梔子中抗高原缺氧疲勞活性成分的分離方法及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種梔子中抗高原缺氧疲勞活性成分的分離方法，該方法包括以下步驟：⑴將梔子果實水提后，經(jīng)過濾、濃縮、干燥，即得梔子粉；⑵將梔子粉配制成水溶液；⑶將步驟⑵所得的水溶液注入處理過的聚酰胺柱，再用蒸餾水沖洗，分別得到聚酰胺柱上樣流出液、水洗脫液；⑷將聚酰胺上樣流出液和水洗脫液合并后注入處理過的大孔樹脂柱，并經(jīng)洗脫、減壓濃縮、冷凍干燥后，即得梔子苷產(chǎn)物；⑸先用10~30%的乙醇溶液沖洗聚酰胺柱除雜，再用30~90%的乙醇溶液沖洗聚酰胺柱，得到30~90%的乙醇洗脫液，該洗脫液經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥后，即得梔子黃色素產(chǎn)物。同時，本發(fā)明該公開了該梔子黃色素的應(yīng)用。本發(fā)明簡單易行、操作方便，可工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】
梔子中抗高原缺氧疲勞活性成分的分離方法及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及中草藥有效成分的富集工藝，尤其涉及梔子中抗高原缺氧疲勞活性成 分的分離方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 平原人進(jìn)入高原后，由于高原地區(qū)空氣稀薄、大氣壓低、氧分壓低等環(huán)境因素，直 接影響機(jī)體的體力和軍事作業(yè)能力。其中，高原低氧對機(jī)體的影響最為明顯，在高原缺氧環(huán) 境下從事一定的體力或腦力勞動后，極易造成血乳酸及其它代謝物堆積，并且造成機(jī)體代 謝性酸堿紊亂，從而肌肉張力下降而導(dǎo)致疲勞現(xiàn)象的產(chǎn)生，從而表現(xiàn)出勞動能力普遍下降， 嚴(yán)重者喪失作業(yè)能力。隨著海拔高度的提升，勞動能力明顯降低。因此，積極探索具有抗疲 勞作用的藥是十分重要的，篩選有效的預(yù)防和緩解疲勞的產(chǎn)品，對于提高高原環(huán)境下機(jī)體 的體力勞動能力、緩解疲勞對于改善生活質(zhì)量、提高工作效率和軍事作業(yè)能力都有積極的 意義。
[0003] 梔子為茜草科植物梔子（ferc/e/3ia Jasffiiooic/es Ellis)的干燥成熟果實，為臨床 常用中藥。其性寒味苦，無毒，入心、肝、肺、三焦經(jīng)，具有瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒之功 效。藥理學(xué)研究表明以梔子的藥理作用廣泛，具有保肝、利膽、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抗腫瘤、降 血糖血脂等多種藥理活性，是極其重要而且具有很大開發(fā)利用價值的中藥材成分。其中梔 子主要的活性成分西紅花苷，同時也是藏藥西紅花的主要活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗動脈粥 樣硬化及調(diào)節(jié)血脂的作用，是自然界唯一的一種天然的類胡蘿卜素色素，由西紅花酸 (crocetin)與二分子龍膽二糖結(jié)合而成，包括西紅花苷-I與西紅花苷-II，具有較高的經(jīng) 濟(jì)價值，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域中。有研究表明，西紅花苷和西紅花酸具有 清除自由基及顯著地抗氧化作用，而類胡蘿卜素的藥理作用機(jī)制中，其抗氧化活性尤為重 要，且有文獻(xiàn)報道，具有清除活性氧、自由基和抗氧化作用的藥物可提高動物的耐缺氧能 力，減輕組織缺氧損傷。
[0004] 由于西紅花產(chǎn)量極低，市場價格偏高，而梔子黃色素和西紅花具有相同的活性成 分西紅花苷，因此，有必要對梔子黃色素進(jìn)行科學(xué)、有效地開發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種簡單易行的梔子中抗高原缺氧疲勞活性 成分的分離方法。
[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供該梔子中抗高原缺氧疲勞活性成分的應(yīng)用。
[0007] 為解決上述問題，本發(fā)明所述的梔子中抗高原缺氧疲勞活性成分的分離方法，包 括以下步驟： ⑴將干燥、粉碎至20~40目的梔子果實用蒸餾水煎煮提取后，經(jīng)過濾、減壓濃縮、噴霧干 燥，即得梔子粉； ⑵將所述梔子粉用25°C蒸餾水配制成20~40 mg/mL的水溶液； (3)將所述步驟⑵所得的水溶液按1.0 ~3.0倍的柱體積以1.5~15mL/min的流速注入8cm X 100 cm處理過的14~30目聚酰胺柱，再按1.0~3.0倍的柱體積以5.0~10.0 mL/min的流速 用蒸餾水沖洗聚酰胺柱，分別得到聚酰胺柱上樣流出液、水洗脫液； ⑷將聚酰胺上樣流出液和水洗脫液合并后，合并液以lOmL/min的流速全部注入處理過 的大孔樹脂柱，先按I.〇~3.0倍的柱體積以5.0~10.0 mL/min的流速用蒸餾水沖洗大孔樹脂 柱，再按2.0~10.0倍的柱體積以1.5~10.0 mL/min的流速用體積濃度為10~70%的乙醇溶液 沖洗大孔樹脂柱，得到10~70%的乙醇洗脫液，該10~70%的乙醇洗脫液經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥 后，即得梔子苷產(chǎn)物； (5)先按1.0~3.0倍的柱體積以5.0~10.0 mL mL/min的流速用體積濃度為10~30%的乙醇 溶液沖洗聚酰胺柱除雜，再按2.0~10.0倍的柱體積以1.5~10.0 mL/min的流速用體積濃度 為30~90%的乙醇溶液沖洗所述聚酰胺柱，得到30~90%的乙醇洗脫液，該30~90%的乙醇洗脫 液經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥后，即得梔子黃色素產(chǎn)物。
[0008] 所述步驟⑴中煎煮提取條件是指料液質(zhì)量比為1:8~10,溫度為90~100°C，次數(shù)為2 ~3次，每次時間為1小時。
[0009] 所述步驟⑴、所述步驟⑷和所述步驟(5)中減壓濃縮的條件均是指溫度為50t>80 cC。
[0010] 所述步驟⑴中噴霧干燥的條件是指溫度為120~140°C，單位時間進(jìn)風(fēng)量20~30 m3， 噴霧壓力0.1~〇.4MPa。
[0011] 所述步驟⑷和所述步驟(5)中冷凍干燥的條件均是指溫度為-55t>2(TC，真空度為 0.2MPa~0.5 MPa。
[0012] 所述步驟⑷中大孔樹脂柱是指D-101、HPD100、XDA-6、DM-130、DA201型大孔樹脂 中的任意一種。
[0013] 所述步驟⑶中的處理過的聚酰胺柱和所述步驟⑷中處理過的大孔樹脂柱均是指 先用體積濃度為95%的乙醇洗脫，直至乙醇洗脫液加蒸餾水不出現(xiàn)渾濁為止，再以蒸餾水洗 脫柱子至無醇味，即得。
[0014]所述步驟⑶中的處理過的聚酰胺柱的尺寸為8cmX 100 cm〇
[0015] 如上所述的梔子中抗高原缺氧疲勞活性成分的分離方法所得到的梔子黃色素作 為抗缺氧活性成分在醫(yī)藥上的應(yīng)用，其特征在于：以梔子黃色素為活性成分，配以藥用鋪料 制備成藥劑學(xué)上的任何一種劑型;或以梔子黃色素為活性成分，添加抗氧化和/或抗疲勞活 性成分組成復(fù)方，并配以藥用輔料制備成藥劑學(xué)上的任何一種劑型。
[0016] 所述劑型是指硬膠囊、軟膠囊、普通片、糖衣片、薄膜衣片、異型片、咀嚼片、泡騰 片、分散片、顆粒劑、丸劑、溶液劑、糖漿劑中的任意一種。
[0017] 如上所述的梔子中抗高原缺氧疲勞活性成分的分離方法所得到的梔子黃色素作 為抗氧化、抗疲勞功能的活性成分在制備抗氧化或抗疲勞保健品方面的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)： 1、本發(fā)明提取的梔子黃色素作為抗缺氧活性成分的藥效可以從以下4個實驗中體現(xiàn)： 實驗1梔子有效部位急性毒性實驗 ⑴實驗?zāi)康?篩選梔子有效部位毒性成分。
