用于治療間皮瘤的雌激素受體β激動劑的制作方法

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用于治療間皮瘤的雌激素受體β激動劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種使用雌激素受體β亞型(ERβ)激動劑進行的間皮瘤——特別是惡性胸膜間皮瘤——的治療，其中所述治療包括將ERβ激動劑給予患者，然后在最長達24小時的時間t后，將含鉑抗癌藥物給予患者。本發(fā)明還提供了用于在患者中治療間皮瘤的ERβ激動劑和含鉑抗癌藥物，其中所述治療包括將ERβ激動劑給予患者，然后在最長達24小時的時間t后，將含鉑抗癌藥物給藥患者；以及一種包括含鉑抗癌藥物和ERβ激動劑的試劑盒。
【專利說明】
用于治療間皮瘤的雌激素受體β激動劑
技術領域
[0001 ]本發(fā)明涉及使用雌激素受體β亞型激動劑(ERP激動劑)和含鉑抗癌藥物治療間皮瘤，特別是惡性胸膜間皮瘤。
【背景技術】
[0002] 間皮瘤是肺和/或腹部的間皮細胞的癌癥。惡性胸膜間皮瘤(MPM)是間皮瘤的最常見形式，并且它與石棉暴露相關。目前，MPM發(fā)病率正在上升，并且估計表明，在西方國家MPM 發(fā)病率在未來的10-15年內將達到峰值，而在日本預計峰值直到從現(xiàn)在開始計40年后才會出現(xiàn)（Robinson BM.，Ann Cardiothorac Surg 2012; 1(4) :491_6;Prazakova S，Thomas PS，Sandrini A，Yates DH.，Clin Respir J 2013;8(1) :1-10)。雖然石棉的使用已在世界范圍內的許多國家被禁止，但是石棉生產和暴露仍然與間皮瘤的地方性高發(fā)病率相關 (Stayner L，Welch LS，Lemen R.，Annu Rev Public Health2013;34:205_16)。碳納米管也已經成為引發(fā)間皮瘤的潛在顧慮，因為已經報道了它們表現(xiàn)出"石棉樣"的致病性，具有誘發(fā)間皮瘤的可能性（Donaldson K，Poland CA，Murphy FA，Macfarlane M，Chernova T， Schinwald A.,Adv Drug Deliv Rev 2013；65(15)：2078-86；Dumortier H.,Adv DrugDeliv Rev.2013;65(15):2120-26)。
[0003] MPM是一種非常難治療的疾病，中位總生存期為9至17個月，不論處于哪一個疾病階段（Campbell NP，Kindler HL.，Semin Respir Crit Care Med 2011;32:102-10; Mossman BT等人，Am J Pathol 2013;182(4):1065-77)。順鉑和培美曲塞的組合已被確立為目前的治療標準（standard of care) (SOC)。然而，只有40%的受治療患者顯示對該療法的響應，總生存期為 12.1 個月（Vogelzang NJ等人，J Clin Oncol 2003;21:2636-44)。多種化療劑已經被用作MPM的二線治療方案，其作為單一療法或作為多藥療法的一部分，但均未被成功證明有效。
[0004] 在Pinton，G.等人，Abstract Book of the 11th International Conference of the International Mesothelioma Interest Group，2012年9月，第104頁-105頁中，記載了ERP激動劑KB9520,其通過在Gl處阻斷細胞周期而抑制人ER即日性REN間皮瘤細胞系在培養(yǎng)物中的增殖。在與該摘要相關的海報中，P inton等人提出了 E邸激動劑增強順鉑和培美曲塞對體外和小鼠體內的人間皮瘤REN細胞的抗增殖作用的證據(jù)。
[0005] 仍然需要用于間皮瘤的臨床治療的改進療法或替代療法。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種ERi3激動劑，其用于在患者中治療間皮瘤，其中該治療包括：
[0007] a)給予患者ERP激動劑，然后在最長達24小時的時間t后，
[0008] b)給予所述患者含鉑的抗癌藥物。
[0009] 本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，當在給予含鉑抗癌藥物前最長達24小時的時間t時給予ERP激動劑時，ERP激動劑與含鉑抗癌藥物的組合對于惡性間皮瘤的治療是特別有效的。該出乎意料出乎意料的協(xié)同效應僅在首先給予ERi3激動劑時存在：當在ERi3激動劑之前給予含鉑抗癌藥物時，所述效應不存在。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種在患者中治療間皮瘤的方法，其包括：
[0011] a)給予患者ERP激動劑，然后在最長達24小時的時間t后，
[0012] b)給予所述患者含鉑抗癌藥物。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種ERP激動劑，其用于制備在患者中治療間皮瘤的藥物，其中該治療包括：
[0014] a)給予患者ERP激動劑，然后在最長達24小時的時間t后，
[0015] b)給予所述患者含鉑抗癌藥物。
[0016] 本發(fā)明還提供了用于在患者中治療間皮瘤的ERP激動劑和含鉑抗癌藥物，其中該治療包括：
[0017] a)給予患者ERP激動劑，然后在最長達24小時的時間t后，
[0018] b)給予所述患者含鉑抗癌藥物。
[0019]本發(fā)明還提供了一種試劑盒，其包括含鉑抗癌藥物和ERP激動劑。
【附圖說明】
[0020]圖IA示出了與未經處理的細胞相比，采用不同劑量的化合物（I)(濃度范圍1-IOOnM)處理24小時后，來自惡性胸膜間皮瘤的REN細胞的生長抑制百分比。每個柱代表平均值+/_標準偏差(s. d);*P彡0.05。
[0021] 圖IB示出了在來自間皮的細胞(MET5A)中，和在具有不同的內源性ERf3表達水平的來自MPM的細胞（REN、MMB、H2596和MST0-211H)中，以及在采用ER0表達載體轉染的MSTO-21把細胞(1^1'〇-211!1/^肋）中，采用化合物（1)(1〇1^)處理24小時和48小時后的生長抑制百分比。還示出了REN細胞和MMB細胞，在這些細胞中已經采用ER0特異性siRNA(REN/siRNA ER β和MMB/siRNA ERi3)敲除了ERi3。柱狀圖下面的蛋白質印跡顯示了各細胞系的ERi3蛋白表達和荷載的對照微管蛋白。每個柱代表平均值+/-S. d廣PS0.0 5。
[0022] 圖2A示出了與未經處理的細胞相比，暴露于單獨的化合物（I) (IOnM)或暴露于與順鉑（100μΜ)和培美曲塞（22μΜ)組合的化合物（I)(10nM)24小時后的REN細胞存活。每個柱代表平均值+/-S. d廣P彡0.05。
[0023]圖2B示出了體內實驗的處理時間表。
[0024]圖2C和圖2D示出了4個不同處理組的箱線圖，其示出了在處理的第21天評估的體內平均腫瘤生長（圖2C)和平均腫瘤生長抑制（圖2D)。粗線代表中位數(shù)，而各矩形的上部和下部邊界代表四分位數(shù)。柱示出了每組的最大值和最小值，且通過小圓圈標出異常值。 [0025]圖3A示出了在采用化合物（I) (IOnM)預處理1、2、4、8、16或24小時，隨后洗掉并在普通培養(yǎng)基(normal medium)中繼續(xù)生長額外的24小時之后，REN細胞中的生長抑制百分比。每個柱代表平均值+/-S. d; *P彡0.05。
[0026]圖3B示出了預暴露于普通培養(yǎng)基(對照)或化合物(I)(10nM)2小時，隨后洗掉并在普通培養(yǎng)基中繼續(xù)生長額外的24、48或72小時之后，REN細胞的存活。
[0027] 圖4A示出了化合物（I) (IOnM)處理開始后2、4、8或12小時加入順鉑（100μΜ)對REN 細胞存活的影響。每個柱代表平均值+/-S. d廣PS0.0 5。
[0028]圖4B示出了采用化合物（I) (IOnM)預處理2小時，隨后洗掉并在補充有不同濃度的順鉑(20-100μΜ)的普通培養(yǎng)基中繼續(xù)生長額外24小時之后，REN細胞的存活。每個柱代表平均值+/_s.d;*P 彡 0.05。
[0029] 圖4(：示出了順鉑（10(^]\〇處理開始后2、4、8或12小時加入化合物（1)(1〇11]\〇對1^^ 細胞存活的影響。每個柱代表平均值+/-S. d。
[0030] 圖4D示出了采用化合物（I) (IOnM)預處理2小時，隨后洗掉并在補充有不同濃度的培美曲塞(5_22μΜ)的普通培養(yǎng)基中繼續(xù)生長額外的24小時之后，REN細胞的存活。每個柱代表平均值+/-S. d。
[0031] 圖4E示出了采用化合物（I) (IOnM)預處理兩小時，隨后洗掉并在普通培養(yǎng)基或含有順鉑（100μΜ)、培美曲塞（22μΜ)或順鉑（100μΜ)/培美曲塞（22μΜ)組合的培養(yǎng)基中繼續(xù)生長額外的24小時之后，REN細胞的存活。每個柱代表平均值+/-S. d廣PS0.0 5。
[0032]圖4F示出了圖4B中所示的結果的等效線圖分析的結果。
[0033] 圖5A示出了采用順鉑（100μΜ)處理24小時或采用化合物（I) (IOnM)預處理2小時、隨后洗掉并在普通培養(yǎng)基±順鉑（1〇〇μΜ)中繼續(xù)生長額外的24小時的REN細胞的細胞周期階段結果。
[0034]圖5Β示出了在采用順鉑(25、50和100μΜ)處理24小時或采用化合物（I) (IOnM)預處理2小時、隨后洗掉并在普通培養(yǎng)基土順鉑(25、50和100μΜ)中繼續(xù)生長額外的24小時的REN 細胞中，PARPl裂解和AKT磷酸化的蛋白質印跡分析和相對光密度測定法。將總AKT和微管蛋白染色用于歸一化。
[0035] 圖6Α示出了在采用順鉑(25、50和100μΜ)處理24小時或采用化合物（I) (IOnM)預處理2小時、隨后洗掉并在普通培養(yǎng)基土不同濃度的順鉑（25、50和100μΜ)中繼續(xù)生長額外的 24小時后，對ΜΕΤ5Α細胞存活的影響。每個柱代表平均值+/-S. d ;*Ρ<0.05。
[0036] 圖6Β示出了在采用順鉑(25、50和100μΜ)處理24小時或采用化合物（I) (IOnM)預處理2小時、隨后洗掉并在普通培養(yǎng)基土不同濃度的順鉑（25、50和100μΜ)中繼續(xù)生長額外的 24小時的ΜΕΤ5Α細胞中，PARPl裂解和AKT磷酸化的蛋白質印跡分析和相對光密度測定法。將總AKT和微管蛋白染色用于歸一化。
[0037]圖7Α示出了采用順鉑(50μΜ)處理24小時或采用化合物（I) (IOnM)預處理2小時、隨后洗掉并在普通培養(yǎng)基土順鉑（50μΜ)中繼續(xù)生長額外的24小時后的MMP細胞的存活。每個柱代表平均值+/ _s. d。
