用于生產(chǎn)銀杏提取物的改進(jìn)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)用作藥物的銀杏葉提取物的改進(jìn)的多步驟方法。
【專利說明】
用于生產(chǎn)銀杏提取物的改進(jìn)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)用作藥物的銀杏葉提取物的改進(jìn)的多步驟方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 銀杏葉提取物已作為藥物使用了幾百年。目前它們用于治療各種癡呆及其癥狀以 及腦和外周循環(huán)障礙。涉及的活性成分有萜類內(nèi)酯(銀杏內(nèi)酯A、B、C和白果內(nèi)酯)和黃酮苷 (槲皮素、山奈酚和異鼠李素）。根據(jù)現(xiàn)行歐洲藥典(8.0版;專著04/2008:1827"銀杏干提取 物，精制和量化"），其對(duì)所有銀杏提取物具有約束力，但在藥典的范圍內(nèi)批準(zhǔn)為藥物，銀杏 提取物含有以黃酮苷計(jì)算的22.0 %到27.0 %的黃酮類化合物、2.6 %到3.2 %白果內(nèi)酯、 2.8%到3·4%銀杏內(nèi)酯A、B和C和不超過5ppm的銀杏酸。制備描述如下"Bekanntmachung ? ber die Zulassung und Registrierung von Arzneimittel (Aufbereitungsmonographien fiir den humanmedizinischen Bereich)-銀杏葉（銀杏 葉)"（"用于藥物批準(zhǔn)和登記的通知（用于人類醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的制備專著）-銀杏葉（銀杏葉)"） (Bundesanzeiger 46,（133) ,7360-7361(1994)): "用丙酮-水從干燥的銀杏林奈葉制備的 干提取物和隨后無需添加濃縮物或分離成分的純化步驟"。
[0003] 最近，正越來越多地得到銀杏葉成分的含量，根據(jù)歐洲藥典的要求，其使用已知的 方法提取不會(huì)得到提取物。特別地，目前不斷地獲得萜類內(nèi)酯含量過高的銀杏葉，導(dǎo)致提取 物含量的相應(yīng)增加。然而，偶爾銀杏葉中也含有含量過高的黃酮類化合物。
[0004] 根據(jù)歐洲藥典的要求，當(dāng)使用適當(dāng)?shù)你y杏葉時(shí)，得到提取物的最重要的提取方法 在EP 431535 Bl(Dr.Willmar Schwabe GmbH&Co.)和在EP 360556 Bl(Indena S.p.A.)中 描述。最近，根據(jù)EP 431536 Bl(Dr.Willmar Schwabe GmbH&Co.)的方法變得更加重要，是 因?yàn)槭褂眠@種方法不需要毒理學(xué)上危險(xiǎn)的化合物如鉛鹽（EP 431535B1)或芳族烴（EP 360556 BI)。
[0005] 根據(jù)EP 431536 Bl的權(quán)利要求1，所要求的用于生產(chǎn)銀杏葉提取物的方法的特征 在于：
[0006] (a)用含水丙酮、碳原子數(shù)為1到3的含水烷醇或無水甲醇在約40至KKTC的溫度下 提取新鮮或干燥銀杏綠葉，
[0007] (b)從提取物中分離有機(jī)溶劑的主要量到含量不超過10%(重量），其中，如果必 要，在最后的蒸餾步驟中添加水，
[0008] (C)用水稀釋剩余濃縮水溶液到固體含量為5至25% (重量），溫度冷卻到低于25°C 并同時(shí)攪拌，保持低溫直到形成沉淀，且分離所形成的由不易溶于水的親脂性成分構(gòu)成的 沉淀，
[0009] (d)將硫酸銨添加到剩余水溶液中并用甲基乙基酮或甲基乙基酮和丙酮的混合物 提取所形成的溶液，
[0010] (e)將得到的提取物濃縮到固體含量為50到70%并且用水稀釋得到的濃縮物到固 體含量為5到20%，
[0011] (f)用不與水混溶的丁醇或戊醇多步提取上述得到的溶液，
[0012] (g)將丁醇和戊醇相分別濃縮到固體含量為50到70%，
[0013] (h)通過添加這樣量的水和乙醇稀釋濃縮物，以得到20到60% (重量）的含水乙醇 中含有5到20 % (重量)干提取物的溶液，
