使用拉喹莫德治療青光眼的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種治療患有視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)損失或損傷或眼內(nèi)壓(IOP)升高的患有青光眼的個(gè)體的方法，或減輕個(gè)體的RGC損失或損傷或者降低IOP的方法，其包括向所述個(gè)體施用有效治療所述個(gè)體的量的拉喹莫德，從而減輕所述個(gè)體的RGC損失或損傷，或者降低IOP。還提供了用于治療患有青光眼的個(gè)體的藥物組合物、包裝以及治療包裝。
【專(zhuān)利說(shuō)明】使用拉喹莫德治療青光眼
[0001 ]本申請(qǐng)要求于2013年11月15日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)第61/904,962號(hào)的優(yōu)先 權(quán)，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用的方式并入本文。
[0002] 本申請(qǐng)全文中以第一作者及出版年份引用了各種出版物。在權(quán)利要求書(shū)之前的參 考文獻(xiàn)部分列出所有引用的出版物。本文參考的文獻(xiàn)和出版物的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用的方式 整體并入本申請(qǐng)。
【背景技術(shù)】
[0003] 青光眼是一組眼科疾病，其特征為至少部分由于眼內(nèi)壓（IOP)升高對(duì)眼睛造成的 進(jìn)行性損傷（Merck Manual of Diagnosis and Therapy(診斷和治療默克診療手冊(cè)） (1999))。另外，青光眼的特征在于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)死亡、軸突損失和視神經(jīng)頭外觀 凹下（excavated) (Alward 1998)。在視力喪失發(fā)生之前，可通過(guò)視野檢測(cè)和通過(guò)視神經(jīng)的 眼底鏡檢查診斷青光眼，以檢測(cè)凹陷（cupping)"。正常成人的平均IOP為15-16mm Hg，正常 范圍是10-21mm Hg。青光眼的一種處理形式基于使用局部應(yīng)用的藥物降低I0P(Coleman 1999)〇
[0004] 目前，有五大類(lèi)藥物用于降低Ι〇Ρ:β_腎上腺素能拮抗劑、腎上腺素能激動(dòng)劑、擬副 交感神經(jīng)劑、前列腺素樣類(lèi)似物或碳酸酐酶抑制劑(Medeiros等，2002)。雖然大多數(shù)藥物局 部施用于眼，但它們可引起嚴(yán)重的全身性副作用并不利地影響患者的生活質(zhì)量。如果指示 IOP額外降低或如果藥物不能充分降低Ι0Ρ，則下一個(gè)步驟通常是激光小梁成形術(shù)。如果仍 然沒(méi)有適當(dāng)控制Ι0Ρ，則表明需要切口青光眼手術(shù)（Id)。盡管IOP降低顯著減少神經(jīng)元損失 的程度，但其不能確保該疾病過(guò)程停止，因?yàn)镽GC損失可能會(huì)繼續(xù)。有關(guān)藥物或手術(shù)干預(yù)后 IOP調(diào)節(jié)和視野缺失之間關(guān)聯(lián)的最近研究表明，如果IOP低，則會(huì)減弱視野檢測(cè)中反映的進(jìn) 行性神經(jīng)元損失。然而，IOP降低后神經(jīng)元損失可能會(huì)繼續(xù)發(fā)生(Bakalash等，2002)。
[0005] 青光眼性視神經(jīng)病變似乎是由特定的病理生理變化和隨后的RGC及其軸突死亡造 成的。認(rèn)為RGC死亡的過(guò)程是兩相的（biphasic):負(fù)責(zé)引發(fā)損傷的原發(fā)性損傷，然后是由退 化細(xì)胞周?chē)牟焕h(huán)境引起的較慢的繼發(fā)性損傷(Kipnis等，2000)。
[0006] 尚未確定觸發(fā)RGC死亡的分子機(jī)制。懷疑神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子喪失、局部缺血、谷氨酸鹽 的慢性升高和紊亂的一氧化氮代謝是可能的機(jī)制(Farkas等，2001)。此外，導(dǎo)致RGC死亡的 機(jī)制可能與其他類(lèi)型的神經(jīng)元損傷享有共同的特征，例如通過(guò)活性氧物質(zhì)發(fā)出信號(hào)、線粒 體的去極化或者誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的細(xì)胞死亡(Weinreb等，1999)。
[0007] 拉喹莫德
[0008] 拉喹莫德(LAQ)是一種具有高口服生物利用率的新合成化合物，已建議將其作為 口服制劑用于治療多發(fā)性硬化癥（MS) (Polman，2005年；Sandberg-Wol lheim，2005年）。例 如，美國(guó)專(zhuān)利第6,077,851號(hào)描述了拉喹莫德及其鈉鹽形式。尚未完全了解拉喹莫德的作用 機(jī)制。動(dòng)物研究表明其引起Thl(輔助T細(xì)胞1，其產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子)依抗炎屬性向Th2(輔助 T細(xì)胞2,其產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子)轉(zhuǎn)化(￥&即，2004;8抓(^，2011)。另一項(xiàng)研究（主要是通過(guò)即1〇 B通路)證明拉喹莫德誘導(dǎo)抑制與抗原呈遞和相應(yīng)炎癥通路有關(guān)的基因的表達(dá)(Gurevich， 2010)。提出的其他潛在作用機(jī)制包括抑制白細(xì)胞迀移到CNS中，提高軸突完整性，調(diào)節(jié)細(xì)胞 因子的產(chǎn)生，以及增加腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)的水平(RimstrGm:,2006 ;Briick，2011)。
[0009] 以前沒(méi)有研究過(guò)拉喹莫德對(duì)青光眼的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明提供治療患有青光眼的個(gè)體的方法，其包括向所述個(gè)體施用有效治療所述 個(gè)體的一定量的拉喹莫德。
[0011] 本發(fā)明還提供治療患有視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損失或視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的個(gè)體 的方法，或減輕個(gè)體的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損失或損傷的方法，其包括向所述個(gè)體施用有效 減輕所述個(gè)體的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損失或視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的量的拉喹莫德。
[0012] 本發(fā)明還提供治療患有眼內(nèi)壓升高的個(gè)體的方法，或降低個(gè)體眼內(nèi)壓的方法，包 括向所述個(gè)體施用有效降低個(gè)體眼內(nèi)壓的量的拉喹莫德。
[0013] 本發(fā)明還提供包裝，其包含a)含有一定量拉喹莫德的藥物組合物;和b)使用所述 藥物組合物治療患有青光眼的個(gè)體的說(shuō)明書(shū)。
[0014] 本發(fā)明還提供用于向患有青光眼的個(gè)體配藥或在向患有青光眼的個(gè)體配藥中使 用的治療包裝，其包含:a)-個(gè)或多個(gè)單位劑量，每個(gè)這樣的單位劑量都包含一定量的拉喹 莫德，其中在向所述個(gè)體施用后，所述單位劑量的所述拉喹莫德的量有效治療所述個(gè)體，以 及b)用于所述治療包裝的成品藥物容器，所述容器含有一種或多種所述單位劑量，所述容 器還含有或包含指導(dǎo)所述包裝在治療所述個(gè)體中使用的標(biāo)簽。
[0015] 本發(fā)明還提供如本文所述的用于治療患有青光眼的個(gè)體的藥物組合物和包裝。
[0016] 本發(fā)明還提供用于治療患有青光眼的個(gè)體的單位劑型的藥物組合物，其包含一定 量的拉喹莫德，在向所述個(gè)體施用所述組合物的一種或多種所述單位劑型后，所述組合物 中所述拉喹莫德的量有效治療所述個(gè)體。
[0017] 本發(fā)明還提供包裝，其包含:a)如本文所述的藥物組合物；以及b)使用所述藥物組 合物治療患有青光眼的個(gè)體的說(shuō)明書(shū)。
[0018] 本發(fā)明還提供用于制備治療患有青光眼的個(gè)體的藥物的拉喹莫德。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 里實(shí)施例 1:平均 ΔΙΟ F(0HI^*#-OHT)(mmHg)。
[0020] 圖2:實(shí)施例1:熒光金標(biāo)記的RGC損失％ 〇
[0021] 圖3:實(shí)施例1:每mm2中平均熒光金標(biāo)記的RGC計(jì)數(shù)。
[0022] 座:視神經(jīng)損傷等級(jí)α-5)。
[0023] 圖5Α:實(shí)施例1:具有熒光金標(biāo)記的RGC的視網(wǎng)膜的代表性圖像-動(dòng)物數(shù)48，第1組， 左眼。
[0024]圖5Β:實(shí)施例1:具有熒光金標(biāo)記的RGC的視網(wǎng)膜的代表性圖像-動(dòng)物數(shù)48,第1組， 右眼。
[0025]圖5C:實(shí)施例1:具有熒光金標(biāo)記的RGC的視網(wǎng)膜的代表性圖像-動(dòng)物數(shù)59,第2組， 左眼。
[0026]圖5D:實(shí)施例1:具有熒光金標(biāo)記的RGC的視網(wǎng)膜的代表性圖像-動(dòng)物數(shù)59,第2組， 右眼。
[0027]圖5E:實(shí)施例1:具有熒光金標(biāo)記的RGC的視網(wǎng)膜的代表性圖像-動(dòng)物數(shù)22,第3組， 左眼。
[0028]圖5F:實(shí)施例1:具有熒光金標(biāo)記的RGC的視網(wǎng)膜的代表性圖像-動(dòng)物數(shù)22,第3組， 右眼。
[0029]圖5G:實(shí)施例1:具有熒光金標(biāo)記的RGC的視網(wǎng)膜的代表性圖像-動(dòng)物數(shù)31，第4組， 左眼。
[0030] 圖5H:實(shí)施例1:具有熒光金標(biāo)記的RGC的視網(wǎng)膜的代表性圖像-動(dòng)物數(shù)31，第4組， 右眼。
[0031] 圖51:實(shí)施例1:具有熒光金標(biāo)記的RGC的視網(wǎng)膜的代表性圖像-動(dòng)物數(shù)35,第5組， 左眼。
[0032]圖5J:實(shí)施例1:具有熒光金標(biāo)記的RGC的視網(wǎng)膜的代表性圖像-動(dòng)物數(shù)35,第5組， 右眼。
[0033]本發(fā)明的詳細(xì)描述
[0034] 本發(fā)明提供治療患有青光眼的個(gè)體的方法，其包括向所述個(gè)體施用有效治療所述 個(gè)體的一定量的拉喹莫德。
[0035] 在一個(gè)實(shí)施方案中，拉喹莫德的施用有效減輕或抑制個(gè)體的青光眼癥狀。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，所述癥狀是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損失或眼內(nèi)壓升高。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，拉喹莫德為拉喹莫德鈉。
