案中，攪拌器具有加熱板。在一些實施方案中，攪拌 器具有供攪動用的外罩。在一些實施方案中，攪拌器具有一個或多個葉輪。如本文使用的， "葉輪"意指這樣的裝置，其經(jīng)安排以在旋轉(zhuǎn)時使細(xì)胞組合物或裂解細(xì)胞組合物運動。適合 供本發(fā)明使用的葉輪包括直葉片葉輪、拉什頓葉片葉輪(Rushton blade impeller)、軸向 流式葉輪、徑向流式葉輪、凹面葉片盤葉輪、高效葉輪、螺旋槳(propellers)、槳(paddles)、 禍輪(turbines)，及其組合。
[0069] 在一些實施方案中，本發(fā)明的方法包括分別以0.1hp/l ,OOOgal至10hp/l，000gal、 0.5hp/l,OOOgal至8hp/l，000gal、lhp/l,OOOgal至6hp/l，000gal、或2hp/l,OOOgal至5hp/ I，000gal的細(xì)胞或組合物來攪拌細(xì)胞和/或裂解細(xì)胞組合物。在一些實施方案中，所述方法 包括分別以〇 . lhp/1000gal至10hp/1000gal的細(xì)胞或組合物來攪拌細(xì)胞和/或裂解細(xì)胞組 合物。
[0070]在一些實施方案中，本發(fā)明包括以如下轉(zhuǎn)速進(jìn)行攪拌：IOrpm或更低、20rpm或更 低、50rpm或更低、IOOrpm或更低、150rpm或更低、200rpm或更低、250rpm或更低、300rpm或更 低、350rpm 或更低、400rpm 或更低、IOrpm 至 400rpm、IOrpm 至 350rpm、IOrpm 至 300rpm、IOrpm 至250rpm、IOrpm至200rpm、IOrpm至150rpm、IOrpm至lOOrprn、IOrpm至50rpm、IOrpm至20rpm、 20rpm至400rpm、20rpm至350rpm、20rpm至300rpm、20rpm至250rpm、20rpm至200rpm、20rpm至 150印111、20印1]1至100印111、20印1]1至50印111、50印1]1至400印111、50印1]1至350印111、50印1]1至300印111、 50rpm至250rpm、50rpm至200rpm、50rpm至150rpm、50rpm至IOOrpm、IOOrpm至400rpm、IOOrpm 至350rpm、IOOrpm至300rpm、IOOrpm至250rpm、IOOrpm至200rpm、IOOrpm至150rpm、150rpm至 400rpm、150rpm至350rpm、150rpm至300rpm、150rpm至250rpm、150rpm至200rpm、200rpm至 400rpm、200rpm至350rpm、200rpm至300rpm、200rpm至250rpm、250rpm至400rpm、250rpm至 350rpm、250rpm 至 300rpm、300rpm 至400rpm、300rpm 至 350rpm、或 350rpm 至400rpm。在一些實 施方案中，攪拌以350rpm或更低的轉(zhuǎn)速進(jìn)行。
[0071 ]在一些實施方案中，所述方法包括用攪拌器來攪拌細(xì)胞和/或裂解細(xì)胞組合物，所 述攪拌器具有90英尺/分鐘至1，200英尺/分鐘、200英尺/分鐘至1，000英尺/分鐘、300英尺/ 分鐘至800英尺/分鐘、400英尺/分鐘至700英尺/分鐘、或500英尺/分鐘至600英尺/分鐘的 葉輪尖端速率。在一些實施方案中，所述方法包括用攪拌器來攪拌，所述攪拌器具有200英 尺/分鐘至1000英尺/分鐘的葉輪尖端速率。
[0072]在一些實施方案中，方法包括使用攪拌器來攪拌細(xì)胞和/或裂解細(xì)胞組合物，所述 攪拌器具有如下葉輪尖端速率:5厘米/秒至900厘米/秒、5厘米/秒至750厘米/秒、5厘米/秒 至500厘米/秒、5厘米/秒至350厘米/秒、5厘米/秒至300厘米/秒、5厘米/秒至250厘米/秒、5 厘米/秒至200厘米/秒、5厘米/秒至150厘米/秒、5厘米/秒至100厘米/秒、5厘米/秒至50厘 米/秒、5厘米/秒至25厘米/秒、25厘米/秒至900厘米/秒、25厘米/秒至750厘米/秒、25厘米/ 秒至500厘米/秒、25厘米/秒至350厘米/秒、25厘米/秒至300厘米/秒、25厘米/秒至250厘 米/秒、25厘米/秒至200厘米/秒、25厘米/秒至150厘米/秒、25厘米/秒至100厘米/秒、25厘 米/秒至50厘米/秒、50厘米/秒至900厘米/秒、50厘米/秒至750厘米/秒、50厘米/秒至500厘 米/秒、50厘米/秒至350厘米/秒、50厘米/秒至300厘米/秒、50厘米/秒至250厘米/秒、50厘 米/秒至200厘米/秒、50厘米/秒至150厘米/秒、50厘米/秒至100厘米/秒、100厘米/秒至900 厘米/秒、100厘米/秒至750厘米/秒、100厘米/秒至500厘米/秒、100厘米/秒至350厘米/秒、 100厘米/秒至300厘米/秒、100厘米/秒至250厘米/秒、100厘米/秒至200厘米/秒、100厘米/ 秒至150厘米/秒、150厘米/秒至900厘米/秒、150厘米/秒至750厘米/秒、150厘米/秒至500 厘米/秒、150厘米/秒至350厘米/秒、150厘米/秒至300厘米/秒、150厘米/秒至250厘米/秒、 150厘米/秒至200厘米/秒、200厘米/秒至900厘米/秒、200厘米/秒至750厘米/秒、200厘米/ 秒至500厘米/秒、200厘米/秒至350厘米/秒、200厘米/秒至300厘米/秒、200厘米/秒至250 厘米/秒、250厘米/秒至900厘米/秒、250厘米/秒至750厘米/秒、250厘米/秒至500厘米/秒、 250厘米/秒至350厘米/秒、250厘米/秒至300厘米/秒、300厘米/秒至900厘米/秒、300厘米/ 秒至750厘米/秒、300厘米/秒至500厘米/秒、300厘米/秒至350厘米/秒、350厘米/秒至900 厘米/秒、350厘米/秒至850厘米/秒、350厘米/秒至800厘米/秒、350厘米/秒至750厘米/秒、 350厘米/秒至700厘米/秒、350厘米/秒至650厘米/秒、350厘米/秒至600厘米/秒、350厘米/ 秒至550厘米/秒、350厘米/秒至500厘米/秒、350厘米/秒至450厘米/秒、350厘米/秒至400 厘米/秒、400厘米/秒至900厘米/秒、400厘米/秒至850厘米/秒、400厘米/秒至800厘米/秒、 400厘米/秒至750厘米/秒、400厘米/秒至700厘米/秒、400厘米/秒至650厘米/秒、400厘米/ 秒至600厘米/秒、400厘米/秒至550厘米/秒、400厘米/秒至500厘米/秒、400厘米/秒至450 厘米/秒、450厘米/秒至900厘米/秒、450厘米/秒至850厘米/秒、450厘米/秒至800厘米/秒、 450厘米/秒至750厘米/秒、450厘米/秒至700厘米/秒、450厘米/秒至650厘米/秒、450厘米/ 秒至600厘米/秒、450厘米/秒至550厘米/秒、450厘米/秒至500厘米/秒、500厘米/秒至900 厘米/秒、500厘米/秒至850厘米/秒、500厘米/秒至800厘米/秒、500厘米/秒至750厘米/秒、 500厘米/秒至700厘米/秒、500厘米/秒至650厘米/秒、500厘米/秒至600厘米/秒、500厘米/ 秒至550厘米/秒、550厘米/秒至900厘米/秒、550厘米/秒至850厘米/秒、550厘米/秒至800 厘米/秒、550厘米/秒至750厘米/秒、550厘米/秒至700厘米/秒、550厘米/秒至650厘米/秒、 550厘米/秒至600厘米/秒、600厘米/秒至900厘米/秒、600厘米/秒至850厘米/秒、600厘米/ 秒至800厘米/秒、600厘米/秒至750厘米/秒、600厘米/秒至700厘米/秒、600厘米/秒至650 厘米/秒、650厘米/秒至900厘米/秒、650厘米/秒至850厘米/秒、650厘米/秒至800厘米/秒、 650厘米/秒至750厘米/秒、650厘米/秒至700厘米/秒、700厘米/秒至900厘米/秒、700厘米/ 秒至850厘米/秒、700厘米/秒至800厘米/秒、700厘米/秒至750厘米/秒、750厘米/秒至900 厘米/秒、750厘米/秒至850厘米/秒、750厘米/秒至800厘米/秒、800厘米/秒至900厘米/秒、 800厘米/秒至850厘米/秒、或850厘米/秒至900厘米/秒。術(shù)語"葉輪尖端速率"，意指當(dāng)葉輪 環(huán)繞其中心軸旋轉(zhuǎn)時，其最外部分的速率。
[0073] 在一些實施方案中，攪拌（以及任選的如本文所述的額外步驟)是在含有葉輪的容 器中進(jìn)行的，其中所述葉輪直徑與該容器體積之比是0.1至0.5、0.1至0.4、0.2至0.5、0.2至 0·4、0·3至0.5、或0.3至0.4。
[0074] 在一些實施方案中，攪拌（以及任選的如本文所述的額外步驟)是在含有葉輪的容 器中進(jìn)行的，其中所述葉輪直徑對該容器內(nèi)徑之比是至少0.25、至少0.34、至少0.65、0.25 至 0.65、0.25至0.33、0.3至0.6、0.3至0.5、0.3至0.4、0.34至0.65、0.34至0.6、0.34至0.55、 0.37至0.55、0.4至0.65、0.4至0.6、0.4至0.5、或0.42至0.55。