[0038]圖7B示出了在采用順鉑(50μΜ)處理24小時或采用化合物（I) (IOnM)預處理2小時、隨后洗掉并在普通培養(yǎng)基土順鉑(50μΜ)中繼續(xù)生長額外的24小時的MMP細胞中，PARPl裂解和AKT磷酸化的蛋白質印跡分析。
【具體實施方式】
[0039]本發(fā)明提供了一種ERi3激動劑，其用于在患者中治療間皮瘤，其中該治療包括： [0040] a)給予患者ERP激動劑，然后在最長達24小時的時間t后，
[0041] b)給予患者含鉑抗癌藥物。
[0042] 本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，化合物（I) 一一一種選擇性ERP激動劑一一在體外MPM細胞系中具有抗增殖作用。已經發(fā)現(xiàn)，化合物（I)的抗增殖作用與其對ERP的作用相關，并且化合物 (I)的效力與內源表達的ERi3水平有關?；衔铮↖)對來自ER即日性間皮的MET5A細胞沒有抗增殖作用。
[0043] 本發(fā)明人現(xiàn)已另外發(fā)現(xiàn)，化合物（I) 一一一種選擇性ERP激動劑一一在體外REN細胞和小鼠體內REN細胞中引起增強的順鉑/培美曲塞的生長抑制作用。
[0044]本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，ERP激動劑和順鉑(或順鉑/培美曲塞的組合)的給藥順序是該改善的治療效果的關鍵:REN細胞在暴露于順鉑之前暴露于ERP激動劑導致惡性間皮瘤細胞增殖和存活的協(xié)同抑制，而相反的藥物暴露順序不具有該增強作用。
[0045]此外，采用ERP激動劑預處理過的MPM細胞對低劑量順鉑的細胞毒性更敏感。當在順鉑之前給予ERf3激動劑時，ERf3激動劑出乎意料地充當化學增敏劑，增加順鉑的細胞毒性。因此，本發(fā)明可允許在患者中較溫和的SOC(順鉑)給藥方案而不損失抗腫瘤效力。由于順鉑與嚴重的毒性相關，并且由于大多數(shù)被診斷患有MPM的患者超過65歲，他們的健康狀況可能不允許順鉑/培美曲塞的標準化療給藥方案。因此，本發(fā)現(xiàn)在不能耐受標準順鉑/培美曲塞給藥方案的患者中可能具有特別有用。
[0046] 本發(fā)明人還已發(fā)現(xiàn)，惡性和非惡性細胞對順鉑和ERP激動劑具有明顯不同的響應：在來自非惡性間皮的細胞中，對化合物（I)的響應是中性的，而化合物(I)抑制MPM細胞的增殖和腫瘤生長。
[0047]此外，采用化合物(I)預處理再用順鉑處理導致在MPM細胞中對順鉑的細胞敏感性顯著增強，而在來自非惡性間皮的細胞中采用化合物（I)預處理抵消順鉑的細胞毒性。因此，ERi3激動劑可用于降低含鉑抗癌藥物在患者正常細胞中的毒性，并由此保護正常細胞免受含鉑抗癌藥物的有害作用。
[0048]因此，ERi3激動劑在降低含鉑抗癌藥物在患者中的毒性方面有用。因此本發(fā)明提供了一種ERi3激動劑，其用于降低含鉑抗癌藥物在患者的非癌細胞中的毒性，其中所述治療包括：
[0049] a)給予患者ERP激動劑，然后在最長達24小時的時間t后，
[0050] b)給予所述患者含鉑抗癌藥物。
[0051] 本發(fā)明還提供了降低含鉑抗癌藥物的副作用的方法，其包括在給予含鉑抗癌藥物前不久給予ER0激動劑的步驟。例如，在給予含鉑抗癌藥物之前最長達24小時(例如之前1至 4小時，例如之前2小時)給予ERB激動劑。
[0052]綜上所述，本發(fā)明人已出乎意料地表明，ERP激動劑充當化學增敏劑，并且與順鉑組合的給藥順序對于體外所觀察的協(xié)同效應是至關重要的。
[0053]此外，他們出乎意料地發(fā)現(xiàn)，化合物（I)在表達ERP的非惡性間皮MET5A細胞中無細胞毒性作用，而且，化合物(I)減少了順鉑在這些細胞中的細胞毒性。因此，存在向目前用于 MPM的順鉑治療中添加 ER0激動劑而不增加顯著的額外毒性的可能性。
[0054] ER0激動劑
[0055] "ER0激動劑"為對雌激素受體β亞型表現(xiàn)出EC5Q0.1 nM至1000 OnM的效力的化合物。用于本發(fā)明的優(yōu)選的ERP激動劑化合物對雌激素受體β亞型表現(xiàn)出在所述EC5q范圍內的較低濃度下的效力，例如EC 5qO · InM至IOOnM的效力。優(yōu)選的本發(fā)明的ERP激動劑化合物是對雌激素受體β亞型的選擇性超過對雌激素受體α亞型的選擇性的那些化合物。選擇性ERP激動劑是與對雌激素受體α亞型相比，表現(xiàn)出對雌激素受體β亞型的選擇性為20或更大的化合物；或更優(yōu)選地，與對雌激素受體α亞型相比，表現(xiàn)出對雌激素受體β亞型的選擇性為50或更大的化合物。在某些優(yōu)選的實施方案中，用于本發(fā)明的ERP激動劑化合物對雌激素受體β亞型的選擇性比對雌激素受體α亞型的選擇性大100倍，大200倍，大300倍，或大500倍(基于EC 50 效力的值來計算）。
[0056] ERP激動劑是本領域已知的。例如，用于本發(fā)明的ERP激動劑可以是在以下任一篇文獻中被描述為ERP激動劑的化合物:WO 2002/072561、W0 03/044006、W0 2004/094401、W0 2006/0887UW0 2006/01983UW0 2006/044176^W0 2006/062876^ffO 2007/062876^EP 2143432、W0 2008/033894、W0 2008/043567、W0 2009/012191、W0 2009/012954、W0 2009/ 055734、W0 2009/124968、W0 2009/127686、W0 2010/031852、W0 2011/042473、W0 2011/ 042474、TO 2011/042475、TO 2011/042477和TO 2013/017619,它們的全部內容以引用的方式納入本文。
[0057] 優(yōu)選地，所述ER0激動劑是在WO 2009/127686或WO 2006/062876中被描述為ER0激動劑的化合物。例如，所述ERP激動劑可以為式（III)的化合物或其藥學上可接受的酯、酰胺、氨基甲酸酯、溶劑合物或鹽，包括所述酯、酰胺或氨基甲酸酯的鹽，以及所述酯、酰胺、氨基甲酸酯或鹽的溶劑合物，
[0058；
[0059] 其中R1選自鹵素、氰基、硝基、OrWrbK(O)C 1-4烷基、-SO2C1-4烷基、C1-6烷基、 C2-6烯基、C2-6炔基、鹵代&-6烷基、二鹵代&-6烷基、三鹵代&-6烷基、鹵代C2-6烯基、二鹵代C2-6 烯基、三鹵代C2-6烯基、氰基Ci-6烷基、Ci-4烷氧基Ci-6烷基、C 3-S環(huán)烷基、C3-S環(huán)烷基Ci-6烷基、苯基、芐基和5-10元雜環(huán)基，其中所述苯基、芐基或雜環(huán)基基團可為未取代的或被1-3個取代基取代，各取代基選自〇R A、鹵素、氰基、硝基、-C( 0) Ci-4烷基、Ci-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、鹵代&-6烷基、二鹵代&-6烷基和三鹵代&-6烷基；
[0060] R2選自鹵素、氰基、硝基、(#、以妒):^(0!〇2、任選地被1至3個鹵素取代的-(：(0)(： 1一4 烷基、-SO2Ci-4 烷基、-C (0) NH-OH、-C (NH2) = N-OH、-C (CO2H) = N-OH、-C (NH2) = NH、-C (NHCi-4 烷基）=NH、-C(〇-Ci-4 烷基）=NH、-C(NH2) =N-NHh-NH-C(Mfe) =NH、-NH-C(0)NH2、_N = C(-NH-CH2CH2-NH-)、-S-CN、-S-C(NH2) = NH、-S-C(NH2) = N-OH、-CO2H、-CH2-CO2H、-CH(OH) CO2H、-C(O)Co2ISO3HXH2SO 3HX1-6烷基、鹵代C1-6烷基、二鹵代&―6烷基、三鹵代(^- 6烷基、氰基&一6 fei基、Cnfei氧基Cnfei基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8環(huán)基、C3-8環(huán)基Cnfei基、苯基、芐基和 5-10元雜環(huán)基，其中所述苯基、芐基或雜環(huán)基基團可為未取代的或被1-3個取代基取代，各取代基選自〇RA、鹵素、氰基、硝基、Cp6烷基、C2-6烯基、C 2-6炔基、鹵代Cp6烷基、二鹵代(^-6烷基和三鹵代Ci-6烷基;條件是如果R 1和R2之一代表鹵素，則另一個必須代表鹵素以外的基團； [0061 ] R3、R4、R5和R6各自獨立地選自氫、OR a、鹵素、氰基、硝基、Ck烷基、C2-6烯基、C2- 6炔基、鹵代烷基、二鹵代&-6烷基和三鹵代烷基；
[0062] 各Ra獨立地選自氫、&-6烷基、C2- 6烯基、C2-6炔基、C3-8環(huán)烷基、C 3-8環(huán)烷基Ck烷基、 C6-1Q芳基和C6-K)芳基Cp6烷基，各自任選地被1至3個鹵素原子取代;和
[0063] 各妒獨立地選自氫、&-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-S環(huán)烷基、C 3-S環(huán)烷基Cp6烷基、 C6-1Q芳基和C6-K)芳基Cp6烷基，各自任選地被1至3個鹵素原子取代；
[0064]條件是式（III)的化合物不為
[0065] 4-[3-(4,5_ 二氫-IH-咪唑-2-基)-2-(3,5-二甲基-異噁唑-4-基)-吲哚-1-基]-苯酚；
[0066] 1-(4-羥基-苯基)-2-(4-甲基-咪唑-1-基)-1Η-吲哚-3-甲腈；
[0067] ^4-羥基-苯基)-2-( IH-吡唑-3-基)-1Η-吲哚-3-甲腈；
[0068] 1-(3-氯-4-羥基-苯基)-2-(1-甲基-IH-吡唑-4-基)-1Η-吲哚-3-甲腈；
[0069] 1-(4-羥基-苯基)-2_丙-1-炔基-IH-吲哚-3-甲酸酰胺;或
[0070] 1-(4-羥基-苯基)-2-噻唑-2-基-IH-吲哚-3-甲酸。
[0071] 優(yōu)選地在式（I II)的化合物中，R1選自ORa、N ( Rb ) 2、-C (0) C1-4烷基、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、鹵代&―4烷基、二鹵代&―4烷基、三鹵代&―4烷基、鹵代匕4烯基、二鹵代C 2-4烯基、三鹵代C2-4烯基、苯基和5-6元雜環(huán)基，其中所述苯基或雜環(huán)基基團可為未取代的或如上所述被1 -3個取代基取代，所述取代基選自ORa、鹵素、氰基、-C (0) &-4烷基、&-4烷基、C2-4烯基、 C2-4炔基、鹵代烷基、二鹵代&-4烷基和三鹵代烷基；
[0072] R2選自鹵素、0RA、N(RB)2、任選地被1至3個鹵素取代的-C(O)C 1-4烷基、-以順2)=^ 0H、-C02H、-CH2-C02H、C1-6烷基、C 2-6烯基、C2-6炔基、鹵代C1-4烷基、二鹵代&―4烷基、三鹵代&―4 烷基、鹵代烯基、二鹵代&-4烯基、三鹵代&-4烯基、苯基和5-6元雜環(huán)基，其中所述苯基或雜環(huán)基基團可為未取代的或被1-3個取代基取代，所述取代基選自0R A、鹵素、氰基、-C(O) &一4烷基、Ci-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、鹵代Ci-4烷基、二鹵代&-4烷基和三鹵代Ci-4烷基；