[0036] 在一個(gè)實(shí)施方案中，拉喹莫德的施用途徑為眼內(nèi)、眼周、全身或局部。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，通過(guò)口服給藥施用拉喹莫德。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)眼給藥施用拉喹莫德。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，以氣霧劑、可吸入粉劑、注射劑、液體、凝膠、固體、膠囊劑或片劑的形 式施用拉喹莫德。
[0037]在一個(gè)實(shí)施方案中，拉喹莫德在液體或凝膠中的濃度為5-100mg/ml溶液、20-100mg/ml溶液、10-15mg/ml溶液或20-50mg/ml溶液。在另一個(gè)實(shí)施方案中，定期施用拉喹莫 德。在另一個(gè)實(shí)施方案中，每天施用拉喹莫德。在另一個(gè)實(shí)施方案中，以多于每天一次施用 拉喹莫德。在又一個(gè)實(shí)施方案中，以少于每天一次施用拉喹莫德。
[0038] 在一個(gè)實(shí)施方案中，拉喹莫德的施用量為至少0.2mg/天和/或少于0.6mg/天。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，拉喹莫德的施用量為〇.〇3-60〇11^/天、0.1-40.〇11^/天、0.1-2.511^/天、 0 · 25-2 · Omg/天或0 · 5-1 · 2mg/天。在另一個(gè)實(shí)施方案中，拉喹莫德的施用量為0 · 25mg/天、 0 · 3mg/天、0 · 5mg/天、0 · 6mg/天、1 · Omg/天、1 · 2mg/天、1 · 5mg/天或2 · Omg/天。在又一個(gè)實(shí)施 方案中，拉喹莫德的施用量為每次施用0.05-4.Omg、每次施用0.05-2.Omg、每次施用0.2- 4. Omg、每次施用0.2-2. Omg、每次施用約0.1 mg或每次施用約0.5mg。
[0039]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該方法還包括施用治療青光眼的第二藥劑。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，第二藥劑為腎上腺素能拮抗劑、腎上腺素能激動(dòng)劑、擬副交感神經(jīng)劑、前 列腺素樣類(lèi)似物或碳酸酐酶抑制劑。
[0040] 在一個(gè)實(shí)施方案中，定期施用拉喹莫德持續(xù)至少3天、多于30天、多于42天、8周或 更長(zhǎng)、至少12周、至少24周、多于24周、或者6個(gè)月或更長(zhǎng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，個(gè)體為人類(lèi) 患者。
[0041] 本發(fā)明還提供治療患有視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損失或視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的個(gè)體 的方法，或減輕個(gè)體的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損失或損傷的方法，包括向所述個(gè)體施用有效減 輕所述個(gè)體的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損失或視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的一定量的拉喹莫德。
[0042] 本發(fā)明還提供治療患有眼內(nèi)壓升高的個(gè)體的方法，或降低個(gè)體的眼內(nèi)壓的方法， 包括向所述個(gè)體施用有效降低所述個(gè)體的眼內(nèi)壓的一定量的拉喹莫德。
[0043] 本發(fā)明還提供包裝，其包含:a)含有一定量拉喹莫德的藥物組合物;和b)使用所述 藥物組合物治療患有青光眼的個(gè)體的說(shuō)明書(shū)。
[0044] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，包裝包含含有一定量的治療青光眼的第二藥劑的第 二藥物組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二藥劑為腎上腺素能拮抗劑、腎上腺素能激動(dòng) 劑、擬副交感神經(jīng)劑、前列腺素樣類(lèi)似物或碳酸酐酶抑制劑。
[0045] 在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物的形式為氣霧劑、可吸入粉劑、注射劑、液體、凝 膠、固體、膠囊劑或片劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物為液體或凝膠形式。
[0046] 在一個(gè)實(shí)施方案中，拉喹莫德在液體或凝膠中的濃度為5-100mg/ml溶液、20-100mg/ml 溶液、10-15mg/ml 溶液或 20-50mg/ml 溶液。
[0047] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物是膠囊劑形式或片劑形式。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，用阻止氧接觸片芯的包衣涂覆片劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包衣包含纖維素聚合物、防 粘劑、增光劑或顏料。
[0048] 在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物還包含甘露醇。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物 還包含堿化劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，堿化劑為葡甲胺。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物 還包含氧化還原劑。
[0049] 在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物是穩(wěn)定的且不含堿化劑或氧化還原劑。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，藥物組合物不含堿化劑且不含氧化還原劑。
[0050] 在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物是穩(wěn)定的且不含崩解劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥 物組合物還包含潤(rùn)滑劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，潤(rùn)滑劑在所述藥物組合物中以固體顆粒形 式存在。在另一個(gè)實(shí)施方案中，潤(rùn)滑劑是硬脂酰富馬酸鈉或硬脂酸鎂。
[0051] 在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物還包含填充劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，填充劑在所 述藥物組合物中以固體顆粒形式存在。在另一個(gè)實(shí)施方案中，填充劑是乳糖、乳糖單水合 物、淀粉、異麥芽酮糖醇、甘露醇、羥基乙酸淀粉鈉、山梨醇、噴霧干燥的乳糖、無(wú)水乳糖或其 組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，填充劑是甘露醇或乳糖單水合物。
[0052]在一個(gè)實(shí)施方案中，包裝還包含干燥劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，干燥劑是硅膠。 [0053]在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物是穩(wěn)定的且具有不超過(guò)4%的水分含量。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，拉喹莫德在藥物組合物中以固體顆粒形式存在。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包裝為 透濕性不超過(guò)15mg/天/升的密封包裝。在另一個(gè)實(shí)施方案中，密封包裝為最大透濕性不超 過(guò)0.005mg/天的泡罩包裝。在另一個(gè)實(shí)施方案中，密封包裝為瓶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用 熱感應(yīng)襯墊封閉瓶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，密封包裝包含HDPE瓶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，密 封包裝包含氧吸收劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，氧吸收劑是鐵。
[0054]在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物中拉喹莫德的量為至少0.2mg或少于0.6mg。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物中拉喹莫德的量是〇. l-40.0mg、0.03-600mg、0. l_2.5mg、 0 · 25-2 · 0mg、0 · 5-1 · 2mg、0 · 25mg、0 · 3mg、0 · 5mg、0 · 6mg、I · Omg、I · 2mg、I · 5mg或2 · Omg。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含的拉喹莫德的單位劑量為0.05-4.011^、0.05-2.011^、0.2-4 · Omg、O · 2-2 · Omg、約O · Img或約O · 5mg。
[0055] 在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物配制為用于眼內(nèi)施用、眼周施用、全身施用或局部 施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物配制為口服或眼施用。
[0056] 本發(fā)明還提供如本文所述的用于治療患有青光眼的個(gè)體的包裝。
[0057] 本發(fā)明還提供用于向患有青光眼的個(gè)體配藥或在向患有青光眼的個(gè)體配藥中使 用的治療包裝，其包含:a)-個(gè)或多個(gè)單位劑量，每個(gè)這樣的單位劑量包含一定量的拉喹莫 德，其中在向所述個(gè)體施用時(shí)所述單位劑量的拉喹莫德的量有效治療所述個(gè)體，以及b)用 于所述治療包裝的成品藥物容器，所述容器含有一種或多種所述單位劑量，所述容器還含 有或包含指導(dǎo)所述包裝在治療所述個(gè)體中使用的標(biāo)簽。
[0058]在一個(gè)實(shí)施方案中，治療包裝包含含有一定量的治療青光眼的第二藥劑的第二藥 物組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二藥劑為腎上腺素能拮抗劑、腎上腺素能激動(dòng)劑、擬 副交感神經(jīng)劑、前列腺素樣類(lèi)似物或碳酸酐酶抑制劑。