[0075] 在一些實施方案中，攪拌包括將細(xì)胞和/或裂解細(xì)胞組合物混合從而使該細(xì)胞和/ 或裂解細(xì)胞組合物處于由如下雷諾數(shù)(Reynolds)描述的流動條件下：10至10,000、1，000至 10,000、1，500至10,000、或2,000至10,000。在一些實施方案中，攪拌過程中裂解的細(xì)胞乳 液具有2,000或更多、3,000或更多、或5,000或更多、或2,000至10,000、3,000至10,000、或 5,000至10,000的雷諾數(shù)。
[0076] 在一些實施方案中，攪拌器皿可以具有2個葉輪。在一些實施方案中，所述葉輪是 拉什頓葉片葉輪。在一些實施方案中，所述葉輪是以至少與最小的葉輪直徑相等的距離彼 此分離。在一些實施方案中，所述葉輪尖端至尖端為30英寸至40英寸、33英寸至37英寸、33 英寸、34英寸、35英寸、36英寸或37英寸。在一些實施方案中，所述攪拌器皿具有至少10,000 升、至少20，OOO升、至少30，OOO升、至少40，OOO升或至少50，OOO升的容積。在一些實施方案 中，所述攪拌器皿具有90英寸至110英寸、95英寸至105英寸、98英寸、99英寸、100英寸、101 英寸、或102英寸的內(nèi)徑。在一些實施方案中，第一葉輪位于距攪拌器皿底部15英寸至20英 寸、16英寸至19英寸、或17英寸至18英寸，而第二葉輪位于第一個葉輪之上60英寸至80英 寸、65英寸至75英寸、68英寸、69英寸、70英寸、71英寸、72英寸、73英寸、74英寸、或75英寸。 在一些實施方案中，以至少50rpm、至少60rpm、或至少70rpm攪拌裂解細(xì)胞組合物。在一些實 施方案中，以50rpm至70rpm、50rpm至60rpm、或60rpm至70rpm攪拌裂解細(xì)胞組合物。
[0077]在一些實施方案中，所述方法還包括攪拌所述裂解細(xì)胞組合物。在一些實施方案 中，攪拌裂解細(xì)胞組合物的方法使該裂解細(xì)胞組合物去乳化。
[0078]在一些實施方案中，去乳化過程中形成的油珠的平均粒度選自：5微米至50微米;5 微米至45微米;5微米至40微米;5微米至35微米;5微米至30微米;5微米至25微米;5微米至 20微米;5微米至15微米；10微米至50微米；10微米至45微米；10微米至40微米；10微米至35 微米；10微米至30微米；10微米至25微米；10微米至20微米；10微米至15微米；15微米至50微 米；15微米至45微米；15微米至40微米；15微米至35微米；15微米至30微米；15微米至25微 米；15微米至20微米；20微米至50微米；20微米至45微米;20微米至40微米；20微米至35微 米；20微米至30微米；20微米至25微米；25微米至50微米;25微米至45微米；25微米至40微 米；25微米至35微米；25微米至30微米；30微米至50微米;30微米至45微米；30微米至40微 米;30微米至35微米；35微米至50微米；35微米至45微米;35微米至40微米;40微米至50微 米;40微米至45微米;和45微米至50微米。在另一個實施方案中，去乳化過程中形成的油珠 的平均粒度選自：至少10微米、至少15微米、至少20微米、至少25微米、至少30微米、至少35 微米、及至少40微米或更大。在另一個實施方案中，去乳化過程中形成的油珠的平均粒度選 自：至少10微米、至少15微米、至少20微米、及至少25微米。在一些實施方案中，平均粒度可 以使用例如Beckman Coulter LS 13 320粒度分析儀(Beckman Coulter,Brea,CA)來測量。 在一些實施方案中，平均粒度可以使用例如Malvern MS2000粒度分析儀（Malvern Instruments Ltd.，Worcestershire，United Kingdom)來測量。
[0079] 在一些實施方案中，使裂解細(xì)胞組合物經(jīng)受乳化劑、酸、鹽、熱以及攪拌中的一種 或多種以形成去乳化的裂解細(xì)胞組合物。
[0080] 在一些實施方案中，所述方法還包括將所述裂解及去乳化步驟組合在一起以形成 一步裂解及去乳化步驟。
[0081 ]在一些實施方案中，所述方法還包括將所述裂解及去乳化步驟組合在一起以形成 一步裂解及去乳化步驟，所述步驟包括提升該細(xì)胞及裂解細(xì)胞組合物的pH。在一些實施方 案中，所述一步裂解及去乳化步驟包括將該細(xì)胞及裂解的細(xì)胞組合物的PH提升至約8或以 上。在一些實施方案中，所述一步裂解及去乳化步驟包括添加堿來提升該細(xì)胞及裂解細(xì)胞 組合物的pH。在一些實施方案中，所述一步裂解及去乳化步驟包括添加堿來將該細(xì)胞及該 裂解細(xì)胞組合物的PH提升至約8或以上。
[0082] 在一些實施方案中，可以添加至所述一步裂解及去乳化步驟的堿選自上文中已描 述的堿。在一些實施方案中，所述一步裂解及去乳化步驟的細(xì)胞及裂解細(xì)胞組合物的pH可 以提升至選自如下的pH:約8或更高；約9或更高；約10或更高；約11或更高;和約12或更高。 在其他實施方案中，所述一步裂解及去乳化步驟的細(xì)胞及裂解細(xì)胞組合物的PH可以提升至 選自如下的pH: 7至13; 7至12; 7至11; 7至10; 7至9 ;8至13 ;8至12 ;8至11 ;8至10 ;8至9 ;9至12; 9至11 ;9至10; 10至12;和10至11。
[0083] 在一些實施方案中，所述細(xì)胞在合適的pH處進(jìn)行裂解以形成去乳化的裂解細(xì)胞組 合物。在一些實施方案中，通過添加上文中已描述的堿來得到合適的pH。在一些實施方案 中，合適的pH選自7至13; 7至12; 7至11; 7至10; 7至9; 8至13; 8至12; 8至11; 8至10; 8至9 ;9至 13;9至12;9至11 ;9至10; 10至13; 10至12;和10至11。在其他實施方案中，合適的pH選自10至 13。在另外的實施方案中，合適的pH選自至少10、至少11、至少12、和至少13。
[0084] 在一些實施方案中，合適的pH通過以選自如下的量添加堿來得到：按重量（或體 積)計，細(xì)胞培養(yǎng)液或組合物的約〇. 5%至約20%、約0.5%至約15%、約0.5 %至約10 %、約 0.5 %至約9 %、約0.5 %至約8 %、約0.5 %至約7 %、約0.5 %至約6 %、約0.5 %至約5 %、約 0.5%至約4%、約0.5%至約3%、約0.5%至約2%、和約0.5%至約1 %。在一個實施方案中， 通過以按培養(yǎng)液重量計約0.5%至約20%的量添加堿來得到合適的pH。
[0085] 在其他實施方案中，合適的pH通過添加上文中已描述的酸來得到。在一些實施方 案中，合適的pH選自7或更低；約6.5或更低；約6或更低；約5.5或更低；約5或更低；約4.5或 更低；約4或更低;約3.5或更低；約3或更低;約2.5或更低；約2或更低；約1.5或更低；約1或 更低;和約0.5或更低。在一些實施方案中，合適的pH選自6或更低。在一些實施方案中，合適 的pH選自約0.5至約7;約0.5至約6.5;約0.5至約6;約0.5至約5.5;約0.5至約5;約0.5至約 4.5;約0.5至約4;約0.5至約3.5;約0.5至約3;約0.5至約2.5;約0.5至約2;約0.5至約1.5; 約0.5至約1;約1至約7;約1至約6.5;約1至約6;約1至約5.5;約1至約5;約1至約4.5;約1至 約4;約1至約3.5;約1至約3;約1至約2.5;約1至約2;約1至約1.5;約1.5至約7 ;約1.5至約 6.5;約1.5至約6;約1.5至約5.5;約1.5至約5;約1.5至約4.5;約1.5至約4;約1.5至約3.5; 約1.5至約3;約1.5至約2.5;約1.5至約2;約2至約7;約2至約6.5;約2至約6;約2至約5.5;約 2至約5;約2至約4.5;約2至約4，約2至約3.5;約2至約3;約2至約2.5;約2.5至約7;約2.5至 約6.5;約2.5至約6;約2.5至約5.5;約2.5至約5 ;約2.5至約4.5;約2.5至約4;約2.5至約 3.5;約2.5至約3;約3至約7;約3至約6.5;約3至約6;約3至約5.5;約3至約5;約3至約4.5;約 3至約4;約3至約3.5;約3.5至約7;約3.5至約6.5;約3.5至約6;約3.5至約5.5;約3.5至約5; 約3.5至約4.5;約3.5至約4;約4至約7;約4至約6.5;約4至約6;約4至約5.5;約4至約5;約4 至約4.5;約4.5至約7;約4.5至約6.5;約4.5至約6;約4.5至約5.5;約4.5至約5;約5至約7; 約5至約6.5;約5至約6;約5至約5.5;約5.5至約7;約5.5至約6.5;約5.5至約6;約6至約7;約 6至約6.5;及約6.5至約7。在一些實施方案中，合適的pH選自約0.5至約6。
