肉桂油及其主成分桂皮醛的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供肉桂油及其主成分桂皮醛作為制備辣椒素受體TRPV1拮抗劑、或制備具有鎮(zhèn)痛作用的藥物的用途，還提供了包括有效量的桂皮醛或肉桂油的辣椒素受體TRPV1拮抗劑或具有鎮(zhèn)痛作用的藥物。本發(fā)明的肉桂油及其主成分桂皮醛作為辣椒素受體TRPV1拮抗劑,具有顯著的鎮(zhèn)痛作用，制備成本低，工藝簡單，毒副作用小，順應(yīng)市場需求。
【專利說明】
肉桂油及其主成分桂皮醛的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及藥理學(xué)領(lǐng)域，具體涉及肉桂油及其主成分桂皮醛的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 疼痛(pain)是一種復(fù)雜的生理心理活動，是臨床上最常見的癥狀之一。疼痛經(jīng)常 困擾著人們的健康和生活質(zhì)量，長期的劇烈疼痛(如癌性疼痛、頑固性疼痛等)是一種難以 忍受的折磨。1970年，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性腦啡肽、外源性嗎啡具有強大的鎮(zhèn)痛作用，此后5-羥色胺 等神經(jīng)遞質(zhì)及其相應(yīng)的受體也被報道參與控制內(nèi)源性疼痛系統(tǒng)。除非麻醉性鎮(zhèn)痛藥(如阿 司匹林）和麻醉性鎮(zhèn)痛藥（如嗎啡）等用于止痛外，一些非固醇類抗炎藥也已開始應(yīng)用。但 是，迄今仍然缺乏療效顯著和可靠、副作用少、長期使用無依賴(成癮)性的鎮(zhèn)痛藥物。
[0003] 神經(jīng)病理性疼痛是由中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)的病理損傷造成的痛覺過敏。神經(jīng)病理 性疼痛又可分為自發(fā)性或誘發(fā)性疼痛。自發(fā)性疼痛常表現(xiàn)為持續(xù)的燒灼感，也可為間斷的 刺痛、撕裂樣痛、觸電樣疼痛。糖尿病、病毒感染、神經(jīng)創(chuàng)傷以及自身免疫性疾病等都是引起 神經(jīng)病理性疼痛的病因。炎癥性疼痛是由外周的創(chuàng)傷、灼燒、低溫、免疫系統(tǒng)疾病、感染等因 素造成的神經(jīng)炎癥反應(yīng)所致。誘發(fā)性疼痛由機械、溫度或化學(xué)刺激所引發(fā)，常表現(xiàn)為痛覺過 敏。外周或中樞敏化被認(rèn)為是神經(jīng)病理性疼痛的重要機制。外周敏化是指初級傷害感受性 神經(jīng)元尤其是其外周末梢發(fā)生的超敏感化。外周神經(jīng)敏化時誘導(dǎo)初級神經(jīng)元可塑性變化， 釋放多種細(xì)胞因子和神經(jīng)遞質(zhì)，導(dǎo)致神經(jīng)元功能穩(wěn)態(tài)失衡，引起疼痛的發(fā)生。傷害性感受器 的辣椒素受體TRPV亞型I (transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)，是非選 擇性陽離子通道型受體。TRPVl主要表達(dá)在傷害性感覺神經(jīng)元，如背根神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)節(jié) 和脊髓背角。TRPVl由838個氨基酸組成，6個跨膜區(qū)，可被辣椒素、H + (pH〈6.0 )、機械、熱刺激 (>43°C )、重金屬等激活。TRPVl參與炎性痛、內(nèi)臟痛、熱痛覺過敏和癌性疼痛的發(fā)生。在完全 弗氏佐劑(CFA)致炎的動物模型，TRPVl受體表達(dá)量升高。
[0004] 肉桂是棒科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl.的干燥樹皮。肉桂油亦稱桂皮 油，為肉桂的干燥皮、葉經(jīng)水蒸氣蒸餾得到的揮發(fā)油，為黃色或棕黃色的澄清液體，有肉桂 的特異香氣，味甜，相對密度1.055-1.070，折光率1.602-1.614。肉桂油經(jīng)GC-MS分析研究證 實，其中的化學(xué)成分主要有桂皮醛、乙酸桂皮酯、水楊醛和桂皮酸等，而桂皮醛的相對含量 高達(dá)87%以上；肉桂油具有較強的揮發(fā)性，遇光和熱不穩(wěn)定，對揮發(fā)油的藥理作用有明顯影 響。桂皮醛又名肉桂醛、苯基丙烯醛等，化學(xué)名為3-苯基-2-丙烯醛，英文名為Cinnamic aldehyde;具有強烈的肉桂香氣且持久。