[0019] ⑵實驗條件:三級動物實驗室，室溫20~25°C，空調(diào)恒溫。
[0020] ⑶實驗對象:動物BalB/C小鼠90只，雌雄各半，體重20±2g，由蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī) 院動物實驗科提供，合格證號:甘肅省醫(yī)動字第1402-0201號。
[0021 ]⑷藥材與儀器:梔子水提取物，梔子多糖，梔子黃色素，梔子苷由實驗室自制，臨用 前制成0.1g/mL水溶液;4%多聚甲醛(批號：20150727北京索萊寶科技有限公司）滅菌注射用 水（四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號:M15111005)。
[0022] 光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司，E200);組織切片機(jī)（德國美康公司，HM340E); TB-718E型生物組織自動包埋機(jī)(湖北泰雅電子技術(shù)有限公司）。
[0023] (5)實驗方法 ①將50只BALB/C小鼠（雌雄各半）隨機(jī)分為空白對照組(0. lmL/lOg滅菌注射用水），梔 子水提取物（I .〇g.kg-l .d-Ι)，梔子黃色素組（I .Og.kg-1 .d-Ι)，梔子多組（I .Og.kg-1 .d-1)，梔子苷（l.〇g.kg-l.d-l)，灌胃給藥，連續(xù)5天。觀察小鼠生理現(xiàn)象、體重變化。
[0024]②將40只BALB/C小鼠（雌雄各半）隨機(jī)分為空白對照組（0.1mL/10g滅菌注射用 水），梔子苷低劑量組(0.5g. kg-1. 0-1)，梔子苷中劑量組（1.0 g. kg-1. 0-1)，梔子苷高劑量組 (2.0g.kg'Cf1)，連續(xù)5天，灌胃給藥。觀察小鼠生理現(xiàn)象、體重變化。解剖小鼠取半截小腸， 用生理鹽水沖洗干凈后，于5mL EP管中加入4mL 4%多聚甲醛固定小腸，常溫放置24h后做病 理切片，進(jìn)行HE染色。
[0025] (6)實驗結(jié)果 給藥梔子黃色素組小鼠表現(xiàn)正常，沒有任何中毒現(xiàn)象，具有安全性。
[0026] 給藥后梔子苷組小鼠精神萎靡，行動緩慢，表現(xiàn)出嚴(yán)重的拉稀現(xiàn)象，大便顏色為深 藍(lán)色，尾巴局部出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，給藥二天后，梔子苷組小鼠已出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，給藥三天后，梔 子苷組雄鼠全部死亡，雌鼠只存活1只。梔子水提取物組小鼠有輕微的拉稀現(xiàn)象。梔子水提 取物和梔子苷小鼠體重減輕，其中，梔子苷組小鼠體重變化明顯。其他組都比較正常。
[0027] 梔子苷對小鼠小腸組織病理改變的影響:HE染色結(jié)果顯示，空白組小鼠小腸組織 結(jié)構(gòu)正常，粘液分泌正常（圖1A)。梔子苷低劑量組小鼠小腸組織變化明顯，粘液分泌亢進(jìn) (圖1B)。梔子苷高劑量組小腸粘液分泌更加明顯（圖1C)。
[0028] ⑵討論 梔子黃色素主要成分是類胡蘿卜素類的藏花素(crocin)和藏花酸(crocetin)，具有保 護(hù)心肌細(xì)胞、抗動脈粥樣硬化、抗氧化、調(diào)血脂、抗凝血和抗血栓等藥理作用。上述實驗研究 發(fā)現(xiàn)梔子黃色素沒有毒副作用，安全性良好。
[0029] 梔子苷可以促進(jìn)大腸的蠕動，具有瀉下功效。梔子水提物及梔子苷口服給藥，對動 物均有顯著的瀉下作用。上述實驗結(jié)果表明梔子苷具有毒性，且毒性相當(dāng)明顯，梔子水提取 物中會含有部分梔子苷，所以小鼠也會表現(xiàn)出輕微拉稀現(xiàn)象，而梔子苷組小鼠拉稀現(xiàn)象嚴(yán) 重，小腸粘液分泌增多，體重變化明顯，死亡率極高，具有嚴(yán)重的毒性。
[0030] 實驗2梔子不同提取部位的體外抗氧化活性試驗 ⑴實驗?zāi)康?通過體外抗氧化實驗篩選梔子的抗氧化活性成分。
[0031] ⑵試劑與儀器： ①藥材與試劑 梔子，購自蘭州黃河中藥材市場，全部經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)楊錫倉主任中藥師鑒定為茜 草科植物梔子（(?TO^e/3iaJ·as?i/3oic/esEllis)的干燥成熟果實；l，l-二苯基-2-三硝基苯 肼（DPPH，Solarbio公司，批號101029108)，2,2_聯(lián)氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺 酸）二氨鹽（ABTS，Solarbio公司，批號20151104)，TRIS(Solarbio公司，批號77861)，抗壞 血酸（VC，Solarbio公司，批號50817)，焦性沒食子酸（Solarbio公司，批號20151202)，1， 10-菲啰啉（Solarbio公司，批號20150916)，乙二胺四乙酸（EDTA,Aladdin公司，批號 46631);亞硝基鐵氰化鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉，亞硝酸鈉，鐵氰化鉀，磷酸二氫鈉，鉬酸銨，硫 酸亞鐵，硫酸，硫代巴比妥酸，卵磷脂，硫代硫酸鈉，碘化鉀，30%雙氧水，三氯化鐵，乙二胺四 乙酸二鈉，三氯乙酸，磷酸鈉，過硫酸鉀，冰乙酸等均為市售分析純試劑； ②儀器 3K15型高速冷凍離心機(jī)(美國Sigma公司）；SpectraMax? i3型全自動焚光酶標(biāo)儀(美 國Molecular Devices公司）;WD-9403F型紫外-可見分光光度計（美國惠普公司）；BP210S 型電子天平(德國Sartorius公司）;DK-8A型電熱恒溫水槽(上海精宏實驗設(shè)備有限公司）； 冷凍干燥機(jī)（西班牙Telster LyoQuest-55 plus型）。實驗溫度20~25°C,空調(diào)恒溫，相對 濕度：40%~70%。
[0032]⑶實驗方法 ① DPPH自由基清除試驗 依據(jù)文獻(xiàn)，將不同質(zhì)量濃度(0.0 3~0.5mg/mL)的樣品和Vc溶液12 5yL，分別加入12 5yL 0.1 mmol /L DPPH 95%乙醇溶液中，暗處室溫反應(yīng)30min，以95%乙醇溶劑做空白對照，測 量其在波長517nm處的吸光度(Ai);測定125yL DPPH 95%乙醇溶液與125yL 95%乙醇混合 后在波517nm處的吸光度(Ao);測定125yL 95%乙醇溶液與125yL樣品溶液在波長517nm處 的吸光度(Aj)。按式(1)計算其清除率，并計算其EC 50。
[0033]清除率（％ ) = ( 1 -( Ai-Aj) /Ao) X 100 ② ABTS自由基清除試驗 將等體積的7mmol/L ABTS溶液與2.45mmol/L過硫酸鉀混合使之反應(yīng)并置于暗處12~ 16h，制備ABTS自由基。用95%乙醇將ABTS自由基溶液稀釋至其在波長734nm處吸光度為0.70 ± 0.02。將IOOyL不同質(zhì)量濃度(0.08~2.Omg/mL)樣品和Vc溶液加入3.9mL ABTS自由基溶 液中，室溫放置IOmin，測量其在波長734nm處的吸光度(Ai);測定3.9mL ABTS自由基溶液與 100yL95%乙醇混合后在波長734nm處的吸光度(Ao);測定3.9mL 95%乙醇溶液與IOOyL樣品 溶液在波長734nm處的吸光度(Aj)。按式(1)計算其清除率，并計算其EC 50。