[0073] 各R3、R4、R5和R6獨立地選自氫、OR a、鹵素、氰基、Ch烷基、鹵代&-4烷基、二鹵代&一4 烷基和三鹵代d-4烷基；
[0074] 各Ra獨立地選自氫、&-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C3-6環(huán)烷基、苯基和芐基;和
[0075] 各妒獨立地選自氫和&―4烷基。
[0076] 更優(yōu)選地在式（I II)的化合物中，R1選自ORa、N ( Rb ) 2、-C (0) 烷基、烷基、C2-4 烯基、C2-4炔基、苯基和5-6元雜環(huán)基，其中所述苯基或雜環(huán)基基團可為未取代的或被1-3個取代基取代，所述取代基選自鹵素、氰基、Ch烷基、_C( 0) Ch烷基和ORa ;
[0077] 各Ra獨立地代表氫或&―4烷基;和
[0078] 各妒獨立地選自氫和(^-4烷基。在這樣的實施方案中，優(yōu)選地R2選自任選地被1至3 個鹵素取代的-C (0) &-4 烷基、-C (NH2 )= N-OH、-CO2H、-CH2-CO2H、&-4 烷基、C2-4 烯基、C2-4 炔基和5-6元雜環(huán)基，其中所述雜環(huán)基基團可為未取代的或被1-3個取代基取代，所述取代基選自鹵素、氰基、-C (0) C1-4烷基、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、鹵代&―4烷基、二鹵代&―4烷基和三鹵代C 1-4烷基，以及ORa，其中Ra代表氫或&―4烷基。更優(yōu)選地，R 2選自-以0)〇13、-(：(順2)=1 0H、-C02H、-CH 2-CO2H、Ch烷基、C2-4烯基、C2-4炔基和5-6元雜環(huán)基，其中所述雜環(huán)基基團可為未取代的或被1-3個取代基取代，所述取代基選自鹵素、氰基Xh烷基、-C(O)C 1^烷基和 ORa，其中Ra代表氫或&-4烷基。
[0079] 在另一優(yōu)選的實施方案中，在式(III)的化合物中，R1為5-6元雜環(huán)基，其中所述雜環(huán)基基團被1-3個選自鹵素、氰基和&-4烷基的取代基取代；
[0080] R2 選自-C (0) CH3、-C (NH2 )= N-OH、-CO2H 和-CH2-CO2H;和 [0081 ] 各R3、R4、R5和R6獨立地選自氫和鹵素。
[0082] 在另一優(yōu)選的實施方案中，在式（III)的化合物中，R1為5元雜環(huán)基，其中所述雜環(huán) 基基團被2個獨立地選自甲基和乙基的取代基取代；
[0083] R2 為-C (NH2) =N-OH;和
[0084] 各R3、R4、R5和R6獨立地選自氫和鹵素。
[0085]更優(yōu)選地，用于本發(fā)明的ERi3激動劑是具有下式的化合物：
[0086]
[0087]或其鹽或酯。最優(yōu)選地，ERi3激動劑為式（I)的化合物（"化合物（I)"）或其鹽或酯。
[0088] 用于本發(fā)明的ERi3激動劑可以為鹽的形式。適合用于藥物的化合物的鹽是其中反荷離子是藥學上可接受的那些鹽。
[0089] 合適的鹽包括與有機的酸或堿或者無機的酸或堿所形成的那些鹽。具體而言，根據(jù)本發(fā)明與酸所形成的合適的鹽包括與無機酸、強有機羧酸所形成的那些鹽，所述強有機羧酸例如具有1至4個未取代的或取代(例如，被鹵素取代）的碳原子的鏈烷羧酸，例如飽和或不飽和的二羧酸，例如羥基羧酸，例如氨基酸;或與有機磺酸所形成的那些鹽，所述有機磺酸例如未取代的或取代(例如被鹵素取代）的(C 1-C4)-烷基磺酸或芳基磺酸。藥學上可接受的酸加成鹽包括由鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、檸檬酸、酒石酸、乙酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、三氟乙酸、琥珀酸、高氯酸、富馬酸、馬來酸、乙醇酸、乳酸、水楊酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸、羥乙磺酸、抗壞血酸、蘋果酸、苯二甲酸、天冬氨酸以及谷氨酸、賴氨酸和精氨酸所形成的那些鹽。
[0090] 藥學上可接受的堿鹽包括銨鹽、堿金屬鹽(例如鉀和鈉的那些鹽）、堿土金屬鹽(例如鈣和鎂的那些鹽）以及與有機堿所形成的鹽，所述有機堿例如二環(huán)己基胺、N-甲基-D-葡糖胺、嗎啉、硫代嗎啉、哌啶、吡咯烷、單低級烷基胺、二低級烷基胺或三低級烷基胺(例如乙胺、叔丁胺、二乙胺、二異丙胺、三乙胺、三丁胺或二甲基丙胺），或單羥基低級烷基胺、二羥基低級烷基胺或三羥基低級烷基胺，例如單乙醇胺、二乙醇胺或三乙醇胺?？梢赃M一步形成相應的內鹽。
[0091] 有機化學/藥物化學領域的技術人員將理解，許多有機化合物可與它們在其中反應或它們從其中沉淀或結晶的溶劑形成絡合物。這些絡合物被稱為"溶劑合物"。例如，與水的絡合物被稱為"水合物"。當藥物物質結合溶劑如水時，溶劑合物(例如水合物）以化學計量的量或非化學計量的量而存在于晶格中。定期篩選藥物物質水合物的存在，因為水合物可在藥品制備過程的任何階段、或在藥物物質或劑型的貯藏時出現(xiàn)。溶劑合物記載于 S.Byrn等人，Pharmaceutical Research 12(7)，1995,954_954,和Water-Insoluble Drug Formulation，第二版，R.Liu，CRC Press，第553頁，它們以引用的方式納入本文。因此，本領域技術人員將理解，用于本發(fā)明的ERP激動劑及其鹽因此可以以溶劑合物的形式存在。適用于藥物的本發(fā)明的ER0激動劑化合物的溶劑合物是其中結合的溶劑是藥學上可接受的那些溶劑合物。例如，水合物是藥學上可接受的溶劑合物的實例。
[0092]有機化學/藥物化學領域的技術人員也將理解，ERi3激動劑可以以前藥的形式提供。前藥可被定義為在給予受試者后，能夠在體內轉化(例如通過在血液中的水解作用）成其具有醫(yī)學作用的活性形式的化合物。藥學上可接受的前藥記載于T.Higuchi和V. Stella， Prodrugs as Novel Delivery Systems,A.C.S.Symposium Series( 1976)的卷 14; "Design of Prodrugs''ed.H.Bundgaard，Elsevier，1985;以及在 Edward B . Roche , ed ., Bioreversible Carriers in Drug Design,American Pharmaceutical Association and Pergamon Press，1987中，它們以引用的方式納入本文。
[0093]本發(fā)明中的活性劑(ER0激動劑和含鉑抗癌藥物(加上任何其他治療劑））可以通過相同的或不同的給藥途徑來給予。
[0094]為達到治療效果所需要的ERi3激動劑的量將根據(jù)特定化合物，給藥途徑，接受治療的受試者(包括受試者的類型、物種、年齡、體重、性別和醫(yī)學狀況，以及受試者的腎功能和肝功能），和待治療的特定病癥或疾病及其嚴重性而變化。普通醫(yī)師可以容易地確定并開出預防、抵抗或阻止病癥進展所需的有效量的藥物。
[0095] 當用于所標明的作用時，本發(fā)明的ERi3激動劑對于成人的口服劑量為約0.1 mg每千克體重每天(mg/kg/天)至約5mg/kg/天，優(yōu)選0 · 3mg/kg/天至3mg/kg/天，更優(yōu)選0 · 5mg/kg/ 天至2.0mg/kg/天，且最優(yōu)選0.75mg/kg/天至1.5mg/kg/天。因此對于成人的口服日劑量為 5mg至約350mg，優(yōu)選20mg至200mg，更優(yōu)選35mg至150mg，且最優(yōu)選50mg至約IOOmg，例如 75mg。可以有利地以單日劑量給予本發(fā)明的ERP激動劑，或可將總日劑量以每日二次、三次或四次的分劑量給藥。對于口服給藥，優(yōu)選地以片劑形式或其他呈現(xiàn)形式提供組合物，所述形式以含有約〇. Olmg至500mg活性成分，優(yōu)選約Img至約IOOmg活性成分，例如0.1 mg、0.5mg、 1 · Omg、2 · 5mg、5 · Omg、10 · Omg、15 · Omg、25 · Omg、50 · Omg、IOOmg 或 500mg 活性成分的分離單位來提供。
[0096] 如果使用靜脈內給藥，在恒速輸注過程中，優(yōu)選的給藥速率將為約0. lmg/kg/min 至約10mg/kg/min。通常的輸注時間是5分鐘至90分鐘。
[0097] 用于本發(fā)明的ERi3激動劑的藥物制劑包括適合于口服給藥，腸胃外(包括皮下、真皮內、肌內、靜脈內[推注或輸注]和關節(jié)內）給藥，吸入(包括可借助于各種類型的計量劑量加壓的氣霧劑、霧化器或吹入器而產生的細顆粒粉劑或霧劑)給藥，直腸給藥，腹膜內給藥和局部(包括皮膚、口腔、舌下和眼內）給藥的那些藥物制劑。
[0098] ERP激動劑的制劑可以便利地以單位劑量形式呈現(xiàn)，并且可以通過任何藥學領域公知的方法來制備。
[0099]適合于口服給藥的ERi3激動劑的制劑可以以分離單位，例如各自含有預定量的活性成分的膠囊劑、扁囊劑(cachet)、丸劑或片劑；以粉劑或顆粒劑；以在含水液體或非水液體中的溶液或懸浮液，例如酏劑、酊劑、懸浮劑或糖漿劑;或以水包油液體乳劑或油包水液體乳劑而呈現(xiàn)?；钚猿煞诌€可以以大丸藥(bolus)、干藥糖劑(electuary)或糊劑呈現(xiàn)。
[0100] 用于腸胃外給藥的制劑包括水性無菌注射液和非水性無菌注射液，其可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使制劑與預期受試者的血液等滲的溶質；以及水性無菌混懸劑和非水性無菌混懸劑，它們可包括懸浮劑和增稠劑。所述制劑可以以單位劑量或多劑量容器(例如密封的安瓿瓶和小瓶)呈現(xiàn)，并且可以貯存在冷凍干燥(凍干)條件下，僅需要在使用前立即加入無菌液體載體(例如鹽水或注射用水）。臨時注射液和臨時注射懸浮液可由之前所描述的那類無菌粉劑、顆粒劑和片劑來制備。用于腸胃外給藥的示例性組合物包括可注射溶液或可注射懸浮液，其可含有例如合適的無毒的、腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑，例如甘露醇、1，3_ 丁二醇、水、林格氏溶液、等滲氯化鈉溶液或其他合適的分散劑或潤濕劑和懸浮劑，包括合成的甘油單酯類或甘油二酯類，以及脂肪酸，包括油酸或Cremaphor。
[0101] 用于經鼻給藥、氣霧劑給藥或吸入給藥的示例性組合物包括鹽水溶液，其可含有例如苯甲醇或其他合適的防腐劑、吸收促進劑以提高生物利用率，和/或其他增溶劑或分散劑，例如本領域公知的那些。
[0102] 用于直腸給藥的制劑可以以含常用載體的栓劑呈現(xiàn)，所述載體例如可可脂、合成甘油酯或聚乙二醇。這樣的載體在常溫下通常為固體，但是在直腸腔中液化和/或溶解以釋放藥物。