桂皮醛難溶于水、甘油和石油醚，易溶于乙醇、乙醚 中，能隨水蒸氣揮發(fā);在強酸性或者強堿性介質(zhì)中不穩(wěn)定，易導(dǎo)致變色，在空氣中易氧化;桂 皮醛在體內(nèi)發(fā)生氧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化成桂皮酸(亦稱為肉桂酸）。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了肉桂油及其主成分桂皮醛的應(yīng)用，作為辣椒素受體TRPVl拮抗劑，具 有顯著的鎮(zhèn)痛作用，制備成本低，工藝簡單，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0006] 本發(fā)明的一個方面，提供肉桂油和/或其主成分桂皮醛作為制備辣椒素受體TRPVl 拮抗劑的用途。
[0007] 本發(fā)明的再一個方面，提供肉桂油和/或其主成分桂皮醛作為制備具有鎮(zhèn)痛作用 的藥物的用途。
[0008] 以上所述的用途，其中，所述鎮(zhèn)痛作用包括對內(nèi)臟痛、炎性痛及痛經(jīng)的鎮(zhèn)痛作用。
[0009] 本發(fā)明的又一個方面，提供一種辣椒素受體TRPVl拮抗劑或具有鎮(zhèn)痛作用的藥物， 其中，包括有效量的桂皮醛和/或肉桂油。
[0010] 以上所述的拮抗劑或藥物，其中，劑型為注射劑、片劑、散劑、顆粒劑、丸劑、膠囊、 口服液、膏劑、乳液、納米劑、霜劑或噴劑。
[0011] 以上所述的拮抗劑或藥物，其中，包括一種或一種以上藥學(xué)上可接受的輔料。
[0012] 以上所述的拮抗劑或藥物，其中，所述輔料包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的賦形劑、填充劑、 粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑或緩釋劑。
[0013] 以上任一所述的肉桂油的制備方法，包括如下步驟：
[0014] 取肉桂的干燥嫩枝，加入肉桂的干燥嫩枝重量2-6%的乙酸乙酯后進(jìn)行蒸餾，棄去 乙酸乙酯層，獲得的揮發(fā)油即所述肉桂油。
[0015] 以上任一所述的桂皮醛的制備方法，包括如下步驟：
[0016] (1)將肉桂的干燥嫩枝粉碎至20-60目；
[0017] (2)將（1)中粉碎后獲得的肉桂粉末，加入20-30倍量的蒸餾水，再加入KCl，進(jìn)行蒸 餾提取1.5-2.5h;
[0018] (3)將(2)中肉桂油-水混合液轉(zhuǎn)移至離心機中離心，棄去水層；
[0019] (4)將(3)中產(chǎn)物精餾，精餾條件為160°C，回流比：1:1，真空度:6.65kpa，通過精餾 獲得桂皮酸。
[0020] 以上制備的肉桂油的質(zhì)控方法，所述肉桂油同時滿足如下（1)至(7)的條件：
[0021] (1)所述肉桂油在乙醇或冰醋酸中易溶，相對密度為1.055~1.070,折光率為 1.602 ~1.614;
[0022] (2)將所述肉桂油冷卻至(TC，加等容的硝酸振搖后析出結(jié)晶性沉淀；
[0023] (3)薄層色譜法鑒別所述肉桂油與桂皮醛對照品在相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點；
[0024] (4)取所述肉桂油IOml，加水IOml與鹽酸1滴，振搖后，通硫化氫氣使飽和，水層與 油層均不變色；
[0025] (5)取所述肉桂油Iml，加70 %乙醇3ml，搖勻，現(xiàn)澄清液體；
[0026] (6)色譜檢測：以交聯(lián)5%苯基甲基聚硅氧烷為固定相的毛細(xì)管柱，柱溫為程序升 溫，初始溫度為100°C，以每分鐘5°C的速率升溫至150°C，保持5min，再以每分鐘5°C的速率 升溫至200°C，保持5min;進(jìn)樣口溫度為200°C ;檢測器溫度為220°C ;分流進(jìn)樣，分離比為20: 1，理論塔板數(shù)按桂皮醛計算應(yīng)不低于20000;
[0027] (7)分別精密吸取桂皮醛對照品溶液與供試品溶液各?μL，注入氣相色譜儀，測定， 所述肉桂油含桂皮醛(C 9H8O)不少于75.0%。
[0028] 以上制備的桂皮醛的質(zhì)控方法，所述桂皮醛同時滿足如下（1)和(2)的條件：
[0029] (1)色譜檢測：用5 %二苯基-95 %二甲基硅烷共聚物為固定相的毛細(xì)管色譜柱;進(jìn) 樣口溫度：230°C ;柱溫：80°C保持3min，再以20°C/min升至160°C，保持6min;檢測器溫度： 240°C ;分流進(jìn)樣測定，分流比25:1;柱溫：150°C ;載氣流速：1.0 ml/min;理論塔板數(shù)按桂皮 醛峰計算不低于30000;桂皮醛峰與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的分離度大于2;