[0034]③羥基自由基清除試驗 取0.75 mmol /L的鄰二氮菲1.0 mL，pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液2.0mL，40 yg /mL， 0.75 mmol /L的FeSOU.O mL，不同質(zhì)量濃度的樣品溶液1.0mL，0.01% H2O2 I. 0 mL(新鮮 配制），混合后在37°C水浴中反應(yīng)60 min后在520 nm處測定吸光度As?？瞻捉M以1.0 mL蒸 餾水代替樣品測定吸光度Ao,對照組以I.OmL蒸餾水代替H2O2和樣品測定光密度A。，用 4. OmL蒸餾水和2. OmL磷酸鹽緩沖溶液調(diào)零。按式(2)計算其清除率，并計算其EC50。
[0035]清除率(％)=(As-Ao)/(Ac- A0) ④抗脂質(zhì)過氧化試驗 將300 mg卵磷脂溶解于30 mL 10 mmol/L、pH=7.40的磷酸鹽緩沖溶液中，冰浴震蕩，制 得卵磷脂溶液。取卵磷脂溶液0.20 mL，加入pH 7.40的磷酸緩沖溶液1.0 mL，不同濃度 (0.08~2.0mg/mL)的樣品溶液 0.50 mL，2.5 mmol /L EDTA-Fe(II) 1.0 mL，混勻后于37 °C水浴中反應(yīng)45 min，再加入28% ( m /V)的三氯乙酸2.0 mL，l% ( m /V)的硫代巴比妥 酸1.0 mL，混勾后置于100 °C沸水浴中加熱10 min，冷卻后在523nm處測定吸光度A#，用磷 酸鹽緩沖液調(diào)零，空白管用磷酸鹽緩沖液代替樣品測光密度Ao。根據(jù)式(3)計算相應(yīng)的抑制 率并與V。進(jìn)行比較。
[0036]抑制率(％)=(Ao-A#)/ Ao ⑤總還原能力的測定 將不同質(zhì)量濃度的樣品溶液（0.25~10.0 mg/mL ) 1.0 mL，加入2.5 mL pH =6.6的 磷酸鹽緩沖液，2.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液，得混合溶液，置于50°C水浴保溫20 min，再加入 2. 5 mL10%三氯乙酸溶液，將所得混合溶液離心（3 000 ι··η?η-1，10 min)，傾取上清液， 精密吸取2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%的三氯化鐵溶液，在700 nm處檢測吸 光度A并與V。進(jìn)行比較。
[0037]⑥總抗氧化能力的測定 將不同質(zhì)量濃度的樣品溶液(0.08~2.0 mg/mL) 0.1 mL，加入1.0 mL試劑溶液(試劑 溶液中包括〇. 6mol/L的硫酸，28 mmol/L的磷酸鈉，4mmol/L的鉬酸銨）?；旌弦褐糜?5°C水 浴孵育90 min。放冷至室溫，以蒸餾水為空白，于波長695 nm處測吸光度A并與Vc進(jìn)行比較。
[0038] ⑷梔子不同提取部位體外抗氧化結(jié)果 ①梔子不同提取部位對DPPH自由基的清除作用 由圖2可知，梔子的不同提取部位對DPPH自由基的清除能力存在明顯差異，Vc、梔子黃 色素和梔子粗提物具有明顯的清除自由基的能力。其中，Vc和梔子黃色素對DPPH自由基的 清除作用顯著，且隨著濃度的增加，梔子黃色素對DPPH自由基的清除作用增強(qiáng)，在0.03-0.5mg/mL濃度范圍內(nèi)呈明顯的量效關(guān)系，計算得出梔子黃色素對DPPH自由基的IC 5q為0.188 mg/mL。梔子苷和多糖對DPPH自由基的清除能力相當(dāng)，活性較小。
[0039] ②梔子不同提取部位對ABTS自由基的清除作用 由圖3可知，梔子的不同提取部位對ABTS自由基的清除能力存在明顯差異，Vc、梔子黃 色素和梔子粗提物具有明顯的清除自由基的能力。其中，Vc和梔子黃色素對ABTS自由基的 清除作用顯著，Vc的清除能力顯著高于梔子各提取物。且隨著濃度的增加，Vc、梔子黃色素 和梔子粗提物對ABTS自由基的清除作用增強(qiáng)，在0.08~2.Omg/mL濃度范圍內(nèi)呈明顯的量效 關(guān)系，計算得出Vc、梔子黃色素對ABTS自由基的IC 5q分別為0.078 mg/mL、0.510 mg/mL。梔子 苷和多糖部分對ABTS自由基的清除能力均較弱，且隨著濃度的增加沒有顯著變化。
[0040] ③梔子不同提取部位對羥基自由基的清除作用 由圖4可知，梔子的不同提取部位均表現(xiàn)出對羥基自由基的不同程度的清除能力，Vc、 梔子黃色素和梔子粗提物具有明顯的清除羥基自由基的能力。其中，梔子黃色素和梔子粗 提物對羥基自由基有明顯的清除作用，Vc的清除能力顯著高于梔子各提取物。且隨著濃度 的增加，梔子黃色素和梔子粗提物對羥基自由基的清除作用增強(qiáng)，在0.09~0.5mg/mL濃度 范圍內(nèi)呈明顯的量效關(guān)系，計算得出梔子黃色素和梔子粗提物對羥基自由基的IC 5Q分別為 0.198mg/mL、0.327mg/mL。梔子苷和多糖部分對羥基自由基的清除能力均較弱，且隨著濃度 的增加沒有顯著變化。
[0041 ]④梔子不同提取部位對脂質(zhì)過氧化的抑制作用 由圖5可知，梔子的不同提取部位均表現(xiàn)出不同程度的抗脂質(zhì)過氧化的能力，在相同濃 度范圍0.08~2. Omg/mL內(nèi)，梔子黃色素的抗脂質(zhì)過氧化能力最強(qiáng)且明顯高于梔子粗提物， 且隨濃度的增大，其抗脂質(zhì)過氧化能力逐漸增強(qiáng)。梔子苷和多糖類成分的脂質(zhì)抗氧化能力 最弱且明顯低于梔子黃色素和梔子粗提物，濃度增大時，二者的抗脂質(zhì)過氧化能力隨濃度 增加沒有明顯變化。
[0042]⑤梔子不同提取部位總還原能力的測定 各物質(zhì)的還原能力在一定程度上反應(yīng)了其抗氧化活性，鐵氰化鉀被抗氧化物質(zhì)還原成 亞鐵氰化鉀，亞鐵氰化鉀與三價鐵離子生成的物質(zhì)在700nm處有最大吸收峰。吸光度越大物 質(zhì)的還原能力越強(qiáng)。如圖6,在相同濃度范圍0.25~10.0 mg/mL內(nèi)，梔子各提取部位隨濃度 的增大吸光度提高，其中，梔子黃色素和梔子粗提物的吸光度值隨濃度的增大而明顯增大， 梔子黃色素尤為顯著，與Vc作用趨勢相近。
[0043]⑥梔子不同提取部位總抗氧化能力的測定 如圖7,梔子各提取部位和Vc在相同濃度范圍0.08~2.0 mg/mL內(nèi)，在695nm下測定總抗 氧化能力得到的吸光度隨著濃度的增大而升高。其中，梔子黃色素的作用趨勢比較明顯，梔 子苷和多糖類成分的吸光度值幾乎不隨濃度的增加而改變。
[0044] (5)結(jié)論： 本實驗對梔子各提取物體外清除DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基的能力及脂質(zhì) 過氧化抑制能力、總還原能力、總抗氧化能力進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，梔子各提取物對DPPH 自由基、ABTS自由基、羥基自由基及脂質(zhì)過氧化抑制能力、總還原能力、總抗氧化能力均表 現(xiàn)出一定的抗氧化能力，且相關(guān)性基本一致，其中梔子黃色素對DPPH自由基、ABTS自由基、 羥基自由基的IC5Q分別為0· 188 mg/mL、0.510 mg/mL、0.198mg/mL，并且具有一定的脂質(zhì)過 氧化抑制能力、還原能力和總抗氧化能力，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著梔子黃色素濃度的增 加，其抗氧化活性增強(qiáng)。因此梔子黃色素可以有效地清除自由基，具有良好的抗氧還能力。
[0045] 實驗3小鼠常壓密閉實驗 ⑴實驗?zāi)康?通過小鼠常壓密閉實驗篩選梔子有效部位抗缺氧活性成分。
[0046] ⑵實驗條件:三級動物實驗室，室溫20~25°C，空調(diào)恒溫。
[0047] ⑶實驗對象：動物BalB/C小鼠60只，體重20±2g，由蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院動物實 驗科提供，合格證號:甘肅省醫(yī)動字第1402-0201號。
[0048]⑷藥材與儀器:梔子水提取物，梔子多糖，梔子黃色素，梔子苷由實驗室自制，臨用 前制成0.05g/mL水溶液。紅景天膠囊（中國人民解放軍西藏軍區(qū)紅景天研制中心，批號： 130604)臨用前制成0.05g/mL。滅菌注射用水（四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號： M15111005)。