[0014] (i)用沸點(diǎn)為60到100°C的脂肪族或環(huán)脂族溶劑提取含水醇溶液，用于進(jìn)一步分離 烷基酚化合物，
[0015] (j)在減壓條件下濃縮水相并在溫度不超過60到80°C下將水相干燥到干提取物的 水含量少于5 %。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 本發(fā)明的目的是提供用于生產(chǎn)滿足歐洲藥典要求的銀杏葉提取物的改進(jìn)的方法， 即使是使用成分光譜不優(yōu)的銀杏葉，特別是使用萜類內(nèi)酯含量增加而且黃酮類化合物含量 增加的銀杏葉。此外，本發(fā)明的目的是以不添加純化合物或幾乎純的濃縮物的方式執(zhí)行該 方法，，是因?yàn)檫@對(duì)于銀杏提取物用作藥物是不允許的。
[0017] 令人驚訝地是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可以通過在根據(jù)EP 431 536 Bl的方法中額外的方法步 驟，來自成分光譜不優(yōu)的銀杏葉，可得到根據(jù)歐洲藥典的提取物。為此目的，在根據(jù)步驟(d) 的提取(液液分配）后，水相分別從甲基乙基酮和甲基乙基酮丙酮相分離，分別濃縮到干提 取部分為40到80% (重量）以得到濃縮物。用水和甲基乙基酮調(diào)節(jié)濃縮物的10到60% (重量） 的部分到干提取部分不超過60% (重量)且甲基乙基酮含量不超過30% (重量），并用甲基乙 基酮和沸點(diǎn)為60到100°C脂肪族溶劑、比例為7/3到9/l(m/m)的混合物提取以得到水-甲基 乙基酮相和甲基乙基酮-脂肪族溶劑相。
[0018] 將水-甲基乙基酮相與剩余90到40% (重量）的濃縮物混合以得到溶液，從而以抵 消最終產(chǎn)品中含量過高的萜類內(nèi)酯。
[0019] 可替代地，所得甲基乙基酮-脂肪族溶劑相可與剩余90到40% (重量）的濃縮物混 合以抵消最終產(chǎn)品中含量過高的黃酮類化合物。
[0020] 因此，根據(jù)本發(fā)明的用于生產(chǎn)具有以黃酮苷計(jì)算的含量為22.0% (重量)到27.0% (重量）的黃酮類化合物、2.6% (重量)到3.2% (重量）的白果內(nèi)酯、2.8% (重量)到3.4% (重 量)的銀杏內(nèi)酯A、B和C和不超過5ppm的銀杏酸的銀杏葉干提取物的方法包括以下步驟：
[0021] (a)用含水丙酮、碳原子數(shù)為1到3的含水烷醇或無水甲醇在約40至KKTC的溫度下 提取新鮮或干燥銀杏綠葉得到粗提取溶液，
[0022] (b)通過蒸餾從步驟(a)的粗提取溶液中分離主要量的丙酮或碳原子數(shù)為1到3的 烷醇到含量不超過10% (重量），其中，如果在步驟(a)中使用無水甲醇，在最后的蒸餾步驟 中添加水以得到的濃縮水溶液，
[0023] (c)用水稀釋步驟(b)的濃縮水溶液到固體含量為5至25% (重量），溫度冷卻到低 于25°C，保持低溫直到沉淀形成并分離形成的沉淀物以再次得到水溶液，
[0024] (d)將硫酸銨添加到步驟(C)中得到的水溶液中并用甲基乙基酮或甲基乙基酮和 丙酮的混合物提取所形成的含有硫酸銨的溶液，從甲基乙基酮或甲基乙基酮-丙酮相中分 離水相以得到甲基乙基酮或甲基乙基酮-丙酮相，
[0025] (e)將步驟(d)的甲基乙基酮或甲基乙基酮-丙酮相濃縮到干提取部分為40到80% (重量)以得到濃縮物，
[0026] (f)用水和甲基乙基酮調(diào)節(jié)步驟(e)濃縮物中10到60% (重量）的部分到干提取部 分不超過60% (重量)且甲基乙基酮的含量不超過30% (重量）以得到調(diào)節(jié)的提取液，并用甲 基乙基酮和沸點(diǎn)為60到100°C的脂肪族溶劑、比例為7/3到9/l(m/m)的混合物提取得到的調(diào) 節(jié)的提取液以得到水-甲基乙基酮相和甲基乙基酮-脂肪族溶劑相，
[0027] (g)將步驟(e)的濃縮物的90到40 % (重量）的剩余部分與步驟(f)的水-甲基乙基 酮相或步驟(f)的甲基乙基酮-脂肪族溶劑相混合以得到溶液，
[0028] (h)濃縮步驟(g)的溶液到固體含量為50到70% (重量)并用水稀釋所得濃縮物到 固體含量不超過50 % (重量)以得到溶液，
[0029] (i)用不與水混溶的丁醇或戊醇多步提取步驟(h)中所得溶液以得到丁醇或戊醇 相，