[0030] (2)精密吸取對照品溶液及供試品溶液各2ul，注入氣相色譜儀，測定，桂皮醛含量 在6.5~9.0%之間。
[0031] 本發(fā)明在色譜檢測方法中采用的色譜柱為石英毛細(xì)管色譜柱，相比于傳統(tǒng)填充 柱，其具有柱效更高、使用壽命更長、靈敏度更高、分析速度更快的特點。
[0032] 本發(fā)明提供肉桂油及其主成分桂皮醛作為辣椒素受體TRPVl拮抗劑應(yīng)用，實驗研 究表明，肉桂油及其主成分桂皮醛對TRPVl受體具有拮抗活性，對醋酸引起的內(nèi)臟痛、甲醛 引起的炎性痛及痛經(jīng)均有顯著鎮(zhèn)痛作用，其藥學(xué)上可以制備成多種劑型，如注射劑、片劑、 散劑、顆粒劑、丸劑、膠囊、口服液、膏劑、乳液、納米劑、霜劑或噴劑等劑型，劑型多樣便于選 擇;并且肉桂油及其主成分桂皮醛原料十分豐富，價格低廉，毒副作用小，制劑成分明確、制 備工藝及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)便于控制，具有良好市場順應(yīng)性。
【具體實施方式】
[0033]以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明的【具體實施方式】進(jìn)行更加詳細(xì)的說明，以便能夠更好 地理解本發(fā)明的方案以及其各個方面的優(yōu)點。然而，以下描述的【具體實施方式】和實施例僅 是說明的目的，而不是對本發(fā)明的限制。
[0034] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0035] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0036] 實施例一肉桂油及其桂皮醛制備及質(zhì)量控制
[0037] 1.桂枝來源:產(chǎn)地廣東肇慶，購買自連云港和興堂中藥材廠，桂枝為樟科植物肉桂 的干燥嫩枝。
[0038] 2.桂枝揮發(fā)油提取制備方法
[0039]
[0040]
[0041]
[0042] 4.桂枝揮發(fā)油質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
[0043] 4. If生狀
[0044] 本實施例制備的桂枝揮發(fā)油為黃色或黃棕色的澄清液體;有肉桂的特異香氣，味 甜、辛。露置空氣中或存放日久，色漸變深，質(zhì)漸濃稠。
[0045] 本實施例制備的桂枝揮發(fā)油在乙醇或冰醋酸中易溶。
[0046] 相對密度:應(yīng)為1.055~1.070。
[0047] 折光率:應(yīng)為1.602~1.614。
[0048] 4.2鑒別
[0049] 4.2.1取本實施例制備的桂枝揮發(fā)油，冷卻至(TC，加等容的硝酸振搖后，即析出結(jié) 晶性沉淀。
[0050] 4.2.2薄層鑒別應(yīng)與桂皮醛對照品在相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點。
[0051] 4.3檢查
[0052] 4.3.1重金屬:取本實施例制備的桂枝揮發(fā)油10ml，加水IOml與鹽酸1滴，振搖后， 通硫化氫氣使飽和，水層與油層均不得變色。
[0053] 4.3.2乙醇中不溶物:取本實施例制備的桂枝揮發(fā)油Iml，加70%乙醇3ml，搖勻，應(yīng) 呈澄清液體。
[0054] 4.4含量測定
[0055] 4.4.1色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性
[0056]以交聯(lián)5%苯基甲基聚硅氧烷為固定相的毛細(xì)管柱(柱長30m，內(nèi)徑0.32mm，膜厚度 0.25μπι)，柱溫為程序升溫:初始溫度為100 °C，以每分鐘5 °C的速率升溫至150°C，保持5min， 再以每分鐘5°C的速率升溫至200°C，保持5min;進(jìn)樣口溫度為200°C ;檢測器溫度為220°C ; 分流進(jìn)樣，分離比為20:1。理論塔板數(shù)按桂皮醛計算應(yīng)不低于20000。
[0057] 4.4.2測定法
[0058]分別精密吸取桂皮醛對照品溶液與供試品溶液各?μL，注入氣相色譜儀，測定，即 得。
[0059] 本品含桂皮醛(C9H8O)不得少于75.0%。
[0060] 4.5|C 藏
[0061] 遮光，密封，置陰涼處。
[0062] 5.桂皮醛(包合物)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
[0063] 5.1色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性