[0086] 在一些實施方案中，所述方法包括將含有微生物油的未洗滌的裂解細(xì)胞去乳化以 形成未洗滌的去乳化的裂解細(xì)胞組合物;然后從該未洗滌的去乳化的裂解細(xì)胞組成物分離 該油。未洗滌的去乳化的裂解細(xì)胞組合物是指這樣的方法，其不用例如水或緩沖液(其隨后 通過離心來去除）來洗滌裂解細(xì)胞組合物。洗滌裂解細(xì)胞組合物可減少從細(xì)胞獲得的油的 總產(chǎn)量/收率。
[0087] 在可供選擇的實施方案中，所述裂解細(xì)胞組合物的洗滌次數(shù)可以減少1次、2次、3 次或更多次。在一些實施方案中，洗滌不超過1次、2次，或3次。
[0088] 在一些實施方案中，形成裂解細(xì)胞組合物、添加乳化劑至裂解細(xì)胞組合物、使裂解 細(xì)胞組合物接觸酸或降低裂解細(xì)胞組合物的pH、使裂解細(xì)胞組合物接觸鹽、加熱裂解細(xì)胞 組合物、以及攪拌裂解細(xì)胞組合物的各種組合可以在單一器皿中進(jìn)行。在一些實施方案中， 使細(xì)胞接觸酸或降低細(xì)胞的pH、添加乳化劑至裂解細(xì)胞組合物、使細(xì)胞接觸鹽、加熱細(xì)胞， 以及攪拌細(xì)胞的各種組合可以在單一器皿中進(jìn)行。在一些實施方案中，所述單一器皿包括 發(fā)酵器皿。在一些實施方案中，所述發(fā)酵器皿可具有20，OOO升、至少50，OOO升、至少100，OOO 升、至少120,000升、至少150,000升、至少200,000升、或至少220,000升的容積。在一些實施 方案中，所述發(fā)酵器皿可具有20,000升至220,000升、20,000升至100,000升、20,000升至 50,000升、50,000 升至 220,000 升、50,000升至 150,000 升、50,000升至 100,000升、100,000 升至 220，000升、100，000升至 150，000升、100，000 升至 120，000升、150，000升至 220，000 升、 150，000升至200，000升、或200，000升至220，000升的容積。
[0089] 在一些實施方案中，可將在器皿中形成的一定量的細(xì)胞和/或裂解細(xì)胞組合物轉(zhuǎn) 移至一個或多個攪拌器皿中。在一些實施方案中，所述攪拌器皿可具有至少20，000升、至少 30，000升、至少40，000升或至少50，000升的容積。在一些實施方案中，所述攪拌器皿可具有 20,000升至 50,000 升、20,000 升至 40,000升、20,000升至 30,000 升、30,000升至 50,000升、 30，000升至40，000升或40，000升至50，000升的容積。
[0090] -般而言，本文所述的方法不利用有機溶劑來從微生物細(xì)胞獲得、分離，或者以其 他方式回收微生物油。在一些實施方案中，從微生物細(xì)胞獲得微生物油時不使用有機溶劑。 在另一個實施方案中，在本文所述方法的過程中，不將有機溶劑以足以獲得微生物油的量 或濃度的添加至細(xì)胞、裂解細(xì)胞組合物，和/或油。有機溶劑包括極性溶劑、非極性溶劑、水 混溶溶劑、水不混溶溶劑，及其組合。
[0091] 在一些實施方案中，所述方法還包括從去乳化的裂解細(xì)胞組合物分離油。在一些 實施方案中，所述方法包括通過將去乳化的裂解細(xì)胞組合物離心而從該去乳化的裂解細(xì)胞 組合物分離油。在一些實施方案中，通過允許去乳化的裂解細(xì)胞組合物靜置而從該去乳化 的裂解細(xì)胞組合物分離油，其中所述油是使用重力從該去乳化的裂解細(xì)胞組合物分離的 (例如作為分離層）。在一些實施方案中，分離通過親脂性膜實現(xiàn)。在一些實施方案中，所述 分離包括在10°C至100°c的溫度離心。在一些實施方案中，通過如下從去乳化的裂解細(xì)胞組 合物分離所述油:首先提升pH(例如通過添加如上所述的堿），然后離心該去乳化的裂解細(xì) 胞組合物以獲得該油。
[0092] 在一些實施方案中，通過向去乳化的裂解細(xì)胞組合物添加堿來提升所述去乳化的 裂解細(xì)胞組合物的pH?？上蛉ト榛牧呀饧?xì)胞組合物添加的堿與上文所述的那些相同。在 一些實施方案中，所述pH選自約7.5或更高;約8或更高；約9或更高；約10或更高；約11或更 高；和約12或更高。在其他實施方案中，所述pH是選自如下的pH: 7至13; 7至12; 7至11; 7至 10;7至9;8至13;8至12;8至11 ;8至10;8至9;9至12;9至11;9至10 ;10至12;和10至11。
[0093] 在一些實施方案中，所述方法包括從去乳化的裂解細(xì)胞組合物分離油，所述分離 是通過在至少l〇°C、至少20°C、至少25°C、至少30°C、至少35°C、至少40°C、至少45°C、至少50 。(：、至少55 °C、至少60 °C、至少65 °C、至少70 °C、至少75°C、至少80 °C、至少85°C、至少90 °C、至 少95°C、或至少100°C的溫度離心所述去乳化的裂解細(xì)胞組合物來進(jìn)行的。在一些實施方案 中，所述方法包括從去乳化的裂解細(xì)胞組合物分離油，所述分離是通過在l〇°C至100°C、10 。(：至 90°C、10°C 至 80°C、20°C 至 100°C、20°C 至 90°C、20°C 至 80°C、25°C 至 100°C、25°C 至 90°C、 25 °C 至80 °C、25 °C 至75 °C、30 °C 至 100 °C、30 °C 至90 °C、30 °C 至80 °C、40 °C 至 100 °C、40 °C 至90 °(：、40°(：至80°(：、50°(：至100°(：、50°(：至90°(：、50°(：至80°(：、50°(：至70°(：、60°(：至100°(：、60°(：至 90°(：、60°(：至80°(：、60°(：至70°(：、70°(：至100°(：、70°(：至90°(：、70°(：至80°(：、80°(：至100°(：、80 1€ 至90°C、或90°C至100°C的溫度離心所述去乳化的裂解細(xì)胞組合物來進(jìn)行的。
[0094] 在一些實施方案中，離心是以1千克每分鐘（kg/min)至500kg/分鐘、Ikg/分鐘至 400kg/分鐘、Ikg/分鐘至300kg/分鐘、Ikg/分鐘至200kg/分鐘、Ikg/分鐘至IOOkg/分鐘、 Ikg/分鐘至75kg/分鐘、Ikg/分鐘至50kg/分鐘、Ikg/分鐘至40kg/分鐘、Ikg/分鐘至30kg/分 鐘、Ikg/分鐘至25kg/分鐘、Ikg/分鐘至IOkg/分鐘、IOkg/分鐘至500kg/分鐘、IOkg/分鐘至 400kg/分鐘、IOkg/分鐘至300kg/分鐘、IOkg/分鐘至200kg/分鐘、IOkg/分鐘至IOOkg/分鐘、 IOkg/分鐘至75kg/分鐘、IOkg/分鐘至50kg/分鐘、IOkg/分鐘至40kg/分鐘、IOkg/分鐘至 30kg/分鐘、20kg/分鐘至500kg/分鐘、20kg/分鐘至400kg/分鐘、20kg/分鐘至300kg/分鐘、 20kg/分鐘至200kg/分鐘、20kg/分鐘至IOOkg/分鐘、20kg/分鐘至75kg/分鐘、20kg/分鐘至 50kg/分鐘、20kg/分鐘至40kg/分鐘、25kg/分鐘至500kg/分鐘、25kg/分鐘至400kg/分鐘、 25kg/分鐘至300kg/分鐘、25kg/分鐘至200kg/分鐘、25kg/分鐘至IOOkg/分鐘、25kg/分鐘至 75kg/分鐘、25kg/分鐘至50kg/分鐘、30kg/分鐘至60kg/分鐘、30kg/分鐘至50kg/分鐘、 30kg/分鐘至40kg/分鐘、50kg/分鐘至500kg/分鐘、IOOkg/分鐘至500kg/分鐘、或200kg/分 鐘至500kg/分鐘的（去乳化的裂解細(xì)胞組合物進(jìn)入離心機的)進(jìn)料速率進(jìn)行的。
[0095] 在一些實施方案中，所述方法包括以l，000g至25,00(^、1，00(^至20,00(^、1，000 8 至10,00(^、2,00(^至25,00(^、2,00(^至20,00(^、2,00(^至15,00(^、3,00(^至25,00(^、3， OOOg至20，000g、5,000g至25,000g、5,000gS20,000g、5,000gSl5,000g、5,000gSl0, 000g、5 ,OOOg至8,000g、10 ,OOOg至25,000g、15 ,OOOg至25,000g、或至少l,000g、至少2， OOOg、至少4，000g、至少5，000g、至少7，000g、至少8，000g、至少 10，000g、至少 15，000g、至少 20，000g、或至少25，000g的離心力對去乳化的裂解細(xì)胞組合物進(jìn)行離心。如本文所用的， "g"意指標(biāo)準(zhǔn)重力或約9.8m/s 2。在一些實施方案中，所述方法包括以4，OOOrpm至14， 000印111、4,000印1]1至10,000印111、6,000印1]1至14,000印111、6,000印1]1至12,000印111、8,000至14， 000rpm、8，OOOrpm至12，OOOrpm、或8，OOOrpm至10，OOOrpm離心去乳化的裂解細(xì)胞組合物。 [00 96] 在一些實施方案中，可以通過例如傾析、撇除（skimming)、真空處理、栗送、吸取 (sucking off )、抽取(drawing off )、虹吸（siphoning)，或以其他方式從分離的組合物表 面回收微生物油來回收所述油。