[01 03]用于在口腔中局部給藥(例如經頰給藥或舌下給藥）的制劑包括錠劑（lozenges)，其包含混于調味基質中的活性成分，所述調味基質例如蔗糖和阿拉伯膠或黃蓍膠；以及軟錠劑(pastilles)，其包含混于基質中（例如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠)的活性成分。用于局部給藥的示例性組合物包括局部載體，例如Plastibase(用聚乙烯凝膠化的礦物油）。
[0104] 優(yōu)選的ERP激動劑的單位劑量制劑是如上文所述含有有效劑量的ERP激動劑的那些制劑，或含有其適當部分的那些制劑。
[0105] 應理解，除了上文特別提到的成分以外，考慮到所討論的制劑類型，用于本發(fā)明的制劑可以包括本領域的其他常規(guī)試劑，例如適于口服給藥的那些試劑可包括調味劑。
[0106] 含鉑抗癌藥物
[0107] 含鉑抗癌藥物是用于治療癌癥的含有鉑的化療劑。認為它們作為單加成物引起 DNA的交聯(lián)，鏈間交聯(lián)、鏈內交聯(lián)或DNA蛋白交聯(lián)。它們包括，但不限于，順鉑、卡鉑、奧鉑 (oxaplatin)、奧沙利鉑、沙鉑、吡鉑、奈達鉑、三鉑（triplatin)、奧馬鉑、四鉑、洛鉑 (]^(^]^1：；[11)和磷鉬類化11(^1^131：；[118)，例如順鉬、卡鉬、奧鉬、奧沙利鉬、沙鉬、吡鉬、奈達鉑或三鉑、奧馬鉑、四鉑和磷鉑類。這些化合物可以通過本領域已知的方法來制備。
[0108] 用于本發(fā)明的含鉑抗癌藥物可以選自順鉑、卡鉑、奧鉑、奧沙利鉑、沙鉑、吡鉑、奈達鉑、三鉑、奧馬鉑、四鉑、洛鉑和磷鉑類，例如順鉑、卡鉑、奧鉑、奧沙利鉑、沙鉑、吡鉑、奈達鉑或三鉑、奧馬鉑、四鉑和磷鉑類。優(yōu)選地，含鉑抗癌藥物選自順鉑或卡鉑。最優(yōu)選地，含鉑抗癌藥物是順鉑。
[0109] 用于本發(fā)明的含鉑抗癌藥物的藥物制劑為，例如，用于靜脈內給藥的制劑(特別是在順鉬、卡鉑和奧沙利鉑的情況下)或用于□服給藥的制劑(特別是在沙鉑的情況下）。 [0110]含鉑抗癌藥物的最佳劑量取決于給藥時間表，所選擇的特定藥物的效力，患者的年齡、大小、性別和狀態(tài)，疾病的性質和嚴重性，以及其他相關的醫(yī)學因素和生理學因素。因此，藥學上有效的量可容易地由看護者或臨床醫(yī)師來確定。通常，選擇適合量的含鉑抗癌藥物以達到化療效果。在本發(fā)明中，含鉑抗癌藥物的靜脈內劑量通常含有約IOmg至約500mg活性成分，優(yōu)選約50mg至約250mg活性成分。
[0111] 通常經靜脈內（IV)給予含鉑抗癌藥物，例如順鉑和卡鉑。在這種情況下，歷時約10 分鐘至約420分鐘，例如約30分鐘至約300分鐘，例如約30分鐘至約180分鐘，例如約120分鐘的時間段給藥。當含鉑抗癌藥物是順鉑時，通常歷時約120分鐘給藥。例如，歷時約120分鐘進行75mg/m 2靜脈內輸注。通常的輸注速率為約0.005mg/kg/min至約0.05mg/kg/min。含鉬抗癌藥物的有效靜脈內劑量通常為約0. lmg/kg體重至約50mg/kg體重，優(yōu)選約lmg/kg體重至約5mg/kg體重。
[0112] 本發(fā)明中的含鉑抗癌藥物對于成人的口服劑量將為約Img每千克體重每天(mg/ kg/天）至約100mg/kg/天，優(yōu)選2mg每千克體重每天(mg/kg/天）至10mg/kg/天，且最優(yōu)選 3mg/kg/天至 6mg/kg/天。
[0113] 例如，可以以在醫(yī)師案頭參考(Physicians'Desk ReferenceJDR)中指示的量，或者由本領域普通技術人員以其他方式確定的量來使用含鉑抗癌藥物。例如，對于成人而言，通常的順鉑靜脈內劑量為每天70-100mg/m2(相當于每天約125-185mg的劑量），其可以重復最長達3天。例如，對于患有惡性胸膜間皮瘤的成人而言，通常的順鉑單劑量為歷時2小時輸注7 5mg/m2。對于MPM而言，順鉑的標準治療劑量為在21天周期的第一天歷時2小時輸注 75mg/m 2順鉑，隨后休息20天，在這段休息時間內不再給予順鉬。根據(jù)MPM的階段可將所述周期重復一次或數(shù)次。
[0114] 在一個實施方案中，本發(fā)明的給藥方案提供了用于在患者中治療間皮瘤(例如用于治療MPM)的ERf3激動劑（例如化合物（I))和順鉑，其中ERf3激動劑以5mg至約350mg，優(yōu)選 20mg至200mg，更優(yōu)選35mg至150mg，且最優(yōu)選50mg至IOOmg，例如75mg的劑量給藥，然后在最長達24小時的時間t后，例如在15分鐘、30分鐘、1小時、90分鐘、2小時、4小時、8小時、16小時或24小時后，在21天周期的第1天歷時2小時輸注75mg/m 2劑量的順鉑，隨后休息20天，在這段休息時間內不再給予順鉑。任選地，也可以在給予順鉑后的21天周期期間的一天或更多天(例如也可在21天周期的第2天至第7天，或也可在21天周期的第2天至第21天)給予ER^t 動劑。根據(jù)MPM的階段可將所述周期重復一次或數(shù)次。
[0115] 當含鉑抗癌藥物是卡鉑時，其通常歷時約30分鐘給藥?？ㄣK的通常劑量為在血漿濃度-時間曲線(AUC)下的2至8個靶面積，更通常歷時約30分鐘靜脈內輸注4至6個AUC?？ㄣK AUC的單位是mg卡鉬/mL · min。可以使用Calvert等人(Calvert，A.H.等人，J Clin Oncol (1989)7:1748-56)的方法來計算卡鉑的精確劑量。該方法為:卡鉑劑量（以毫克計）=AUCX (腎小球濾過率+25)，即如果AUC = 5,卡鉑劑量（以毫克計）=5 X (腎小球濾過率+25)。腎小球濾過率基于肌酸酐清除率、EDTA清除率或Cockcroft-Gault公式(例如在Cockcroft D， Gault MD·Nephron，16:31-41，1976 ;Winter，Μ·Α·等人，Pharmacotherapy(2012)32(7): 604/12;Brown，D.L.等人，Ann Pharmacother(2013)47(7-8): 1039-44中所描述的；或參見 iSihttp：//nephron. com/cgi-bin/CGSI.cgi,http://www.clinicalculator.com/english/ nephrology/cockroft/cca.htm，或http://www.clinicalculator.com/english/ nephrology/cockroft/cca.htm上的計算工具）。
[0116] 對于患有惡性胸膜間皮瘤的成人，卡鉑劑量的實例是在21天周期的第一天歷時30 分鐘輸注4至6個AUC(例如5個AUC)，隨后休息20天，在這段休息時間內不再給予卡鉑(參見，例如，Santoro Α·等人，J Thorac 0ncol(2008)3:756_63;Ceresoli G.L.等人，J Clin Oncol (2006)24:1443;和http: //chemoregimen · com/Mesothelioma-c-47-57 .html)。根據(jù) MPM的階段可將所述周期重復一次或數(shù)次。
[0117] 在一個實施方案中，本發(fā)明的給藥方案提供了用于在患者中治療間皮瘤(例如用于治療MPM)的ERP激動劑（例如化合物（I))和卡鉑，其中ERP激動劑以5mg至約350mg，優(yōu)選 20mg至200mg，更優(yōu)選35mg至150mg，且最優(yōu)選50mg至IOOmg，例如75mg的劑量給藥，然后在最長達24小時的時間t后，例如在15分鐘、30分鐘、1小時、90分鐘、2小時、4小時、8小時、16小時或24小時后，在21天周期的第1天歷時30分鐘輸注5個AUC劑量的卡鉑，隨后休息20天，在這段休息時間內不再給予卡鉑。任選地，也可以在給予卡鉑后的21天周期期間的一天或更多天（例如也在21天周期的第2天至第7天，或也在21天周期的第2天至第21天）給予劑。根據(jù)MPM的階段可將所述周期重復一次或數(shù)次。
[0118] 應理解，除了上述特別提到的成分之外，考慮到所討論的制劑的類型，本發(fā)明的制劑可以包括本領域中的其他常規(guī)試劑，例如適于口服給藥的那些制劑可以包括調味劑。
[0119] 其他治療劑
[0120] 雖然在本發(fā)明的治療中，ERP激動劑和含鉑抗癌藥物可被用作僅有的活性劑，但是也可以將一種或多種其他治療劑與ERP激動劑和含鉑抗癌藥物組合使用。所述一種或多種其他治療劑可與ERP激動劑和含鉑抗癌藥物之一或兩者同時使用、依序使用或分開使用。這樣的其他治療劑可為其他ERP激動劑，或者適用于預防或治療癌癥的不同藥劑，例如化療劑。
[0121] 特別地，本發(fā)明的ERP激動劑和含鉑抗癌藥物可以與其他適用于治療間皮瘤的試劑(例如培美曲塞)組合使用。這種組合的單獨組分可以在治療過程中的不同時間點分別給予，或以分開的或單一的組合物形式同時給予。
[0122] 在本發(fā)明的某些實施方案中，例如，在其中含鉑抗癌藥物是順鉑的實施方案中，給予其他化療藥物。優(yōu)選所述其他化療藥物是培美曲塞。例如，可以以在醫(yī)師案頭參考(PDR) 中指示的量，或者由本領域普通技術人員以其他方式確定的量給予培美曲塞。例如，在連同順鉑一起的21天周期的第一天，歷時10分鐘靜脈內輸注給予500mg/m 2培美曲塞，在培美曲塞給藥結束后大約30分鐘，開始以75mg/m2的劑量歷時2小時輸注順鉑。隨后休息20天，在這段休息時間內不再給予培美曲塞或順鉑。根據(jù)MPM的階段可將所述周期重復一次或數(shù)次。這是惡性胸膜間皮瘤的治療標準。
[0123] 在 Vo g e I z an g，N · J ·等人，J CI i n On c 〇 1 ( 2 0 0 3 ) 2 1 : 2 6 3 6 和h 11 p : / / chemoregimen · com/Me so the lioma-c-47-57 .html中進一步描述了使用順鉬和培美曲塞的治療標準。除了其他治療劑培美曲塞以外，在培美曲塞的首劑量之前1周直到培美曲塞的最終劑量后21天可以給予維生素補充劑(每9周葉酸350-1000mcg Po qd;維生素 B12 1000 mcg I.Μ.)。在給予培美曲塞的前一天、當天和后一天，也可以每天給予兩次4mg地塞米松(地卡特?。?br>[0124] 在本發(fā)明的某些實施方案中，例如，在其中含鉑抗癌藥物是卡鉑的實施方案中，給予其他化療藥物。優(yōu)選所述其他化療藥物是培美曲塞。例如，在連同卡鉑一起的21天周期的第一天，歷時10分鐘靜脈內輸注給予500mg/m 2培美曲塞，在培美曲塞給藥結束后大約30分鐘，開始以5個AUC的劑量歷時30分鐘輸注卡鉑。隨后休息20天，在這段休息時間內不再給予培美曲塞或卡鉑。根據(jù)MPM的階段可將所述周期重復一次或數(shù)次。在Ceresoli G.L.等人，J Cl in Oncol(2006);24:1443和http://chemoregimen·com/MesotheIioma-c-47-57·html中進一步描述了使用卡鉑和培美曲塞的間皮瘤治療。除了其他治療劑培美曲塞以外，在培美曲塞的首劑量之前一周直到培美曲塞的最終劑量后21天，可以給予維生素補充劑(每9周葉酸350-1000mcg po qd;維生素 B12 1000 mcg I ·Μ·)。在給予培美曲塞的前一天、當天和后一天，也可以每天給予兩次地塞米松(地卡特隆)4mg。