[0064]用5%二苯基-95%二甲基硅烷共聚物為固定相的毛細(xì)管色譜柱（30m X 0.32mm X 0.25μπι);進(jìn)樣 口溫度：230°C ;柱溫：80°C保持3min，再以20°C/min升至160°C，保持6min;檢 測器溫度：240°C ;分流進(jìn)樣測定(分流比25:1);柱溫：150°C ;載氣流速：1.0 ml/min;理論塔 板數(shù)按桂皮醛峰計算應(yīng)不低于30000;桂皮醛峰與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的分離度應(yīng)大于2。
[0065] 5.2測定法
[0066] 精密吸取對照品溶液及供試品溶液各2ul，注入氣相色譜儀，測定，即得。
[0067] 本品含桂皮醛(C9H8O)應(yīng)為6.5~9.0%。
[0068]實施例二肉桂油及其桂皮醛對TRPVl受體拮抗作用研究
[0069]實驗?zāi)康模貉芯咳夤鹩图捌涔鹌と苯匪?Capsaicin)激動TRPVl通道Ca2+釋放 影響，研究肉桂油及其桂皮醛對TRPVl受體拮抗活性。
[0070] 1.材料
[0071] 1.1細(xì)胞:hTRPVl-HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，公眾可從中國藥科大學(xué)購買獲得。
[0072] I. 2藥物及試劑：肉桂油及其桂皮醛，由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司制備，具體制 備方法見實施例一；DMEM培養(yǎng)基（粉末，高糖），購自Gibco公司，12800-017;丙酮酸 (Pyruvate)，購自Gibco 公司，12800-017;胎牛血清(FBS)，購自Gibco 公司，10099-141;選擇 性抗生素(G418sulfate，Geneticin)，購自 Gibco公司，11811-031;多聚賴氨酸(Poly-D-lysine，PDL，27964-99_4)，購自 Sigma公司；青鏈霉素混合液（雙抗，Penicillin-Streptomycin， Li quid， 100 X )，購自Gibco公司， 15140-122 ;4_ 輕乙 基哌嗪乙橫酸 （HEPES) ， 購自美國Sigma公司，H3375-25G;二甲亞砜（Dimethyl Sulfoxide，DMS0,0231)，購自 Biosharp公司，Calcium5 Kit，Molecular Devices公司；辣椒素（Capsaicin，CAP)，購自美 國 Sigma 公司，360376-1G。
[0073] 2.方法
[0074] 2· 1藥物配制：肉桂油10mg，溶于200yLDMS0溶液中，渦旋溶解，配成50mg/mL儲備 液;稱量桂皮醛1.32mg，溶于200yLMS0溶液中，渦旋溶解，配成50mM儲備液;作為母液放入-80°C冰箱中保存。進(jìn)行細(xì)胞篩選時配成系列母液用Lock's緩沖液稀釋千分之一倍用于試 驗。
[0075] 2.20.01M PBS 緩沖液配制：稱取下列試劑：NaCl 8g，KCl 0.2g，KH2P〇4〇.24g， Na2HPO4 · 12H203.64g置于IL燒杯中，加入約800mL的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙猓渭親Cl將pH 值調(diào)至7.4，加入去離子水定容至lL，0.22μm濾膜過濾后于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0076] 2.31^〇^^'8緩沖液配制：稱取下列試劑：此口68 2.1448，他(：19.(^、1((：10.4178、 CaCl2〇 · 256g、MgCl2 · 6H2O 0.204g、葡萄糖 l.Og、甘氨酸0· 0075mg，用去離子水配制成 1000 mL，將 pH 值調(diào)至7.4。
[0077] 2.4藥物篩選:將對數(shù)生長期的hTRPVl-HEK293細(xì)胞以1.5 X IO4個/孔接種96孔板 (96 孔板預(yù)包被 Poly-D-lysine，50yl/孔，10yg/mL)，細(xì)胞接種體積 150μ1/孔，置于 37°C、5% CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)，培養(yǎng)過夜待細(xì)胞長至80 %進(jìn)行試驗。從培養(yǎng)箱中取出96孔板，吸出培 養(yǎng)基，加入70μ1/孔Calcium5進(jìn)行負(fù)載染料后放入培養(yǎng)箱中孵育45分鐘，另取出一塊96孔透 明尖底板，設(shè)置溶媒對照(DMS0的Lock' s稀釋液）、激動劑Capsaisin(DMS0的Lock' s稀釋液） 及8X各個受試藥物(Lock's緩沖液稀釋125倍），加入體積100μΙ/孔，另取出一塊96孔板，設(shè) 置溶媒對照(DMS0的Lock's稀釋液)及激動劑Capsaisin組(終濃度30ηΜ)，加入體積100μΙ/ 孔，設(shè)置雙復(fù)孔或者三復(fù)孔。