[0059] 本發(fā)明還提供包含一定量用于治療患有青光眼的個(gè)體的拉喹莫德的藥物組合物。
[0060] 在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含一定量的治療青光眼的第二藥劑。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，第二藥劑為β-腎上腺素能拮抗劑、腎上腺素能激動(dòng)劑、擬副交感神經(jīng)劑、前列 腺素樣類(lèi)似物或碳酸酐酶抑制劑。
[0061] 在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物的形式為氣霧劑、可吸入粉劑、注射劑、液體、凝 膠、固體、膠囊劑或片劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物是液體或凝膠形式。
[0062]在一個(gè)實(shí)施方案中，拉喹莫德在液體或凝膠中的濃度為5-100mg/ml溶液、20-100mg/ml溶液、10-15mg/ml溶液或20-50mg/ml溶液。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含 單位劑量為1〇μ1的水性藥物溶液，其溶液中包含至少〇.2mg拉喹莫德。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，拉喹莫德為拉喹莫德鈉。
[0063] 在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物是膠囊劑形式或片劑形式。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 用阻止氧接觸片芯的包衣涂覆片劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包衣包含纖維素聚合物、防粘 劑、增光劑或顏料。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物還包含甘露醇。
[0064] 在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物還包含堿化劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，堿化劑為葡 甲胺。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物還包含氧化還原劑。
[0065] 在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物不含堿化劑或氧化還原劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 藥物組合物不含堿化劑和氧化還原劑。
[0066] 在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物是穩(wěn)定的且不含崩解劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥 物組合物還包含潤(rùn)滑劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，潤(rùn)滑劑在所述藥物組合物中以固體顆粒形 式存在。在另一個(gè)實(shí)施方案中，潤(rùn)滑劑是硬脂酰富馬酸鈉或硬脂酸鎂。
[0067] 在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物還包含填充劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，填充劑在所 述藥物組合物中以固體顆粒形式存在。在另一個(gè)實(shí)施方案中，填充劑是乳糖、乳糖單水合 物、淀粉、異麥芽酮糖醇、甘露醇、羥基乙酸淀粉鈉、山梨醇、噴霧干燥的乳糖、無(wú)水乳糖或其 組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，填充劑是甘露醇或乳酸單水合物。
[0068]在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物中拉喹莫德的量為至少0.2mg或少于0.6mg。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，拉喹莫德的量是〇 · 1-40 · Omg、0 · 03-600mg、0 · 1-2 · 5mg、0 · 25-2 · Omg、0 · 5- I · 2mg、0· 25mg、0 · 3mg、0 · 5mg、0 ·6mg、I ·Omg、I · 2mg、I · 5mg或2·Omg。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥 物組合物包含的拉喹莫德的單位劑量為0.05-4. Omg、0.05-2. Omg、0.2-4. Omg、0.2-2. Omg、 約0.1 mg或約0.5mg。
[0069] 在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物配制為用于眼內(nèi)施用、眼周施用、全身施用或局部 施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物配制為口服施用或眼施用。
[0070] 本發(fā)明還提供如本文所述的用于治療患有青光眼的個(gè)體的藥物組合物。
[0071] 本發(fā)明還提供用于治療患有青光眼的個(gè)體的單位劑型的藥物組合物，其包含一定 量的拉喹莫德，在向所述個(gè)體施用所述組合物的一種或多種所述單位劑型后，所述組合物 中所述拉喹莫德的量有效治療所述個(gè)體。
[0072] 本發(fā)明還提供包裝，其包含:a)如本文所述的藥物組合物；以及b)使用所述藥物組 合物治療患有青光眼的個(gè)體的說(shuō)明書(shū)。
[0073] 本發(fā)明還提供用于制備治療患有青光眼的個(gè)體的藥物的拉喹莫德。
[0074] 對(duì)于上述實(shí)施方案，預(yù)期本文公開(kāi)的每個(gè)實(shí)施方案適用于每個(gè)其他公開(kāi)的實(shí)施方 案。例如，方法實(shí)施方案中列舉的要素可以用于本文描述的藥物組合物、包裝和用途實(shí)施方 案，反之亦然。
[0075]
[0076] 除非另有說(shuō)明，如本文所用的下列各個(gè)術(shù)語(yǔ)應(yīng)具有如下列出的定義。
[0077]如本文所用，"拉喹莫德"是指拉喹莫德酸或其藥學(xué)上可接受的鹽。
[0078] "其鹽"是指通過(guò)制備本申請(qǐng)化合物的酸鹽或堿鹽而改性的所述化合物的鹽。就這 一點(diǎn)而言，術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的鹽"是指本發(fā)明化合物的相對(duì)無(wú)毒的無(wú)機(jī)酸加成鹽和有機(jī) 酸加成鹽或堿加成鹽。例如，制備這種鹽的一種方法是用無(wú)機(jī)堿處理本發(fā)明的化合物。 [0079]如本文所用，以毫克計(jì)的拉喹莫德的"量"或"劑量"是指不論制劑的形式，在制劑 中存在的拉喹莫德酸的毫克量。"〇.6mg劑量的拉喹莫德"是指不論制劑的形式，拉喹莫德酸 在制劑中的量是〇.6mg。因此，當(dāng)為鹽的形式例如拉喹莫德鈉鹽時(shí)，由于存在額外的鹽離子， 提供〇. 6mg劑量的拉喹莫德需要的鹽形式的重量要大于0.6mg(例如0.64mg)。
[0080] 如本文所用，"一種單位劑量"、"多種單位劑量"和"單位劑型"是指單個(gè)的藥物施 用的一種/多種實(shí)體。
[0081] 如本文所用，在數(shù)值或范圍的上下文中"約"是指所列舉或要求保護(hù)的數(shù)值或范圍 的 ± 10%。
[0082] 如本文所用，"不含"化學(xué)實(shí)體的組合物意指組合物含有，如果有的話，一定量無(wú)法 避免的化學(xué)實(shí)體，但所述化學(xué)實(shí)體不是制劑的一部分，并且肯定不是在生產(chǎn)過(guò)程的任何部 分中添加的。例如，"不含"堿化劑的組合物意指堿化劑，如果存在的話，按重量計(jì)是組合物 的少量組分。優(yōu)選地，當(dāng)組合物"不含"某種組分時(shí)，該組合物包含少于〇.lwt%、0.05wt%、 0.02*1:%或0.01￥1:%的所述組分。
[0083] 如本文所用，"堿化劑"與術(shù)語(yǔ)"堿性反應(yīng)組分"或"堿性劑"可互換使用，并且是指 藥物組合物所用的中和質(zhì)子并且提高藥物組合物的PH值的任何藥學(xué)上可接受的賦形劑。
[0084] 如本文所用，"氧化還原劑"是指一組包含"抗氧化劑"、"還原劑"和"螯合劑"的化 學(xué)品。
[0085] 如本文所用，"抗氧化劑"是指選自下組的化合物:生育酚、蛋氨酸、谷胱甘肽、生育 三烯酚、二甲基甘氨酸、甜菜堿、丁基化羥基苯甲醚、丁基化羥基甲苯、姜黃提取物 (turmerin)、維生素 E、抗壞血酸棕櫚酸酯、生育酚、甲磺酸去鐵敏、尼泊金甲酯、尼泊金乙 酯、丁基化羥基苯甲醚、丁基化羥基甲苯、沒(méi)食子酸丙酯、偏亞硫酸氫鈉或偏亞硫酸氫鉀、亞 硫酸鈉或亞硫酸鉀、α生育酚或其衍生物、抗壞血酸鈉、依地酸二鈉、BHA(丁基化羥基苯甲 醚）、所提及化合物的藥學(xué)上可接受的鹽或酯，以及其混合物。
[0086]如本文所用的術(shù)語(yǔ)"抗氧化劑"還指類(lèi)黃酮類(lèi)化合物，例如選自下組的那些:槲皮 素、桑色素、柚皮素和桔皮素、紫杉葉素、阿福豆苷、櫟素、楊梅苷、染料木素、芹黃素和鷹嘴 豆芽素 Α、黃酮、夫拉平度、異黃酮例如大豆異黃酮、染料木素、兒茶素例如茶兒茶素表沒(méi)食 子兒茶素沒(méi)食子酸酯、黃酮醇、表兒茶素、桔皮素、白楊素、地奧司明、橙皮苷、木犀草素和蕓 香苷。
[0087]如本文所用，"還原劑"是指選自下組的化合物:含硫醇化合物、硫代甘油、巰基乙 醇、硫代乙二醇、硫代二乙二醇、半胱氨酸、硫代葡萄糖、二硫蘇糖醇(DTT )、二硫基-雙-馬來(lái) 酰亞氨基乙烷(DTME)、2，6_二-叔丁基-4-甲酚(BHT)、連二亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、甲脒偏亞 硫酸氫鈉和亞硫酸氫銨。
[0088]如本文所用，"螯合劑"是指選自下組的化合物:青霉胺、曲恩汀、Ν，Ν'_二乙基二硫 代氨基甲酸酯(00〇、2,3,2'-四胺（2,3,2'-四）（2,3,2'4的）、新亞銅試劑、1^，『-四 (2-吡啶基甲基）乙二胺(TPEN)、1，10-菲羅啉(PHE)、四乙烯五胺、三乙烯四胺和三（2-羧乙 基)膦(TCEP)、鐵草銨、CP94、EDTA、甲烷磺酸鹽形式的去鐵胺B (DFO)(也稱(chēng)為甲磺酸去鐵敏B (DFOM))、來(lái)自Novartis(以前是Ciba-Giegy)的甲碘酸去鐵胺，以及去鐵鐵蛋白。
[0089]如本文所用，當(dāng)藥物組合物在儲(chǔ)存期間保持活性藥物成分的物理穩(wěn)定性/完整性 和/或化學(xué)穩(wěn)定性/完整性時(shí)，該組合物是"穩(wěn)定的"。此外，"穩(wěn)定的藥物組合物"的特征在于 與其在時(shí)間零點(diǎn)的水平相比，在40°C/75%RH下6個(gè)月之后其降解產(chǎn)物的水平不超過(guò)5%或 在55°C/75%RH下兩周之后不超過(guò)3%。
[0090]如本文所用，當(dāng)提及一定量的拉喹莫德時(shí)，"有效"是指足以產(chǎn)生所需治療響應(yīng)的 拉喹莫德的量?？赏ㄟ^(guò)例如眼內(nèi)壓(IOP)降低來(lái)測(cè)量療效。
