治療腎癌的藥物組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種治療腎癌的藥物組合物。該藥物組合物由如化合物(Ⅰ)的組分A、化合物(Ⅱ)的組分B和化合物(Ⅲ)的組分C組成，本發(fā)明的藥物組合物能夠有效地抑制腎癌細胞株RC?2增殖，并且抑制呈濃度及時間依賴性。本發(fā)明中的組合物對腎癌細胞的抑制作用相對于藥物單獨使用時顯著提高，且本發(fā)明的藥物組合物均為非傳統(tǒng)意義的化療藥物，對機體的損害小，而且避免了癌細胞對傳統(tǒng)化療藥物的耐藥性。
【專利說明】
治療腎癌的藥物組合物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種治療腎癌的藥物組合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 枳殼為蕓香科植物酸橙(Citrus aurantium L.)及其栽培變種的干燥未成熟果 實。7月果皮尚綠時采收，自中部橫切為兩半，曬干或低溫干燥。味苦、辛、酸。性微寒。歸脾、 胃經(jīng)。具有理氣寬中，行滯消脹之功效。用于胸脅氣滯，脹滿疼痛，食積不化，痰飲內(nèi)停，臟器 下垂。枳殼是中藥典型的理氣藥之一，廣泛應(yīng)用于中醫(yī)臨床。
[0003] 枳殼所含化學(xué)成分較為復(fù)雜，目前已知的有效成分主要有黃酮類、揮發(fā)油類、生物 堿類、香豆素類和一些微量元素等。枳殼中黃酮類成分主要有:橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、 柚皮蕓香苷、異柚皮苷、陳皮素、柚皮素、川陳皮素、紅橘素、去甲基川陳皮素、去甲川陳 皮素、橙黃酮、4'，5,7,8_四甲氧基黃酮、4-0-甲基黃芩素、3-羥基_3'，4'，5,6,7,8_六甲氧 基黃酮和5，6-二羥基-7，4 二甲氧基黃酮等。揮發(fā)油主要有檸檬烯、芳樟醇、2-十一烷酮、 Y-松油烯。枳殼中所含的生物堿類活性成分主要有辛弗林、N-甲基酪胺、酪胺、大麥芽堿 等。枳殼中所含的香豆素類成分主要有葡萄內(nèi)酯、傘形花內(nèi)酯、異前胡素、馬明丙酮化合物、 潑朗弗林、異米拉素、花椒毒酚、5-異戊烯氧基線呋喃香豆素、5-甲氧基線呋喃香豆素等。
[0004] 枳殼中的橙皮苷具有抗炎、抗氧化、抗癌和保肝等作用；柚皮苷具有抗炎鎮(zhèn)痛、降 血糖等作用；川陳皮素具有抗炎，抗病毒，抗氧化等藥理作用；川陳皮素具有很好的抗腫瘤 的作用；柚皮素具有抗抑郁、保肝、抗氧化、改善大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙、抗血小板聚集的作用。 枳殼揮發(fā)油的主要成分是檸檬烯。在臨床上，檸檬烯膠囊已上市，主要用于膽囊炎、膽管炎、 膽結(jié)石和膽道術(shù)后綜合征等的治療。在枳殼揮發(fā)油中，另一重要成分為芳樟醇，具有防腐、 抗菌、抗病毒和鎮(zhèn)靜等作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種治療腎癌的藥物組合物，其具有治療腎癌作用。
[0006] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實現(xiàn)的：
[0007] 治療腎癌的藥物組合物，它由如下式化合物（I)的組分Α、如下式化合物（Π )的組 分B和如下式化合物（ΙΠ)的組分C組成，
[0008；
[0009]以重量百分含量計，組分A占總重量的45-55% ;
[0010] 組分B占總重量的25-45%;
[0011] 組分C占總重量的10-25 %。
[0012] 進一步地，所述化合物(I)從枳殼中分離提取獲得，包含以下操作步驟：
[0013] (a)將干燥的枳殼粉碎，用70~80%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味， 依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物 和正丁醇萃取物；
[0014] (b)步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫8個柱體積，再 用70%乙醇洗脫12個柱體積，收集70%乙醇洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫物浸膏；
[0015] (C)步驟(b)中70 %乙醇洗脫物浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1、50:1、 30:1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個組分；