45分鐘后從培養(yǎng)箱中取出負(fù)載染料的96孔板，加入Lock's緩沖 液130μ1，吸出150μ1，再加入150μ1，反復(fù)3次，最后加入lOOylLock's緩沖液，使終體積150μ 1/孔。三塊96孔板按照順序放入FLIPR TETRA高通量實時熒光成像分析儀中進(jìn)行檢測。檢測 前進(jìn)行黃板板底檢測及待測細(xì)胞板板底檢測，使待測板底值在500左右。熒光值的大小代表 細(xì)胞內(nèi)鈣離子多少。
[0078] 3.結(jié)果
[0079]與溶媒組比較，模型組熒光峰面積顯著增加（ρ〈0.01);與模型組比較，肉桂油組 (30μg/ml)、肉桂油組（15μg/ml)、桂皮醛組(30μΜ)、桂皮醛組（15μΜ)熒光峰面積顯著減少(ρ 〈0.01)。結(jié)果見表1。
[0080]表1肉桂油及其桂皮醛對TRPVl抑制活性(^bsd.n = 4)
[0082] 與溶媒組比較，p〈0 · 01;與模型組比較:林p〈0 · 01。
[0083] 實施例三肉桂油及其桂皮醛對醋酸扭體反應(yīng)影響
[0084] 研究目的:通過腹腔注射0.6 %醋酸溶液致小鼠疼痛模型，觀察肉桂油及其桂皮醛 鎮(zhèn)痛作用。
[0085] 1.材料
[0086] 1.1動物：ICR小鼠，清潔級，18_22g，雌性，購自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，質(zhì)量合格 證號：SCXK (蘇）2012-0004。
[0087] 1.2藥物與試劑
[0088]肉桂油及其桂皮醛，由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司制備，具體制備方法見實施例 ，
[0089]布洛芬緩釋膠囊：中美天津史克制藥有限公司，規(guī)格:0.3g/粒，批號：1409081; [0090] 冰醋酸(AR):廣州市南駿貿(mào)易有限公司，批號：150121;
[0091]乙醇，南京化學(xué)試劑有限公司，批號：13051510689;
[0092]羧甲基纖維素鈉 (CMC-Na)，中國醫(yī)藥(集團）上?；瘜W(xué)試劑公司，批號:20140720。 [0093] 2.方法
[0094] 60只雌性小鼠隨機分成6組，每組10只，即模型組、陽性組(布洛芬，100mg/kg )、肉 桂油組(30mg/kg)、肉桂油組（15mg/kg)、桂皮醛組(30mg/kg)、桂皮醛組（15mg/kg)。各給藥 組灌胃給予相應(yīng)藥物，模型組灌胃給予0.5%CMC-Na，給藥體積均為20ml/kg。每日1次，連續(xù) 5日，末次灌胃給藥Ih后，各鼠腹部注射0.6%醋酸溶液，0.4ml/只，觀察記錄注射后25min內(nèi) 小鼠扭體次數(shù)(腹部內(nèi)凹、伸展后肢、臀部抬高），計算各組抑制率百分率（％)。
[0095] 抑制率百分率（％ )=(模型組扭體次數(shù)平均值-各給藥組扭體次數(shù)平均值)/模型 組扭體次數(shù)平均值X 100%。
[0096] 3.結(jié)果
[0097] 與模型組比較，陽性組(布洛芬，100mg/kg)、肉桂油組(30mg/kg)、肉桂油組（15mg/ kg)、桂皮醛組（30mg/kg)、桂皮醛組（15mg/kg)均能顯著減少小鼠扭體反應(yīng)（p〈0.01，p〈 0.05)。結(jié)果見表2。
[0098]表2肉桂油及其桂皮醛對醋酸致小鼠扭疼痛模型影響(：士sd，n = 10)
L0100J 與模型組比較:*p〈0 · 05，#p〈0 · Ol。
[0101] 實施例四肉桂油及其桂皮醛對催產(chǎn)素引起小鼠痛經(jīng)影響
[0102] 實驗?zāi)康模和ㄟ^腹腔注射縮宮素注射液致小鼠痛經(jīng)模型，觀察肉桂油及其桂皮醛 對催產(chǎn)素引起小鼠痛經(jīng)影響。
[0103] 1.材料
[0104] 1.1動物：ICR小鼠，清潔級，18-22g，雌性，購自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，質(zhì)量合格 證號：SCXK (蘇）2012-0004。
[0105] 1.2藥物與試劑
[0106] 肉桂油及其桂皮醛，由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司制備，具體制備方法見實施例 ，
[0107] 布洛芬緩釋膠囊：中美天津史克制藥有限公司，規(guī)格:0.3g/粒，批號：1409081;苯 甲酸雌二醇注射液:寧波第二激素廠，規(guī)格:2ml: 4mg，批號：150202;