[0091] "向個(gè)體施用"或"向（人類(lèi))患者施用"意指向個(gè)體/患者給予、分配或應(yīng)用藥品、藥 物或治療，以緩解、治愈或減輕與病癥例如病理病癥相關(guān)的癥狀。施用可以是定期施用。如 本文所用，"定期施用"意指間隔一段時(shí)間的重復(fù)/反復(fù)施用。施用間隔時(shí)間優(yōu)選是一致的時(shí) 間。定期施用可包含例如每天一次、每天兩次、每天三次、每天四次、每周一次、每周兩次、每 周三次、每周四次施用等。
[0092] 施用途徑可以是例如局部施用。施用途徑也可以根據(jù)效果是局部的（例如在局部 施用）還是全身性的（例如在腸內(nèi)施用或腸胃外施用）來(lái)進(jìn)行分類(lèi)。如本文所用的"局部施 用"是指化合物或組合物直接施用至期望其發(fā)揮作用的地方，并明確地將全身施用排除在 外。如本文所用的化合物或組合物的"局部施用"是指將化合物或組合物應(yīng)用到身體表面例 如皮膚或粘膜例如眼睛。如本文所用的"眼施用"是指將化合物或組合物應(yīng)用到個(gè)體的眼睛 或個(gè)體眼睛周?chē)钠つw（眼周皮膚），即，局部施用。眼施用的實(shí)例包括直接局部應(yīng)用于眼 睛、局部應(yīng)用于眼瞼或注射至眼睛的一部分或眼窩中。另外，如本文所用的"眼用藥物組合 物"是指配制用于眼施用的藥物組合物。
[0093] 如本文所用的"治療"涵蓋例如誘導(dǎo)疾病或障礙（例如青光眼）的抑制、消退或停 滯，或者緩解、減輕、壓抑(suppressing)、抑制、降低疾病或障礙的嚴(yán)重程度，消除或基本上 消除疾病或障礙，或者改善疾病或障礙的癥狀。
[0094] "抑制"個(gè)體的疾病進(jìn)展或疾病并發(fā)癥，意指預(yù)防或減輕個(gè)體的疾病進(jìn)展和/或疾 病并發(fā)癥。
[0095] 與青光眼相關(guān)的"癥狀"包括與青光眼相關(guān)的任何臨床表現(xiàn)或?qū)嶒?yàn)室表現(xiàn)，并不限 于個(gè)體可以感覺(jué)或觀察到的癥狀。
[0096]如本文所用，"患有"青光眼的個(gè)體意指已經(jīng)診斷為患有青光眼的個(gè)體。
[0097]如本文所用，"基線"處的個(gè)體是在施用如本文所述的治療中的拉喹莫德之前的個(gè) 體。
[0098] "藥學(xué)上可接受的載體"是指適合用于人類(lèi)和/或動(dòng)物的沒(méi)有過(guò)度不良副作用（例 如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))并且與合理的利益/風(fēng)險(xiǎn)比率相稱(chēng)的載體或賦形劑。它可以是用 于向個(gè)體遞送本發(fā)明化合物的藥學(xué)上可接受的溶劑、懸浮劑或載體(vehicle)。
[0099] 應(yīng)理解，在提供參數(shù)范圍時(shí)，本發(fā)明也提供了這一范圍內(nèi)的所有整數(shù)和其十分位 數(shù)。例如，"〇 · 1 -2 · 5mg/天"包括0 · Img/天、0 · 2mg/天、0 · 3mg/天等，直到2 · 5mg/天。
[0100]參考以下實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)將更好地理解本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，詳述的具 體實(shí)驗(yàn)僅說(shuō)明本發(fā)明，而本發(fā)明更完整地描述于隨后所附的權(quán)利要求書(shū)中。
[0101] 實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)
[0102] 實(shí)施例1:評(píng)估拉喹莫德對(duì)大鼠青光眼模型中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)存活的神經(jīng) 保護(hù)效果
[0103] 該研究的目的是評(píng)估拉喹莫德在大鼠青光眼模型中預(yù)防慢性眼內(nèi)壓(OHT)升高和 RGC變性的效果，通過(guò)將高滲生理鹽水注射至棕色挪威鼠一只眼睛的鞏膜靜脈中建立該大 鼠青光眼模型。在該模型中，RGC變性響應(yīng)于IOP升高和與人類(lèi)青光眼患者類(lèi)似的OHT而發(fā) 生。
[0104]
[0105] 本研究包括5個(gè)組(每組n = 8):第1組（1%拉喹莫德，局部施用）、第2組(載體，局部 施用）、第3組(4%拉喹莫德，局部施用）、第4組(0.25%拉喹莫德，局部施用）和第5組(0.1 % 拉喹莫德，口服施用）。
[0106] 在進(jìn)行任何實(shí)驗(yàn)步驟之前，每日進(jìn)行臨床觀察，獲得體重，測(cè)量眼內(nèi)壓(IOP)，并對(duì) 兩只眼睛進(jìn)行仔細(xì)的眼睛檢查。選擇認(rèn)為是臨床正常且無(wú)基線眼部異常的動(dòng)物用于本研 究。
[0107] 通過(guò)間隔一周的兩次高滲生理鹽水注射(HSI)在每只動(dòng)物的左眼建立慢性眼內(nèi)壓 (0ΗΤ)升高/青光眼的大鼠模型。未注射的右眼作為對(duì)照。在整個(gè)研究中，每周一次制備載體 對(duì)照和測(cè)試樣品。
[0108] 給大鼠服藥，口服組(第5組)為每日一次，局部施用組(第1-4組)為每日兩次，從進(jìn) 行第一次HSI的那天開(kāi)始直至安樂(lè)死。在第二次HSI后一周和安樂(lè)死當(dāng)天進(jìn)行仔細(xì)的眼部檢 查。安樂(lè)死前約一周，通過(guò)將熒光-金(FG)雙側(cè)注射至腦的上丘逆行標(biāo)記RGC。從第二次HSI 之后一周開(kāi)始直至安樂(lè)死，每周測(cè)量給藥后的IOP，持續(xù)5周。
[0109] 對(duì)于第二次HSI之后的每個(gè)IOP測(cè)量時(shí)間點(diǎn)，IOP升高計(jì)算為有OHT的左眼的IOP與 非OHT的右眼的IOP的差值（Δ I O F )。求出5周HSI后IOP測(cè)量值的Δ I O F的平均值，得到每 只動(dòng)物的平均A I O F。從較大的池中選出OHT眼睛中單個(gè)IOP測(cè)量值不多50mmHg的大鼠，并 使所述組(每組n = 8)與平均Δ I O F匹配。將其他動(dòng)物從本研究中剔除。
[0110] 在第二次HSI后五周，對(duì)動(dòng)物實(shí)施安樂(lè)死。將視網(wǎng)膜扁平封固（flat-mounted)，掩 蓋玻片ID(標(biāo)識(shí))并使用共聚焦顯微鏡對(duì)每個(gè)視網(wǎng)膜的8個(gè)區(qū)域進(jìn)行成像。使用Image J軟件 對(duì)這些區(qū)域的RGC進(jìn)行計(jì)數(shù)。在提取視神經(jīng)后，在斯格本斯眼科研究所（Schepens Eye Research Institute ,Boston,MA)將它們塑料包埋、切片并用甲苯胺藍(lán)染色。以掩蓋的方式 (in a masked fashion)通過(guò)顯微鏡檢查，并對(duì)視神經(jīng)的損傷進(jìn)行評(píng)估和分級(jí)。
[0111] 在本研究初期，在40只動(dòng)物中都沒(méi)有觀察到異常的臨床癥狀和眼部異常。在本研 究期間，在臨床觀察或眼部檢查中所有動(dòng)物均沒(méi)有治療相關(guān)的發(fā)現(xiàn)。
[0112] 單因素方差分析(One-Way AN0VA)表明，在給藥當(dāng)天，在各個(gè)組之間，各組的體重 并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異(P = 〇.957)。在給藥當(dāng)天和安樂(lè)死當(dāng)天之間各組得到的體重的量也 無(wú)差異(單因素方差分析;P = O. 559)。對(duì)于第1組、第2組、第3組、第4組和第5組，給藥后五周 的平均 Δ I O F 值(0ΗΤ-非-OHT)(平均值土 SD)分別為9 · 1 ± 2 · 2mmHg、9 · 1 ± 2 · 6mmHg、9 · 3 土 2.7mmHg、9.2 ± 1.5mmHg和9.1 ± 2.9mmHg。單因素方差分析表明所述組與平均Δ I O F是良 好匹配的(P>〇.9)。與非-OHT視網(wǎng)膜相比，對(duì)于第1組、第2組、第3組、第4組和第5組，OHT視網(wǎng) 膜中熒光-金標(biāo)記的RGC損失％ (平均值土SD)分別為17.6±33.8、34.8±42.7、26.8±36.4、 21·6±21·7和22·9±33·1。使用雙尾配對(duì)t檢驗(yàn)（two-tailed paired-t tests)比較每組 非-OHT視網(wǎng)膜和OHT視網(wǎng)膜之間每Him2FG-標(biāo)記的RGC的數(shù)目。第2組(載體，局部;P = O.047) 和第4組(0.25%拉喹莫德，局部;P = 0.0 33)的OHT眼睛中的RGC與非-OHT眼睛相比更少。第3 組(4%拉喹莫德，局部;P = 0.071)和第5組(0.1 %拉喹莫德，口服;P = 0.075)的OHT眼睛與 非-OHT眼睛之間在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異。然而，在第1組（1%拉喹莫德，局部）中，OHT眼睛和非-OHT眼睛的RGC計(jì)數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有顯著性差異(P = 0.189)。這表明每日局部施用1%拉喹 莫德對(duì)RGC有神經(jīng)保護(hù)作用。對(duì)于非OHT(對(duì)照）眼睛中的視神經(jīng)，第1組、第2組、第3組、第4組 和第5組的平均損傷等級(jí)（平均值土SD)分別為1.1 ±0.1、1.2±0.2、1.2±0.2、1.2±0.3和 1.2 ±0.2。對(duì)于OHT眼睛中的視神經(jīng)，第1組、第2組、第3組、第4組和第5組的平均損傷等級(jí) (平均值土SD)分別為2.5±1.3、3.0±1.6、3.0±1.5、2.8±1.3和2.7±1.5。作為二級(jí)分析， 使用雙尾配對(duì)t檢驗(yàn)比較每組非-OHT視神經(jīng)和OHT視神經(jīng)之間的平均ON損傷等級(jí)。在所有組 中，與非OHT對(duì)照眼睛相比，OHT眼睛中的平均ON損傷等級(jí)明顯更高(P〈0.05)。
[0113] gg
[0114] 測(cè)試樣品:室溫下避光保存的拉喹莫德鈉。
[0115] 對(duì)照樣品:冷藏保存的0%拉喹莫德鈉。
[0116]
[0117] 數(shù)目和物種：本研究引用和概述說(shuō)明的數(shù)據(jù)是在40只棕色瑞士大鼠 （Rattus norvegicus)收集的。在歷史上，用大鼠作OHT模型，并且沒(méi)有其他批準(zhǔn)的替代物(非動(dòng)物方 法）。本研究開(kāi)始時(shí)使用90只動(dòng)物以確保研究結(jié)束時(shí)可獲得足夠的數(shù)據(jù)。
[0118] 性別：雄性
[0119] 重量/年齡范圍：約271.2-366.4克/至少12周齡(成年），精確到O.lg。
[0120]
[0121]眼睛暴露和口腔暴露對(duì)應(yīng)人類(lèi)暴露途徑。對(duì)于4個(gè)局部施用組，將測(cè)試樣品和對(duì)照 樣品局部應(yīng)用至測(cè)試系統(tǒng)的一只眼睛的表面。對(duì)于第5組的動(dòng)物，口服施用測(cè)試樣品。
[0122] 制備測(cè)試樣品和對(duì)照樣品
[0123] 如下所述制備所有的測(cè)試樣品和對(duì)照樣品。下文所述的制劑的終體積為200mL，但 是可將所述制劑按比例改為每種制備物所需的體積。每周一次制備三種不同濃度(0.25%、 1 %和4%)的用于局部應(yīng)用的測(cè)試樣品和用于口腔強(qiáng)飼（oral gavage)的測(cè)試樣品 (0.1%)。同樣每周一次制備局部應(yīng)用的對(duì)照樣品。在制備局部制劑后，掩蓋局部施用的測(cè) 試樣品和對(duì)照樣品標(biāo)識(shí)。