[0097] 在一些實施方案中，所述方法包括將回收的油進(jìn)行干燥以從該油去除水。在一些 實施方案中，干燥該油可包括但不限于加熱該油以蒸發(fā)水。在一些實施方案中，干燥后所述 油具有按油的重量（或體積）百分比計為低于3%、低于2.5%、低于2%、低于1.5%、低于 1 %、低于0.5%、低于0.1 %、或0%的水含量。在一些實施方案中，干燥后所述油具有按油的 重量(或體積）百分比計為〇%至3%、0%至2.5%、0%至2%、0%至1.5%、0%至1%、0%至 0.5%、0.1%至3%、0.1%至2.5%、0.1%至2%、0.1%至1.5%、0.1%至1%、0.1%至 0.5%、0.5%至3%、0.5%至2.5%、0.5%至2%、0.5%至1.5%、0.5%至1%、1%至3%、1% 至2.5%、1 %至2%、1 %至1.5%、1.5%至3%、1.5%至2.5%、1.5%至2%、2%至3%、2%至 2.5%、或2.5%至3%的水含量。
[0098] 本發(fā)明公開了可以通過本文所述任一種方法從微生物細(xì)胞獲得的微生物油。在一 些實施方案中，所述油包含按重量(或體積)計至少30%的花生四烯酸。在一些實施方案中， 所述油包含按重量(或體積)計至少30%的二十二碳六烯酸。
[0099]茴香胺值(AV)根據(jù)AOCS官方方法Cd 18-90來確定。在一個實施方案中，本文所述 的油具有低于約50;低于約40;低于約30;低于約20;低于約15;或低于約10的AV。在一些實 施方案中，所述油具有低于約50的AV。術(shù)語茴香胺值意指次級反應(yīng)產(chǎn)物(例如油的氧化過程 中產(chǎn)生的醛和酮）的測量值。
[0100]過氧化物值(PV)根據(jù)AOCS官方方法Cd 8-53來確定。在一個實施方案中，本文所述 的油具有低于約20meq/kg;低于約10meq/kg;或低于約5meq/kg的PV。在一些實施方案中，所 述油具有低于5meq/kg的PV。術(shù)語過氧化物值意指初級反應(yīng)產(chǎn)物(例如油的氧化過程中產(chǎn)生 的過氧化物和氫過氧化物)的測量值。如本文所用，過氧化物值以meq/kg測量。
[0101 ] 在一些實施方案中，所述油具有IOOppm或更低、95ppm或更低、90ppm或更低、85ppm 或更低、80ppm或更低、75ppm或更低、70ppm或更低、65ppm或更低、60ppm或更低、55ppm或更 低、50ppm或更低、45ppm或更低、40ppm或更低、35ppm或更低、30ppm或更低、25ppm或更低、 20ppm或更低、15ppm或更低、IOppm或更低、9ppm或更低、8ppm或更低、7ppm或更低、6ppm或更 低、5ppm或更低、4ppm或更低、3ppm或更低、2ppm或更低、或Ippm或更低的磷含量。在一些實 施方案中，所述油具有約8ppm或更低的磷含量。
[0102] 在一些實施方案中，所述油包含一種或多種PUFA。在一些實施方案中，所述油包含 至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少 50 %、至少60 %、至少70 %或至少80 %的PUFA(按PUFA重量計）。在一些實施方案中，所述油 包含至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、 至少50 %、至少60 %、至少70 %或至少80 %的DHA(按DHA重量計），和/或至少10 %、至少 15%、或至少20%的DPA n-6(按DPAn-6重量計），和/或至少10%、至少15%、或至少20%的 EPA(按EPA重量計），和/或至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、 至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、或至 少80%的ARA(按ARA重量計）。在一些實施方案中，所述油包含低于50%、低于40%、低于 30%、低于20%、低于15%、低于10%、或低于5%的EPA(按EPA重量計）。在一些實施方案中， 所述油包含低于50%、低于40%、低于30%、低于20%、低于15%、低于10%、或低于5%的 DHA(按DHA重量計）。在一些實施方案中，油包含按重量(或體積)計低于10%、低于5%、低于 2%、低于1 %、或低于0.5%的固醇類。
[0103] 在一些實施方案中，油包含按重量(或體積)計至少50%、至少60%、至少70%、至 少 80%、至少90%、至少95%、或50%至95%、50%至90%、50%至85%、50%至80%、50%至 75%、60%至95%、60%至90%、60%至85%、70%至95%、70%至90%、70%至85%、75%至 95%、75%至90%、或75%至85%的甘油三酯。
[0104] 在一些實施方案中，所述甘油三酯包含按重量(或體積)計至少10 %、至少20%、至 少30 %、至少35%、至少40 %、至少50%、至少60 %、至少70%或至少80 %的DHA。在一些實施 方案中，所述甘油三酯包含按重量(或體積)計至少10%、至少20%、至少30%、至少35%、至 少40 %、至少45 %、至少50 %、至少55 %、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、或至少 80%的ARA。在一些實施方案中，所述甘油三酯包含按重量(或體積)計至少50%、至少40%、 至少30%、至少20%、至少15%、至少10%、或至少5%的EPA。
[0105] 在一些實施方案中，通過本文所述方法的任一種獲得和/或回收的微生物油是粗 制油。在另一個實施方案中，本文所述的油是精制油。"粗制油"是從微生物細(xì)胞獲得的、未 經(jīng)進(jìn)一步加工的油。"精制油"是通過用精制、漂白，和/或脫臭的標(biāo)準(zhǔn)流程處理粗制油而獲 得的油。參見例如，美國專利No. 5，130，242。在一些實施方案中，精制包括但不限于:苛性精 制法(caustic ref ining)、脫膠、酸處理、堿處理、冷卻、加熱、漂白、脫臭、脫酸，及其組合。
[0106] 在一些實施方案中，所述方法包括濃縮包含微生物細(xì)胞的發(fā)酵液。在一些實施方 案中，該方法包括濃縮裂解細(xì)胞組合物。如本文使用的，"濃縮"意指從組合物去除水。濃縮 可以包括但不限于蒸發(fā)、化學(xué)干燥、離心等等，及其組合。在一些實施方案中，將細(xì)胞組合物 或裂解細(xì)胞組合物濃縮以提供按裂解細(xì)胞組合物的重量(或體積)計至少4%，至少5%，至 少10%，至少15%，至少20%，至少25%，或至少30%的油濃度。在一些實施方案中，將細(xì)胞 組合物或裂解細(xì)胞組合物濃縮以提供按裂解細(xì)胞組合物的重量(或體積)計4 %至40 %、4 % 至30%、4%至20%、4%至15%、5%至40%、5%至30%、5%至20%、10%至40%、10%至 30%、10%至20%、15%至40%、15%至30%、20%至40%、20%至30%、25%至40%、或30% 至40 %的油濃度。
[0107] 供本發(fā)明使用的微生物細(xì)胞的有效培養(yǎng)條件包括但不限于允許生產(chǎn)油的有效的 培養(yǎng)基、生物反應(yīng)器、溫度、PH、以及氧條件。有效的培養(yǎng)基是指任何這樣的培養(yǎng)基，其中通 常培養(yǎng)微生物細(xì)胞，例如破囊壺菌目微生物細(xì)胞。此類培養(yǎng)基通常包含水性基質(zhì)，其具有可 同化的碳源、氮源、與磷酸鹽源，以及適當(dāng)?shù)柠}、礦物質(zhì)、金屬，及其他營養(yǎng)物，如維生素。供 本發(fā)明使用的微生物細(xì)胞可以培養(yǎng)于常規(guī)的發(fā)酵生物反應(yīng)器、搖瓶、試管、微滴定盤，以及 培養(yǎng)皿(petri plate)內(nèi)。
[0108] 在一些實施方案中，微生物細(xì)胞包含按重量(或體積)計至少30%的油，按重量(或 體積)計至少35 %的油，按重量（或體積）計至少40 %的油，按重量（或體積)計至少50 %的 油，按重量(或體積)計至少60 %的油，按重量(或體積)計至少70 %的油，或按重量(或體積） 計至少80%的油。在一些實施方案中，供本發(fā)明使用的微生物細(xì)胞能夠產(chǎn)生至少0.1克每升 每小時（g/L/h)的 DHA，至少 0 · 2g/L/h 的 DHA，至少 0 · 3g/L/h 的 DHA，或至少 0 · 4g/L/h 的 DHA。在 一些實施方案中，供本發(fā)明使用的微生物細(xì)胞能夠產(chǎn)生至少0.01克每升每小時(g/L/h)的 ARA，至少0.05g/L/h的ARA，至少0. lg/L/h的ARA，至少0.2g/L/h的ARA，至少0.3g/L/h的ARA， 或至少0.4g/L/h的ARA。