[0108] 縮宮素注射液:上海禾豐制藥有限公司，規(guī)格:Iml: IOIU，批號：141212;
[0109] 生理鹽水：山東長富潔晶藥業(yè)有限公司，批號：150229;
[0110]乙醇，南京化學(xué)試劑有限公司，批號：13051510689;
[0111] 羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，中國醫(yī)藥(集團）上?；瘜W(xué)試劑公司，批號:20140720。
[0112] 2.方法
[0113] 70只雌性小鼠隨機分成7組，每組10只，即正常組、模型組、陽性組(布洛芬，IOOmg/ kg)、肉桂油組(30mg/kg)、肉桂油組（15mg/kg)、桂皮醛組(30mg/kg)、桂皮醛組（15mg/kg)。 正常組小鼠背部皮下注射生理鹽水，連續(xù)l〇d，第1天、第10天注射0.05ml/只，其余日 0.025ml/只；其余6組各鼠背部皮下注射苯甲酸雌二醇注射液，連續(xù)10天，第UlOd注射 0.05ml/0.1 mg/只，其余日0.025ml/0.05mg/只。正常組和模型組于皮下注射生理鹽水第4d 灌胃給予0.5%CMC-Na;陽性2組、藥物1組、藥物2組和藥物3組于皮下注射苯甲酸雌二醇注 射液第4d灌胃給予相應(yīng)藥物，陽性1組與皮下注射苯甲酸雌二醇注射液第8d灌胃給予相應(yīng) 藥物，給藥體積均為20ml/kg。末次灌胃Ih后，各鼠腹部注射縮宮素注射液0.2ml/2IU/只。觀 察注射縮宮素注射液后30min內(nèi)扭體次數(shù)(腹部內(nèi)凹、伸展后肢、臀部抬高），計算各組抑制 率百分率（％)。
[0114] 抑制率百分率（％ )=(模型組扭體次數(shù)平均值-各給藥組扭體次數(shù)平均值)/模型 組扭體次數(shù)平均值X 100%。
[0115] 3.結(jié)果
[0116] 與正常組比較，模型組小鼠能產(chǎn)生明顯的扭體反應(yīng)；與模型組比較，陽性組(布洛 芬，100mg/kg)、肉桂油組(30mg/kg)、肉桂油組（15mg/kg)、桂皮醛組（30mg/kg)、桂皮醛組 (15mg/kg)扭體次數(shù)顯著減少。結(jié)果見表3。
[0117] 表3肉桂油及其桂皮醛對對縮宮素致小鼠痛經(jīng)模型影響士 Sd，n = 10)
[0119] 與正常組比較:##ρ〈0·01;與模型組比較:林ρ〈0·01。
[0120] 實施例五肉桂油及其桂皮醛對福爾馬林致小鼠炎性痛影響
[0121] 研究目的:通過足底皮下注射5%福爾馬林溶液致小鼠疼痛模型，觀察肉桂油及其 桂皮醛鎮(zhèn)痛作用。
[0122] 1.材料
[0123] 1.1動物：ICR小鼠，清潔級，18_22g，雌性，購自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，質(zhì)量合格 證號：SCXK (蘇）2012-0004。
[0124] 1.2藥物與試劑
[0125] 肉桂油及其桂皮醛，由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司制備，具體制備方法見實施例 ，
[0126] 布洛芬緩釋膠囊，中美天津史克制藥有限公司，規(guī)格:0.3g/粒，批號：1409081;
[0127] 甲醛，南京化學(xué)試劑有限公司，批號：12062011019;
[0128] 乙醇，南京化學(xué)試劑有限公司，批號：13051510689;
[0129] 羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，中國醫(yī)藥(集團）上海化學(xué)試劑公司，批號:20140720。
[0130] 2.方法
[0131] 60只雄性小鼠隨機分成6組，每組10只，即模型組、陽性組(布洛芬，100mg/kg)、肉 桂油組(30mg/kg)、肉桂油組（15mg/kg)、桂皮醛組(30mg/kg)、桂皮醛組（15mg/kg)。各給藥 組灌胃給予相應(yīng)藥物，模型組灌胃給予0.5%CMC-Na，給藥體積均為20ml/kg。每日1次，連續(xù) 5日，末次灌胃給藥Ih后，各鼠右后足足跖底部注射5%福爾馬林溶液，20μ1/只，注射后立即 計時，分別記錄小鼠在注射后I相(O-IOmin)及Π相（10-60min)兩個時相內(nèi)舔、咬右后足的 累計時間。
[0132] 3.結(jié)果
[0133] 與模型組比較，陽性組(布洛芬，100mg/kg)、肉桂油組(30mg/kg)、肉桂油組（15mg/ kg)、桂皮醛組(30mg/kg)、桂皮醛組（15mg/kg)對Π相疼痛反應(yīng)均有非常顯著的抑制作用(p 〈0.01)。結(jié)果提示肉桂油、桂皮醛對甲醛致痛模型有一定的鎮(zhèn)痛作用，具有一定外周鎮(zhèn)痛作 用。結(jié)果見表4。