[0030] (j)濃縮步驟(i)的丁醇或戊醇相到固體含量至少為50% (重量）以得到濃縮物，
[0031] (k)如果必要，通過加入一定量的水和乙醇稀釋步驟（j)中所得的濃縮物，可得到 水中具有5到20% (重量)的干提取物的溶液或不超過60% (重量)含水乙醇溶液，
[0032] (1)用具有沸點(diǎn)為60到HKTC的脂肪族溶劑提取步驟(k)中水或含水乙醇溶液，從 脂肪族溶劑相中分離水相以得到水相，
[0033] (m)在減壓且溫度不超過60到80°C的情況下濃縮步驟（1)中得到的水相以得到水 含量小于5 % (重量)的干提取物。
[0034]在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，
[0035] ?使用丙酮含量為約50到70% (重量），特別優(yōu)選為丙酮含量約為60% (重量)的含 水丙酮作為步驟(a)中的提取溶劑，
[0036] ?使用選自甲醇、乙醇、1 -丙醇和2-丙醇的烷醇含量為約50 % (重量）到70 % (重 量）的含水烷醇，特別優(yōu)選乙醇含量約為60% (重量）的含水乙醇作為步驟(a)中的提取溶 劑，
[0037] ?在步驟(c)中，稀釋活性溶液冷卻到低于12°C的溫度，
[0038] ?相對(duì)于步驟(c)中的水溶液，步驟(d)中添加至少30 % (重量）的硫酸銨，特別優(yōu) 選30到50 % (重量）的硫酸銨，
[0039] ?在步驟(d)中用甲基乙基酮和丙酮、比例為7/3到3/4(m/m)的混合物提取，
[0040] ?在步驟(i)中用1-丁醇提取和/或
[0041] ?在步驟(1)中用庚烷提取，特別優(yōu)選為用正庚烷或具有正庚烷部分大于35% (重 量)的庚烷異構(gòu)體的混合物提取。
[0042] 此外，類似于EP 1868625 Bl和EP 1868568 Bl，可以進(jìn)行用于除去4'-0_甲基吡哆 醇的下列補(bǔ)充方法步驟：
[0043] (η)從步驟(k)的水相或從步驟(m)的干提取物中制備乙醇含量為40 % (重量）到 60% (重量)的含水乙醇銀杏提取液，
[0044] (〇)將步驟(η)中的含水乙醇銀杏提取液涂覆在強(qiáng)酸性離子交換劑上以除去保留 在離子交換劑中的4'-0_甲基吡哆醇并使用含水乙醇洗脫以得到不含4'-0_甲基吡哆醇的 提取液作為洗脫液，
[0045] (ρ)在減壓情況下濃縮步驟(〇)的洗脫液并在不超過60到80 °C的溫度下干燥到干 提取物的水含量小于5 % (重量）。
[0046] Merck I和Amberlite IR-120是強(qiáng)酸性離子交換劑的例子。通常，強(qiáng)酸性離子交換 劑是與磺酸基團(tuán)結(jié)合的聚苯乙烯樹脂。
[0047] 在下文中，使用的與根據(jù)本發(fā)明的方法有關(guān)的一些術(shù)語的定義如下：
[0048] 干提取物:根據(jù)歐洲藥典，干提取物的水含量一般不超過5% (重量）。
[0049] 例如與步驟(a)中無水甲醇有關(guān)的無水的根據(jù)本發(fā)明是指水含量<1% (重量）。
[0050] 提取包括一步、多步和連續(xù)提取。
[0051] 沸點(diǎn)為60到100°C的脂肪族溶劑優(yōu)選為正庚烷或飽和無環(huán)和/或環(huán)狀脂肪族烴的 混合物，該混合物通過其沸點(diǎn)定義，并且在指定為石油醚或石油汽油的情況下是已知和市 售的。優(yōu)選地，使用的是基本上由正庚烷和其他C7烷烴構(gòu)成的脂肪烴的混合物。超過35% (重量)的正庚烷(沸點(diǎn)98°C)的較多部分的正庚烷在如94-100°C段的組分找到。
[0052]步驟(i)中提到的不與水混溶的丁醇或戊醇優(yōu)選為1-丁醇或1-戊醇。
【具體實(shí)施方式】
[0053]在下文中，根據(jù)本發(fā)明的方法被進(jìn)一步解釋并通過根據(jù)EP 431 536 Bl的比較實(shí) 施例1和根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例1來說明。
[0054]用于實(shí)施例1和比較實(shí)施例1的起始溶液
[0055](根據(jù)EP 431 536 Bl的方法步驟(a)到(d)和根據(jù)本發(fā)明的方法）
[0056]在以下實(shí)施例中，術(shù)語"庚燒"是指沸點(diǎn)范圍為94_100°C的飽和脂肪烴和超過35% (重量)的正庚烷部分的混合物。