[0049]電熱鼓風(fēng)干燥箱（101A，上海實驗儀器廠）;BP210S電子天平(德國Sartorius公 司）。
[0050] (5)實驗方法 ①將60只BALB/C小鼠（雌雄各半）隨機(jī)分為空白對照組(0.1mL/10g蒸餾水），紅景天組 (O.Sg.kg'cf1)梔子乙醇提取物組(O.Sg.kg'cf1)，梔子黃色素組(O.Sg.kg'cf 1)，梔子多 糖組(0.5g. kg' Cf1)，梔子苷組(0.5g. kg義Cf1)，灌胃給藥，連續(xù)5天。末次給藥Ih后將小鼠 放入盛有5 g鈉石灰(吸收二氧化碳和水)的200 mL磨口廣口瓶內(nèi)，每瓶放1只小鼠，并且用 凡士林涂抹瓶口，蓋嚴(yán)防止漏氣，立即計時。以小鼠呼吸停止（小鼠胸部不起伏）時間為指 標(biāo)，觀察小鼠因缺氧而死亡的時間。
[0051 ]②將60只BALB/C小鼠（雌雄各半）隨機(jī)分為空白對照組(0.1mL/10g蒸餾水），模型 組(0.11^/1(^蒸餾水），紅景天組（1.(^.1^1.(14)，梔子黃色素低劑量組（（0.258.1^ 1.(1^1)， 梔子黃色素中劑量組（(0.5g. kg'Cf1)，梔子黃色素高劑量組(1.0 g. kg'Cf1)，灌胃給藥，連 續(xù)5天。末次給藥Ih后將小鼠放入盛有5 g鈉石灰的200 mL磨口廣口瓶內(nèi)，每瓶放1只小鼠， 用凡士林涂抹瓶口，蓋嚴(yán)防止漏氣，立即計時。以小鼠呼吸停止(小鼠胸部不起伏)時間為指 標(biāo)，觀察小鼠因缺氧而死亡的時間。取腦組織和肺組織測定濕質(zhì)量，并與55°C電熱鼓風(fēng)干燥 箱中干燥3天，測腦組織和肺組織的干質(zhì)量，通過公式(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量X 100計算 腦肺組織含水量。
[0052] (6)實驗結(jié)果 ① 梔子有效部位對常壓密閉小鼠抗缺氧時間的影響與空白組(NG)比較，抗缺氧時間增 長，梔子黃色素組（Crocin)小鼠抗缺氧時間明顯增加 （P〈0.01)。與陽性藥紅景天組 (Rhodiola)比較，梔子黃色素組(crocin)小鼠抗缺氧時間明顯增加。結(jié)果見表1: 表1梔子有效部位各組小鼠常壓密閉抗缺氧時間（s，n= 10) Tab. I The time of mice sustaining anoxia at common atmosphere in each group of the effective-part of GardeniaC無土 J，/?= 10)
注:*p〈0.05，**p〈0.01，給藥組vs空白組D
[0053] Note: *ρ〈0·05,**ρ〈0·01,medicated group compared with NG ② 梔子黃色素低中高各劑量組(Crocin-L，Crocin-M，Crocin-H)小鼠常壓密閉抗缺氧 時間與模型組相比有所增加，梔子黃色素高劑量組(Crocin-H)與模型組(MG)抗缺氧時間相 比具有顯著性(P〈〇. 05)。結(jié)果見表2: 表2梔子黃色素各組小鼠常壓密閉抗缺氧時間/2=10) Tab. 2 The time of mice sustaining anoxia at common atmosphere in each group of crocin (5，/]=l〇)
注:*p〈0 · 05，**p〈0 · Ol，給藥組vs模型組。
[0054] Note:Note: *p<0.05,**p<0.01,medicated group compared with NG ③梔子黃色素(Crocin)對小鼠肺組織和腦組織含水量的影響：與空白組比較，模型組 (MG)小鼠肺組織含水量明顯增加(P〈0.01)，腦組織含水量也明顯增加(P〈0.05)。紅景天組 (Rhodi 〇 la)和梔子黃色素低中高各組(Crocin-L ,Crocin-M ,Crocin-H)小鼠肺組織和腦組 織含水量與模型組相比明顯減少(P〈〇. 05或P〈0.01)，與空白組(NG)相比無明顯變化。結(jié)果 見表3: 表3梔子黃色素對小鼠肺組織和腦組織含水量的影響（X± s，/3= 10) Tab. 3 Effect of Crocin on the water content of lung and brain in mice (x ±s, n=10)
注：，<0·01，*Ρ<0·05模型組vs空白對照組;## P<0.01，# P<0.05,給藥組vs模型 組。
[0055] Note： **P<0.01 ,*P<0.05,MG compared with NG group;P<0.01 P<0.05, medicated group compared with NG group (7)討論 組織缺血缺氧主要表現(xiàn)為細(xì)胞氧化過程障礙、能量生成不足、無氧代謝產(chǎn)物蓄積、細(xì) 胞功能紊亂、甚至細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變。常壓缺氧為非特異性缺氧，小鼠在密閉容器中受缺氧因素 損害，主要反映在心和腦缺氧。有研究報道反式西紅花酸鈉鹽能降低急性缺氧大鼠死亡率， 表明西紅花酸能夠提尚動物的耐缺氧能力。紅景天有抗缺氧的作用，能明顯提尚小鼠心 肌的耐缺氧能力。本實驗以紅景天作為陽性藥，研究梔子黃色素(Crocin)抗缺氧活性，結(jié)果 表明：梔子黃色素(Crocin)對小鼠常壓缺氧條件的存活時間有顯著的延長作用。缺氧引起 肺動脈壓增高和血流動力學(xué)的改變;炎癥介質(zhì)會導(dǎo)致血管內(nèi)皮受損，通透性升高，大量液體 進(jìn)入肺間質(zhì)，而進(jìn)入肺間質(zhì)的液體不能被有效吸收后會進(jìn)入肺泡，從而形成肺泡性肺水腫。 缺氧可以引起血腦屏障（BBB)通透性增加，而BBB通透性增加會應(yīng)發(fā)血管性腦水腫。本實驗 研究發(fā)現(xiàn)梔子黃色素(Crocin)能顯著減輕常壓密閉小鼠肺組織和腦組織含水量，即能減輕 腦水腫和肺水腫。
[0056]實驗4低壓低氧環(huán)境下小鼠力竭游泳實驗 ⑴實驗?zāi)康?通過模擬低壓低氧環(huán)境研究梔子黃色素的抗疲勞活性。
[0057] ⑵實驗條件:三級動物實驗室，室溫20~25°C，空調(diào)恒溫，相對濕度：40%~70%。
[0058] ⑶實驗對象：動物BalB/C小鼠60只，體重20±2g，由蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院動物實 驗科提供，合格證號:甘肅省醫(yī)動字第1402-0201號。
[0059]⑷試劑與儀器： ①試劑:紅景天膠囊（中國人民解放軍西藏軍區(qū)紅景天研制中心，批號：130604);大孔 吸附樹脂(D101凈品型，天津市海光化工有限公司，批號：070305); 75%乙醇（山東利爾康 消毒科技股份有限公司，批號：130619);0(測試盒(生產(chǎn)批號：20151201)、肝/肌糖原試劑盒 (生產(chǎn)批號：20151202)、超微量ATP(Na+K+)測試盒(生產(chǎn)批號：20151203)、超微量ATP(生產(chǎn) 批號：Ca 2+Mg2+)、測試盒（生產(chǎn)批號：20151203)、琥珀酸脫氫酶（生產(chǎn)批號：SDH)測試盒 (20151203)、丙酮酸激酶(PK)試劑盒(生產(chǎn)批號:20151203)、丙二醛(生產(chǎn)批號:MDA)測試盒 (20151202)、還原型谷胱甘肽(GSH)試劑盒(生產(chǎn)批號：20151203)、丙酮酸試劑盒(生產(chǎn)批 號：2015 1203)、考馬斯亮蘭（生產(chǎn)批號：2015 12 18)、SOD試劑盒（測總）（生產(chǎn)批號： 20151130)、BCA測定試劑盒（生產(chǎn)批號：20151203)、乳酸脫氫酶（LDH)測試盒（生產(chǎn)批號： 20151006)、乳酸(LD)測試盒(生產(chǎn)批號：20151014)均由南京建成生物技術(shù)研究所提供；10 XI 3BS(批號：20140807)購自北京索萊寶科技有限公司。電熱鼓風(fēng)干燥箱（IOlA，上海實驗儀 器廠）；BP210S電子天平(德國Sartorius公司）。