[0016] (d)步驟(C)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為15:1、10:1和5:1的 二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；
[0017] (e)步驟（d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為 70 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~10個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物 (1)〇
[0018] 進一步地，步驟(a)中，用75%乙醇熱回流提取，合并提取液。
[0019]進一步地，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。
[0020] -種治療腎癌的藥，其中含有治療有效量的上述藥物組合物和藥學(xué)上可接受的載 體。
[0021] 本發(fā)明藥物組合物作為治療胃癌的藥物時，可以直接使用，或者加入藥學(xué)上可接 受的載體。該藥物含有治療有效量的本發(fā)明藥物組合物，其余為藥物學(xué)上可接受的、對人和 動物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
[0022]所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料 以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明藥物可 通過口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時，可將其制成片劑、緩釋片、控 釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等;用于注射時，可制成滅菌的 水性或油性溶液、無菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等。
[0023]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：
[0024]本發(fā)明的藥物組合物能夠有效地抑制腎癌細胞株RC-2增殖，并且抑制呈濃度及時 間依賴性。本發(fā)明中的組合物對腎癌細胞的抑制作用相對于藥物單獨使用時顯著提高，且 本發(fā)明的藥物組合物均為非傳統(tǒng)意義的化療藥物，對機體的損害小，而且避免了癌細胞對 傳統(tǒng)化療藥物的耐藥性。
【附圖說明】
[0025]圖1為化合物(I)結(jié)構(gòu)式；
[0026]圖2為化合物（I)理論E⑶值與實驗E⑶值比較。
【具體實施方式】
[0027]下面結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護范 圍。盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對 本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。
[0028]實施例1: 一種治療腎癌的藥物組合物，它由如下式化合物（I)的組分A、如下式化 合物（π)的組分B和如下式化合物（m)的組分c組成，
[0029]
[0030]以重量百分含量計，組分A占總重量的55% ;
[0031] 組分B占總重量的25%;
[0032] 組分C占總重量的20%。
[0033]其中，化合物（Π )為公開號為CN105418558 A的專利文獻公開一種用于治療腎癌 的檸檬苦素類化合物，化合物（Π )對腎癌細胞的增殖、迀移、侵襲、死亡都有顯著地影響;化 合物（m)名稱為= Norzoanthamine;它在中國科學(xué)院大學(xué)，2012年作者為莊澤陽，名為《天然 產(chǎn)物Norzoanthamine的核心骨架ABC環(huán)以及Dalesconol A的合成研究》博士論文一文中有 詳細提及。
[0034]化合物（I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0035] 試劑來源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海凌峰化 學(xué)試劑有限公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。