[0125] 在一個實施方案中，本發(fā)明的給藥方案提供了用于在患者中治療間皮瘤(例如用于治療MPM)的ERP激動劑(例如化合物（I))和順鉑或卡鉑，以及培美曲塞，其中在21天周期的第1天以5mg至約350mg，優(yōu)選20mg至200mg，更優(yōu)選35mg至150mg，且最優(yōu)選50mg至I OOmg，例如75mg的劑量給予ERP激動劑，然后在最長達24小時的時間t后，例如在15分鐘、30分鐘、1 小時、90分鐘、2小時、4小時、8小時、16小時或24小時后，歷時2小時輸注50-100mg/m 2 (例如 75mg/m2)劑量的順鉑或歷時30分鐘輸注4-7.5 (例如5或6)個AUC劑量的卡鉑，該輸注在歷時 10分鐘靜脈內輸注給予500mg/m2培美曲塞后大約30分鐘開始。隨后休息20天，在這段休息時間內不再給予培美曲塞或順鉑/卡鉑。任選地，也可以在給予順鉑或卡鉑后的21天周期期間的一天或更多天(例如也可在21天周期的第2天至第7天，或也可在21天周期的第2天至第 21天)給予ERi3激動劑。根據(jù)MPM的階段可將所述周期重復一次或數(shù)次。
[0126] 在一個實施方案中，本發(fā)明的給藥方案提供了用于在患者中治療間皮瘤(例如用于治療MPM)的ERP激動劑(例如化合物(I))，以及順鉑和培美曲塞，其中在21天周期的第1天以5mg至約350mg，優(yōu)選20mg至200mg，更優(yōu)選35mg至150mg，且最優(yōu)選50mg至I OOmg，例如75mg 的劑量給予ERi3激動劑，然后在最長達24小時的時間t后，例如在15分鐘、30分鐘、1小時、90 分鐘、2小時、4小時、8小時、16小時或24小時后，歷時2小時輸注75mg/m 2劑量的順鉑，該輸注在歷時10分鐘靜脈內輸注給予500mg/m2培美曲塞后大約30分鐘開始。隨后休息20天，在這段休息時間內不再給予培美曲塞或順鉑。任選地，也可以在給予順鉑后的21天周期期間的一天或更多天（例如也可在21天周期的第2天至第7天，或也可在21天周期的第2天至第21 天)給予ERi3激動劑。根據(jù)MPM的階段可將所述周期重復一次或數(shù)次。
[0127] 在一個實施方案中，本發(fā)明的給藥方案提供了用于在患者中治療間皮瘤(例如用于治療MPM)的ERP激動劑(例如化合物(I))，以及卡鉑和培美曲塞，其中在21天周期的第1天以5mg至約350mg，優(yōu)選20mg至200mg，更優(yōu)選35mg至150mg，且最優(yōu)選50mg至I OOmg，例如75mg 的劑量給予ERi3激動劑，然后在最長達24小時的時間t后，例如在15分鐘、30分鐘、1小時、90 分鐘、2小時、4小時、8小時、16小時或24小時后，歷時30分鐘輸注5個AUC劑量的卡鉑，該輸注在歷時10分鐘靜脈內輸注給予500mg/m 2培美曲塞后大約30分鐘開始。隨后休息20天，在這段休息時間內不再給予培美曲塞或卡鉑。任選地，也可以在給予卡鉑后的21天周期期間的一天或更多天（例如也可在21天周期的第2天至第7天，或也可在21天周期的第2天至第21 天)給予ERi3激動劑。根據(jù)MPM的階段可將所述周期重復一次或數(shù)次。
[0128] 在其他化療藥物是培美曲塞的實施方案中，在給予培美曲塞的前一天、當天和后一天，也可以給予地塞米松。為了降低毒性，也可指導采用培美曲塞治療的患者每天服用低劑量的口服葉酸制劑或含有葉酸的多種維生素。例如，可以從培美曲塞的首劑量前7天開始，持續(xù)整個治療過程，并在培美曲塞的最終劑量后21天中，每日一次經口服給予葉酸 400mcg至lOOOmcg。在培美曲塞的首劑量前一周和從那之后的每3個周期期間，患者也可以接受一次維生素 B12的肌肉注射。可以在給予培美曲塞的同一天給予隨后的維生素 B12注射。因此，在治療包括給予其他化療藥物培美曲塞的本發(fā)明的實施方案中，所述治療可進一步包括給予如下的一種或多種：地塞米松，葉酸制劑，含有葉酸的多種維生素，和維生素 B12〇
[0129]例如，可以以在醫(yī)師案頭參考(PDR)中指示的那些量，或者由本領域普通技術人員以其他方式確定的量使用上述其他治療劑。
[0130]間皮瘤的其他治療方式可以與本發(fā)明結合使用，例如放療。除了外科手術，例如胸膜切除術/皮質剝除術(P/D)或胸膜外肺切除術(EPP)，可以使用本發(fā)明的治療以除去腫瘤，或者如果液體積聚在胸部或腹部，可以使用胸腔穿刺術/穿刺抽液術或胸膜固定術。
[0131 ]在本發(fā)明中被用作其他試劑的其他ERP激動劑可以是在以下任一篇文獻中被描述為ER0激動劑的化合物：WO 2002/072561、W0 03/044006、WO 2004/094401、W0 2006/08871、 WO 2006/019831、W0 2006/044176、W0 2006/062876、W0 2007/062876、EP 2143432、W0 2008/033894、W0 2008/043567、W0 2009/012191、W0 2009/012954、W0 2009/055734、W0 2009/124968、W0 2009/127686、W0 2010/031852、W02011/042473、W0 2011/042474、W0 2011/042475、W0 2011/042477和WO 2013/017619。
[0132] 用于本發(fā)明中的其他化療劑可以選自其他含鉑抗癌藥物(例如選自順鉑、卡鉑、奧鉑、奧沙利鉑、沙鉑，啦鉑、奈達鉑和三鉑）；烷化劑（例如氮芥（包括二氯甲基二乙胺 (mechlorethamine)、環(huán)磷酰胺、美法侖、苯丁酸氮芥、異環(huán)磷酰胺和白消安），亞硝基脲類 (包括亞硝基脲類，包括N-亞硝基-N-甲基脲(MNU )、卡莫司汀(BCNU )、洛莫司汀(CCNU)和司莫司汀(MeCCNU)、福莫司汀和鏈脲菌素），四嗪類(包括達卡巴嗪、米托唑胺和替莫唑胺），氮丙啶類(包括噻替派、絲裂霉素 C和地吖醌(AZQ))，以及非典型烷化劑(包括丙卡巴肼和六甲嘧胺））；抗代謝藥(例如抗葉酸劑(包括培美曲塞和甲氨蝶呤），氟嘧啶(包括氟尿嘧啶和卡培他濱），脫氧核苷類似物(包括阿糖胞苷、吉西他濱、地西他濱、阿扎胞苷、氟達拉濱、奈拉濱、克拉屈濱、氯法拉濱和噴司他丁)和巰基嘌呤(包括硫鳥嘌呤和巰嘌呤））；抗微管劑(例如長春花生物堿(包括長春新堿、長春堿、長春瑞濱、長春地辛和長春氟寧）和紫杉烷類(包括紫杉醇、依托泊苷和替尼泊苷））；拓撲異構酶抑制劑（例如伊立替康、托泊替坎、多柔比星、米托蒽醌、新生霉素、美巴龍(merbarone)和阿柔比星）；其他酶抑制劑(例如硼替佐米、伊馬替尼和丙卡巴肼）；和細胞毒性抗生素類(例如蒽環(huán)類(包括多柔比星、柔紅霉素、表柔比星、伊達比星、吡柔比星、阿柔比星和米托蒽醌)及放線菌素、博萊霉素、普卡霉素和絲裂霉素)）。
[0133] 間皮瘤
[0134] 如本文所使用的術語"間皮瘤"包括但不限于上皮樣間皮瘤、肉瘤樣間皮瘤以及混合性(雙相性）間皮瘤。間皮瘤的類型包括但不限于，胸膜惡性間皮瘤、腹膜惡性間皮瘤、心包惡性間皮瘤和鞘膜惡性間皮瘤。
[0135] 本發(fā)明的治療適用于治療間皮瘤，例如上皮樣間皮瘤、肉瘤樣(纖維性）間皮瘤以及混合性(雙相性）間皮瘤。本發(fā)明的治療特別適用于治療上皮樣和混合性間皮瘤。本發(fā)明的治療適用于治療例如惡性胸膜間皮瘤、惡性腹膜間皮瘤、惡性心包間皮瘤和惡性鞘膜間皮瘤。本發(fā)明的治療特別適用于治療惡性胸膜間皮瘤。
[0136] 如本文所使用的，"患者"是易患有間皮瘤的任何哺乳動物(例如，人）。本發(fā)明所用的化合物特別用于治療人類患者。
[0137] 時間，t
[0138] 在本發(fā)明的治療中，首先給予患者ERP激動劑，然后在最長達24小時的時間t后，給予含鉑抗癌藥物。
[0139] 在某些優(yōu)選的實施方案中，t為最長達約16小時;優(yōu)選最長達約8小時;更優(yōu)選最長達約4小時;最優(yōu)選最長達約2小時。
[0140] 在某些優(yōu)選的實施方案中，t為約15分鐘至約24小時；約15分鐘至約16小時;優(yōu)選約30分鐘至約8小時；更優(yōu)選約30分鐘至約4小時；更優(yōu)選約1小時至約2小時；最優(yōu)選約2小時。
[0141 ]在包括給予ERP激動劑、含鉑抗癌藥物和培美曲塞的實施方案中，優(yōu)選至少在給予 ERP激動劑后最長達約24小時給予含鉑抗癌藥物。在更優(yōu)選的實施方案中，至少在給予ERP 激動劑后最長達約4小時給予含鉬抗癌藥物，且最優(yōu)選在給予ERP激動劑后最長達約2小時給予含鉑抗癌藥物。在這樣的實施方案中，優(yōu)選在給予含鉑抗癌藥物之前給予培美曲塞，例如約10分鐘至約60分鐘之前，且更優(yōu)選約30分鐘前。優(yōu)選地，所述含鉑抗癌藥物是順鉑或卡鉑。
[0142] 在包括給予ERP激動劑以及順鉑和培美曲塞兩者的實施方案中，優(yōu)選至少在給予 ERP激動劑后最長達約24小時給予順鉑。在更優(yōu)選的實施方案中，至少在給予ERP激動劑后最長達約4小時給予順鉬，且最優(yōu)選在給予ERP激動劑后最長達約2小時給予順鉬。在這樣的實施方案中，優(yōu)選在給予順鉑之前給予培美曲塞，例如約10分鐘至約60分鐘之前，且更優(yōu)選約30分鐘前。
[0143] 在包括給予ERP激動劑以及順鉑和培美曲塞兩者的實施方案中，優(yōu)選至少在給予 ERP激動劑后約15分鐘至約24小時給予順鉑。在更優(yōu)選的實施方案中，至少在給予劑后約30分鐘至約4小時給予順鉑，且最優(yōu)選在給予ERi3激動劑后約2小時給予順鉑。
[0144] 在包括給予ERP激動劑以及卡鉑和培美曲塞兩者的實施方案中，優(yōu)選至少在給予 ERP激動劑后最長達約24小時給予卡鉑。在更優(yōu)選的實施方案中，至少在給予ERP激動劑后最長達約4小時給予卡鉑，且最優(yōu)選在給予ERi3激動劑后最長達約2小時給予卡鉑。在這樣的實施方案中，優(yōu)選在給予卡鉑之前給予培美曲塞，例如約10分鐘至約60分鐘之前，且更優(yōu)選約30分鐘前。
[0145] 在包括給予ERP激動劑以及卡鉑和培美曲塞兩者的實施方案中，優(yōu)選至少在給予 ERP激動劑后約15分鐘至約24小時給予卡鉑。在更優(yōu)選的實施方案中，至少在給予劑后約30分鐘至約4小時給予卡鉑，且最優(yōu)選在給予ERf3激動劑后約2小時給予卡鉑。
[0146] 在某些優(yōu)選的實施方案中，所述ERP激動劑是化合物（I)，所述含鉑抗癌藥物是順鉑，且t是，例如，最長達8小時、最長達4小時、最長達2小時或約2小時，且任選地還給予培美曲塞。
[0147]在另一個實施方案中，所述ERi3激動劑是化合物（I)，所述含鉑抗癌藥物是卡鉑，且 t是，例如，最長達8小時、最長達4小時、最長達2小時或約2小時，且任選地還給予培美曲塞。