[0060]②儀器:DYC-9070型模擬高原低壓低氧動物實驗艙(貴州風(fēng)雷航空軍械有限責(zé)任 公司）；3K15型高速冷凍離心機(jī)(美國Sigma公司）；SpectraMax ? i3型全自動焚光酶標(biāo) 儀(美國Molecular Devices公司）；動物全血細(xì)胞分析儀(XT_2000i，日本希森美康）； WD-9403F型紫外-可見分光光度計（美國惠普公司）；BP210S型電子天平(德國Sartorius 公司）；DK-8A型電熱恒溫水槽(上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；TB-718E型生物組織自動包 埋機(jī)(湖北泰雅電子技術(shù)有限公司）；E200型光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）；HM340E型組 織切片機(jī)（德國美康公司）；電動勻漿器（PolytronOPT 1200E，Kinematica AG公司），冷 凍干燥機(jī)（西班牙 Telster LyoQuest-55 plus型）。
[0061 ] (5)實驗方法 ①小鼠力竭游泳時間檢測 72只BALB/C小鼠，隨機(jī)分為6組，即常氧對照組，模型組、紅景天膠囊陽性對照組及梔子 黃色素低、中、高劑量組，每組12只。常氧對照組及模型組灌胃滅菌注射用水(0.2mL/20g)， 剩余各組分別灌胃給予相應(yīng)試藥。除常氧對照組外其余各組均置于大型低壓氧艙中模擬海 拔800〇111高原環(huán)境(艙內(nèi)壓力：35.9 1^:^，氧分壓:7.4 1^:^)，每天上午9:00以1〇1]1'8-1流速 下降至4000 m(艙內(nèi)壓力：62.1 kPa，氧分壓：13.8 kPa)，實驗人員進(jìn)艙，在艙里灌胃給藥， 換水食和墊料，連續(xù)5 d，每天給藥完畢后，將艙內(nèi)高度以10 πτ?Γ1的流速勻速上升到預(yù)定海 撥8000 m，在此期間動物自由攝食及進(jìn)水。常氧對照組大鼠于動物房同時飼養(yǎng)。末次給藥1 h后，在海拔4000 m實驗，以小鼠體質(zhì)量7%的負(fù)荷(鉛絲）系于1/3尾巴處，放入水深18 cm的 水槽(50 cmX40 cmX30 cm)中，水溫控制在(25±1)°C，進(jìn)行負(fù)重游泳，記錄小鼠從放入水 槽至小鼠沉入水7 s未能浮在水面上的時間，即為小鼠力竭游泳時間。
[0062]②小鼠血清水平檢測 力竭游泳后，立即取出，摘眼球取血，靜置I h后3500 r/min離心10 min，分離得到血 清。
[0063] ③血常規(guī) 取20 μL EDTA抗凝血，加入180 μL血液稀釋液后，在動物全血細(xì)胞分析儀上檢測血常 規(guī)指標(biāo)。
[0064]④小鼠肌肉及肝組織活性檢測 頸椎脫臼處死后，取兩后肢的股四頭肌及肝臟，用冰生理鹽水洗凈擦干，稱取140-150mg組織，冷的PBS制成10%勾衆(zhòng)，3500 r/min離心10 min,取上清液。
[0065] ⑤統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。結(jié)果以表示，組間比較采用方差分 析和t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0066] (6)動物實驗結(jié)果 ①各組小鼠游泳力竭時間檢測 與常氧對照組比較，紅景天膠囊組及梔子黃色素低、中、高劑量組能顯著的延長小鼠力 竭游泳時間，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<〇.01或P<〇.05)。各組小鼠力竭游泳時間見表4。
[0067] 表4小鼠力竭游泳時間結(jié)果(尤± :?，/3=12)
注：，<0·01，*Ρ<0·05模型組vs空白對照組;## Ρ<0·01，# Ρ<0·05,模型組vs給藥 組。
[0068] ②各組小鼠代謝產(chǎn)物檢測與常氧組比較，缺氧模型組小鼠血尿素氮的含量顯著 的升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Ρ<〇.05)。與缺氧模型組比較紅景天膠囊組及梔子黃色素 高、中劑量組能顯著降低血尿素氮的含量，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Ρ<〇.05);與常氧組比較， 模型組小鼠肝臟、肌肉及血清中的丙酮酸含量顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Ρ<〇.05)。 與缺氧模型組比較，紅景天膠囊組及梔子黃色素高劑量組能顯著的提高肝臟、肌肉及血清 中丙酮酸的含量，梔子黃色素中劑量組也能提高血清中丙酮酸的含量，差異具有統(tǒng)計學(xué)意 義(Ρ<0.05);與常氧組比較，缺氧模型組小鼠肝臟、肌肉及血清中乳酸含量顯著升高，差異 具有統(tǒng)計學(xué)意義(Ρ<〇. 01或Ρ<〇. 05)。與缺氧模型組比較，紅景天膠囊組及梔子黃色素高 劑量組能顯著降低小鼠肝臟、肌肉及血清中乳酸含量，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<〇.〇lSP< 0.05)梔子黃色素中、低劑量組也能降低血清中乳酸的含量，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.01)。各組小鼠肝臟、肌肉、血清中BUN、丙酮酸及LD的檢測結(jié)果見表5: 表5各組小鼠肝臟、肌肉、血清中BUN、丙酮酸及LD的檢測(IiU= 12)
注：，<0·01，*Ρ<0·05模型組vs空白對照組;## Ρ<0·01，# Ρ<0·05,模型組vs給藥 組。
[0069] ③各組小鼠氧化指標(biāo)檢測與常氧組比較，缺氧模型組小鼠肝臟、肌肉中GSH顯著 降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Ρ<〇.01或Ρ<〇.05)。與缺氧模型組比較，紅景天膠囊組及梔子 黃色素高劑量組能顯著的提高GSH含量，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或Ρ<0.05)，梔子黃 色素中劑量組也能提高肝臟中GSH的含量，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Ρ<0.05);與常氧組比較， 缺氧模型組小鼠肝臟、肌肉中MDA含量顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Ρ<0.01)。與缺氧模 型組比較，紅景天膠囊組及梔子黃色素中、高劑量組能顯著的降低小鼠肝臟及肌肉組織中 MDA含量，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或Ρ<0.05);與常氧組比較，缺氧模型組小鼠肝臟、 肌肉及血清中SOD活性顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Ρ<0.01)。與缺氧組比較，紅景天膠 囊劑梔子黃色素高劑量組能顯著的提高小鼠肝臟、肌肉及血清中SOD活性，差異具有統(tǒng)計學(xué) 意義(P<0.01或Ρ<0.05)，且梔子黃色素中、低劑量組也能提高肝臟和肌肉中SOD的含量， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(ρ<〇.〇1或ρ<〇.〇5)。各組小鼠肝臟、肌肉、血清中GSH、MDA、SOD檢 測結(jié)果見表6。
[0070] 表6各組小鼠肝臟、肌肉、血清中GSH、MDA、SOD檢測結(jié)果
注：，<0·01，*Ρ<0·05模型組vs空白對照組;## Ρ<0·01，# Ρ<0·05,模型組vs給藥 組。