[0036]制備方法：（a)將干燥的枳殼(8kg)粉碎，用75 %乙醇熱回流提取(25L X 3次），合并 提取液，濃縮至無醇味(3L)，依次用石油醚(3LX3次）、乙酸乙酯（3LX3次)和水飽和的正丁 醇(3LX3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(347g)和正丁醇萃取物；（b)步 驟(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫8個柱體積，再用70% 乙醇洗脫12個柱體積，收集70%乙醇洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫物浸膏（129g); (c) 步驟(b)中70%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1(8個柱體積）、50:1(8 個柱體積）、30:1(6個柱體積）、10:1(8個柱體積)和1:1(5個柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度 洗脫得到5個組分；（d)步驟(c)中組分4(31g)用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為15:1 (8個柱體積）、10:1(10個柱體積)和5:1(6個柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組 分；（e)步驟（d)中組分2(14g)用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為 70 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8-10個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物 (I)(48mg)〇
[0037] 結(jié)構(gòu)確證:無色晶體（甲醇），HR-ESMS顯示[M+Na]+為m/z 523.2314,結(jié)合核磁特 征可得分子式為C28H36〇8，不飽和度為11。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δΗ(ρρηι，DMS0_d6，500MHz):H-I (4.85，d，J = 7.5)，H-2(2.72，dd，J=16.0,7.5)，H-2(3.43，d，J=16.0)，H-5(2.39，d，J = 13.5)，H-6(1.57，d，J = 13.5)，H-6(1.85，t，J=13.5)，H-7(3.33，d，J = 4.5)，H-9(1.96，s)， H-ll(3.78，br，s)，H-12(3.34，d，J = 6.0)，H-14(2.89，s)，H-16(2.41，dd，J=19.0,9.0)，H-16(2.20，dd，J=19.0,9.0)，H-17(4.19，t，J=10.0)，H-18(0.61，s)，H-19(1.41，s)，H-21 (7.45，s)，H-22(6.46，d，J=1.0)，H-23(7.47，t，J=1.5)，H-28(1.22，s)，H-29(1.39，s)，H-30(1.16,8)，7-0!1(4.69，(1，了 = 4.5)，1-(^〇(1.87,8);核磁共振碳譜數(shù)據(jù)6。(卯111，0130-(1 6， 125MHz):70.7(CH，1-C)，34.5(CH2,2-C)，169.6(C，3-C)，85.1(C，4-C)，38.9(CH，5-C)，27.8 (CH2,6-C)，68.8(CH，7-C)，44.0(C，8-C)，36.2(CH，9-C)，41.7(C，10-C)，70.6(CH，n-C)， 70.1(CH，12-C)，44.0(C，13-C)，57.2(CH，14-C)，220.1(C，15-C)，41.8(CH2，16-C)，34.9 (CH，17-C)，21.1(CH3，18-C)，22.9(CH 3，19-C)，123.3(C，20-C)，140.8(CH，21-C)，111.2(CH， 22-C) ,141.7(CH,23-C), 33.8(CH3,28-0,17.7(CH3,29-C) ,19.3(CH3,30-0,169. l(Ca-OAc)，20.3(CH3，l-0Ac);碳原子標(biāo)記參見圖1。紅外波譜表明該化合物含有羥基(3526CHT 1)， 羰基（1732cm-〇和烯烴（1685cm-〇等基團。1H NMR譜顯示六個甲基信號(δΗΙ · 87，1 ·41，1 · 39， 1.22，1.16,〇.61，各3!1，8)，0型取代的呋喃環(huán)0!17.45,8;6.46，(1，了=1.〇!^和7.47，^ = 1.5Hz)，以及一個乙酰氧基[δΗΙ. 87(3Η，s) ]。