[0109] 在一些實施方案中，根據(jù)本文所述方法的任一種而獲得的油、用過的生物質(zhì)，或其 組合可以直接地用作食品或食品成分，如下列兒童食品，嬰兒配方、飲料、醬汁、基于乳品的 食品（例如奶、酸乳、奶酪與冰淇淋）、油類(例如烹調(diào)油(cooking oil)或色拉調(diào)味汁(salad dressing))，以及烘焙食物;營養(yǎng)補充劑(例如以膠囊或片劑形式）；用于任何非人動物的飼 料或飼料補充劑(例如其產(chǎn)物(例如肉、奶、或蛋)供人消耗的動物）；食物補充劑；以及藥物 (于直接或附加療法應(yīng)用中）。術(shù)語"動物"意指屬于動物界(kingdom Animalia)的任何生 物，且包括任何人類動物，和由其得到產(chǎn)品（例如奶、蛋、禽肉、牛肉、豬肉或羊肉）的非人動 物。在一些實施方案中，該油和/或生物質(zhì)可以用于海產(chǎn)食品中。海產(chǎn)食品來源于，但不限于 魚、奸與貝類。術(shù)語"產(chǎn)物"包括由此類動物得到的任何產(chǎn)品，包括但不限于肉、蛋、奶或其他 產(chǎn)物。當(dāng)將該油和/或生物質(zhì)喂予此類動物時，多不飽和油可并入此類動物的肉、奶、蛋或其 它產(chǎn)品中以增加這些油中它們的含量。 實施例
[oho] 實施例1
[0111] 將含有微生物細(xì)胞（裂殖壺菌屬菌種（Schizochytrium sp .))的細(xì)胞培養(yǎng)液 (300g)于60 °C巴氏消毒1小時。將未洗滌的細(xì)胞培養(yǎng)液以180RPM的速度攪拌并加熱至60 °C。 通過添加50wt%NaOH溶液以將培養(yǎng)液pH調(diào)整至7-7.5，以及以基于培養(yǎng)液重量添加0.5%的 量添加 Alca丨ase? 2.4FG (可從Novozymes (Frankl inton，NC)得到）來裂解細(xì)胞。在維持?jǐn)嚢?之時，通過添加按重量計98 %的出5〇4溶液來將裂解細(xì)胞組合物的pH調(diào)整至4。以按裂解細(xì)胞 組合物的重量計2%的量添加固體NaCl，并將該組合物加熱至90°C且保持20小時。通過添加 50wt%Na0H溶液將該組合物的pH調(diào)整至7·5-8·5，然后以8000RPM離心（Thermo Scientific SorvelI ST40R離心機)5分鐘以提供粗制油，其產(chǎn)出91.7%的DHA(按重量計DHA)。
[0112] 實施例2
[0113] 將含有微生物細(xì)胞（裂殖壺菌屬菌種（Schizochytrium sp .))的細(xì)胞培養(yǎng)液 (300g)于60 °C巴氏消毒1小時。通過添加按重量計20 %的秘〇4溶液以將細(xì)胞培養(yǎng)液的pH調(diào) 整至2,然后將培養(yǎng)液加熱至90°C且保持45小時，從而形成去乳化的裂解細(xì)胞組合物。通過 如下從該去乳化的裂解細(xì)胞組合物分離微生物油:添加50wt%Na0H溶液以將該組合物的pH 調(diào)整至7.5_8.5,然后以8000RPM將組合物離心（Thermo Scientific Sorvell ST40R離心 機)5分鐘以提供粗制油，其產(chǎn)出51.62 %的DHA(以DHA重量計）。
[0114] 實施例3
[0115] 將含有微生物細(xì)胞（裂殖壺菌屬菌種（Schizochytrium sp .))的細(xì)胞培養(yǎng)液 (300g)于60 °C巴氏消毒1小時。通過添加按重量計20 %的秘〇4溶液以將細(xì)胞培養(yǎng)液的pH調(diào) 整至2;以按培養(yǎng)液的重量計2%的量添加固體NaCl;以及將培養(yǎng)液加熱至90°C并保持18小 時，從而形成去乳化的裂解細(xì)胞組合物。通過如下從該去乳化的裂解細(xì)胞組合物分離微生 物油：以8000RPM將組合物離心（Thermo Scientific Sorvell ST40R離心機）5分鐘以提供 粗制油，其產(chǎn)出38.82 %的DHA(以DHA重量計）。
[0116] 實施例4
[0117] 將含有微生物細(xì)胞（裂殖壺菌屬菌種（Schizochytrium sp .))的細(xì)胞培養(yǎng)液 (300g)于60°C巴氏消毒1小時。通過如下形成去乳化的裂解細(xì)胞組合物:添加按培養(yǎng)液重量 計2%的按重量計98%的出3〇4溶液，并將培養(yǎng)液加熱至90°C4小時。通過如下從該去乳化的 裂解細(xì)胞組合物分離微生物油:添加50wt %Na0H溶液將該組合物的pH調(diào)整至7-8.5，在90°C 保持21小時，并以8000RPM將組合物離心（Thermo Scientific Sorvell ST40R離心機)5分 鐘以提供粗制油，其產(chǎn)出72%的DHA(以重量計DHA)。所述粗制油具有145的茴香胺值(AV)。
[0118] 實施例5
[0119] 將含有微生物細(xì)胞（裂殖壺菌屬菌種（Schizochytrium sp .))的細(xì)胞培養(yǎng)液 (300g)于60 °C巴氏消毒1小時。將未洗滌的細(xì)胞培養(yǎng)液以180RPM的速度攪拌并加熱至60 °C。 通過添加50wt %Na0H以將培養(yǎng)液pH調(diào)整至7-7.5，以及以基于培養(yǎng)液重量0.5%的量添加 Alealas.e? 2.4FG (可從Novozymes (Frankl inton，NC)得到）來裂解細(xì)胞。在維持?jǐn)嚢柚畷r， 通過添加按重量計98 %的H2S〇4溶液以將裂解細(xì)胞組合物的pH調(diào)整至4,然后將組合物加熱 至90°C。在90°C45小時之后，以8000RPM將組合物離心（Thermo Scientific Sorvell ST40R 離心機)5分鐘以提供粗制油，其產(chǎn)出81 %的DHA(以DHA重量計）。所述粗制油具有14.5的AV。
[0120] 實施例6
[0121] 將含有微生物細(xì)胞（裂殖壺菌屬菌種（Schizochytrium sp .))的細(xì)胞培養(yǎng)液 (300g)于60°C巴氏消毒1小時。通過如下形成去乳化的裂解細(xì)胞組合物:添加按培養(yǎng)液重量 計2.5%的按重量計98%的出3〇4溶液，然后將培養(yǎng)液加熱至90°C5小時。通過如下從該去乳 化的裂解細(xì)胞組合物分離微生物油:添加50wt %NaOH溶液以將該組合物的pH調(diào)整至7-8.5， 在90°C幾個小時后，以8000RPM將組合物離心（Thermo Scientific Sorvell ST40R離心機） 5分鐘以提供粗制油，其產(chǎn)出92.5%的DHA(以DHA重量計）。
[0122] 實施例7
[0123] 將含有微生物細(xì)胞（裂殖壺菌屬菌種（Schizochytrium sp .))的細(xì)胞培養(yǎng)液 (350g)于60°C巴氏消毒1小時。通過如下形成去乳化的裂解細(xì)胞組合物:添加按培養(yǎng)液重量 計2%的按重量計98%的出3〇4溶液，然后將培養(yǎng)液加熱至90 °C5-6小時。通過如下從該去乳 化的裂解細(xì)胞組合物分離微生物油:添加50wt %NaOH溶液以將pH調(diào)整至7-8.5，在90°C幾個 小時后，以8000RPM將組合物離心（Thermo Scientific Sorvell ST40R離心機)5分鐘以提 供粗制油，其產(chǎn)出82.63%的DHA(以DHA重量計）。
[0124] 實施例8
[0125] 將含有微生物細(xì)胞（裂殖壺菌屬菌種（Schizochytrium sp.))的細(xì)胞培養(yǎng)液 (350g)于60°C巴氏消毒1小時。通過如下形成去乳化的裂解細(xì)胞組合物:添加按培養(yǎng)液重量 計1 %的按重量計98 %的出3〇4溶液，然后將培養(yǎng)液加熱至90 °C 5-10小時。通過如下從該去乳 化的裂解細(xì)胞組合物分離微生物油：添加50wt %NaOH溶液以將pH調(diào)整至7-8.5，并以 8000RPM將組合物離心（Thermo Scientific Sorvell ST40R離心機)5分鐘以提供粗制油， 其產(chǎn)出42%的DHA(以DHA重量計）。
[0126] 實施例9