[0071 ]④各組小鼠代謝調(diào)節(jié)酶檢測 與常氧組比較，缺氧模型組小鼠肝臟、肌肉、血清中LDH活性減弱，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.01或Ρ<0.05);與缺氧模型組比較，紅景天膠囊組及梔子黃色素組高劑量組小鼠肝 臟、肌肉、血清中LDH活性增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或Ρ<0.05)，梔子黃色素中劑量 組也能提高血清中LDH的含量，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。各組小鼠肝臟、肌肉、血清 中LDH檢測結(jié)果見表7。
[0072]表7各組小鼠肝臟、肌肉、血清中LDH檢測結(jié)果
注：，<0·01，*Ρ<0·05模型組vs空白對照組;## Ρ<0·01，# Ρ<0·05,模型組vs給藥 組。
[0073]⑤各組小鼠能量代謝酶檢測 與常氧組比較，缺氧模型組小鼠肝臟、肌肉及血清中MDH、SDH、PK、Ca-Mg-ATP酶及Na-K-ATP酶活性顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Ρ<0.01)。與缺氧模型組比較，紅景天膠囊組及 梔子黃色素中、高劑量組能顯著的增強(qiáng)小鼠肌肉組織中MDH、SDH、PK、Ca-Mg-ATP酶及Na-K-ATP酶活性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或Ρ<0.05)，梔子黃色素低劑量組也能提高肌肉 中SDH、血清中PK及肝臟中Na-K-ATP酶活性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果見表8、表 9： 表8各組小鼠肝臟、肌肉、血清中MDH、SDH、PK、Ca-Mg-ATP酶及Na-K-ATP酶檢測結(jié)果
注：**Ρ<0·01，*Ρ<0·05模型組vs空白對照組;## Ρ<0·01，# Ρ<0·05,模型組vs給藥 組。
[0074] 表9各組小鼠Ca-Mg-ATP酶、Na-K-ATP及CK酶檢測結(jié)果
注：**Ρ<0·01，*Ρ<0·05模型組vs空白對照組;## Ρ<0·01，# Ρ<0·05,模型組vs給藥 組。
[0075]⑥各組小鼠儲能物質(zhì)檢測 與常氧組比較，缺氧模型組小鼠糖原含量顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Ρ<〇.01或P <0.05)。與缺氧模型組比較，紅景天膠囊組及梔子黃色素各劑量組能顯著增加糖原儲備 量，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Ρ<〇.01或Ρ<〇.05)。各組小鼠糖原檢測結(jié)果見表10。
[0076]表10各組小鼠糖原檢測結(jié)果
注：**Ρ<0·01，"Ρ<0·05模型組vs空白對照組;## Ρ<0·01，# Ρ<0·05,模型組vs給藥 組。
[0077] (7)討論： 結(jié)果表明，梔子黃色素具有良好的抗疲勞效果。梔子黃色素可以增強(qiáng)乳酸脫氫酶的活 力，減少乳酸堆積，降低BUN的濃度，可見梔子黃色素能夠減輕肌肉組織損傷，從而減少能源 物質(zhì)的消耗，延緩疲勞;肝糖原存儲量作為體內(nèi)能源物質(zhì)的評價指標(biāo)，梔子黃色素能夠通過 升高肌糖元和肝糖元水平，運(yùn)動時增加ATP的釋放，促進(jìn)能量代謝;通過減少因劇烈運(yùn)動 引起的膜結(jié)構(gòu)損傷，降低CK酶活性，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而增加運(yùn)動強(qiáng)度及運(yùn)動時間，實現(xiàn) 其抗運(yùn)動疲勞功效;SOD廣泛存在于機(jī)體細(xì)胞中，可清除體內(nèi)產(chǎn)生的過量的超氧陰離子自 由基，保護(hù)DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜免遭超氧自由基的破壞，MDA可直接反映出自由基水平，其 含量高低是組織細(xì)胞損傷的重要標(biāo)志，可知梔子黃色素在清除自由基、抗氧化方面效果顯 著，從而達(dá)到抗疲勞的效果;SDH活性的變化可反映細(xì)胞能量代謝情況，梔子黃色素能增強(qiáng) SDH和MDH活性，促進(jìn)機(jī)體有氧氧化代謝;PK是糖酵解途徑的限速酶，在酵解過程中起著 決定性作用，梔子黃色素能增加PK含量，促進(jìn)糖酵解，增加ATP，從而達(dá)到抗疲勞的效果。
[0078] 2、本發(fā)明可有效分離富集高色價梔子黃色素，同時也將梔子苷進(jìn)行了富集和純 化，從而提高了藥材的利用率，為將梔子黃色素科學(xué)、有效地開發(fā)，進(jìn)而應(yīng)用于運(yùn)動營養(yǎng)食 品領(lǐng)域奠定了基礎(chǔ)。
[0079] 3、本發(fā)明簡單易行、操作方便、安全、重復(fù)性好，可工業(yè)化生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0080]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0081 ]圖1為本發(fā)明的小鼠小腸病理切片圖。
[0082]圖2為本發(fā)明梔子不同提取部位對DPPH自由基的清除率。
[0083]圖3為本發(fā)明梔子不同提取部位對ABTS自由基的清除率。
[0084]圖4為本發(fā)明梔子不同提取部位對羥基自由基的清除率。
[0085]圖5為本發(fā)明梔子不同提取部位的脂質(zhì)抗氧化能力。
[0086]圖6為本發(fā)明梔子不同提取部位的總還原能力。
[0087]圖7為本發(fā)明梔子不同提取部位的總抗氧化能力。
【具體實施方式】
[0088]實施例1梔子中抗高原缺氧疲勞活性成分的分離方法，包括以下步驟： ⑴將干燥、粉碎至20目的梔子果實用蒸餾水煎煮提取后，經(jīng)過濾、減壓濃縮、噴霧干燥， 即得梔子粉。
[0089]其中：煎煮提取條件是指料液質(zhì)量比(g/g)為1:8,溫度為90°C，次數(shù)為2次，每次時 間為1小時。
[0090]減壓濃縮的條燥的件是指溫度為50°C。
[0091]噴霧干燥的條件是指溫度為120°C，單位時間進(jìn)風(fēng)量20 m3,噴霧壓力O.IMPa。
[0092]⑵將梔子粉用25°C蒸餾水配制成20 mg/mL的水溶液。
[0093]⑶將步驟⑵所得的水溶液按1.0倍的柱體積以1.5mL/min的流速注入處理過的14 目聚酰胺柱，再按1.0倍的柱體積以5.0 mL/min的流速用蒸餾水沖洗聚酰胺柱，分別得到聚 酰胺柱上樣流出液、水洗脫液。
[0094]其中：處理過的聚酰胺柱是指將尺寸為ScmX 100 cm的聚酰胺柱先用體積濃度為 95%的乙醇洗脫，直至乙醇洗脫液加蒸餾水不出現(xiàn)渾濁為止，再以蒸餾水洗脫柱子至無醇 味，即得。
[0095] ⑷將聚酰胺上樣流出液和水洗脫液合并后，合并液以lOmL/min的流速全部注入處 理過的大孔樹脂柱，先按1.0倍的柱體積以5.0 mL/min的流速用蒸餾水沖洗大孔樹脂柱，再 按2.0倍的柱體積以1.5 mL/min的流速用體積濃度為30%的乙醇溶液沖洗大孔樹脂柱，得到 30%的乙醇洗脫液，該30%的乙醇洗脫液經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥后，即得梔子苷產(chǎn)物。
[0096] 其中：大孔樹脂柱是指D-IOl型大孔樹脂。
[0097]減壓濃縮的條件是指溫度為50°C。
[0098] 冷凍干燥的條件是指溫度為-55°C，真空度為0.5MPa。
[0099] 處理過的大孔樹脂柱是指將大孔樹脂先用體積濃度為95%的乙醇洗脫，直至乙醇 洗脫液加蒸餾水不出現(xiàn)渾濁為止，再以蒸餾水洗脫柱子至無醇味，即得。