[0057] 用3.751^60%(重量）的丙酮在60°(：提取50(^干燥且壓碎的銀杏葉301^11。過濾該 植物材料，再次用3.75kg 60 % (重量)丙酮在60 °C提取30min并再次過濾。將這樣得到的兩 種提取液混合并濃縮(438g;干燥提取部分36.9 % )。
[0058]用400g水稀釋得到的濃縮物并在12°C下攪拌lh。過濾所形成的沉淀且將240g硫酸 銨添加到濾液中并溶解。用各400ml甲基乙基酮/丙酮6/5(m/m)將該溶液提取兩次。將甲基 乙基酮/丙酮相混合(808g)。
[0059] 根據(jù)EP 431536B1的比較實(shí)施例1 [0060](根據(jù)方法步驟(e)至（j))
[00611 濃縮上述起始溶液(404g)的一半（27.2g);干提取物部分(50%)。用107.8g水(干 提取物部分10%)稀釋此濃縮物并通過每次用65ml水飽和1-丁醇搖動(dòng)三次來提取。混合、濃 縮1-丁醇相并在50°C下真空干燥16h(6.72g)。
[0062]將這樣得到的干提取物在20.2g乙醇和40.3g水(干提取物部分10 % )的混合物中 溶解。該溶液通過每次用20ml庚烷搖動(dòng)三次來提取，濃縮并在50°C下真空干燥16小時(shí)： 6. llg(相對(duì)于藥物為2.4% )。

[0064] ~這樣得到提取物在白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯A、B和C含量方面不符合歐洲藥典的要求.
[0065] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例1
[0066](根據(jù)本發(fā)明的方法步驟(e)到(m))
[0067] 濃縮上述起始溶液(404g)的第二半(20 · 5g;干提取部分68 · 2 % )。用8 · Ig水和5 · 6g 甲基乙基酮調(diào)節(jié)10.75g此濃縮物得到干提取物部分為30%且甲基乙基酮含量為23% (重 量），并通過每次用18.3g甲基乙基酮/庚烷8/2(m/m)搖動(dòng)兩次來提取。
[0068]用起始溶液的剩余濃縮物（9.75g)將水-甲基乙基酮相混合。將此溶液濃縮至 24.17g，并用115.5g水調(diào)節(jié)到干提取物部分為10%，且通過每次使用65ml水飽和1-丁醇搖 動(dòng)三次來提取?；旌稀饪s1-丁醇相并在50°C下真空中干燥16h(5.93g)。
[0069]將這樣得到的干提取物在17.8g乙醇和35.6g水(干提取物部分10% )的混合物中 溶解。該溶液通過每次用20ml庚烷搖動(dòng)三次來提取，濃縮并在50°C下真空干燥16小時(shí)： 5.29g(相對(duì)于藥物為2.1%)。
L〇〇71 J 這樣得到提取物在所有含量方_，特別是白果內(nèi)酯和銀否內(nèi)酯A、B和C含量方_符 合歐洲藥典的要求。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于生產(chǎn)銀杏葉干提取物的方法，所述提取物具有以黃酮苷計(jì)，重量為22.0%到 27.0%的黃酮類化合物、重量為2.6%到3.2%的白果內(nèi)酯、重量為2.8%到3.4%的銀杏內(nèi)酯A、B 和C以及不超過5ppm的銀杏酸，所述方法包括以下步驟： (a) 用含水丙酮、碳原子數(shù)為1到3的含水烷醇或無水甲醇在約40至IOOtC的溫度下提取 新鮮或干燥銀杏綠葉得到粗提取溶液， (b) 通過蒸餾從步驟(a)的粗提取溶液中分離主要量的丙酮或碳原子數(shù)為1到3的烷醇 到重量含量不超過10%，其中，如果在步驟(a)中使用無水甲醇，在最后的蒸餾步驟中添加水 以得到濃縮的水溶液， (c) 用水稀釋步驟(b)的濃縮水溶液到固體重量含量為5至25%，溫度冷卻到低于25°C， 保持低溫直到沉淀形成并分離形成的沉淀物以再次得到水溶液， (d) 將硫酸銨添加到步驟(c)中得到的水溶液中并用甲基乙基酮或甲基乙基酮和丙酮 的混合物提取所形成的含有硫酸銨的溶液，從甲基乙基酮或甲基乙基酮-丙酮相中分離水 相以得到甲基乙基酮或甲基乙基酮-丙酮相， (e) 將步驟(d)的甲基乙基酮或甲基乙基酮-丙酮相濃縮到干提取部分重量為40到80% 以得到濃縮物， (f) 