[0124] 表 1:LAQ 4.0%局部制劑(40mg/mL的LAQ)
[0126] 表1過(guò)程:
[0127] 1.整個(gè)過(guò)程在黃光或黑暗條件下進(jìn)行。
[0128] 2.在含攪拌器的玻璃容器中稱(chēng)取175g( 175mL)注射用水。
[0129] 3.稱(chēng)取并加入磷酸二氫鈉單水合物和磷酸氫二鈉七水合物，并攪拌約5分鐘。通過(guò) 對(duì)澄清透明的溶液進(jìn)行視覺(jué)檢查來(lái)確認(rèn)完全溶解。
[0130] 4.測(cè)量 pH(約7.7-8.3)。
[0131 ] 5.稱(chēng)取并將拉喹莫德鈉加入至溶液中。用約5mL水將剩余的拉喹莫德鈉從稱(chēng)量盤(pán) (weighting boat)沖洗至溶液中。攪拌約5分鐘并通過(guò)對(duì)澄清透明的溶液進(jìn)行視覺(jué)檢查來(lái) 確認(rèn)完全溶解。
[0132] 6.稱(chēng)取并加入羥乙基纖維素 HX。
[0133] 7.攪拌約2小時(shí)。
[0134] 8.移去攪拌器，將溶液加入至200mL容量瓶。
[0135] 9.加注射用水直至200mL。
[0136] 10.手動(dòng)搖晃約2分鐘。
[0137] 11.轉(zhuǎn)移至適當(dāng)?shù)娜萜髦小Ｓ娩X箱包裹并冷藏溶液。
[0138]表2:1^〇1.0%局部制劑（1〇11^/1^的1^〇)
[0140] 表2過(guò)程:
[0141] 1.整個(gè)過(guò)程在黃光或黑暗條件下進(jìn)行。
[0142] 2.在含攪拌器的玻璃容器中稱(chēng)取175g( 175mL)注射用水。
[0143] 3.稱(chēng)取并加入磷酸二氫鈉單水合物和磷酸氫二鈉七水合物，并攪拌約5分鐘。通過(guò) 對(duì)澄清透明的溶液進(jìn)行視覺(jué)檢查來(lái)確認(rèn)完全溶解。
[0144] 4.測(cè)量 pH(約7.7-8.3)。
[0145] 5.稱(chēng)取并將拉喹莫德鈉加入至溶液中。用約5mL水將剩余的拉喹莫德鈉從稱(chēng)量盤(pán) 沖洗至溶液中。攪拌約5分鐘并通過(guò)對(duì)澄清透明的溶液進(jìn)行視覺(jué)檢查來(lái)確認(rèn)完全溶解。
[0146] 6.稱(chēng)取并將氯化鈉加入至溶液中。攪拌約2分鐘。通過(guò)對(duì)澄清透明的溶液進(jìn)行視覺(jué) 檢查來(lái)確認(rèn)完全溶解。
[0147] 7.稱(chēng)取并加入羥乙基纖維素 HX。
[0148] 8.攪拌約2小時(shí)。
[0149] 9.移去攪拌器，將溶液加入至200mL容量瓶。
[0150] 10.加注射用水直至200mL。
[0151] 11.手動(dòng)搖晃約2分鐘。
[0152] 12.轉(zhuǎn)移至適當(dāng)?shù)娜萜髦?。用鋁箱包裹并冷藏溶液。
[0153] 表3:1^0 0.25%局部制劑（2.5111!?/11^的1^^) L0155J 表3過(guò)程:
[0156] 1.整個(gè)過(guò)程在黃光或黑暗條件下進(jìn)行。
[0157] 2.在含攪拌器的玻璃容器中稱(chēng)取175g( 175mL)注射用水。
[0158] 3.稱(chēng)取并加入磷酸二氫鈉單水合物和磷酸氫二鈉七水合物，攪拌約5分鐘。通過(guò)對(duì) 澄清透明的溶液進(jìn)行視覺(jué)檢查來(lái)確認(rèn)完全溶解。
[0159] 4.測(cè)量 pH(約 7.7_8.3)。
[0160] 5.稱(chēng)取并將拉喹莫德鈉加入至溶液中。用約5mL水將剩余的拉喹莫德鈉從稱(chēng)量盤(pán) 沖洗至溶液中。攪拌約5分鐘并通過(guò)對(duì)澄清透明的溶液進(jìn)行視覺(jué)檢查來(lái)確認(rèn)完全溶解。
[0161] 6.稱(chēng)取并將氯化鈉加入至溶液中。攪拌約2分鐘。通過(guò)對(duì)澄清透明的溶液進(jìn)行視覺(jué) 檢查來(lái)確認(rèn)完全溶解。
[0162] 7.稱(chēng)取并加入羥乙基纖維素 HX。
[0163] 8.攪拌約2小時(shí)。
[0164] 9.移去攪拌器，將溶液加入至200mL容量瓶。
[0165] 10.加注射用水直至200mL。
[0166] 11.手動(dòng)搖晃約2分鐘。
[0167] 12.轉(zhuǎn)移至適當(dāng)?shù)娜萜髦?。用鋁箱包裹并冷藏溶液。
[0168] 表4:LAQ 0%局部制劑(對(duì)照樣品） L關(guān)」 表4迓捏:
[0171] 1.整個(gè)過(guò)程在黃光或黑暗條件下進(jìn)行。
[0172] 2.在含攪拌器的玻璃容器中稱(chēng)取175g( 175mL)注射用水。
[0173] 3.稱(chēng)取并加入磷酸二氫鈉單水合物和磷酸氫二鈉七水合物，攪拌約5分鐘。通過(guò)對(duì) 澄清透明的溶液進(jìn)行視覺(jué)檢查來(lái)確認(rèn)完全溶解。
[0174] 4.測(cè)量 pH(約7.7-8.3)。
[0175] 5.稱(chēng)取并將氯化鈉加入至溶液中。攪拌約2分鐘。通過(guò)對(duì)澄清透明的溶液進(jìn)行視覺(jué) 檢查來(lái)確認(rèn)完全溶解。
[0176] 6.稱(chēng)取并加入羥乙基纖維素 HX。
[0177] 7.攪拌約2小時(shí)。
[0178] 8.移去攪拌器，將溶液加入至200mL容量瓶。
[0179] 9.加注射用水直至200mL。
[0180] 10.手動(dòng)搖晃約2分鐘。
[0181] 11.轉(zhuǎn)移至適當(dāng)?shù)娜萜髦小?br>[0182] 衷；0」％ 口 服制劑Π .Ome/mL的LA0)
[0184] 表5過(guò)程:
[0185] 1.整個(gè)過(guò)程在黃光或黑暗條件下進(jìn)行。
[0186] 2.在含攪拌器的玻璃容器中稱(chēng)取150g(150mL)經(jīng)高壓蒸汽處理的自來(lái)水。
[0187] 3.稱(chēng)取并將拉喹莫德鈉加入至溶液中，用約5mL水沖洗稱(chēng)量盤(pán)中剩余的拉喹莫德 鈉并加入至溶液中。攪拌約5分鐘并通過(guò)對(duì)澄清透明的溶液進(jìn)行視覺(jué)檢查來(lái)確認(rèn)完全溶解。
[0188] 4.加入經(jīng)高壓蒸汽處理的自來(lái)水直至200mL。
[0189] 5.攪拌約5分鐘。
[0190] 6.轉(zhuǎn)移至適當(dāng)?shù)溺曛小?br>[0191] 給藥前施用和動(dòng)物篩選：
[0192] 根據(jù)下表6每天進(jìn)行臨床觀察：
[0193]表6:臨床體征和觀察結(jié)果
[0195] 在開(kāi)始給藥前，每周給動(dòng)物稱(chēng)重。將給動(dòng)物稱(chēng)重的第一天命名為第1個(gè)研究日和第 1個(gè)研究周的開(kāi)始。
[0196] 眼科檢查:
[0197] 在開(kāi)始施用測(cè)試樣品或?qū)φ諛悠分皩?duì)本研究所選用的動(dòng)物進(jìn)行檢查以確保兩 只眼睛都沒(méi)有異常、損傷和疾病。使用手持式裂隙燈和直接檢眼鏡或手術(shù)顯微鏡根據(jù)表7描 述的眼部損傷分級(jí)的分類(lèi)系統(tǒng)和表8的眼后段評(píng)分量表對(duì)兩只眼睛都進(jìn)行檢查、評(píng)分并記 錄，然后施用初始劑量。在局部應(yīng)用托吡卡胺后在有意識(shí)的狀態(tài)下進(jìn)行眼后段檢查或者用 異氟醚吸入劑麻醉大鼠后進(jìn)行眼后段檢查。本研究?jī)H使用沒(méi)有表現(xiàn)出眼睛發(fā)炎、眼部缺陷 和先前存在角膜損傷的大鼠。
[0198] 表7:合并的Draize評(píng)分系統(tǒng)和McDonald-Shadduck評(píng)分系統(tǒng)




[0208] 眼內(nèi)壓（IOP)測(cè)量:
[0209] 在施用初始劑量之前，測(cè)量基線Ι0Ρ。在進(jìn)行局部麻醉(0.5%鹽酸丙美卡因眼用溶 液）后，使用Tono-Pen Vet眼壓計(jì)（Reichert,Inc·;Depew,NY)測(cè)量有意識(shí)的大鼠的兩只眼 睛的Ι0Ρ。對(duì)每只眼睛記錄十（10)個(gè)IOP讀數(shù)并求出平均值。在各測(cè)量時(shí)間點(diǎn)，約同時(shí)進(jìn)行 IOP測(cè)量(例如在上午10點(diǎn)和下午2點(diǎn)之間）以使IOP的晝夜節(jié)律變化最小。
[0210] 給藥:
[0211] 大鼠分為5個(gè)組。在研究期間每個(gè)組的動(dòng)物接受以下五種樣品之一：
[0212] 1.對(duì)照載體，局部施用
[0213] 2.0.25%拉喹莫德，局部施用
[0214] 3.1 %拉喹莫德，局部施用
[0215] 4.4%拉喹莫德，局部施用
[0216] 5.0.1 %拉喹莫德，口服施用
[0217] 局部給藥：
[0218] 僅在誘發(fā)OHT的左眼的表面對(duì)大鼠局部給藥。不對(duì)作為對(duì)照的未手術(shù)的右眼施用 任何樣品。使用經(jīng)校準(zhǔn)的微量移液器和無(wú)菌吸頭對(duì)左眼表面施用局部劑量。每個(gè)局部的體 積為IOyL。
[0219]從第一次HSI那天開(kāi)始直至安樂(lè)死，每日兩次對(duì)大鼠給藥。在約上午8點(diǎn)和上午9點(diǎn) 之間施用第一個(gè)日劑量。在約下午4點(diǎn)和下午5點(diǎn)之間施用第二個(gè)日劑量。在安樂(lè)死當(dāng)天，僅 在早上約上午8點(diǎn)和上午9點(diǎn)之間對(duì)大鼠給藥一次。
[0220] □服給藥：
[0221] 從第一次HSI那天開(kāi)始直至安樂(lè)死，在約上午8點(diǎn)和上午10點(diǎn)之間每日一次對(duì)大鼠 給藥。給藥的最后一天是安樂(lè)死當(dāng)天。每個(gè)口服劑量的體積為lmL。
[0222] 給藥后步驟:
[0223] 通過(guò)在左眼間隔一周進(jìn)行兩次高滲生理鹽水注射(HSI)建立慢性高眼壓(0ΗΤ)。對(duì) 于每次HSI，在用適當(dāng)?shù)穆樽韯┞樽泶笫蠛?，使縫合線穿過(guò)左眼瞼以使其保持張開(kāi)。對(duì)手術(shù) 眼睛局部應(yīng)用局部麻醉劑(例如0.5%鹽酸丙美卡因眼用溶液）。用Vannas剪刀切開(kāi)結(jié)膜以 暴露鞏膜靜脈。將帶有溝槽的封堵器環(huán)(occulder ring)安裝在左眼周?chē)栽谧韪羝渌?膜靜脈的同時(shí)為所選的鞏膜靜脈提供暢通的通道。使用拉長(zhǎng)的玻璃針（pulled-glass needle)，將50-250yL的1.8M高滲生理鹽水溶液注射至暴露的鞏膜靜脈中以給房水流出通 道留下傷痕，嘗試增高Ι0Ρ。在注射后不久移去所述環(huán)。未手術(shù)的右眼作為對(duì)照。對(duì)兩只眼睛 都應(yīng)用眼用軟膏以預(yù)防角膜損傷。對(duì)于每個(gè)HSI步驟，皮下施用丁丙諾啡約24小時(shí)以恰當(dāng)?shù)?控制術(shù)后疼痛。至少每日一次如表6所述進(jìn)行臨床觀察。
[0224] 垂死的動(dòng)物和死亡的動(dòng)物：
[0225] 每天一次觀察動(dòng)物的垂死率/死亡率，作為臨床觀察的一部分。沒(méi)有垂死的動(dòng)物。
[0226] 測(cè)量和標(biāo)準(zhǔn):