[0100] (5)先按1.0倍的柱體積以5.OmL mL/min的流速用體積濃度為10%的乙醇溶液沖洗 聚酰胺柱除雜，再按2.0倍的柱體積以1.5 mL/min的流速用體積濃度為75%的乙醇溶液沖洗 所述聚酰胺柱，得到75%的乙醇洗脫液，該75%的乙醇洗脫液經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥后，即得 梔子黃色素產(chǎn)物。
[0101]其中：減壓濃縮的條件是指溫度為50°C。
[0102] 冷凍干燥的條件是指溫度為-55°C，真空度為0.5MPa。
[0103] 實施例2梔子中抗高原缺氧疲勞活性成分的分離方法，包括以下步驟： ⑴將干燥、粉碎至30目的梔子果實用蒸餾水煎煮提取后，經(jīng)過濾、減壓濃縮、噴霧干燥， 即得梔子粉。
[0104] 其中：煎煮提取條件是指料液質(zhì)量比(g/g)為1:10，溫度為100°C，次數(shù)為3次，每次 時間為1小時。
[0105]減壓濃縮的條件是指溫度為80°C。
[0106]噴霧干燥的條件是指溫度為140°C，單位時間進(jìn)風(fēng)量30 m3,噴霧壓力0.4MPa。
[0107]⑵將梔子粉用25°C蒸餾水配制成30 mg/mL的水溶液。
[0108] ⑶將步驟⑵所得的水溶液按3.0倍的柱體積以15mL/min的流速注入處理過的30目 聚酰胺柱，再按3.0倍的柱體積以10.0 mL/min的流速用蒸餾水沖洗聚酰胺柱，分別得到聚 酰胺柱上樣流出液、水洗脫液。
[0109] 其中：處理過的聚酰胺柱同實施例1。
[0110]⑷將聚酰胺上樣流出液和水洗脫液合并后，合并液以lOmL/min的流速全部注入處 理過的大孔樹脂柱，先按3.0倍的柱體積以10.0 mL/min的流速用蒸餾水沖洗大孔樹脂柱， 再按10.〇倍的柱體積以10.〇 mL/min的流速用體積濃度為10%的乙醇溶液沖洗大孔樹脂柱， 得到10%的乙醇洗脫液，該10%的乙醇洗脫液經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥后，即得梔子苷產(chǎn)物。 [0111]其中：大孔樹脂柱是指HPDlOO型大孔樹脂。
[0112]減壓濃縮的條件是指溫度為80°C。
[0113] 冷凍干燥的條件是指溫度為20°C，真空度為0.2 MPa。
[0114] 處理過的大孔樹脂柱同實施例1。
[0115] (5)先按3.0倍的柱體積以10.OmL mL/min的流速用體積濃度為30%的乙醇溶液沖洗 聚酰胺柱除雜，再按10.〇倍的柱體積以10.〇 mL/min的流速用體積濃度為30%的乙醇溶液沖 洗所述聚酰胺柱，得到30%的乙醇洗脫液，該30%的乙醇洗脫液經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥后，即 得梔子黃色素產(chǎn)物。
[0116] 其中：減壓濃縮的條件是指溫度為80°C。
[0117] 冷凍干燥的條件是指溫度為20°C，真空度為0.2 MPa。
[0118] 實施例3梔子中抗高原缺氧疲勞活性成分的分離方法，包括以下步驟： ⑴將干燥、粉碎至40目的梔子果實用蒸餾水煎煮提取后，經(jīng)過濾、減壓濃縮、噴霧干燥， 即得梔子粉。
[0119] 其中：煎煮提取條件是指料液質(zhì)量比(g/g)為1:9,溫度為95°C，次數(shù)為2次，每次時 間為1小時。
[0120] 減壓濃縮的條件是指溫度為60°C。
[0121] 噴霧干燥的條件是指溫度為130°C，單位時間進(jìn)風(fēng)量25 m3,噴霧壓力0.2MPa。
[0122] ⑵將梔子粉用25°C蒸餾水配制成40 mg/mL的水溶液。
[0123] ⑶將步驟⑵所得的水溶液按2.0倍的柱體積以5mL/min的流速注入處理過的20目 聚酰胺柱，再按2.0倍的柱體積以8.0 mL/min的流速用蒸餾水沖洗聚酰胺柱，分別得到聚酰 胺柱上樣流出液、水洗脫液。
[0124] 其中：處理過的聚酰胺柱同實施例1。
[0125] ⑷將聚酰胺上樣流出液和水洗脫液合并后，合并液以lOmL/min的流速全部注入處 理過的大孔樹脂柱，先按2.0倍的柱體積以8.0 mL/min的流速用蒸餾水沖洗大孔樹脂柱，再 按6.0倍的柱體積以5.0 mL/min的流速用體積濃度為30%的乙醇溶液沖洗大孔樹脂柱，得到 30%的乙醇洗脫液，該30%的乙醇洗脫液經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥后，即得梔子苷產(chǎn)物。
[0126] 其中：大孔樹脂柱是指XDA-6型大孔樹脂。
[0127] 減壓濃縮的條件是指溫度為60°C。
[0128] 冷凍干燥的條件是指溫度為_30°C，真空度為0.3 MPa。
[0129] 處理過的大孔樹脂柱同實施例1。
[0130] (5)先按2.0倍的柱體積以8.OmL mL/min的流速用體積濃度為15%的乙醇溶液沖洗 聚酰胺柱除雜，再按6.0倍的柱體積以5.0 mL/min的流速用體積濃度為50%的乙醇溶液沖洗 所述聚酰胺柱，得到50%的乙醇洗脫液，該50%的乙醇洗脫液經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥后，即得 梔子黃色素產(chǎn)物。
[0131] 其中：減壓濃縮的條件是指溫度為60°C。
[0132] 冷凍干燥的條件是指溫度為_30°C，真空度為0.3 MPa。
[0133] 實施例4梔子中抗高原缺氧疲勞活性成分的分離方法，包括以下步驟： ⑴將干燥、粉碎至20目的梔子果實用蒸餾水煎煮提取后，經(jīng)過濾、減壓濃縮、噴霧干燥， 即得梔子粉。
[0134] 其中：煎煮提取條件是指料液質(zhì)量比(g/g)為1:8.5，溫度為92°C，次數(shù)為3次，每次 時間為1小時。
[0135] 減壓濃縮的條件是指溫度為70°C。
[0136] 噴霧干燥的條件是指溫度為125°C，單位時間進(jìn)風(fēng)量20 m3,噴霧壓力0.3MPa。
[0137] ⑵將梔子粉用25°C蒸餾水配制成20 mg/mL的水溶液。
[0138] ⑶將步驟⑵所得的水溶液按1.5倍的柱體積以lOmL/min的流速注入處理過的25目 聚酰胺柱，再按1.5倍的柱體積以6.0 mL/min的流速用蒸餾水沖洗聚酰胺柱，分別得到聚酰 胺柱上樣流出液、水洗脫液。
[0139] 其中：處理過的聚酰胺柱同實施例1。
[0140] ⑷將聚酰胺上樣流出液和水洗脫液合并后，合并液以lOmL/min的流速全部注入處 理過的大孔樹脂柱，先按1.5倍的柱體積以6.0 mL/min的流速用蒸餾水沖洗大孔樹脂柱，再 按4.0倍的柱體積以3.0 mL/min的流速用體積濃度為50%的乙醇溶液沖洗大孔樹脂柱，得到 50%的乙醇洗脫液，該50%的乙醇洗脫液經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥后，即得梔子苷產(chǎn)物。
[0141] 其中：大孔樹脂柱是指DM-130型大孔樹脂。
[0142] 減壓濃縮的條件是指溫度為70°C。
[0143] 冷凍干燥的條件是指溫度為_10°C，真空度為0.4 MPa。
[0144] 處理過的大孔樹脂柱同實施例1。
[0145] (5)先按1.5倍的柱體積以6.OmL mL/min的流速用體積濃度為20%的乙醇溶液沖洗 聚酰胺柱除雜，再按4.0倍的柱體積以3.0 mL/min的流速用體積濃度為75%的乙醇溶液沖洗 所述聚酰胺柱，得到75%的乙醇洗脫液，該75%的乙醇洗脫液經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥后，即得 梔子黃色素產(chǎn)物。
[0146] 其中：減壓濃縮的條件是指溫度為70°C。
[0147] 冷凍干燥的條件是指溫度為-HTC，真空度為0.4 MPa。
[0148] 實施例5梔子中抗高原缺氧疲勞活性成分的分離方法，包括以下步驟： ⑴將干燥、粉碎至40目的梔子果實用蒸餾水煎煮提取后，經(jīng)過濾、減壓濃縮、噴霧干燥， 即得梔子粉。
[0149] 其中：煎煮提取條件是指料液質(zhì)量比(g/g)為1:9.5，溫度為98°C，次數(shù)為2次，每次 時間為1小時。
[0150]減壓濃縮的條件是指溫度為80°C。