13C NMR、DEPT和HSQC譜中顯示有28個碳信號， 包括六甲基，三個亞甲基，十一個次甲基（四個含氧碳和三個烯烴碳），以及八個季碳(三個 羰基碳，一個含氧碳和一個烯烴碳）。上述數(shù)據(jù)表示，該化合物為檸檬苦素類化合物，再結(jié)合 不飽和數(shù)可知該化合物為五環(huán)結(jié)構(gòu)。HMBC譜中，H-I (δΗ4.85，d，J = 7.5)與C-2 (SC34.5)和兩 個羰基碳[SC169.1(OAc)和169.6(C-3)]的相關(guān)性表明，C-I位連有一個乙酰氧基。HMBC譜中 H-I 與 C-3，C-5 和 C-10，H2-2 與 C-3，Me-28 和 Me-29 與 C-4，Me-19 與 C-I 的相關(guān)性表明 A 環(huán)為七 元內(nèi)酯環(huán)。HMBC譜中，質(zhì)子(4.69，d，J = 4.5)與C-7(SC68.8)的相關(guān)性表明B環(huán)的C-7位連有 一個羥基。此外，兩個含氧碳信號SC70.6(CH，11-C)和70.1(CH，12-C)表明C環(huán)存在一個11， 12-環(huán)氧基團。HMBC譜中，H-14和H 2-16與酮羰基C-15(SC220.1)的相關(guān)性表明D環(huán)為五元環(huán)。 通過HMBC譜中H-17與C-20，C-21和C-22,以及H2-16與C-20的相關(guān)性可知呋喃環(huán)位于C-17位 上。ROESY 譜中，Η-6β 與 Me-19，Me-19 與 Me-29，Me-19 與 Me-30，Me-30 與 H-7，Me-30 與 H-12 和 H-12 與 H-17 的相關(guān)性表明 H-7，H-12，H-17，Me-19，Me-29和Me-30為β構(gòu)型。此外，H-6α與H-5，H-5與Me-28，H-5與H-9，H-9與H-14，H-14與7-OH，以及H-14與Me-18的相關(guān)性表明它們均為α構(gòu) 型。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和ROESY譜，以及文獻關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化 合物如圖1所示，立體構(gòu)型進一步通過ECD試驗確定，理論值與實驗值基本一致(圖2)。
[0038]實施例2:化合物（I)藥理作用試驗
[0039] -、材料和儀器
[0040] 人腎癌RC-2細胞株購于ATCC細胞庫(美國）。分析純蔗糖購于國藥集團化學(xué)試劑公 司。重水(D2O)購于青島騰龍微波科技有限公司。1^8、303、30%丙烯酰胺單體、1'冊61120購 于重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)研究所實驗室。小牛血清、RPMI-1640購于美國Gibco公司。Centriplus 離心超濾管、Amicon Ultra高回收率高流速切向流超濾離心管（IOOkD)、PVDF膜購于 Mi 11 ipore公司。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購于上海安亭科學(xué)儀器廠。5 X SDS-PAGE蛋白質(zhì) 上樣緩沖液、BeyoECL熒光檢測試劑、考馬斯亮藍G250、考馬斯亮藍R250購于碧云天生物技 術(shù)研究所?；衔铮↖)自制，HPLC歸一化純度大于98%。鼠抗人HSP70單克隆抗體、兔抗人 ICAM-I單克隆抗體、兔抗人G250多克隆抗體購于Sigma公司。兔抗人Survivin多克隆抗體武 漢博士德生物有限公司。
[0041] 超凈工作臺（蘇州華新空調(diào)凈化有限公司），自動平衡離心機(上海醫(yī)用分析儀器 廠），光學(xué)顯微鏡(NIKON，日本），透射電子顯微鏡(LeicaTCS-NT，德國），低溫高速離心機（日 立公司，日本），低溫超高速離心機H-80B(日立公司，日本）。垂直電泳槽、電轉(zhuǎn)槽(北京六一 廠，中國）。臺式高速離心機、酶標(biāo)儀(上海安亭科學(xué)儀器廠，中國）。96孔培養(yǎng)板(Corning公 司，美國）。凝膠儀、PCR擴增儀(BIO-RAD，美國）。
[0042]二、試驗方法
[0043] UMTT檢測化合物（I)不同濃度48h對腎癌細胞株RC-2增殖的影響