[0148]在某些優(yōu)選的實施方案中，首先將ERP激動劑給予患者，然后在最長達24小時，例如最長達約16小時；最長達約8小時；最長達約4小時；或約2小時的時間t后，給予含鉑抗癌藥物，且任選地給予培美曲塞;隨后，在給予含鉬抗癌藥物后的一天或多天再給予一劑或多劑ERi3激動劑。例如，可在給予含鉑抗癌藥物后最長達20天(且包括20天)每日給予劑。
[0149] 在某些優(yōu)選的實施方案中，首先將ERP激動劑給予患者，然后在15分鐘至24小時，例如30分鐘至16小時;30分鐘至8小時；1小時至4小時;或約2小時的時間t后，給予含鉑抗癌藥物，且任選地給予培美曲塞;隨后，在給予含鉬抗癌藥物后的一天或多天再給予一劑或多劑ERi3激動劑。例如，可在給予含鉑抗癌藥物后最長達20天(且包括20天)每日給予劑。
[0150] 實施例
[0151] 以下材料和方法適用于下面的一個或多個實施例。
[0152] 材料和方法
[0153] 試劑和抗體
[0154] 特異性針對α-微管蛋白、PARPl的單克隆抗體以及特異性針對ERf3的多克隆抗體購自 Santa Cruz Biotechnology(Santa 〇1'112，〇厶，1]3厶）。磷酸-厶1(1'(卩36『473)來自〇611 Signaling Technology(Beverly，MA，USA)，抗小鼠和抗兔IgG過氧化物酶綴合的抗體和化學試劑來自 Sigma-Aldrich(St LouisjCMJSAhECL來自 Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala，Sweden)。硝酸纖維素膜和蛋白測定試劑盒來自Bio-Rad (Hercules，CA，USA)。培養(yǎng)基、血清、抗生素和LipofectAMINE轉染試劑來自 Invitrogen(CarIsbad，CA，USA)。ERP選擇性激動劑化合物（I)可以按照WO 2009/127686中所記載的方法來制備。順鉑來自EBEWE Arzneimittel Ges.m.h.H(Unterach，澳大利亞）或EBEWE Italia SRL(Roma，意大利）。培美曲塞來自EliLi Ily (Houten，荷蘭）。
[0155] 細胞培養(yǎng)和轉染
[0156] 來自上皮樣 MPM 的 REN 細胞系由 Albelda S.M.博士（University of Pennsy I vania ,Philadelphia; PA，USA)分離、表征和提供。雙相 MST0-21IH 和間皮MET5A 細胞系從意大利Istituto Scientifico Tumori(IST)Cell_bank，Genoa獲得;MMB和MMP細胞系來自患有M P M的患者的胸腔積液并已被穩(wěn)定在培養(yǎng)物中（C a c c i 〇 11 i P等人，P r 〇 c N a 11 Acad Sci U S A 2001 ;98:12032-7;Pinton G.等人，Cancer Res 2009;69:4598-604); H2 5 9 6細胞系是由H. I. P a s s博士從得自患有切除的M P M的患者的外科手術樣本中制備的 (Pass H.I.等人，Ann Thorac Surgl995;59(4):835-44)。細胞在補充有 10%FBS、100μg/ml 鏈霉素和lOμg/ml青霉素的RPMI培養(yǎng)基中在37°C下在含有5%⑶2的潮濕環(huán)境中生長。通過使用來自 Stratagene(La Jolla，CA，USA)的Mycoplasma PlusTM PCR Primer Set試劑盒來排除支原體感染。對于MST0-211H/ERi3細胞，按照制造商的描述，使用LipofectAMINE試劑，采用表達人野生型ER0的pCNX2質粒(Addgene ,Cambridge，MA，USA)瞬時轉染在組織培養(yǎng)皿中生長至80 %融合的細胞。使用來自Sigma(St Loui s，MO，USA)的ER0特異性shRNA慢病毒質粒(pLKO· I-puro)或來自Qiagen(Hilden，Germany)的特異性siRNA實現(xiàn)了基因沉默。
[0157] 增殖測定
[0158] 將細胞以10\104細胞/孔的密度在6孔板中接種于補充有10^^85、10(^8/1111鏈霉素和lOμg/ml青霉素的RPMI培養(yǎng)基中，并在37°C下在含有5%⑶ 2的潮濕環(huán)境中孵育過夜以使細胞粘附。處理后，使細胞受胰蛋白酶作用并用臺盼藍染色。在染色后5分鐘內，在Bilrker 血球計數(shù)器中對認為的活細胞(未染色細胞)的數(shù)量進行計數(shù)。
[0159] 洗掉實驗
[0160] 將細胞培養(yǎng)物采用化合物(I)預處理1-16小時(取決于實驗），隨后洗滌，然后補充普通生長培養(yǎng)基土順鉑、培美曲塞或順鉑/培美曲塞?？偡跤龝r間為24-72小時（取決于實驗）。對照培養(yǎng)物保留在不添加藥物的普通生長培養(yǎng)基中。按照增殖測定所述的方法測定活細胞的數(shù)量。
[0161] 追加實驗
[0162] 在追加實驗中，不洗掉第一藥物，將第二藥物直接加入細胞培養(yǎng)基中?？偡跤龝r間為24小時。對照培養(yǎng)物保留在不添加藥物的普通生長培養(yǎng)基中。按照增殖測定所述的方法測定活細胞的數(shù)量。
[0163] 細胞裂解和免疫印跡
[0164] 采用含有新鮮加入的蛋白酶抑制劑（10μg/ml亮抑蛋白酶肽、4μg/ml胃蛋白酶抑制劑和0.1 單位/ml抑肽酶）的 I %NP-40裂解緩沖液（I %NP-40、150mM NaCl、50mM Tris-HCl pH8、5mM EDTAUOmM NaF、IOmM Na4P2〇7、0.4mM Na3V〇4)來提取細胞。對于從組織中提取蛋白，使用Potter-Elvehjem勻漿器裝置，在1%ΝΡ-40裂解緩沖液中將約IOOmg每種樣品勻漿化。在4°C13,000 Xg下離心裂解物10分鐘，收集上清液并用Bio-Rad蛋白測定方法來測定蛋白濃度。
[0165] 在還原條件下通過SDS-PAGE分離蛋白。SDS-PAGE后，將蛋白轉移至硝酸纖維素，與特異性抗體反應，然后采用過氧化物酶綴合的二級抗體和化學發(fā)光ECL試劑進行檢測。使用 GS 250 Molecular Image(Bio-Rad)進行光密度分析。
[0166] 細胞周期分析
[0167] 對于細胞周期/凋亡分析，在組織培養(yǎng)皿中接種5 X IO5個細胞并用100μΜ順鉑處理 24小時或用IOnM化合物（I)預處理2小時，隨后洗掉并在普通培養(yǎng)基±100μΜ順鉑中在37°C 下、在5%C02空氣中繼續(xù)生長額外的24小時。孵育后，將分離的細胞和懸浮的細胞收集在完全RPMI中，并在500 X g下離心10分鐘。用PBS洗滌細胞沉淀，在4°C下將其固定在冰冷的75% 乙醇中，在37°C下用100mg/mL RNAse A處理1小時，用25yg/mL碘化丙啶染色，最后利用流式細胞儀FACS(Becton Dickinson，San Jose，CA，USA)和Modfit軟件（Verity Software House，Topsham，ME，USA)來分析。
[0168] 體內實驗
[0169] 動物。CDl裸鼠（雄性，6周齡;Charles River，Calco,意大利)接受腹膜內（i.p.)注射于0.5mL RPMI培養(yǎng)基中的2 X IO6個熒光素酶轉染的REN細胞。在麻醉和腹膜內注射0.3mL 的 15mg/mL D-焚光素后，使用In Vivo Imaging System(lVlS?)'系統(tǒng) 100系列（Xenogen Corporation，Hopkinton，MA，USA)監(jiān)測發(fā)光細胞的腫瘤尺寸和定位。使用Living Image軟件(Xenogen Corporation)在腫瘤位點周圍確定目的區(qū)域，并將其定量為總光子計數(shù)。在接種(治療開始的天)后的第15天，獲得腫瘤尺寸的值，以一個治療組內所有動物的平均值計，減去各個每周測量的發(fā)光信號。為了評估治療毒性，在治療開始時和治療結束時稱量小鼠的重量。在治療后20天，處死小鼠并進行尸檢。體內實驗經Istituto Scientifico Tumori (Genoa，意大利)倫理委員會批準，并符合相關規(guī)定的標準。將小鼠保持在無菌條件下并在無菌條件下進行處理，并且允許其隨意獲得食物和水。
[0170] 給藥。經過15天形成可通過IVIS?成像檢測的腫瘤結節(jié)。然后將小鼠稱重并分為十只動物的治療組。治療方案從第15天至第35天實施，并且通過IVXS?成像每周對小鼠進行分析以評估腫瘤生長。使用一個劑量的化合物（I)(l〇mg/kg/天）。將化合物（I)溶解在溶媒(5 % DMS0/40 % PEG 400/55 %水）中，并通過皮下給藥的方式每天給予一次（1-21天）。在第4天和第11天分別經皮下給予5mg/kg順鉬溶液(EBEWE Italia srl，Roma，意大利），并且在第5-9天和第12-16天分別經皮下注射150mg/kg培美曲塞(溶于等滲鹽水中）（Eli Lilly， Houten，荷蘭）。給予未治療的動物空白溶媒。在第35天，對來自四組的小鼠實施安樂死并進行尸檢。切除在腹膜中生長的腫瘤，并將一部分腫瘤組織立即冷凍并儲存在-80°C下用于以后的分析。
[0171] 統(tǒng)計分析
[0172] 通過單因素方差分析和學生t檢驗來進行示差分析的統(tǒng)計評估。統(tǒng)計學顯著性的閾值設定在 Ρ^?〇·〇5。利用R Core Team .R:A language and environment for statistical computing.R Foundation for Statistical Computing?Vienna?Austria? 2012 ISBN 3-900051-07-0進行體內實驗的統(tǒng)計分析。為了比較不同的組，使用了非參數(shù) Kruskal-WalIis檢驗;如果發(fā)現(xiàn)差異是顯著的(P<0.05)，隨后用WiIkoxon秩和檢驗進行配對比較。
[0173] 實施例1:化合物(I)對MPM細胞增殖的影響
[0174] (a)使用上述增殖測定，在ER即日性REN間皮瘤細胞上測試不同劑量的化合物（I) (范圍I-IOOnM)的生長抑制作用。結果示于圖IA中。化合物（I)以劑量依賴性方式顯著地(P 彡0.05)降低了細胞生長和存活，在IOnM下效力最高。
[0175] (b)評估了化合物（I) (IOnM)作為單一藥劑在24小時和48小時時在以下細胞中的抗增殖活性:非惡性間皮MET5A細胞，惡性間皮瘤細胞REN、MMB、H2596和MST0-211H，被瞬時轉染以表達人ER0的MST0-211H細胞(MSTO_211H/ER0)，以及其中已經用ER0特異性siRNA敲除了ER0的惡性間皮瘤細胞REN和MMB(REN/siRNA ER0和MMB/siRNA ER0)。結果示于圖IB中。