[0134]表4肉桂油及其桂皮醛對福爾馬林致小鼠炎性痛影響G±Sd，n = 10)
[0136] 與模型組比較:林ρ〈0·01。
[0137] 實施例六小鼠毒性實驗
[0138] 1、實驗材料
[0139] 6-8周齡雄性小鼠，130只，體重18~22g克，購自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，質(zhì)量合格 證號：SCXK (蘇）2012-0004。
[0140] 2、實驗方法
[0141] 1)藥物的配制
[0142] 肉桂油及桂皮醛用無水乙醇溶解(濃度不超過1%)，用0.5%CMC_Na配制所需的系 列濃度。
[0143] 2) LD5Q 測定
[0144] 取體重ICR小鼠130只，按體重隨機分為13個劑量組，每組10只，雌雄各半。其中第 13組為對照組，給予0.5%CMC-Na，1-6組給予不同劑量的肉桂油，組間比值按照1:0.8遞減 稀釋成系列濃度藥液，最大劑量組的藥液濃度為8g/k g<37-12組給予不同劑量的桂皮醛，組 間比值按照1:0.8遞減稀釋成系列濃度藥液，最大劑量組的藥液濃度為5g/kg。組均按20ml/ kg體重灌胃給藥。采用SPSS19.0分別計算小鼠半數(shù)致死量(LD 50)。
[0145] 2)評價指標(biāo)
[0146] 給藥后4小時內(nèi)連續(xù)密切觀察動物的毒性反應(yīng)情況，記錄動物死亡數(shù)目和死亡時 間。給藥后第1-14天，每日觀察一次，記錄動物是否出現(xiàn)毒性反應(yīng)，毒性癥狀及其程度，毒性 出現(xiàn)和消失的時間等，記錄動物死亡情況。
[0147] 觀察指標(biāo)包括:各組動物死亡數(shù)目、死亡時程;動物的一般狀況、皮毛與呼吸狀況、 行為步態(tài)等運動與神經(jīng)狀況、眼耳口鼻狀況、糞便、尿液等。給藥后以及觀察期死亡的動物， 立即剖檢;瀕臨死亡的動物或發(fā)現(xiàn)動物有嚴(yán)重痛苦時，出于倫理原則將其處死進(jìn)行剖檢。觀 察有無死亡發(fā)生，記錄死亡發(fā)生時間，尸檢，觀察有無異?，F(xiàn)象。
[0148] 在急性毒性試驗中，灌胃大、小鼠的毒性分級依據(jù)LD5q分為五級:LD5Q〈 lmg/kg為極 毒，LD5Q 在 l-50mg/kg 之間為劇毒，LD5Q在 51_500mg/kg 為中等毒，LD5Q在 501-5000mg/kg 之間 為低毒，大于5000mg/kg為實際無毒。
[0149] 3、實驗結(jié)果
[0150] 3.1中毒反應(yīng)情況
[0151 ] (1)中樞運動系統(tǒng):第3、9組給藥后2小時內(nèi)靜伏少動，動物出現(xiàn)昏睡，之后正常;第 1、7組持續(xù)6小時，第2、8組持續(xù)5小時;第4、5、6、10、11、12組未見此現(xiàn)象發(fā)生。（2)神經(jīng)系統(tǒng)： 第1、7組給藥后24小時內(nèi)對刺激的反應(yīng)遲鈍，之后正常;第2、8組給藥18小時內(nèi)對刺激的反 應(yīng)遲鈍，之后正常；第3、4、5、6、9、10、11、12組未見此現(xiàn)象發(fā)生。（3)呼吸系統(tǒng)：均未見分泌 物，也未見呼吸頻率和深度改變。（4)胃腸系統(tǒng):大便均為黑色固體。（5)皮膚和皮毛:給藥后 均出現(xiàn)皮毛松散，顏色發(fā)黃。第1、7組持7天后恢復(fù)正常，第2、8組持續(xù)5天后恢復(fù)正常，第3、9 組持續(xù)3天后恢復(fù)正常，第4、5、6、10、11、12組持續(xù)2天后恢復(fù)正常。
[0152] 3.2LD5q 計算結(jié)果
[0153] 肉桂油的LD5q為4.724g/kg，桂皮醛LD5q為2.937g/kg，結(jié)果見表5。
[0154]表5肉桂油及桂皮醛對小鼠毒性反應(yīng)情況
[0156] 本發(fā)明的肉桂油及其桂皮醛LD5q均在501-5000mg/kg之間，說明本發(fā)明的肉桂油及 其桂皮醛屬低毒。
[0157] 最后應(yīng)說明的是:顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并 非對實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做 出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引 申出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之中。
【主權(quán)項】