[0044]用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液(含有0.1 %青霉素、鏈霉素)常規(guī)培養(yǎng)人腎 癌細胞株RC-2，根據(jù)細胞生長密度1~2天換液一次，3天傳代一次。取對數(shù)期生長細胞，按照 如下步驟操作：（1)接種細胞:胰酶消化對數(shù)生長期的腎癌RC-2細胞，用含10%小牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)液ImL制成單細胞懸液，混勻后用移液管按照體積IOOyL/孔，即接種腎癌細 胞數(shù)目5 X IO3個/孔，加入96孔培養(yǎng)板中。每組細胞設(shè)置3個復(fù)孔；（2)培養(yǎng)細胞:將培養(yǎng)板小 心置入孵箱中（37 °C、5 % CO2)培養(yǎng)3天；（3)處理細胞:分別按空白組(加5yL DMSO液）、0.25、 0.5、0.75、lymol/L化合物（I)處理組分組后加藥處理48h; (4)顯色：在各個時間點，予以每 孔各加入MTT溶液20yL，之后繼續(xù)放入孵箱中孵育4h，然后小心把孔內(nèi)培養(yǎng)液用注射器吸 去;對于當(dāng)天接種的細胞而言，離心之后（l〇〇〇rpm，5min)，然后將孔內(nèi)培養(yǎng)液移除。之后把 150yL DMSO加入每孔，使其充分振蕩IOmin后，把結(jié)晶物溶解完全；（5)比色:在全自動酶標(biāo) 儀上檢測各孔在580nm波長下的光密度值[(D580)]，按公式測定細胞活力:D(580)實驗孔/D (580)對照孔 X 100%。
[0045] 2、MTT檢測0.5μΜ化合物（I)不同時間對腎癌細胞株RC-2增殖的影響
[0046] 接種和處理細胞及顯色和比色步驟同上（1)、（2)、（4)、（5)，處理細胞:分別按空白 組（加5yL DMSO液）、0.5μΜ化合物（I)處理24h、48h、72h分組。
[0047] 3 ^lJgexosomes
[0048] (I)細胞分組：取6份細胞計數(shù)相近的人腎癌RC-2細胞株體外常規(guī)培養(yǎng)，其中三份 為對照組（CE)，另外三份為實驗組（CE2)，等細胞呈對數(shù)生長時，兩組細胞株按照3 X IO6/ IOOmL重新傳代至新的培養(yǎng)瓶，嚴格控制每組細胞培養(yǎng)基的體積一致;在實驗組，等細胞培 養(yǎng)48h后加入0.5μΜ的化合物（I)處理細胞48h，之后收集培養(yǎng)上清液各150mL;對照組不加藥 物，加入與實驗組等量的DMSO，48h后收集培養(yǎng)上清液各150mL，置于-20°C冰箱保存；（2)提 取exosomes:培養(yǎng)上清液150mL，300g低溫離心(4°C) IOmin去除細胞;800g低溫離心30min獲 取上清1000 Og低溫離心30min獲取上清通過IOOkD Mff⑶Centriplus離心超濾管濃縮超濾 (MffCO:分子量截留），以1000 g離心30min，得到約20mL超濾液。將超濾液分別移至2mL含30g/ L的蔗糖重水墊的IOmL的離心管中，1000 OOg低溫超速離心lh。收集離心管底部的緩沖墊用 PBS稀釋，置于IOOkD MWCO高回收率高流速切向流超濾離心管中1000 g離心30min，得到3mL exosome。。. 22μηι濾膜過濾除菌，_80°C保存?zhèn)溆迷O(shè)置對照組細胞(CE1)來源的exosomes為 EXl 組 exosomes，實驗組細胞(CE2)來源的 exosomes 為EX2 組 exosomes。
[0049] 4、BCA法檢測exosomes蛋白含量
[0050] (1)測定方法:取96孔酶標(biāo)板，按下表加入試劑并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：
[0052] 上述試劑加完后，準(zhǔn)確吸取IOyL樣品溶液于酶標(biāo)孔中，加入BCA試劑200yL，輕搖， 于37°C保溫30min，冷卻至室溫后，以空白為對照，在酶標(biāo)儀上562nm處比色，以牛血清白蛋 白含量為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)曲線空白為對照，根據(jù)樣品的 吸光值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的蛋白質(zhì)濃度；（2)計算方法:exosome濃縮液總蛋白質(zhì)含量 (mg)=濃縮后的總體積XBCA法測定蛋白質(zhì)濃度。重復(fù)6次實驗，取平均值做統(tǒng)計學(xué)分析。 [0053] 5、統(tǒng)計學(xué)方法
[0054] 使用軟件GRAGHPAD PRISM 5.0進行圖表制作及統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以1±8表 示，比較組間差異使用方差分析或t檢驗。
[0055]三、結(jié)果及結(jié)論
[0056] UMTT顯示不同濃度化合物（I)作用腎癌細胞株RC-2后細胞活力變化