[0176] 化合物（I)顯著地(p彡0.05)抑制REN細胞和MMB細胞的增殖，而在MET5A細胞中沒有觀察到抑制作用，盡管E邸的高內源性水平。這可能與它們的非惡性表型有關。由于H2596 細胞表達非常低水平的ERf3，H2596細胞對化合物（I)的響應弱。ERf3陰性MST0-211H細胞對化合物(I)治療無響應。然而，采用ERf3表達載體對MST0-211H細胞進行的瞬時轉染增加這些細胞對化合物(I)的敏感性。
[0177] 實施例2:化合物(I)在體外和體內對順鉑/培美曲塞的有效性的影響
[0178] (a)與普通培養(yǎng)基(對照）、僅化合物（I)以及順鉑/培美曲塞相比，在REN細胞中研究了將化合物（I)(IOnM)加入順鉑/培美曲塞化療組合(在它們各自的IC 5q濃度的）中的生長抑制作用。按照增殖測定所述的方法測定了活細胞的數(shù)量。測定了 24小時后的細胞存活。結果不于圖2A中。
[0179] 化合物（I)/順鉑/培美曲塞(濃度分別為10ηΜ/100μΜ/22μΜ)的三聯(lián)組合優(yōu)于單獨的化合物(I)或單獨的順鉑/培美曲塞治療，這表明化合物（I)增強了順鉑/培美曲塞治療的效果。
[0180] (b)還在間皮瘤體內小鼠模型中評估了化合物（I)對順鉑/培美曲塞組合的影響。對六周齡CD 1雄性裸鼠腹膜內接種2 X IO6個REN細胞(4組，每組10只動物）。在接種前，將MPM 細胞采用攜帶熒光素酶基因的慢病毒載體轉染，以允許在活的小鼠內成像。在第15天時（當在所有動物組中在腹膜腔中的腫瘤發(fā)生率為100%時），開始采用溶媒、化合物(I)、順鉑/培美曲塞或化合物（I)/順鉑/培美曲塞治療，并持續(xù)21天，如圖2B中所示。通過皮下注射給予 IOmg/kg/天的化合物（I)。對未治療的動物經皮下注射空溶媒。第4天和第11天采用5mg/kg 順鉑治療兩組，隨后采用150mg/kg培美曲塞單獨地或與化合物（I)組合治療5天(第5-9天和第12-16天）。在第35天處死小鼠，切割腫瘤并立即冷凍。結果示于圖2C和2D中。
[0181] 在10天內，與溶媒對照相比，采用化合物（I)治療的小鼠與順鉑/培美曲塞治療組產生了相似的腫瘤尺寸的減小(數(shù)據(jù)未示出）。治療20天后，與溶媒組、化合物（I)組以及順鉑/培美曲塞組相比，在采用化合物（I)/順鉑/培美曲塞治療的組中觀察到了統(tǒng)計學上顯著的腫瘤生長的減少。因此，在體內采用化合物（I)結合順鉑/培美曲塞的治療比任一個的單獨治療具有更高的效力，并且在治療期結束時，與溶媒治療的動物相比，產生了顯著降低的腫瘤負荷。此外，化合物（I)/順鉑/培美曲塞的三聯(lián)組合縮小了腫瘤體積，甚至低于在治療開始時的腫瘤體積。采用化合物(I)的治療不具有毒性，如通過在給藥期間監(jiān)測小鼠體重的變化所評估的。因此，在實施例2(a)中所示出的體外生長抑制作用轉化為在小鼠中的體內抗腫瘤發(fā)生活性。
[0182] 實施例3:化合物（I)對REN細胞生長的影響
[0183] (a)在REN細胞中研究了短暫暴露于化合物（I) (IOnM) (1、2、4、8、16和24小時）的生長抑制作用。將細胞培養(yǎng)物用化合物（I)預處理1-16小時，隨后洗掉，然后補充普通生長培養(yǎng)基?？偡跤龝r間為24小時。對于24小時研究，將細胞保持在含有化合物（I)的培養(yǎng)基中24 小時的孵育時間。將對照培養(yǎng)物保持在普通生長培養(yǎng)基中。按照增殖測定所述的方法測定了活細胞的數(shù)量。結果示于圖3A中。
[0184] 相對于1小時暴露和超過8小時的暴露，暴露于化合物（1)2小時顯著地(PS0.05) 增加生長抑制活性。
[0185] (b)在REN細胞中研究了短暫暴露于不同劑量的化合物（1)(0.4、2和10恤)2小時后歷時72小時的生長抑制作用。將細胞培養(yǎng)物用不同濃度的化合物(I) (0.4、2和IOnM)預處理 2小時，隨后洗掉，然后在普通培養(yǎng)基(不含化合物(I))中繼續(xù)生長額外的24小時、48小時或 72小時。將對照培養(yǎng)物只保持在普通生長培養(yǎng)基中。按照增殖測定所述的方法在0小時、24 小時、48小時和72小時測定活細胞的數(shù)量。結果示于圖3B中。
[0186] 不論在2小時預處理期間所使用的化合物（I)的濃度如何，對REN細胞增殖的抑制作用的持續(xù)時間持續(xù)至少24小時。采用最高的化合物(I)濃度觀察到了最大的抗增殖作用。 24小時后，細胞慢慢地恢復增殖活性，并且從化合物（I)預處理后約48小時，它們的增殖速率與從研究開始時在普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)的REN細胞的增殖率相似。
[0187] 實施例4:采用化合物(I)的預處理對順鉑和/或培美曲塞對REN細胞的作用的影響
[0188] (a)將100μΜ順鉑加入采用IOnM化合物（I)預處理2、4、8和12小時的REN細胞培養(yǎng)物中（追加實驗）。按照上述增殖測定所述的方法測定了在24小時時的活細胞數(shù)量。將對照培養(yǎng)物保持在普通生長培養(yǎng)基;加有化合物（I) (IOnM)的生長培養(yǎng)基;和加有順鉑（100μΜ)的生長培養(yǎng)基中。結果示于圖4Α中。
[0189] 順鉑的增強的抗增殖作用是時間依賴性的，當在化合物(I)預處理2小時后加入順鉑時獲得了最大的抑制作用。
[0190] (13)將不同濃度的順鉑(20、40、60、80和10(^)加入采用化合物（1)(101^)預處理2 小時的REN細胞培養(yǎng)物中。將細胞用化合物（I)(IOnM)預處理2小時，隨后洗掉并在補充有不同濃度的順鉑(20、40、60、80和1 ΟΟμΜ)的普通培養(yǎng)基中繼續(xù)生長額外的24小時。按照上述增殖測定所述的方法測定了所述額外的24小時后的活細胞數(shù)量。將對照培養(yǎng)物保持在普通生長培養(yǎng)基中；采用化合物(I)(IOnM)預處理2小時，洗掉，然后在普通培養(yǎng)基中繼續(xù)生長額外的24小時；以及保持在加有順鉑（100μΜ)的生長培養(yǎng)基中。結果示于圖4Β中。
[0191] 當將化合物（I)預處理與最高濃度的順鉑（100μΜ)組合時觀察到了最有效的抗增殖作用。然而，出乎意料的是，采用化合物（I)的2小時預處理與20μΜ順鉑的組合與單獨的 100μΜ順鉑一樣有效。
[0192] 對該實驗的結果進行了等效線圖分析（Tallarida RJ. ,Perspectives in Pharmacology 2001；298(3)：865-72；Tallarida RJ.,Perspectives in Pharmacology 2006;319:1-7)。結果示于圖4F中。從該圖中可以看出，化合物（I)與順鉑的組合具有協(xié)同效應。
[0193] (c)將化合物（I) (IOnM)加入采用100μΜ順鉑預處理2、4、8和12小時的REN細胞培養(yǎng) 物中（追加實驗）。按照上述增殖測定所述的方法測定了在24小時時的活細胞數(shù)量。將對照培養(yǎng)物保持在普通生長培養(yǎng)基中；加有化合物(I) (IOnM)的生長培養(yǎng)基中；和加有順鉑（100 μΜ)的生長培養(yǎng)基中。結果示于圖4C中。
[0194] 盡管采用順鉑和化合物（I)兩者同時處理的細胞比只用一種試劑處理的細胞表現(xiàn) 出更大的生長抑制，但在加入化合物（I)之前采用順鉑進行預處理不導致細胞生長和存活的協(xié)同抑制作用。這與在加入順鉑之前采用化合物（I)進行預處理不同，如實施例4(a)中所示。因此，化合物⑴和順鉑對惡性間皮瘤細胞增殖和存活的協(xié)同抑制作用只出現(xiàn)在采用化合物(I)進行預處理的情況中，相反的順序則不出現(xiàn)。
[0195] (〇1)將不同劑量的培美曲塞(5、11、16.5和22以1〇加入采用化合物（1)(1〇1^)預處理 2小時的REN細胞培養(yǎng)物中。將細胞用化合物（I) (IOnM)預處理2小時，隨后洗掉并在補充有不同濃度的培美曲塞（5、11、16.5和22μΜ)的普通培養(yǎng)基中繼續(xù)生長額外的24小時。按照上述增殖測定所述的方法測定了在額外的24小時后的活細胞數(shù)量。將對照培養(yǎng)物保持在普通生長培養(yǎng)基中；用化合物（I)(IOnM)預處理2小時，洗掉，然后在普通培養(yǎng)基中繼續(xù)生長額外的24小時；以及保持在加有培美曲塞(22μΜ)的生長培養(yǎng)基中。結果示于圖4D中。
[0196] 當在化合物（I)預處理2小時后加入培美曲塞時，沒有得到增強的抗增殖作用。這與在加入順鉑之前用化合物（I)進行預處理不同，如實施例4a中所示。因此，采用化合物（I) 的預處理對培美曲塞不表現(xiàn)出其對順鉑所表現(xiàn)出的相同的有利的協(xié)同效應。
[0197] (e)將順鉑（100μΜ)或順鉑（100μΜ)和培美曲塞（22μΜ)加入采用化合物（I) (IOnM) 預處理了2小時的REN細胞培養(yǎng)物中。將細胞用化合物（I)(IOnM)預處理2小時，然后洗掉，并在補充有順鉑（1〇〇μΜ)，或順鉑（100μΜ)和培美曲塞(22μΜ)的普通培養(yǎng)基中繼續(xù)生長額外的 24小時。按照上述增殖測定所述的方法測定了在額外的24小時后的活細胞數(shù)量。將對照培養(yǎng)物保持在普通生長培養(yǎng)基中；加有順鉑（1〇〇μΜ)的生長培養(yǎng)基中；加有培美曲塞(22μΜ)的生長培養(yǎng)基中；加上順鉑（1〇〇μΜ)和培美曲塞（22μΜ)的生長培養(yǎng)基中；以及用化合物（I) (IOnM)預處理2小時，隨后洗掉并在普通培養(yǎng)基繼續(xù)生長額外的24小時。結果示于圖4Ε中。
[0198] 在加入順鉑或順鉑/培美曲塞之前采用化合物（I)對REN細胞進行預處理導致了對細胞生長和存活的強協(xié)同抑制作用。
[0199] 實施例5:采用化合物(I)處理的細胞的細胞周期分析
[0200] 將REN細胞采用100μΜ順鉑處理24小時，或采用IOnM化合物（I)預處理2小時，隨后洗掉，并在普通培養(yǎng)基±1〇〇μΜ順鉑中繼續(xù)生長額外的24小時。如上所述進行細胞周期分析。將對照培養(yǎng)物保持在普通生長培養(yǎng)基中。處理后，將細胞用碘化丙啶染色，并通過流式細胞儀分析細胞的DNA含量。結果示于圖5Α中。
[0201] 與任何其他處理相比，采用化合物（I)預處理2小時隨后采用順鉑處理24小時導致顯著且高效地將細胞周期在G0/G1期阻斷，并抑制細胞進入細胞周期的S期。此外，與所測試的其他處理方案相比，在采用化合物（I)預處理隨后采用順鉑處理的孔中發(fā)現(xiàn)了顯著更高的死細胞百分比。
[0202]對于在化合物（I)/順鉑處理的細胞中死細胞數(shù)量更高的一個似乎合理的解釋是細胞凋亡的誘導。