[0127] 將含有微生物細(xì)胞（裂殖壺菌屬菌種（Schizochytrium sp.))的細(xì)胞培養(yǎng)液 (350g)于60°C巴氏消毒1小時。通過如下形成去乳化的裂解細(xì)胞組合物:添加按培養(yǎng)液重量 計3 %的按重量計98 %的出3〇4溶液，然后將培養(yǎng)液加熱至90 °C 1-5小時。通過如下從該去乳 化的裂解細(xì)胞組合物分離微生物油：添加50wt %Na0H溶液以將pH調(diào)整至7-8.5，并以 8000RPM將組合物離心（Thermo Scientific Sorvell ST40R離心機)5分鐘以提供粗制油， 其產(chǎn)出88%的DHA(以DHA重量計）。
[0128] 實施例10
[0129] 將含有微生物細(xì)胞（裂殖壺菌屬菌種（Schizochytrium sp .))的細(xì)胞培養(yǎng)液 (350g)于60°C巴氏消毒1小時。通過如下形成去乳化的裂解細(xì)胞組合物:添加按培養(yǎng)液重量 計4%的按重量計70%的硝酸溶液，然后將培養(yǎng)液加熱至90°C1小時。通過如下從該去乳化 的裂解細(xì)胞組合物分離微生物油：添加50wt %Na0H溶液將pH調(diào)整至7-8.5，并以8000RPM將 組合物離心(Thermo Scientific Sorvell ST40R離心機)5分鐘以提供粗制油，其產(chǎn)出82% 的DHA(以DHA重量計）。
[0130] 實施例11
[0131] 將含有微生物細(xì)胞（裂殖壺菌屬菌種（Schizochytrium sp .))的細(xì)胞培養(yǎng)液 (350g)于60°C巴氏消毒1小時。通過如下形成去乳化的裂解細(xì)胞組合物:添加按培養(yǎng)液重量 計2 %的按重量計70 %的硝酸溶液，然后將培養(yǎng)液加熱至90°C5-6小時。通過如下從該去乳 化的裂解細(xì)胞組合物分離微生物油：添加50wt %NaOH溶液以將pH調(diào)整至7-8.5，并以 8000RPM將組合物離心（Thermo Scientific Sorvell ST40R離心機)5分鐘以提供粗制油， 其產(chǎn)出58.5%的DHA(以DHA重量計）。
[0132] 實施例12
[0133] 將含有微生物細(xì)胞（裂殖壺菌屬菌種（Schizochytrium sp .))的細(xì)胞培養(yǎng)液 (350g)于60°C巴氏消毒1小時。通過如下形成去乳化的裂解細(xì)胞組合物:添加按培養(yǎng)液重量 計2.5 %的按重量計70 %的硝酸溶液，然后將培養(yǎng)液加熱至90 °C5小時。通過如下從該去乳 化的裂解細(xì)胞組合物分離微生物油:添加50wt %NaOH溶液以將pH調(diào)整至7-8.5，在90°C幾個 小時后，以8000RPM將組合物離心（Thermo Scientific Sorvell ST40R離心機)5分鐘以提 供粗制油，其產(chǎn)出74 %的DHA(以DHA重量計）。
[0134] 實施例13
[0135] 將含有微生物細(xì)胞（裂殖壺菌屬菌種（Schizochytrium sp.))的細(xì)胞培養(yǎng)液 (350g)于60°C巴氏消毒1小時。通過如下形成去乳化的裂解細(xì)胞組合物:添加按培養(yǎng)液重量 計4%的磷酸，然后將培養(yǎng)液加熱至90°C5小時。通過如下從該去乳化的裂解細(xì)胞組合物分 離微生物油：添加50的％他0招容液將?!1調(diào)整至7-8.5，在90°(：幾個小時后，以80001?^將組合 物離心（Thermo Scientific Sorvell ST40R離心機）5分鐘以回收粗制油，該組合物的45g 樣品產(chǎn)出1.0 mL的粗制油。
[0136] 實施例14
[0137] 將含有微生物細(xì)胞（裂殖壺菌屬菌種（Schizochytrium sp.))的細(xì)胞培養(yǎng)液 (350g)于60°C巴氏消毒1小時。通過如下形成去乳化的裂解細(xì)胞組合物:添加按培養(yǎng)液重量 計8%的磷酸，然后將培養(yǎng)液加熱至90°C3小時。通過如下從該去乳化的裂解細(xì)胞組合物分 離微生物油：添加50的％他0招容液將?!1調(diào)整至7-8.5，在90°(：幾個小時后，以80001?^將組合 物離心（Thermo Scientific Sorvell ST40R離心機）5分鐘以回收粗制油，該組合物的45g 樣品產(chǎn)出〇.5mL的粗制油。
[0138] 實施例15
[0139] 將含有微生物細(xì)胞（裂殖壺菌屬菌種（Schizochytrium sp .))的細(xì)胞培養(yǎng)液 (2000L)置于以190rpm攪拌的處理罐內(nèi)。通過如下形成去乳化的裂解細(xì)胞組合物:添加按培 養(yǎng)液重量計4 %的按重量計98 %的出3〇4溶液，然后將培養(yǎng)液加熱至90-95 °C 1小時。通過如下 從該去乳化的裂解細(xì)胞組合物分離微生物油：將該組合物冷卻至75°C，添加50wt%Na0H溶 液以將pH調(diào)整至7-8.5，將組合物混合過夜，并以1754RPM、8L/分鐘將組合物在線（in I ine) 離心以提供粗制油，其產(chǎn)出93 %的DHA (以DHA重量計），以及具有0.69meq的過氧化物值 (PV)、23.9的AV、及1.04的游離脂肪(FFA)含量的粗制油。
[0140] 實施例16
[0141] 將含有微生物細(xì)胞（裂殖壺菌屬菌種（Schizochytrium sp .))的細(xì)胞培養(yǎng)液 (550L)置于以190rpm攪拌的處理罐內(nèi)。將細(xì)胞培養(yǎng)液加熱至60°C，通過添加50wt. %NaOH溶 液將pH調(diào)整至7.3-7.5，以及以按培養(yǎng)液的重量計0.5%的量添加堿性蛋白酶(alcalase)。2 小時后，通過添加按重量計98 %的H2S〇4將裂解細(xì)胞組合物的pH調(diào)整至4,并加熱至90°C，同 時維持?jǐn)嚢琛Ｔ?0°C20小時后，通過如下從去乳化的裂解細(xì)胞組合物分離微生物油:將組合 物冷卻至75°(：，通過添加50?丨.％此0!1溶液將？!1調(diào)整至8.5，將組合物保持過夜，并以 1754RPM、8L/分鐘將組合物在線離心以提供粗制油，其產(chǎn)出84%的DHA(以DHA重量計），以及 具有Omeq的過氧化物值(PV )、7.3的AV、及0.17的FFA含量的粗制油。
[0142] 實施例17
[0143] 將含有微生物細(xì)胞(被孢霉屬(Mortierella))的細(xì)胞培養(yǎng)液（2500-3000升)置于 傾析罐(decanting tank)內(nèi)數(shù)個小時以沉降。一旦沉降，將50-60%無生物質(zhì)的液體抽出棄 去。然后使?jié)饪s的未洗滌的巴氏消毒的細(xì)胞培養(yǎng)液通過與處理罐相連(in line to)的高剪 切混合機(Siemens ULTRA-Turrax UTL 1000/10于60Hz)。通過如下形成去乳化的裂解細(xì)胞 組合物:添加按培養(yǎng)液重量計3 %的按重量計98 %的賊〇4溶液以將pH調(diào)整至IjO. 9至1.5，并將 培養(yǎng)液加熱至94 °C 20-24小時，或直至ImL的培養(yǎng)液在IOmL的去離子水中的稀釋液產(chǎn)出25μπι 或更小的粒度為止。用脫氧水將去乳化的裂解細(xì)胞組合物稀釋至10%的固體含量（用 Omnimark Uwave濕度分析儀產(chǎn)生的數(shù)目），并且如果加水造成溫度下降至低于85°C則再加 熱至85°C。通過如下從去乳化的裂解細(xì)胞組合物分離微生物油：添加50wt%Na0H溶液以將 組合物的pH調(diào)整至7.8-8.2，允許該組合物混合30分鐘或者直至樣本的離心顯示完全沒有 乳液層為止，并以1750RPM、7升/分鐘的流速在線離心（Seital SR1010)該組合物7-10小時 以回收粗制油。
[0144] 三個分離批次的細(xì)胞培養(yǎng)液各自獨立進(jìn)行以上的方法。
[0145] 第1批次粗制油產(chǎn)出86.6%的ARA(以ARA重量計），以及具有26.1的AV和0.39meq的 PV的干燥的、過濾的粗制油。
[0146] 第2批次粗制油產(chǎn)出87.6%的ARA(以ARA重量計），以及具有14的AV和0.31meq的PV 的干燥的、過濾的粗制油。
[0147] 第3批次粗制油產(chǎn)出85 %的ARA(以ARA重量計），以及具有24.7的AV和0.51meq的PV 的干燥的、過濾的粗制油。
[0148] 實施例18
[0149] 將含有微生物細(xì)胞(被孢霉屬(Mortierella))的細(xì)胞培養(yǎng)液（1000 mL)于70°C巴氏 消毒1小時。通過如下形成去乳化的裂解細(xì)胞組合物:添加按培養(yǎng)液重量計4%的硝酸(70% 溶液）以將pH調(diào)整至0.7-1.0，并將培養(yǎng)液加熱至90°C同時以200rpm的速度攪拌30小時。通 過如下從去乳化的裂解細(xì)胞組合物分離微生物油:添加50wt % NaOH溶液以將組合物的pH調(diào) 整至8.0-8.2,并以8000g將組合物離心（Thermo Sorvell ST 40R)5分鐘以提供粗制油，其 產(chǎn)出74.13%的ARA(以ARA重量計），以及具有27.9的AV的粗制油。