[0057] MTT結(jié)果顯示當(dāng)化合物（I)濃度0·75μΜ作用細胞時，細胞活力（71·32±4·68%)與 化合物（I)濃度〇·5μΜ及0·25μΜ作用細胞時細胞組（91.43±2.74%;94.67±1.21%)相比， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Ρ〈〇. 05)。
[0058] 2、11'1'顯示0.5以1化合物（1)不同時間作用腎癌細胞株此-2后細胞活力變化
[0059] MTT結(jié)果顯示當(dāng)0.5μΜ化合物（I)作用細胞72h組（71.34±1.64%)與作用4811組 (91 ·04±6· 23% )、24h組(94.56± 1 · 13% )對比，細胞活力差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Ρ〈0·05)。
[0060] 3、Exosomes計數(shù)和蛋白定量
[0061 ] 電鏡下實驗組(EX2)和對照組(EXl) exosomes計數(shù)和exosomes蛋白定量結(jié)果:經(jīng)化 合物（I)處理后，RC-2細胞產(chǎn)生的exosomes數(shù)量和exosome蛋白含量較未經(jīng)藥物處理組都明 顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P〈〇. 05)。結(jié)果見表1。
[0062]結(jié)果說明，化合物⑴能夠抑制腎癌細胞株RC-2增殖，這種抑制呈濃度及時間依賴 性。經(jīng)化合物（I)處理后，透射電鏡觀察腎癌細胞株RC-12源性exosomes形態(tài)未見明顯改變， 其分泌量和蛋白含量較處理前明顯增加(P<〇.05)，這些說明化合物（I)對腎癌細胞株RC-12的抑制作用與化合物（I)引起的腎癌細胞RC-2表達野生型p53mRNA上調(diào)有關(guān)。
[0063] 表1實驗組和對照組分泌exosomes數(shù)量及蛋白含量對比
[0065] 實施例3
[0066] 與上述類似地，將本發(fā)明實施例1中的組分A、組分B和組分C組合的藥物進行如上 實驗通過MTT檢測實施例1的組合物對腎癌細胞株RC-2增殖的影響，結(jié)果及結(jié)論如下：
[0067] I、MTT顯示不同濃度組合物作用腎癌細胞株RC-2后細胞活力變化
[0068] MTT結(jié)果顯示當(dāng)組合物濃度0.75μΜ作用細胞時，細胞活力(67.55 ± 3.18 % )與組合 物濃度〇.5μΜ及0.25μΜ作用細胞時細胞組(85.27±3.14%;89.98±2.11%)相比，差異具有 統(tǒng)計學(xué)意義(Ρ〈〇.〇5)。
[0069] 2、ΜΤΤ顯示0.5μΜ組合物不同時間作用腎癌細胞株RC-2后細胞活力變化
[0070] MTT結(jié)果顯示當(dāng)0.5μΜ組合物作用細胞72h組(67.22± 1.84% )與作用48h組（85.05 ±2.13% )、24h組(89.31 ± 1 · 23% )對比，細胞活力差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Ρ〈0·05)。
[0071 ] 3、Exosomes計數(shù)和蛋白定量
[0072] 電鏡下實驗組(EX2)和對照組(EXl) exosomes計數(shù)和exosomes蛋白定量結(jié)果:經(jīng)組 合物處理后，RC-2細胞產(chǎn)生的exosomes數(shù)量和exosome蛋白含量較未經(jīng)藥物處理組都明顯 增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P〈〇. 05)。結(jié)果見表2。
[0073]結(jié)果說明，組合物能夠抑制腎癌細胞株RC-2增殖，這種抑制呈濃度及時間依賴性。 經(jīng)組合物處理后，透射電鏡觀察腎癌細胞株RC-12源性exosomes形態(tài)未見明顯改變，其分泌 量和蛋白含量較處理前明顯增加(P<〇.05)，這些說明組合物對腎癌細胞株RC-12的抑制作 用與組合物引起的腎癌細胞RC-2表達野生型p53mRNA上調(diào)有關(guān)。
[0074] 表2實驗組和對照組分泌exosomes數(shù)量及蛋白含量對比
[0076]實施例4: 一種治療腎癌的藥物組合物，按照重量百分含量計，它由50 %的化合物 (I)的組分A、35%的化合物（Π )的組分B和15%的化合物（ΙΠ)組分C組成。
[0077]實施例5: -種治療腎癌的藥物組合物，按照重量百分含量計，它由45 %的化合物 (I)的組分A、30%的化合物（Π )的組分B和25%的化合物（ΙΠ)組分C組成。