用水和甲基乙基酮調(diào)節(jié)步驟(e)濃縮物中重量為10到60%的部分到干提取部分重量 不超過60%和甲基乙基酮的重量含量不超過30%以得到調(diào)節(jié)的提取液，并用甲基乙基酮和沸 點(diǎn)為60到IOO tC的脂肪族溶劑、比例為7/3到9/l(m/m)的混合物提取得到的調(diào)節(jié)提取液以得 到水-甲基乙基酮相和甲基乙基酮-脂肪族溶劑相， (g) 將步驟(e)的濃縮物的重量為90到40%的剩余部分與步驟(f)的水-甲基乙基酮相或 步驟(f)的甲基乙基酮-脂肪族溶劑混合以獲得溶液， (h) 濃縮步驟(g)的溶液到固體重量含量為50到70%并用水稀釋所得濃縮物到固體重量 含量不超過50%以得到溶液， (i) 用不與水混溶的丁醇或戊醇多步提取步驟(h)中所得溶液以得到丁醇或戊醇相， (j) 濃縮步驟(i)的丁醇或戊醇相到固體重量含量至少為50%以得到濃縮物， (k) 如果必要，通過加入一定量的水和乙醇稀釋步驟(j)中所得的濃縮物，得到水中具 有重量為5到20 %的干提取物的溶液或重量不超過60 %的含水乙醇溶液， (l) 用具有沸點(diǎn)為60到HKTC的脂肪族溶劑提取步驟(k)中水或含水乙醇溶液，從脂肪 族溶劑相中分離水相以得到水相， (m) 在減壓且溫度不超過60到80°C的情況下濃縮步驟（1)中得到的水相以得到水重量 含量小于5%的干提取物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，使用丙酮重量含量約50%到70%的含水丙酮作為步 驟(a)中的提取溶劑。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，使用丙酮重量含量約60%的含水丙酮作為步驟(a) 中的提取溶劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，使用選自甲醇、乙醇、1-丙醇和2-丙醇，烷醇重量 含量約50%到70%的含水烷醇作為步驟(a )中的提取溶劑。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，使用乙醇重量含量約60%的含水乙醇作為步驟(a) 中的提取溶劑。6. 根據(jù)權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟(c)中稀釋水溶液冷卻到低于12 °(：的溫度。7. 根據(jù)權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，相對(duì)于步驟(c)中的水溶液，步驟(d) 中添加至少30%重量的硫酸銨。8. 根據(jù)權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在步驟(d)中用甲基乙基酮和丙酮、 比例為7/3到3/4(m/m)的混合物提取。9. 根據(jù)權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在步驟(i)中用1-丁醇提取。10. 根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在步驟(1)中用庚烷提取。11. 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中，庚烷是正庚烷或具有正庚烷部分大于35%重量的庚 烷異構(gòu)體的混合物。12. 根據(jù)權(quán)利要求1到11中任一項(xiàng)所述的方法，包括以下附加步驟： (η)從步驟(k)的水相或從步驟(m)的干提取物中制備乙醇重量含量為40%到60%的含水 乙醇銀杏提取液， (〇)將步驟(η)中的含水乙醇銀杏提取液涂覆在強(qiáng)酸性離子交換劑上以除去保留在離 子交換劑中的4'-0_甲基吡哆醇并使用含水乙醇洗脫以得到不含4'-0_甲基吡哆醇的提取 液作為洗脫液， (P)在減壓情況下濃縮步驟(O)的洗脫液并在不超過60到80°C的溫度下干燥到干提取 物的水重量含量小于5%。
【文檔編號(hào)】A61K36/16GK105960245SQ201580005342
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2015年1月12日
【發(fā)明人】弗蘭克·魏默, 斯特芬·萊茵哈德, 荷爾曼·豪爾
【申請(qǐng)人】威瑪舒培博士公司