[0150] 實施例19
[0151] 將含有微生物細(xì)胞(被孢霉屬(Mortierella))的細(xì)胞培養(yǎng)液（1000 mL)于70°C巴氏 消毒1小時。通過如下形成去乳化的裂解細(xì)胞組合物：添加按培養(yǎng)液重量計15%的磷酸 (85%溶液）以將pH調(diào)整至0.7至1.5,并將組合物加熱至90 °C同時以200rpm的速度攪拌50小 時。通過如下從去乳化的裂解細(xì)胞組合物分離微生物油：添加50w/w NaOH溶液以將組合物 的pH調(diào)整至8.0-8.2,并以8000g將組合物離心(Thermo Sorvell ST 40R)5分鐘以提供粗制 油，其產(chǎn)出42.61 %的ARA(以ARA重量計）。粗制油具有16.1的AV。
[0152] 實施例20
[0153] 將含有微生物細(xì)胞(被孢霉屬(Mortierella))的細(xì)胞培養(yǎng)液（1000 mL)于70°C巴氏 消毒1小時。通過如下形成去乳化的裂解細(xì)胞組合物:添加按培養(yǎng)液重量計6%的鹽酸(32% 溶液）以將pH調(diào)整至O . 7-1.5，并將培養(yǎng)液加熱至90°C同時以200rpm的速度攪拌50小時。通 過如下從去乳化的裂解細(xì)胞組合物分離微生物油：添加50w/w NaOH溶液以將組合物的pH調(diào) 整至8.0-8.2,并以8000g將組合物離心（Thermo Sorvell ST 40R)5分鐘以提供粗制油，其 產(chǎn)出72.61 %的ARA(以ARA重量計）。粗制油具有11.1的AV。
[0154] 實施例21
[0155] 將含有微生物細(xì)胞（裂殖壺菌屬菌種（Schizochytrium sp.))的細(xì)胞培養(yǎng)液 (300g)于60 °C巴氏消毒1小時。通過如下形成去乳化的裂解細(xì)胞組合物:添加12.5wt % NaOH 溶液至細(xì)胞培養(yǎng)液以將pH調(diào)整至11，添加按培養(yǎng)液重量計2 %的NaCl，并將組合物加熱至90 °C。在90°C25小時后，通過如下從去乳化的裂解細(xì)胞組合物分離微生物油：以8000RPM將組 合物離心（Thermo Scientific Sorvell ST40R離心機)5分鐘以提供粗制油，其產(chǎn)出71 %的 DHA (以DHA重量計）。
[0156] 實施例22
[0157] 將含有微生物細(xì)胞(被孢霉屬(Mortierella))的未洗滌的細(xì)胞培養(yǎng)液(2129.8kg) 于70°C巴氏消毒1小時，然后經(jīng)過與處理罐相連的高剪切混合機（Siemens ULTRA-Turrax UTL 1000/10于60Hz)。通過如下形成去乳化的裂解細(xì)胞組合物:添加按培養(yǎng)液重量計3.5% 的按重量計98%的硫酸溶液以將?!1調(diào)整到0.7(或0.07)至1.5，加熱至90°(：，并保持28小時 同時以200RPM的速度攪拌。通過如下從去乳化的裂解細(xì)胞組合物分離微生物油：中和該組 合物并通過添加50 %NaOH和按組合物重量計2 %NaCl以將pH調(diào)整至8.0，然后將組合物離心 (SeitalSRlOlO)以提供粗制油，其產(chǎn)出77.4%的ARA(以ARA重量計），以及具有12.4的AV、 2.27 %的FFA含量、及0.13meq的PV的粗制油。
[0158] 實施例23
[0159] 將含有微生物細(xì)胞(寇氏隱甲藻(Crypthecodinium cohnii))的未洗滌的細(xì)胞培 養(yǎng)液（7 5 0 g )于6 0 °C巴氏消毒1小時。通過使細(xì)胞培養(yǎng)液以1 2，0 0 0 P SI經(jīng)過均質(zhì)機 (Microfluidizer M110)兩次而將細(xì)胞機械裂解。將裂解細(xì)胞組合物置于圓形燒瓶中并通 過如下去乳化:添加按組合物重量計4 %的硫酸(98 %純)溶液，加熱至90 °C同時以200RPM攪 拌，并維持28小時。通過如下從去乳化的裂解細(xì)胞組合物分離微生物油：中和該組合物并通 過添加50 %NaOH溶液將pH調(diào)整至8.0，然后以8000g將組合物離心（Thermo Sorval I ST 40R)5分鐘以提供粗制油，其產(chǎn)出45%的DHA(以DHA重量計）（基于FAME分析），以及具有 12 · 35的AV和1 · 09meq的PV的粗制油。
[0160] 實施例24
[0161] 將含有微生物細(xì)胞(裂殖壺菌屬物種(Schizochytrium sp.))的未洗滌的細(xì)胞培 養(yǎng)液(750g)于60°C巴氏消毒1小時并置于以250RPM攪拌的IL燒瓶中。將溫度提升至60 °C以 減少由于粘性所致的混合時間。通過如下形成去乳化的裂解細(xì)胞組合物:添加按培養(yǎng)液重 量計4%的50%Na0H以將pH調(diào)整至12.62;加熱至90 °C;以及允許反應(yīng)26小時直至pH降至 7.75為止。通過如下從去乳化的裂解細(xì)胞組合物分離微生物油：以8000g將組合物離心 (Thermo Sorvall ST40R)5分鐘以提供粗制油，其產(chǎn)出88%的DHA(以DHA重量計）（基于FAME 分析)。
[0162] 實施例25
[0163] 將含有微生物細(xì)胞(裂殖壺菌屬物種(Schizochytrium sp.))的未洗滌的細(xì)胞培 養(yǎng)液(750g)于60°C巴氏消毒1小時并置于以250RPM攪拌的IL燒瓶中。將溫度提升至60 °C以 減少由于粘性所致的混合時間。通過如下形成去乳化的裂解細(xì)胞組合物:添加按培養(yǎng)液重 量計4%的50 %NaOH溶液以將pH調(diào)整至12.93;加熱至90°C;以及允許反應(yīng)26小時直至pH降 至7.95為止。通過如下從去乳化的裂解細(xì)胞組合物分離微生物油：以8000g將組合物離心 (Thermo Sorval I ST40R) 5分鐘以提供粗制油，其產(chǎn)出82 · 5 %的DHA(以DHA重量計）（基于 FAME分析)。
[0164] 實施例26
[0165] 將含有微生物細(xì)胞(裂殖壺菌屬物種(Schizochytrium sp.))的未洗滌的細(xì)胞培 養(yǎng)液(750g)于60°C巴氏消毒1小時并置于以250RPM攪拌的IL燒瓶中。將溫度提升至60 °C以 減少由于粘性所致的混合時間，并將PH提升至7.5。通過如下形成去乳化的裂解細(xì)胞組合 物:添加按培養(yǎng)液重量計3.5%的50%NaOH溶液以將pH調(diào)整至12.28;加熱至90°C ;以及允許 反應(yīng)32小時直至pH降至7.88為止。通過如下從去乳化的裂解細(xì)胞組合物分離微生物油：以 8000g將組合物離心（Thermo Sorvall ST 40R)5分鐘以提供粗制油，其產(chǎn)出88%的DHA(以 DHA重量計）（基于FAME分析）。
[0166] 實施例27
[0167] 將含有微生物細(xì)胞(裂殖壺菌屬物種(Schizochytrium sp.))的未洗滌的細(xì)胞培 養(yǎng)液(750g)于60°C巴氏消毒1小時并置于以250RPM攪拌的IL燒瓶中。將溫度提升至60 °C以 減少由于粘性所致的混合時間。通過如下形成去乳化的裂解細(xì)胞組合物:添加按培養(yǎng)液重 量計4.0%的50%Na0H溶液以將pH調(diào)整至12.87;加熱至90°C ;以及允許反應(yīng)36小時直至pH 降至8.15為止。通過如下從去乳化的裂解細(xì)胞組合物分離微生物油：以8000g將組合物離心 (Thermo Sorvall ST 40R)5分鐘以提供粗制油，其產(chǎn)出84%的DHA(以DHA重量計）（基于 FAME分析)。
[0168] 比較實施例1
[0169] 將含有微生物細(xì)胞（裂殖壺菌屬物種（Schizochytrium sp .))的細(xì)胞培養(yǎng)液 (300g)于60 °C巴氏消毒1小時。以180RPM的速度攪拌未洗滌的細(xì)胞培養(yǎng)液并加熱至60 °C。通 過添加 50wt %Na0H溶液以將細(xì)胞的pH調(diào)整至7-7.5，和以基于培養(yǎng)液重量0.5%的量添加 Alca丨ase:? 2.4FG (可從Novozymes (Frankl inton，NC)得到）來裂解細(xì)胞。在維持?jǐn)嚢柚畷r， 通過如下將裂解細(xì)胞組合物去乳化：同時添加 12.5wt%Na0H溶液以將pH調(diào)整至10-11并以 按組合物重量計2 %的量添加 CaCl2，然后將該組合物加熱至90 °C并保持68小時。通過如下 從去乳化的裂解細(xì)胞組合物分離微生物油：以8000RPM將組合物離心（Thermo Scientific Sorvell ST40R離心機)5分鐘以提供粗制油，其產(chǎn)出62.5%的DHA(按DHA重量計）以及具有 43.8的AV的粗制油。