[0078]實施例6:片劑的制備：先制得實施例1-5任意一項的藥物，再利用有機酸如酒石 酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重量 比為1:9的比例加入賦形劑，制粒壓片。
[0079] 實施例7: 口服液制備：先制得實施例1-5任意一項的藥物，再利用有機酸如酒石 酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)口服液制法 制成口服液。
[0080] 實施例8:膠囊劑或顆粒劑的制備:先制得實施例1-5任意一項的藥物，再利用有機 酸如酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦 形劑重量比為1:9的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。
[0081 ]實施例9:注射液的制備:先制得實施例1-5任意一項的藥物，再利用有機酸如酒石 酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)加注射用 水，精濾，灌封滅菌制成注射液。
[0082] 實施例10:無菌粉針的制備:先制得實施例1-5任意一項的藥物，再利用有機酸如 酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，將其溶于無菌 注射用水中，攪拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安瓿中，低溫冷凍干燥后 無菌熔封得粉針劑。
[0083] 上述實施例的作用在于說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 治療腎癌的藥物組合物，其特征在于，它由如下式化合物（I)的組分A、如下式化合物 (Π )的組分B和如下式化合物（虹）的組分C組成，W重量百分含量計，組分A占總重量的45-55 % ; 組分B占總重量的25-45 %; 組分C占總重量的10-25 %。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療腎癌的藥物組合物，其特征在于，所述化合物（I)從積殼 中分離提取獲得，包含W下操作步驟： (a)將干燥的積殼粉碎，用70~80%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次 用石油酸、乙酸乙醋和水飽和的正下醇萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正 下醇萃取物； (b)步驟(a)中乙酸乙醋萃取物用大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫8個柱體積，再用 70%乙醇洗脫12個柱體積，收集70%乙醇洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫物浸膏； (C)步驟(b)中70%乙醇洗脫物浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1、50:1、30: 1、10:1和1:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得至化個組分； (d) 步驟(C)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為15:1、10:1和5:1的二氯 甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個組分； (e) 步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為70%的 甲醇水溶液等度洗脫，收集8~10個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的治療腎癌的藥物組合物，其特征在于，步驟(a)中，用75%乙醇 熱回流提取，合并提取液。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的治療腎癌的藥物組合物，其特征在于，所述大孔樹脂為AB-8型 大孔吸附樹脂。5. -種治療腎癌的藥，其特征在于，其中含有治療有效量的權(quán)利要求1所述的藥物組合 物和藥學(xué)上可接受的載體。
【文檔編號】C07D498/22GK105963308SQ201610387822
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月2日
【發(fā)明人】董秋月
【申請人】杭州更藍生物科技有限公司