1. 肉桂油和/或其主成分桂皮醛作為制備辣椒素受體TRPV1拮抗劑的用途。2. 肉桂油和/或其主成分桂皮醛作為制備具有鎮(zhèn)痛作用的藥物的用途。3. 如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述鎮(zhèn)痛作用包括對內(nèi)臟痛、炎性痛及痛經(jīng) 的鎮(zhèn)痛作用。4. 一種辣椒素受體TRPV1拮抗劑或具有鎮(zhèn)痛作用的藥物，其特征在于，包括有效量的桂 皮醛和/或肉桂油。5. 如權(quán)利要求4所述的拮抗劑或藥物，其特征在于，劑型為注射劑、片劑、散劑、顆粒劑、 丸劑、膠囊、口服液、膏劑、乳液、納米劑、霜劑或噴劑。6. 如權(quán)利要求5所述的拮抗劑或藥物，其特征在于，包括一種或一種以上藥學(xué)上可接受 的輔料。7. 如權(quán)利要求6所述的拮抗劑或藥物，其特征在于，所述輔料包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的賦形 劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑或緩釋劑。8. 如權(quán)利要求1至3中任一所述的肉桂油的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： 取肉桂的干燥嫩枝，加入肉桂的干燥嫩枝重量2-6 %的乙酸乙酯后進(jìn)行蒸餾，棄去乙酸 乙酯層，獲得的揮發(fā)油即所述肉桂油。9. 如權(quán)利要求1至3中任一所述的桂皮醛的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 將肉桂的干燥嫩枝粉碎至20-60目； (2) 將（1)中粉碎后獲得的肉桂粉末加入20-30倍量的蒸餾水，再加入KC1，進(jìn)行蒸餾提 取1.5-2.5h; (3) 將(2)中肉桂油-水混合液轉(zhuǎn)移至離心機中離心，棄去水層； (4) 將(3)中產(chǎn)物精餾，精餾條件為160 °C，回流比：1:1，真空度:6.65kpa，通過精餾獲得 桂皮醛。10. 如權(quán)利要求8中制備的肉桂油的質(zhì)控方法，其特征在于，所述肉桂油同時滿足如下 (1)至(7)的條件： (1) 所述肉桂油在乙醇或冰醋酸中易溶，相對密度為1.055~1.070,折光率為1.602~ 1.614； (2) 將所述肉桂油冷卻至0°C，加等容的硝酸振搖后析出結(jié)晶性沉淀； (3) 薄層色譜法鑒別所述肉桂油與桂皮醛對照品在相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點； (4) 取所述肉桂油10ml，加水10ml與鹽酸1滴，振搖后，通硫化氫氣使飽和，水層與油層 均不變色； (5) 取所述肉桂油lml，加70%乙醇3ml，搖勾，現(xiàn)澄清液體； (6) 色譜檢測：以交聯(lián)5%苯基甲基聚硅氧烷為固定相的毛細(xì)管柱，柱溫為程序升溫，初 始溫度為100°C，以每分鐘5°C的速率升溫至150°C，保持5min，再以每分鐘5°C的速率升溫至 200°C，保持5min;進(jìn)樣口溫度為200°C ;檢測器溫度為220°C ;分流進(jìn)樣，分離比為20:1，理論 塔板數(shù)按桂皮醛計算應(yīng)不低于20000; (7) 分別精密吸取桂皮醛對照品溶液與供試品溶液各?μL，注入氣相色譜儀，測定，所述 肉桂油含桂皮醛不少于75.0%。11. 如權(quán)利要求8中制備的桂皮醛的質(zhì)控方法，其特征在于，所述桂皮醛同時滿足如下 (1)和(2)的條件： (1) 色譜檢測：用5%二苯基-95%二甲基硅烷共聚物為固定相的毛細(xì)管色譜柱;進(jìn)樣口 溫度：230 °C ;柱溫：80 °C保持3min，再以20 °C /min升至160 °C，保持6min;檢測器溫度：240 °C ; 分流進(jìn)樣測定，分流比25:1;柱溫：150°C ;載氣流速：1 .Oml/min;理論塔板數(shù)按桂皮醛峰計 算不低于30000;桂皮醛峰與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的分離度大于2; (2) 精密吸取對照品溶液及供試品溶液各2ul，注入氣相色譜儀，測定，桂皮醛含量在 6.5~9.0%之間。
【文檔編號】C07C45/83GK105963352SQ201610424863
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月15日
【發(fā)明人】蕭偉, 孫蘭, 宗紹波, 李家春, 周軍, 曹亮, 王振中
【申請人】江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司