[0151] 噴霧干燥的條件是指溫度為140°C，單位時間進(jìn)風(fēng)量25 m3,噴霧壓力O.IMPa。
[0152] ⑵將梔子粉用25°C蒸餾水配制成40 mg/mL的水溶液。
[0153] ⑶將步驟⑵所得的水溶液按2.5倍的柱體積以12mL/min的流速注入處理過的30目 聚酰胺柱，再按2.5倍的柱體積以9.0 mL/min的流速用蒸餾水沖洗聚酰胺柱，分別得到聚酰 胺柱上樣流出液、水洗脫液。
[0154] 其中：處理過的聚酰胺柱同實施例1。
[0155] ⑷將聚酰胺上樣流出液和水洗脫液合并后，合并液以lOmL/min的流速全部注入處 理過的大孔樹脂柱，先按2.5倍的柱體積以9.0 mL/min的流速用蒸餾水沖洗大孔樹脂柱，再 按6.0倍的柱體積以8.0 mL/min的流速用體積濃度為70%的乙醇溶液沖洗大孔樹脂柱，得到 70%的乙醇洗脫液，該70%的乙醇洗脫液經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥后，即得梔子苷產(chǎn)物。
[0156] 其中：大孔樹脂柱是指DA201型大孔樹脂。
[0157] 減壓濃縮的條件是指溫度為80°C。
[0158] 冷凍干燥的條件是指溫度為10°C，真空度為0.4MPa。
[0159] 處理過的大孔樹脂柱同實施例1。
[0160] (5)先按2.5倍的柱體積以9.OmL mL/min的流速用體積濃度為25%的乙醇溶液沖洗 聚酰胺柱除雜，再按8.0倍的柱體積以8.0 mL/min的流速用體積濃度為90%的乙醇溶液沖洗 所述聚酰胺柱，得到90%的乙醇洗脫液，該90%的乙醇洗脫液經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥后，即得 梔子黃色素產(chǎn)物。
[0161] 其中：減壓濃縮的條件是指溫度為80°C。
[0162] 冷凍干燥的條件是指溫度為HTC，真空度為0.4MPa。
[0163] 上述實施例1~5中提取的梔子黃色素作為抗缺氧活性成分在醫(yī)藥上的應(yīng)用是指： 以梔子黃色素為活性成分，配以藥用鋪料制備成藥劑學(xué)上的任何一種劑型；或以梔子黃色 素為活性成分，添加抗氧化和/或抗疲勞活性成分組成復(fù)方，并配以藥用輔料制備成藥劑學(xué) 上的任何一種劑型。劑型是指硬膠囊、軟膠囊、普通片、糖衣片、薄膜衣片、異型片、咀嚼片、 泡騰片、分散片、顆粒劑、丸劑、溶液劑、糖漿劑中的任意一種。
[0164] 實施例6將實施例1~5所得梔子黃色素與肉蓯蓉提取物按照1:1的比例進(jìn)行混合， 采用藥劑學(xué)方法做成膠囊，用于預(yù)防和治療高原缺氧型疲勞。
[0165] 實施例7將實施例1~5所得梔子黃色素與肉蓯蓉提取物按照3:1的比例進(jìn)行混合， 采用藥劑學(xué)方法做成分散片，用于預(yù)防和治療高原缺氧型疲勞。
[0166] 實施例8將實施例1~5所得梔子黃色素與肉蓯蓉提取物按照5:1的比例進(jìn)行混合， 采用藥劑學(xué)方法做成顆粒劑，用于預(yù)防和治療高原缺氧型疲勞。
[0167] 實施例9將實施例1~5所得梔子黃色素與肉蓯蓉提取物按照7:1的比例進(jìn)行混合， 采用藥劑學(xué)方法做成丸劑，用于預(yù)防和治療高原缺氧型疲勞。
[0168] 實施例10將實施例1~5所得梔子黃色素與肉蓯蓉提取物按照1:3的比例進(jìn)行混 合，采用藥劑學(xué)方法做成溶液劑，用于預(yù)防和治療高原缺氧型疲勞。
[0169] 上述實施例1~5中所得到的梔子黃色素可作為抗氧化、抗疲勞功能的活性成分在 制備抗氧化或抗疲勞保健品方面的應(yīng)用。
【主權(quán)項】
1. 梔子中抗高原缺氧疲勞活性成分的分離方法，包括以下步驟： ⑴將干燥、粉碎至20~40目的梔子果實用蒸餾水煎煮提取后，經(jīng)過濾、減壓濃縮、噴霧干 燥，即得梔子粉； ⑵將所述梔子粉用25°C蒸餾水配制成20~40 mg/mL的水溶液； (3)將所述步驟⑵所得的水溶液按1.0~3.0倍的柱體積以1.5~15mL/min的流速注入8cm X 100 cm處理過的14~30目聚酰胺柱，再按1.0~3.0倍的柱體積以5.0~10.0 mL/min的流速 用蒸餾水沖洗聚酰胺柱，分別得到聚酰胺柱上樣流出液、水洗脫液； ⑷將聚酰胺上樣流出液和水洗脫液合并后，合并液以10mL/min的流速全部注入處理過 的大孔樹脂柱，先按1.〇~3.0倍的柱體積以5.0~10.0 mL/min的流速用蒸餾水沖洗大孔樹脂 柱，再按2.0~10.0倍的柱體積以1.5~10.0 mL/min的流速用體積濃度為10~70%的乙醇溶液 沖洗大孔樹脂柱，得到10~70%的乙醇洗脫液，該10~70%的乙醇洗脫液經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥 后，即得梔子苷產(chǎn)物； (5)先按1.0~3.0倍的柱體積以5.0~10.0 mL mL/min的流速用體積濃度為10~30%的乙醇 溶液沖洗聚酰胺柱除雜，再按2.0~10.0倍的柱體積以1.5~10.0 mL/min的流速用體積濃度 為30~90%的乙醇溶液沖洗所述聚酰胺柱，得到30~90%的乙醇洗脫液，該30~90%的乙醇洗脫 液經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥后，即得梔子黃色素產(chǎn)物。2. 如權(quán)利要求1所述的梔子中抗高原缺氧疲勞活性成分的分離方法，其特征在于:所述 步驟⑴中煎煮提取條件是指料液質(zhì)量比為1:8~10,溫度為90~100 °C，次數(shù)為2~3次，每次時 間為1小時。3. 如權(quán)利要求1所述的梔子中抗高原缺氧疲勞活性成分的分離方法，其特征在于:所述 步驟⑴、所述步驟⑷和所述步驟(5)中減壓濃縮的條件均是指溫度為50°O8(TC。4. 如權(quán)利要求1所述的梔子中抗高原缺氧疲勞活性成分的分離方法，其特征在于:所述 步驟⑴中噴霧干燥的條件是指溫度為120~140°C，單位時間進(jìn)風(fēng)量20~30 m3,噴霧壓力0.1~ 0.4MPa 〇5. 如權(quán)利要求1所述的梔子中抗高原缺氧疲勞活性成分的分離方法，其特征在于:所述 步驟⑷和所述步驟(5)中冷凍干燥的條件均是指溫度為-55°O20°C，真空度為0.2MPa~0.5 MPa〇6. 如權(quán)利要求1所述的梔子中抗高原缺氧疲勞活性成分的分離方法，其特征在于:所述 步驟⑷中大孔樹脂柱是指D-101、HPD100、XDA-6、DM-130、DA201型大孔樹脂中的任意一種。7. 如權(quán)利要求1所述的梔子中抗高原缺氧疲勞活性成分的分離方法，其特征在于:所述 步驟⑶中的處理過的聚酰胺柱和所述步驟⑷中處理過的大孔樹脂柱均是指先用體積濃度 為95%的乙醇洗脫，直至乙醇洗脫液加蒸餾水不出現(xiàn)渾濁為止，再以蒸餾水洗脫柱子至無醇 味，即得。8. 如權(quán)利要求1所述的梔子中抗高原缺氧疲勞活性成分的分離方法所得到的梔子黃色 素作為抗缺氧活性成分在醫(yī)藥上的應(yīng)用，其特征在于：以梔子黃色素為活性成分，配以藥用 鋪料制備成藥劑學(xué)上的任何一種劑型;或以梔子黃色素為活性成分，添加抗氧化和/或抗疲 勞活性成分組成復(fù)方，并配以藥用輔料制備成藥劑學(xué)上的任何一種劑型。9. 如權(quán)利要求8所述的梔子中抗高原缺氧疲勞活性成分的分離方法所得到的梔子黃色 素作為抗缺氧活性成分在醫(yī)藥上的應(yīng)用，其特征在于:所述劑型是指硬膠囊、軟膠囊、普通 片、糖衣片、薄膜衣片、異型片、咀嚼片、泡騰片、分散片、顆粒劑、丸劑、溶液劑、糖漿劑中的 任意一種。10.如權(quán)利要求1所述的梔子中抗高原缺氧疲勞活性成分的分離方法所得到的梔子黃 色素作為抗氧化、抗疲勞功能的活性成分在制備抗氧化或抗疲勞保健品方面的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P39/00GK105963389SQ201610305926
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月10日
【發(fā)明人】李茂星, 王先敏, 毛婷, 曹馨元, 馬幸福
【申請人】李茂星