[0227] 從第二次HSI-周后開(kāi)始直至安樂(lè)死，每周一次測(cè)量IOP(總共5次測(cè)量）。在進(jìn)行局 部麻醉（0.5%鹽酸丙美卡因眼用溶液）后，使用Tono-Pen Vet眼壓計(jì)（ReichertJnc.; DepeW，NY)測(cè)量有意識(shí)的大鼠的兩只眼睛的Ι0Ρ。對(duì)于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每只眼睛記錄十（10)個(gè) IOP讀數(shù)并求出平均值。在各測(cè)量時(shí)間點(diǎn)，約同時(shí)進(jìn)行IOP測(cè)量(例如在上午I〇點(diǎn)和下午2點(diǎn) 之間）以使IOP的晝夜節(jié)律變化最小。
[0228] 如下評(píng)估IOP測(cè)量值:對(duì)于HSI之后的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，IOP升高計(jì)算為有OHT的左眼的 水平與正常右眼的水平的差值（A I 0 F )。求出5周的HSI后IOP測(cè)量值的Δ I 0 F的平均值， 得到每只動(dòng)物的平均A I 〇 F。對(duì)于每一個(gè)組，從較大的池中選出十（10)只持續(xù)高IOP的動(dòng) 物，并使組與平均A I 0 F匹配。將其他動(dòng)物從本研究中剔除并實(shí)施安樂(lè)死。對(duì)OHT眼睛中單 個(gè)IOP測(cè)量值不多50mmHg的大鼠的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和報(bào)告。
[0229] 眼科檢查:
[0230] 在第二次HSI后一周和安樂(lè)死當(dāng)天對(duì)兩只眼睛都進(jìn)行檢查和評(píng)分，總計(jì)兩次。使用 手持式裂隙燈和直接檢眼鏡或手術(shù)顯微鏡根據(jù)表7描述述的眼部損傷分級(jí)的分類(lèi)系統(tǒng)和表 8的眼后段評(píng)分量表進(jìn)行眼科檢查。在局部應(yīng)用托吡卡胺后在有意識(shí)的狀態(tài)下進(jìn)行眼后段 檢查或者用異氟醚吸入劑麻醉大鼠后進(jìn)行眼后段檢查。
[0231] 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)的熒光-金(FG)逆行標(biāo)記(Back-Labe I ing)
[0232]在安樂(lè)死前約一周，用逆向示蹤物FG標(biāo)記RGC。首先，適度麻醉使動(dòng)物鎮(zhèn)定。使用立 體定位裝置，通過(guò)將2.5yL的4%FG注射至每個(gè)腦半球的上丘來(lái)逆行標(biāo)記RGC。大鼠接受皮下 注射丁丙諾啡約48小時(shí)以適當(dāng)控制術(shù)后疼痛。
[0233] 在第2次HSI后5周通過(guò)吸入CO2對(duì)動(dòng)物實(shí)施安樂(lè)死。
[0234] 眼球和視神經(jīng)(ON)的取出和處理:
[0235] 立即摘除眼球以及所附的視神經(jīng)。將最接近眼球的約2. Omm的ON塊分離出來(lái)并用 組織標(biāo)記標(biāo)明以標(biāo)示神經(jīng)的方向。將ON塊置于在0.1 M二甲胂酸鈉 (Na cacodylate)緩沖液 中的改良的Karnovsky固定劑中，在4 ± 2°C過(guò)夜保存。第二天，在0.1 M二甲胂酸鈉緩沖液中 洗滌ON塊至少三次，每次至少10分鐘，并在4±2°C下保存在0.1 M二甲胂酸鈉緩沖液中。將樣 品轉(zhuǎn)移至商定的處理設(shè)備中后，在一周內(nèi)，處理視神經(jīng)用于塑料包埋:在〇. IM二甲胂酸鈉緩 沖液中的2%四氧化鋨中后固定至少1.5小時(shí)后，將ON在梯度酒精中脫水，在氧化丙烯中過(guò) 渡并用氧化丙烯和環(huán)氧樹(shù)脂(epon)混合物滲透。在離眼球約2. Omm遠(yuǎn)的ON末端通過(guò)超薄切 片機(jī)獲得一至五（1-5)μπι厚的橫切片。將ON切片用1%甲苯胺藍(lán)染色并封片。將經(jīng)處理的樣 品送回。在進(jìn)行損傷分析之前ON的標(biāo)識(shí)是隱藏的。如下用光學(xué)顯微鏡分析ON橫切片的損傷： [0236]使用表9描述的已確立的分級(jí)系統(tǒng)，通過(guò)對(duì)ON橫切片進(jìn)行定性顯微鏡分析來(lái)評(píng)估 持續(xù)的高IOP的損傷效應(yīng)。該方法使得能夠通過(guò)光學(xué)顯微鏡對(duì)一個(gè)切片的整個(gè)視網(wǎng)膜神經(jīng) 節(jié)細(xì)胞輸出（ON)進(jìn)行損傷分析，且比對(duì)總軸突進(jìn)行計(jì)數(shù)更靈敏，尤其是有輕度神經(jīng)損傷的 情況。持續(xù)的高IOP導(dǎo)致視神經(jīng)退化、軸突腫脹和髓鞘破裂。然后基于在高IOP大鼠中觀察到 的損傷的類(lèi)型用光學(xué)顯微鏡對(duì)損傷的程度進(jìn)行分級(jí)。
[0237]表9:視神經(jīng)損傷的等級(jí)量表
[0239] 在4 ± 2 °C下將眼睛固定于4 %多聚甲醛(PFA)固定劑中至少24小時(shí)。解剖視網(wǎng)膜， 并將其整體扁平封固用于共聚焦可視化和成像。在共聚焦成像之前掩蓋視網(wǎng)膜扁平封固物 的實(shí)際標(biāo)識(shí)。使用共聚焦顯微鏡對(duì)每個(gè)視網(wǎng)膜的八個(gè)區(qū)域進(jìn)行成像，如下計(jì)數(shù)每個(gè)區(qū)域中 的 RGC:
[0240] 通過(guò)共聚焦熒光顯微鏡檢查評(píng)估視網(wǎng)膜圖像。使用圖像分析軟件(Leica共聚焦軟 件）的特定系統(tǒng)設(shè)計(jì)并處理X-軸，y-軸和Z-軸的三維視圖，以獲得用FG標(biāo)記的可行的RGC。在 每個(gè)視網(wǎng)膜象限(每個(gè)視網(wǎng)膜8個(gè)區(qū)域）中選擇距離ON頭中心約1.5mm和2.75mm的兩個(gè)區(qū)域， 并由共聚焦顯微鏡拍攝視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層的系列圖像。使用圖像分析軟件，系列圖像的 二維最大投影圖像用于計(jì)數(shù)可行的RGC。在mm 2中表達(dá)每幅圖像可行的RGC的數(shù)量。
[0241] 評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)
[0242] 在生活觀察和任何顯微鏡觀察方面考慮該項(xiàng)研究的結(jié)果。
[0243] IOP 標(biāo)準(zhǔn):
[0244] 對(duì)于HIS后的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，IOP升高計(jì)算為OHT左眼水平和正常右眼水平之間的差 異（Δ IO F )。將5周HSI后IOP測(cè)量值的Δ IO F平均，構(gòu)建每個(gè)動(dòng)物的平均Δ IO F。對(duì)于每 個(gè)組，從較大池中選擇具有在OHT眼睛中持續(xù)I O F升高的十（10)只動(dòng)物，且所有組在平均 Δ IO F方面均匹配。將其他動(dòng)物從研究中除去并實(shí)施安樂(lè)死。分析并報(bào)道在OHT眼中單個(gè) IOP測(cè)量值不彡50mmHg的大鼠的數(shù)據(jù)。
[0245] 通過(guò)共聚焦顯微鏡術(shù)使視網(wǎng)膜成像:
[0246] 通過(guò)共聚焦熒光顯微鏡檢查評(píng)估視網(wǎng)膜圖像。使用圖像分析軟件(Leica共聚焦軟 件）的特定系統(tǒng)設(shè)計(jì)并處理X-軸，y-軸和Z-軸的三維視圖，以獲得用FG標(biāo)記的可行的RGC。在 每個(gè)視網(wǎng)膜象限(每個(gè)視網(wǎng)膜8個(gè)區(qū)域）中選擇距離ON頭中心約1.5mm和2.75mm的兩個(gè)區(qū)域， 并由共聚焦顯微鏡拍攝視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層的系列圖像。使用圖像分析軟件，系列圖像的 二維最大投影圖像用于計(jì)數(shù)可行的RGC。在mm 2中表達(dá)每幅圖像可行的RGC的數(shù)量。
[0247] 使用下式計(jì)算與同一動(dòng)物非-OHT視網(wǎng)膜中RGC計(jì)數(shù)相比于OHT視網(wǎng)膜中RGC損失的 百分?jǐn)?shù)：（100-(100 X每個(gè)視網(wǎng)膜的OHT平均RGC計(jì)數(shù)/每個(gè)視網(wǎng)膜的非-OHT平均RGC計(jì)數(shù)））。 認(rèn)為該動(dòng)物的每個(gè)非-OHT視網(wǎng)膜中RGC計(jì)數(shù)為100 %。
[0248]使用表9描述的已確立的分級(jí)系統(tǒng)，通過(guò)對(duì)ON橫切片進(jìn)行定性顯微鏡分析來(lái)評(píng)估 持續(xù)的高IOP的損傷效應(yīng)。該方法使得能夠通過(guò)光學(xué)顯微鏡對(duì)一個(gè)切片的整個(gè)視網(wǎng)膜神經(jīng) 節(jié)細(xì)胞輸出（ON)進(jìn)行損傷分析，且比對(duì)總軸突進(jìn)行計(jì)數(shù)更靈敏，尤其是有輕度神經(jīng)損傷的 情況。持續(xù)的高IOP導(dǎo)致視神經(jīng)退化、軸突腫脹和髓鞘破裂。然后，基于在高IOP大鼠中觀察 到的損傷的類(lèi)型用光學(xué)顯微鏡對(duì)損傷的程度進(jìn)行分級(jí)。
[0249]數(shù)據(jù)分析:
[0250]用單因素方差分析處理組之間統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性差異。如果有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，則使 用Dunnett多項(xiàng)比較檢測(cè)將試驗(yàn)組的數(shù)據(jù)進(jìn)一步與對(duì)照組的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。也進(jìn)行雙因素 方差分析、配對(duì)t-檢驗(yàn)、神經(jīng)保護(hù)計(jì)算％。僅當(dāng)由于偶然產(chǎn)生的差異的概率等于或小于5% 時(shí)(p<0.05,雙尾），認(rèn)為對(duì)照和檢測(cè)動(dòng)物之間的任何差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。使用Minitab公 司、賓夕法尼亞州立大學(xué)的Minitab進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通過(guò)與文獻(xiàn)和歷史數(shù)據(jù)進(jìn)一步比較評(píng)估 用于生物相關(guān)性的任何顯著差異。
[0251] 莖里
[0252] 表10 :RGC損失％ (100-( 100 X每個(gè)視網(wǎng)膜的OHT平均RGC計(jì)數(shù)/每個(gè)視網(wǎng)膜的非-OHT平均RGC計(jì)數(shù)））
[0254] RGC =視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞
[0255] OHT =高眼壓
[0256] SD =標(biāo)準(zhǔn)偏差
[0257] 1.對(duì)于每個(gè)方案，分析并報(bào)告四十（40)只大鼠的數(shù)據(jù)，所述大鼠 OHT眼睛中單個(gè) IOP測(cè)量值不彡50mmHg。