[0203] 還通過蛋白質印跡分析和相對光密度測定法測定了REN細胞中的PARPl水平、裂解的PARPl水平、AKT水平和磷酸化的AKT水平，所述REN細胞采用順鉑（25、50和100μΜ)處理了 24小時或采用化合物（I) (IOnM)預處理了2小時，隨后洗掉，并在普通培養(yǎng)基土順鉑（25、50 和100μΜ)中繼續(xù)生長額外的24小時。將總AKT和微管蛋白染色用于歸一化。結果示于圖5Β 中。由于PARPl裂解是細胞凋亡的指標，因此，對它進行了分析。由于在增殖、細胞凋亡和順鉑耐藥性的控制中涉及增加的AKT活性(Pinton G.等人，PLoS 0ne(2012)7:e36856)，因此，還分析了不同處理之后的AKT激活狀態(tài)。
[0204]如從細胞周期分析和死細胞百分比中所預期的，在加入順鉑之前，采用化合物(I) 處理2小時對裂解的PARPl的出現(xiàn)影響最大（圖5B)。有趣的是，單獨的順鉑或化合物(I)均不導致顯著的PARPl裂解。在不存在順鉑和存在順鉑兩種情況下，化合物（I)處理也顯著地減少了 AKT磷酸化(圖5B)。
[0205]實施例6:在MET5A細胞中化合物(I)對順鉑毒性的影響
[0206]在來自正常間皮的細胞系MET5A中測試了化合物⑴對順鉑毒性的影響。將MET5A 細胞采用IOnM化合物（I)處理2小時，隨后洗掉并在普通培養(yǎng)基中或在不同劑量的順鉑(25、 50、100μΜ)存在下繼續(xù)生長額外的24小時。將對照培養(yǎng)物保持在普通生長培養(yǎng)基中；加有順鉑（100μΜ)的生長培養(yǎng)基中；采用化合物（I) (IOnM)處理2小時，洗掉，然后在普通培養(yǎng)基中繼續(xù)生長額外的24小時。結果示于圖6Α中。
[0207] 與REN細胞相比，ΜΕΤ5Α細胞對順鉑處理表現(xiàn)出更高的敏感性，IC5q為25μΜ。單獨的化合物(I)對ΜΕΤ5Α細胞增殖或存活沒有影響。當化合物（I)預處理與低劑量的順鉑組合時，觀察到保護作用。
[0208]因此，與在惡性REN細胞中化合物（I)顯著增加順鉑的細胞毒性的作用（參見實施例4(a)、（b)和(e))不同，在非惡性間皮ΜΕΤ5Α細胞中化合物（I)減少和/或抵消了順鉑的毒性。似乎ERi3激動劑發(fā)揮變阻器樣的作用，試圖在患病細胞或受激細胞中重建體內穩(wěn)態(tài)。 [0209] 還通過蛋白質印跡分析和相對光密度測定法測定了在24小時時MET5A細胞培養(yǎng)物中的PARPl水平、裂解的PARPl水平、AKT水平和磷酸化的AKT水平。
[0210]與所獲得的關于細胞存活的數(shù)據(jù)（圖6A)-致，化合物（I)預處理在暴露于所有濃度的順鉑的細胞中減少了裂解的PARP1的百分比（參見圖6B)?；衔铮↖)對MET5A對照細胞中的基礎PAKT水平沒有影響，但是它拮抗順鉑介導的pAKT的抑制作用（也在圖6B中示出）。 AKT途徑激活與抗細胞凋亡作用以及細胞存活有關。與化合物（I)對減少的PARP1裂解的作用一起，這可解釋在非惡性MET5A細胞中化合物（I)介導的順鉑細胞毒性的降低。
[0211] 實施例7:采用化合物(I)和順鉑預處理對MMP細胞的影響
[0212] 將50μΜ順鉑加入采用IOnM化合物（I)預處理了兩小時的MMP細胞培養(yǎng)物中（洗掉實驗）。按照上述增殖測定所述的方法測定了在24小時時的活細胞數(shù)量。將對照培養(yǎng)物保持在普通生長培養(yǎng)基中；加有化合物（I)(IOnM)的生長培養(yǎng)基中；和加有順鉑(50μΜ)的生長培養(yǎng) 基中。結果示于圖7Α中。
[0213]當將細胞采用化合物⑴預處理2小時時，觀察到順鉑的增強的抗增殖作用。
[0214]還通過蛋白質印跡分析測定了在24小時時MMP細胞培養(yǎng)物中的PARPl水平、裂解的 PARPl水平、AKT水平和磷酸化的AKT水平。
[0215] 結果示于圖7Β中。從該圖中可以看出，在采用化合物（I)預處理兩小時，隨后洗掉并在補充有50μΜ順鉑的普通培養(yǎng)基中繼續(xù)生長的細胞中，裂解的PARPl的水平顯示最顯著的增加。在不存在和存在順鉑的兩種情況下，化合物（I)處理都顯著降低了 AKT磷酸化，但是當采用化合物（I)和順鉑處理細胞時最顯著。
[0216] 因此，在第二種人惡性間皮瘤細胞系--MMP中，與體外單獨的化合物（I)或順鉑相比，與順鉑相組合的化合物（I)導致了協(xié)同生長抑制作用。此外，與在REN細胞中的作用相似，化合物⑴和順鉑的組合在MMP細胞中降低了磷酸化的AKT的水平并增加了裂解的PARP1 的水平。
【主權項】
1. 一種用于在患者中治療間皮瘤的ERi3激動劑，其中該治療包括： a) 將ER0激動劑給予患者，然后在最長達24小時的時間t后， b) 將含鉑抗癌藥物給予患者。2. 用于如權利要求1所述用途的ERi3激動劑，其中所述含鉑抗癌藥物是順鉑。3. 用于如權利要求1或2中所述用途的ERi3激動劑，其中所述ERi3激動劑是式（III)的化合物，或其鹽或酯，其中R1選自鹵素、氰基、硝基、〇RA、N( RB) 2、-C (0) Ci-4烷基、-SOA-4烷基、Ci-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、鹵代&―6烷基、二鹵代&―6烷基、三鹵代&―6烷基、鹵代(：2-6烯基、二鹵代(：2-6烯基、三鹵代C2-6烯基、氰基&-6烷基、&-4烷氧基&-6烷基、C3-8環(huán)烷基、C3-8環(huán)烷基&-6烷基、苯基、芐基和5-10元雜環(huán)基，其中所述苯基、芐基或雜環(huán)基基團可為未取代的或被1-3個取代基取代，各取代基選自0R A、鹵素、氰基、硝基、-C( 0 ) CP4烷基、CP6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、鹵代 &一6烷基、二鹵代&-6烷基和三鹵代&-6烷基； R2選自鹵素、氰基、硝基、〇#4(1^):^(0!〇2、任選地被1至3個鹵素取代的-(：(0)(： 1-4烷基、-SO2C1-4 烷基、-C (0) NH-OH、-C (NH2) = N-OH、-C (C02H) = N-OH、-C (NH2) = NH、-C (NHCi-4 烷基）=NH、-C (O-Ci-4 烷基）=NH、-C (NH2) = N-NH2、-NH-C (NH2) = NH、-NH-C (0) NH2、-N=C (-NH-CH2CH2-NH-)、-S-CN、-S-C(NH2) =NH、-S-C(NH2) =N-〇H、-C〇2H、-CH2-C〇2H、-CH(OH)C〇2H、-C (Ο) C02H、S03H、CH2S03H、Ci-6烷基、鹵代Ci-6烷基、二鹵代&―6烷基、三鹵代&―6烷基、氰基Ci-6烷基、&-4烷氧基Ci-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8環(huán)烷基、C3-8環(huán)烷基Ci-6烷基、苯基、芐基和5-10元雜環(huán)基，其中所述苯基、芐基或雜環(huán)基基團可為未取代的或被1-3個取代基取代，各取代基選自〇R A、鹵素、氰基、硝基、Ci-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、鹵代Ci-6烷基、二鹵代&-6烷基和三鹵代&-6烷基;條件是如果R 1和R2之一代表鹵素，則另一個必須代表鹵素以外的基團；各R3、R4、R5和R6獨立地選自氫、OR A、鹵素、氰基、硝基、Ch烷基、C2-6烯基、C2- 6炔基、鹵代 &一6烷基、二鹵代&-6烷基和三鹵代&-6烷基；各RA獨立地選自氫、&-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8環(huán)烷基、C3-8環(huán)烷基&-6烷基、〇5- 10芳基和C6-1Q芳基烷基，每個任選地被1至3個鹵素原子取代;和各妒獨立地選自氫、&-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8環(huán)烷基、C3-8環(huán)烷基&-6烷基、〇5-10芳基和C6-1Q芳基烷基，每個任選地被1至3個鹵素原子取代；條件是式(III)的化合物不為 4-[3-(4，5-二氫-1H-咪唑-2-基)-2-(3，5-二甲基-異噁唑-4-基)-吲哚-1-基]-苯酚； 1-(4-羥基-苯基)-2-(4-甲基-咪唑-1-基)-1Η-吲哚-3-甲腈； 1-(4-羥基-苯基)-2-( 1H-吡唑-3-基)-1Η-吲哚-3-甲腈； 1-(3-氯-4-羥基-苯基)-2-( 1-甲基-1H-吡唑-4-基)-1Η-吲哚-3-甲腈； 1-(4-羥基-苯基)-2-丙-1-炔基-1H-吲哚-3-甲酸酰胺;或 1-(4-羥基-苯基)-2-噻唑-2-基-1H-吲哚-3-甲酸。4. 用于如權利要求3所述用途的ERi3激動劑，其中所述ERi3激動劑是具有下式的化合物：或其鹽或酯。5. 用于如權利要求1至4中任一項所述用途的ERi3激動劑，其中所述間皮瘤是惡性胸膜間皮瘤。6. 用于如權利要求1至5中任一項所述用途的ERi3激動劑，還包括給予其他化療藥物。7. 用于如權利要求6所述用途的ERi3激動劑，其中所述其他化療藥物是培美曲塞。8. 用于如權利要求7所述用途的ERi3激動劑，其中在給予ERi3激動劑之后且任選地在給予含鉑抗癌藥物之前給予培美曲塞。9. 用于如權利要求1至8中任一項所述用途的ERf3激動劑，其中t最長達約8小時，例如最長達4小時。10. 用于如權利要求9所述用途的ERi3激動劑，其中所述ERi3激動劑對雌激素受體β亞型的選擇性比對雌激素受體α亞型的選擇性大200倍以上。11. 一種ERi3激動劑和含鉑抗癌藥物，其用于在患者中治療間皮瘤，其中該治療包括： a) 將所述ER0激動劑給予患者，然后在最長達24小時的時間t后， b) 將所述含鉑抗癌藥物給予患者。12. 用于如權利要求11所述用途的ER0激動劑，其中所述ER0激動劑為如權利要求3中所定義的化合物，或其鹽或酯。13. 用于如權利要求12所述用途的ERi3激動劑，其中所述ERi3激動劑是具有下式的化合物：或其鹽或酯。14. 一種在患者中治療間皮瘤的方法，其包括： a) 將ER0激動劑給予患者，然后在最長達24小時的時間t后， b) 將含鉑抗癌藥物給予患者。15. -種ERi3激動劑，其用于制備在患者中治療間皮瘤的藥物，其中該治療包括： a) 將ER0激動劑給予患者，然后在最長達24小時的時間t后， b) 將含鉑抗癌藥物給予患者。16. -種試劑盒，其包括含鉑抗癌藥物和ER0激動劑，例如如權利要求3中所定義的化合物或其鹽或酯，以及順鉑或卡鉑。17. 如權利要求16所述的包括含鉑抗癌藥物和ERi3激動劑的試劑盒，其中所述ERB激動劑是具有下式的化合物：或其鹽或酯，且所述含鉑抗癌藥物是順鉑。
【文檔編號】A61K31/4045GK105960236SQ201480074885
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2014年12月4日
【發(fā)明人】S·尼爾森, L·莫洛, G·潘東, A·G·曼恩特
【申請人】卡羅醫(yī)藥股份公司

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