【主權(quán)項】
1. 一種用于從一個或多個微生物細(xì)胞獲得包含一種或多種多不飽和脂肪酸的微生物 油的方法，其中該方法包括： (a) 裂解包含所述微生物油的細(xì)胞以形成裂解細(xì)胞組合物； (b) 將所述裂解細(xì)胞組合物去乳化以形成去乳化的裂解細(xì)胞組合物； (c) 從所述去乳化的裂解細(xì)胞組合物分離所述油；以及 (d) 回收所述油； 其中(b)包括降低所述裂解細(xì)胞組合物的pH。2. 權(quán)利要求1的方法，其中（a)或(b)中至少一個還包括將所述細(xì)胞或組合物加熱到至 少70。。。3. 權(quán)利要求1或2的方法，其中（a)或(b)中至少一個還包括將所述細(xì)胞或組合物加熱到 約 70°C 至約 100°C。4. 前述任一權(quán)利要求的方法，其中(b)還包括添加乳化劑至所述裂解細(xì)胞組合物。5. 前述任一權(quán)利要求的方法，其中(b)還包括將所述pH降低至約6或更低。6. 前述任一權(quán)利要求的方法，其中（b)還包括將所述裂解細(xì)胞組合物的pH降低至約0.5 至約6。7. 前述任一權(quán)利要求的方法，其中（b)還包括以按重量計所述裂解細(xì)胞組合物的約 0.5 %至約20 %的量添加酸。8. 前述任一權(quán)利要求的方法，其中（b)還包括以按重量計所述裂解細(xì)胞組合物的約 0.05 %至約20 %的量添加鹽。9. 前述任一權(quán)利要求的方法，其中(b)還包括攪拌所述裂解細(xì)胞組合物。10. 前述任一權(quán)利要求的方法，其中(a)還包括攪拌所述細(xì)胞。11. 前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述酸選自：硫酸、磷酸、鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、次 氯酸、亞氯酸、氯酸(chloric)、高氯酸(perchloric)、氟硫酸、硝酸、氟銻酸、氟硼酸、六氟磷 酸、鉻酸、硼酸、乙酸、檸檬酸、甲酸，及其組合。12. 前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述酸為硫酸。13. 前述任一權(quán)利要求的方法，其中(a)的細(xì)胞是未洗滌的。14. 前述任一權(quán)利要求的方法，其中(a)的細(xì)胞包含于發(fā)酵液中。15. 前述任一權(quán)利要求的方法，其中（c)還包括離心所述去乳化的裂解細(xì)胞組合物。16. 前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述多不飽和脂肪酸選自ω-3脂肪酸，ω-6脂肪 酸，及其混合物。17. 前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述多不飽和脂肪酸選自二十二碳六烯酸(DHA)、 二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)、花生四烯酸(ARA)、γ -亞麻酸(GLA)、二高-γ -亞麻酸(DGLA)、十八碳四稀酸(stearidonic acid,SDA)，及其混合物。18. 權(quán)利要求17的方法，其中所述多不飽和脂肪酸是二十二碳六烯酸(DHA)。19. 權(quán)利要求17的方法，其中所示多不飽和脂肪酸是花生四烯酸(ARA)。20. 前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述微生物細(xì)胞是藻類、酵母、真菌、原生生物，或 細(xì)菌細(xì)胞。21. 前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述微生物細(xì)胞來自被孢霉屬(Mort i ere I Ia )、隱 甲藻屬（Crypthecodinium)，或破囊壺菌目（Thraustochytriales) ·22. 權(quán)利要求20的方法，其中所述微生物細(xì)胞來自破囊壺菌目。23. 權(quán)利要求21的方法，其中所述微生物細(xì)胞來自破囊壺菌屬(Thraustochytrium)、裂 殖壺菌屬（Schizochytrium)，或其混合物。24. 權(quán)利要求20的方法，其中所述微生物細(xì)胞來自高山被孢霉(Mortierella Alpina)。25. 前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述裂解細(xì)胞組合物包含液體、細(xì)胞碎片以及微生 物油。26. 前述任一權(quán)利要求的方法，其中不使用有機溶劑而從所述細(xì)胞獲得所述油。27. 前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述去乳化的裂解細(xì)胞組合物的平均粒度是25微 米或更小。28. 權(quán)利要求4-27任一項的方法，其中所述乳化劑是離子性乳化劑。29. 權(quán)利要求28的方法，其中所述離子性乳化劑是陰離子乳化劑，其選自陰離子硫酸鹽 乳化劑、陰離子磺酸鹽乳化劑、陰離子磷酸鹽乳化劑、陰離子羧酸鹽乳化劑，及其組合。30. 權(quán)利要求29的方法，其中所述離子性乳化劑是陰離子硫酸鹽乳化劑，其選自月桂基 硫酸銨、十二烷基硫酸鈉、月桂醇聚醚硫酸鈉 （sodium laureth sulfate)、月桂基醚硫酸 鈉、肉豆蔻醇聚醚硫酸鈉 (sodium myreth sulfate)，及其組合。31. 權(quán)利要求4-30任一項的方法，其中以按重量計所述裂解細(xì)胞組合物的0.2%至10% 的量添加所述乳化劑。32. 權(quán)利要求8-30任一項的方法，其中所述鹽選自下組：堿金屬鹽、堿土金屬鹽、硫酸 鹽，及其組合。33. 前述任一權(quán)利要求的方法，其中(d)的油是粗制油。34. 權(quán)利要求33的方法，其中(d)還包括精制所述粗制油以獲得精制油。35. 前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述油包含按重量計至少30 %的花生四烯酸。36. 前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述油包含按重量計至少30 %的二十二碳六烯酸。37. 前述任一權(quán)利要求的方法，其中所示油具有低于約50的茴香胺值。38. 前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述油具有約8ppm或低的磷含量。39. 前述任一權(quán)利要求的方法，其中所示油具有低于約5meq/kg的過氧化物值。40. 通過前述任一權(quán)利要求的方法獲得的油。41. 前述任一權(quán)利要求的方法，其中將(a)和(b)組合在一起以形成一步裂解及去乳化 步驟。42. 前述任一權(quán)利要求的方法，其中（c)還包括提升所述去乳化的裂解細(xì)胞組合物的 pH〇43. -種用于從一個或多個微生物細(xì)胞獲得包含一種或多種多不飽和脂肪酸的微生物 油的方法，其中所述方法包括： (a) 裂解包含所述微生物油的細(xì)胞以形成裂解細(xì)胞組合物； (b) 將所述裂解細(xì)胞組合物去乳化以形成去乳化的裂解細(xì)胞組合物； (c) 從所述去乳化的裂解細(xì)胞組合物分離所述油；以及 (d) 回收所述油； 其中將(a)和(b)組合在一起以形成一步裂解及去乳化步驟，所述步驟包括提升pH。44. 權(quán)利要求43的方法，其中所述一步裂解及去乳化步驟包括將pH提升至約8或以上。45. 權(quán)利要求43的方法，其中所述一步裂解及去乳化步驟包括添加堿以將pH提升至約8 或以上。46. -種用于從一個或多個微生物細(xì)胞獲得包含一種或多種多不飽和脂肪酸的微生物 油的方法，其中該方法包括： (a) 在適合形成去乳化的裂解細(xì)胞組合物的pH裂解包含所述微生物油的細(xì)胞； (b) 從所述去乳化的裂解細(xì)胞組合物分離所述油；以及 (c) 回收所述油； 其中所述去乳化的裂解細(xì)胞組合物在所述裂解過程中獲得。
【文檔編號】A61K31/20GK105960235SQ201480074728
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2014年12月19日
【發(fā)明人】M·巴克, N·塔巴耶內(nèi)賈德, G·尚克, N·F·萊寧格爾, S·K·L·馬修斯
【申請人】帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司