[0258] 2.體重:研究開(kāi)始時(shí)，第1 -5組中40只大鼠的基線體重的范圍為258.6-351.3克。給 藥當(dāng)天和第一次HIS時(shí)，所有大鼠的體重范圍為271.2-366.4克。單因素方差分析表明，在給 藥當(dāng)天，各組之間的體重不是統(tǒng)計(jì)學(xué)上不同的（P = 〇. 957)。安樂(lè)死當(dāng)天，大鼠體重271.4-349.3克。在給藥當(dāng)天和安樂(lè)死當(dāng)天之間各組得到的體重量沒(méi)有差異（單因素 AN0VA，P = 0.559)〇
[0259] 3.臨床觀察:研究開(kāi)始動(dòng)物分配時(shí)無(wú)異常的臨床觀察。HIS手術(shù)后，所有組中均觀 察到在手術(shù)后眼睛中手術(shù)眼睛腫脹、結(jié)膜腫脹和鞏膜/角膜變色。由于手術(shù)前剃光頭骨上的 毛發(fā)且手術(shù)后切開(kāi)和縫合頭骨皮，因此在熒光金腦注射手術(shù)后，在所有組中都注意到頭發(fā) 缺失和皮膚創(chuàng)傷。預(yù)計(jì)這些觀察與青光眼模型建立(HIS)和熒光金腦注射手術(shù)有關(guān)。與HSI 和FG注射手術(shù)不相關(guān)的異常臨床觀察是:第2組動(dòng)物和第5組動(dòng)物的脫發(fā)，第5組中2只動(dòng)物 的皮膚創(chuàng)傷。由于第2組是載體對(duì)照組，因此，這些異常是偶然的，而不是檢測(cè)樣品相關(guān)的。 [0260] 4. IOP測(cè)量值(mmHg):研究包括的動(dòng)物中沒(méi)有一只動(dòng)物的OHT眼具有彡50mmHg的單 個(gè)IOP測(cè)量值。第1組、第2組、第3組、第4組和第5組的平均Δ IO F (0ΗΤ-非-0ΗΤ)(平均值土 SD)分別為9 · 1 ± 2 · 2mmHg、9 · 1 ± 2 · 6mmHg、9 · 3 ± 2 · 7mmHg、9 · 2 ± 1 · 5mmHg和9 · 1 ± 2 · 9mmHg。單 因素方差分析表明，這些組對(duì)平均八1〇?匹配度良好(？>0.9)(圖1)。圖5六-51顯示了具有 熒光金標(biāo)記的RGC的視網(wǎng)膜的代表性圖像。表10顯示了 OHT視網(wǎng)膜與相應(yīng)的非-OHT相比的熒 光金標(biāo)記的RGC損失％。與非-OHT視網(wǎng)膜相比，第1組、第2組、第3組、第4組和第5組的OHT視 網(wǎng)膜中RGC損失％ (平均值土SD)分別為 17·6±33·8、34·8±42·7、26·8±36·4、21·6±21·7 和 22.9±33.1(圖 2)。
[0261] 5.熒光金標(biāo)記的RGC計(jì)數(shù):OHT和非-OHT(對(duì)照）眼睛對(duì)應(yīng)于組中RGC計(jì)數(shù)的單因素 方差分析沒(méi)有顯示顯著的眼睛對(duì)應(yīng)于組的相互作用(Ρ = 〇. 919)，這表明組中OHT和非-OHT (對(duì)照)眼睛的RGC計(jì)數(shù)沒(méi)有區(qū)別（圖3)。作為二次分析，使用配對(duì)t檢驗(yàn)(雙尾），將每組中非-OHT和OHT視網(wǎng)膜之間每mm2熒光標(biāo)記的RGC計(jì)數(shù)進(jìn)行比較。與非-OHT眼睛相比，第2組(載體， 局部施用，P = O.047)和第4組(0.25%的拉喹莫德，局部施用，P = O.033)的OHT眼睛具有較 低的RGC。第3組(4%拉喹莫德，局部施用，P = 0.0 71)和第5組(0.1 %拉喹莫德，口服施用，P = 0.075)中，OHT和非-OHT眼睛之間RGC的數(shù)量在統(tǒng)計(jì)學(xué)上略有不同。然而，第1組（1 %拉喹 莫德，局部施用）中，OHT和非-OHT眼睛之間RGC計(jì)數(shù)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性差異(P = O. 189)。 這表明每天局部應(yīng)用1 %的拉喹莫德可能對(duì)RGC具有神經(jīng)保護(hù)作用。
[0262] 6.視神經(jīng)(ON)損傷等級(jí):第1組、第2組、第3組、第4組和第5組中非-OHT眼睛的平均 ON 損傷等級(jí)（平均值土SD)分別為1.1±0.1、1.2±0.2、1.2±0.2、1.2±0.3和1.2±0.2。第1 組、第2組、第3組、第4組和第5組中OHT視神經(jīng)的平均損傷等級(jí)（平均值土SD)分別為2.5土 1.3、3.0±1.6、3.0±1.5、2.8±1.3和2.7±1.5。0!11'和非-0!11'(對(duì)照）眼睛對(duì)應(yīng)于組中平均 ON損傷等級(jí)的單因素方差分析沒(méi)有顯示顯著的眼睛對(duì)應(yīng)于組的相互作用(P = O.98)，這表 明組中OHT和非-OHT視神經(jīng)的損傷沒(méi)有區(qū)別（圖4)。作為二次分析，使用雙尾配對(duì)t檢驗(yàn)將每 組中非-OHT和OHT視神經(jīng)之間的平均ON損傷進(jìn)行比較。所有組中，與非-OHT對(duì)照眼睛相比， OHT眼睛的平均ON損傷等級(jí)顯著較高(P〈0.05)。
[0263] 7.眼科檢查(OE):在初始給藥之前在基線處進(jìn)行眼科檢查，研究包括的任何動(dòng)物 的任一只眼睛中都沒(méi)有觀察到眼睛異常。在給藥后OE期間，任何動(dòng)物的非-OHT眼睛都沒(méi)有 觀察到眼部問(wèn)題。然而，由于所有組的青光眼模型建立過(guò)程(對(duì)鞏膜靜脈的高滲鹽水注射手 術(shù)），〇HT眼睛中觀察到一些眼部異常。這些異常包括結(jié)膜中輕微淤血和結(jié)膜水腫(腫脹），輕 微角膜混濁，應(yīng)用瞳孔擴(kuò)張劑托吡卡胺后瞳孔缺乏足夠的擴(kuò)張，晶狀體輕微混濁，以及在晶 狀體前面和OHT眼睛中存在自由浮動(dòng)的虹膜色素。具有類(lèi)似情況的所有組的OHT眼睛中都觀 察到HIS后眼部結(jié)果，這些結(jié)果不是檢測(cè)樣品相關(guān)的。
[0264]
[0265] 研究涉及五組每天給藥，持續(xù)約六周：第1組（1 %拉喹莫德，局部施用），第2組(載 體對(duì)照），第3組（4%拉喹莫德，局部施用），第4組（0.25%拉喹莫德，局部施用）和第5組 (0.1%拉喹莫德，口服施用）。對(duì)第1組動(dòng)物的RGC計(jì)數(shù)分析表明，每天局部應(yīng)用1%拉喹莫德 后有神經(jīng)保護(hù)作用的傾向。
[0266] 實(shí)施例2:拉喹莫德用于治療患有青光眼的患者的功效評(píng)估
[0267] 拉喹莫德定期(例如，每天一次或每天兩次)施用（口服或局部)有效治療青光眼人 類(lèi)患者。拉喹莫德定期（例如，每天一次或每天兩次)施用（口服或局部)有效減輕個(gè)體的青 光眼相關(guān)癥狀。
[0268] 將如本文所述的拉喹莫德組合物全身性或口服施用至患有青光眼的個(gè)體的眼睛。 組合物的施用有效治療患有青光眼的個(gè)體。組合物的施用也有效減輕個(gè)體中青光眼的青光 眼相關(guān)癥狀。組合物的施用還有效降低個(gè)體的眼內(nèi)壓。組合物的施用有效減輕個(gè)體中RGC損 傷和/或RGC損失，并提高RGC生存能力。
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【主權(quán)項(xiàng)】
1. 治療患有青光眼的個(gè)體的方法，其包括向所述個(gè)體施用有效治療所述個(gè)體的量的拉 喹莫德。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述拉喹莫德的施用有效減輕或抑制所述個(gè)體的 青光眼的癥狀。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述癥狀為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié) 細(xì)胞損失或眼內(nèi)壓升高。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中拉喹莫德為拉喹莫德鈉。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中拉喹莫德的施用途徑為眼內(nèi)、眼周、眼 睛、口服、全身或局部。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中以氣霧劑、可吸入粉劑、注射劑、液體、 凝膠、固體、膠囊劑或片劑的形式施用拉喹莫德。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中拉喹莫德在所述液體或凝膠中的濃度為5-100mg/ ml 溶液、20-1 OOmg/ml 溶液、10-15mg/ml 溶液或 20-50mg/ml 溶液。8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，定期施用拉喹莫德。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中每天施用拉喹莫德。10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中以多于每天一次或少于每天一次施用拉喹莫德。11. 根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述拉喹莫德的施用量為至少 0 · 2mg/天和/或少于0 · 6mg/天。12. 根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述拉喹莫德的施用量為0.03-600mg/天、0 · 1-40 · Omg/天、0 · 1-2 · 5mg/天、0 · 25-2 · Omg/天、0 · 5-1 · 2mg/天、0 · 25mg/天、 0.311^/天、0.511^/天、0.611^/天、1.〇11^/天、1.211^/天、1.511^/天或2.〇11^/天。13. 根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述拉喹莫德的施用量為每次施用 0.05-4. Omg、每次施用0.05-2. Omg、每次施用0.2-4. Omg、每次施用0.2-2. Omg、每次施用約 0· Img或每次施用約0.5mg。14. 根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括施用治療青光眼的第二藥劑。15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述第二藥劑為β-腎上腺素能拮抗劑、腎上腺素 能激動(dòng)劑、擬副交感神經(jīng)劑、前列腺素樣類(lèi)似物或碳酸酐酶抑制劑。16. 根據(jù)權(quán)利要求8-15中任一項(xiàng)所述的方法，其中定期施用拉喹莫德持續(xù)至少3天、多 于30天、多于42天、8周或更長(zhǎng)、至少12周、至少24周、多于24周或者6個(gè)月或更長(zhǎng)。17. 根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述個(gè)體為人類(lèi)患者。18. 治療患有視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損失或視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的個(gè)體的方法，或減輕 個(gè)體的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損失或損傷的方法，包括向所述個(gè)體施用有效減輕所述個(gè)體的視 網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損失或視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的量的拉喹莫德。19. 治療患有眼內(nèi)壓升高的個(gè)體的方法，或降低個(gè)體的眼內(nèi)壓的方法，包括向所述個(gè)體 施用有效降低所述個(gè)體的眼內(nèi)壓的量的拉喹莫德。20. 包裝，其包含： a) 含有一定量拉喹莫德的藥物組合物;和 b) 使用所述藥物組合物治療患有青光眼的個(gè)體的說(shuō)明書(shū)。21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的包裝，其中所述包裝包括含有一定量的治療青光眼的第二 藥劑的第二藥物組合物。22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的包裝，其中所述第二藥劑為β-腎上腺素能拮抗劑、腎上腺素 能激動(dòng)劑、擬副交感神經(jīng)劑、前列腺素樣類(lèi)似物或碳酸酐酶抑制劑。23. 根據(jù)權(quán)利要求20-22中任一項(xiàng)所述的包裝，其中所述藥物組合物的形式為氣霧劑、 可吸入粉劑、注射劑、液體、凝膠、固體、膠囊劑或片劑。24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的包裝，其中拉喹莫德在所述液體或凝膠中的濃度為5-100mg/ml 溶液、20-100mg/ml 溶液、10-15mg/ml 溶液或 2〇-50mg/ml 溶液。25. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的包裝，其中所述片劑涂覆有阻止氧接觸片芯的包衣。26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的包裝，其中所述包衣包含纖維素聚合物、防粘劑、增光劑或 顏料。27. 根據(jù)權(quán)利要求20-26中任一項(xiàng)所述的包裝，其中所述藥物組合物還包含甘露醇、堿 化劑、氧化還原劑、潤(rùn)滑劑、填充劑和/或干燥劑。28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的包裝，其中所述堿化劑為葡甲胺。29. 根據(jù)權(quán)利要求20-27中任一項(xiàng)所述的包裝，其中所述藥物組合物是穩(wěn)定的且不含堿 化劑或氧化還原劑，優(yōu)選地所述藥物組合物不含堿化劑且不含氧化還原劑。30. 根據(jù)權(quán)利要求20-29中任一項(xiàng)所述的包裝，其中所述藥物組合物是穩(wěn)定的且不含崩 解劑。31. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的包裝，其中所述潤(rùn)滑劑在所述藥物組合物中以固體顆粒形 式存在。32. 根據(jù)權(quán)利要求27或31所述的包裝，其中所述潤(rùn)滑劑為硬脂酰富馬酸鈉或硬脂酸鎂。33. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的包裝，其中所述填充劑在所述藥物組合物中以固體顆粒形 式存在。34. 根據(jù)權(quán)利要求27或33所述的包裝，其中所述填充劑為乳糖、乳糖單水合物、淀粉、異 麥芽酮糖醇、甘露醇、羥基乙酸淀粉鈉、山梨醇、噴霧干燥的乳糖、無(wú)水乳糖或其組合。35. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的包裝，其中所述干燥劑為硅膠。36. 根據(jù)權(quán)利要求20-35中任一項(xiàng)所述的包裝，其中所述藥物組合物是穩(wěn)定的且具有不 超過(guò)4 %的水分含量。37. 根據(jù)權(quán)利要求20-36中任一項(xiàng)所述的包裝，其中拉喹莫德在所述藥物組合物中以固 體顆粒形式存在。38. 根據(jù)權(quán)利要求20-37中任一項(xiàng)所述的包裝，其中所述包裝為透濕性不超過(guò)15mg/天/ 升的密封包裝或者為最大透濕性不超過(guò)0.005mg/天的泡罩包裝。39. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的包裝，其中所述密封包裝為瓶或包含HDPE瓶，優(yōu)選地用熱感 應(yīng)襯墊封閉所述瓶。40. 根據(jù)權(quán)利要求38或39所述的包裝，其中所述密封包裝包含氧吸收劑，所述氧吸收劑 優(yōu)選為鐵。41. 根據(jù)權(quán)利要求20-40中任一項(xiàng)所述的包裝，其中所述藥物組合物中拉喹莫德的量為 至少0 · 2mg、少于0 · 6mg、0 · 1-40 · 0mg、0 · 03-600mg、0 · 1-2 · 5mg、0 · 25-2 · 0mg、0 · 5-1 · 2mg、 0·25mg、0·3mg、0·5mg、0·6mg、I·Omg、I·2mg、I·5mg或2·Omg 〇42. 根據(jù)權(quán)利要求20-41中任一項(xiàng)所述的包裝，其中所述藥物組合物包含的拉喹莫德的 單位劑量為O · 〇5-4 · Omg、O · 05-2 · Omg、O · 2-4 · Omg、O · 2-2 · Omg、約O · Img或約O · 5mg。43. 根據(jù)權(quán)利要求20-42中任一項(xiàng)所述的包裝，其中所述藥物組合物配制為用于眼內(nèi)施 用、眼周施用、眼睛施用、口服施用、全身施用或局部施用。44. 根據(jù)權(quán)利要求20-43中任一項(xiàng)所述的包裝，其用于治療患有青光眼的個(gè)體。45. 用于向患有青光眼的個(gè)體配藥或在向患有青光眼的個(gè)體配藥中使用的治療包裝， 其包含： a) -個(gè)或多個(gè)單位劑量，每個(gè)這樣的單位劑量都包含一定量的拉喹莫德，其中在向所 述個(gè)體施用后，所述單位劑量的所述拉喹莫德的量有效治療所述個(gè)體，以及 b) 用于所述治療包裝的成品藥物容器，所述容器含有一種或多種所述單位劑量，所述 容器還含有或包含指導(dǎo)所述包裝在治療所述個(gè)體中使用的標(biāo)簽。46. 根據(jù)權(quán)利要求45所述的治療包裝，其中所述包裝包含含有一定量的治療青光眼的 第二藥劑的第二藥物組合物。47. 根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述第二藥劑為β-腎上腺素能拮抗劑、腎上腺素 能激動(dòng)劑、擬副交感神經(jīng)劑、前列腺素樣類(lèi)似物或碳酸酐酶抑制劑。48. 藥物組合物，其包含一定量用于治療患有青光眼的個(gè)體的拉喹莫德。49. 根據(jù)權(quán)利要求48所述的藥物組合物，其包含一定量的治療青光眼的第二藥劑。50. 根據(jù)權(quán)利要求49所述的藥物組合物，其中所述第二藥劑為β-腎上腺素能拮抗劑、腎 上腺素能激動(dòng)劑、擬副交感神經(jīng)劑、前列腺素樣類(lèi)似物或碳酸酐酶抑制劑。51. 根據(jù)權(quán)利要求48-50中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其形式為氣霧劑、可吸入粉劑、注 射劑、液體、凝膠、固體、膠囊劑或片劑。52. 根據(jù)權(quán)利要求51所述的藥物組合物，其中拉喹莫德在所述液體或凝膠中的濃度為 5-100mg/ml 溶液、20-100mg/ml 溶液、10-15mg/ml 溶液或 2〇-50mg/ml 溶液。53. 根據(jù)權(quán)利要求51所述的藥物組合物，其包含單位劑量為10μ1的水性藥物溶液，溶液 中包含至少0.2mg拉喹莫德。54. 根據(jù)權(quán)利要求48-53中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中拉喹莫德為拉喹莫德鈉。55. 根據(jù)權(quán)利要求51所述的藥物組合物，其中所述片劑涂覆有阻止氧接觸片芯的包衣。56. 根據(jù)權(quán)利要求55所述的藥物組合物，其中所述包衣包含纖維素聚合物、防粘劑、增 光劑或顏料。57. 根據(jù)權(quán)利要求48-56中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其還包含甘露醇、堿化劑、氧化還 原劑、潤(rùn)滑劑和/或填充劑。58. 根據(jù)權(quán)利要求57所述的藥物組合物，其中所述堿化劑為葡甲胺。59. 根據(jù)權(quán)利要求48-57中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其不含堿化劑或氧化還原劑，優(yōu) 選地所述藥物組合物不含堿化劑且不含氧化還原劑。60. 根據(jù)權(quán)利要求48-59中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其是穩(wěn)定的且不含崩解劑。61. 根據(jù)權(quán)利要求57所述的藥物組合物，其中所述潤(rùn)滑劑在所述藥物組合物中以固體 顆粒形式存在。62. 根據(jù)權(quán)利要求57或61所述的藥物組合物，其中所述潤(rùn)滑劑為硬脂酰富馬酸鈉或硬 脂酸鎂。63. 根據(jù)權(quán)利要求57所述的藥物組合物，其中所述填充劑在所述藥物組合物中以固體 顆粒形式存在。64. 根據(jù)權(quán)利要求57或63所述的藥物組合物，其中所述填充劑為乳糖、乳糖單水合物、 淀粉、異麥芽酮糖醇、甘露醇、羥基乙酸淀粉鈉、山梨醇、噴霧干燥的乳糖、無(wú)水乳糖或其組 合。65. 根據(jù)權(quán)利要求48-64中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述拉喹莫德的量為至少 O · 2mg、少于 O · 6mg、0 · 1-40 · 0mg、0 · 03-600mg、0 · 1-2 · 5mg、0 · 25-2 · 0mg、0 · 5-1 · 2mg、0 · 25mg、 0·3mg、0·5mg、0·6mg、I·Omg、I·2mg、I·5mg或2·Omg 〇66. 根據(jù)權(quán)利要求48-65中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其包含的拉喹莫德的單位劑量為 0 · 05-4 · Omg、0 · 05-2 · Omg、0 · 2-4 · Omg、0 · 2-2 · Omg、約0 · Img或約0 · 5mg。67. 根據(jù)權(quán)利要求48-66中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其配制為用于眼內(nèi)施用、眼周施 用、眼睛施用、口服施用、全身施用或局部施用。68. 根據(jù)權(quán)利要求48-67中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其用于治療患有青光眼的個(gè)體。69. 用于治療患有青光眼的個(gè)體的單位劑型的藥物組合物，其包含一定量的拉喹莫德， 在向所述個(gè)體施用所述組合物的一種或多種所述單位劑型后，所述組合物中所述拉喹莫德 的量有效治療所述個(gè)體。70. 包裝，其包含： a) 權(quán)利要求48-69中任一項(xiàng)所述的藥物組合物；以及 b) 使用所述藥物組合物治療患有青光眼的個(gè)體的說(shuō)明書(shū)。71. 用于制備治療患有青光眼的個(gè)體的藥物的拉喹莫德。
【文檔編號(hào)】A61K9/00GK105960238SQ201480062699
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2014年11月13日
【發(fā)明人】羅恩·諾伊曼, 悅薇·艾茨尤尼
【申請(qǐng)人】梯瓦制藥工業(yè)有限公司