一種具有腫瘤引發(fā)靶向能力的藥物運(yùn)載控釋系統(tǒng)及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有腫瘤引發(fā)靶向能力的藥物運(yùn)載控釋系統(tǒng)及其制備方法。該藥物運(yùn)載控釋系統(tǒng)具有三層核殼結(jié)構(gòu)，內(nèi)層為載藥的介孔硅納米粒子，中間層為葉酸修飾的疊氮化殼聚糖，外層為聚乙二醇。該藥物運(yùn)載控釋系統(tǒng)的制備方法包括如下步驟：巰基功能化介孔硅納米粒子的制備；雙硫功能化；炔基修飾；去除模板；葉酸修飾的疊氮化殼聚糖的制備；殼聚糖包裹；PEG修飾等。與現(xiàn)有技術(shù)相比，其以殼聚糖作為“閥門”材料，價(jià)廉、易得、生物相容性好；PEG通過pH敏感的亞胺鍵接枝在CHI表面，使該藥物運(yùn)載控釋系統(tǒng)可以在正常血液循環(huán)中“隱形”、在腫瘤部位脫除PEG裸露出靶向配體葉酸，從而“激活”該系統(tǒng)對癌細(xì)胞的主動靶向能力。
【專利說明】
一種具有腫瘤引發(fā)靶向能力的藥物運(yùn)載控釋系統(tǒng)及其制備 方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有腫瘤引發(fā)靶向能力的藥物運(yùn)載控釋 系統(tǒng)及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在癌癥治療中，傳統(tǒng)的藥物療法因缺乏靶向性，往往會導(dǎo)致藥物利用率不高和毒 副作用嚴(yán)重。而且腫瘤組織和正常組織間存在一些差異，利用這些差異可以設(shè)計(jì)藥物載體 來克服傳統(tǒng)癌癥的治療的缺陷。
[0003] 在目前被廣泛研究的藥物載體中，介孔硅納米粒子(MSN)的載體系統(tǒng)具備優(yōu)異的 性能，MSN的諸多優(yōu)點(diǎn)：良好的生物相容性、大的比表面積及孔隙體積可以裝載大量藥物、良 好的表面改性能力使其具有修飾各種功能基團(tuán)的潛力。此外，制備MSN的手段豐富以及成 熟、方法簡單，MSN的形狀、尺寸、孔隙大小在一定范圍內(nèi)都可以較好的控制。這些特點(diǎn)賦予 了 MSN載體系統(tǒng)良好的應(yīng)用前景:其百納米級的尺寸滿足"被動靶向"的需求;通過在其表面 修飾不同刺激響應(yīng)性的"閥門"可以賦予其不同的藥物控釋能力，且可以實(shí)現(xiàn)"零提前釋 放"。顯然，功能化"閥門"的設(shè)計(jì)對于MSN載體而言至關(guān)重要。"閥門"賦予了載體控釋能力， 而且通過對"閥門"的改性可以使載體獲得諸如"熒光成像"、"主動靶向"等功能。
[0004] 許多不同類型的"閥門"已經(jīng)被用于MSN載體中。常見的"閥門"包括各類超分子系 統(tǒng)、金屬納米粒子、脂質(zhì)體、蛋白質(zhì)、DNA和天然多糖等。從藥物控釋的角度出發(fā)，這些載體設(shè) 計(jì)精巧、性能出色。但是從實(shí)際應(yīng)用的前景出發(fā)，"閥門"材料的選擇應(yīng)當(dāng)從生物相容性、控 釋效果、來源是否廣泛、合成或改性的難度以及經(jīng)濟(jì)成本等方面綜合考慮。由此，種類繁多、 廉價(jià)易得、生物相容性好的天然多糖是一個不錯的選擇。天然多糖來源非常豐富，較易從動 植物體內(nèi)提取，并且很多已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn);富含羥基、羧基、氨基等基團(tuán)便于化學(xué)改性，在 生物材料領(lǐng)域應(yīng)用非常廣泛。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的為提供一種具有腫瘤引發(fā)靶向能力的藥物運(yùn)載控釋系統(tǒng)及其制備 方法，該系統(tǒng)具有運(yùn)載藥物并控制藥物在腫瘤組織處釋放的能力，可做到藥物在正常組織 處零釋放，有效提高藥物利用率并降低其毒副作用。
[0006] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下:一種具有腫瘤引發(fā)靶向能力的藥物運(yùn) 載控釋系統(tǒng)，具有三層核殼結(jié)構(gòu)，其特征在于，內(nèi)層為載藥的介孔硅納米粒子，中間層為葉 酸修飾的疊氮化殼聚糖，外層為聚乙二醇。
[0007] 在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以有如下進(jìn)一步的優(yōu)選方案。
[0008] 進(jìn)一步，所述介孔娃納米粒子與所述葉酸修飾的疊氮化殼聚糖通過雙硫鍵連接， 所述葉酸修飾的疊氮化殼聚糖與所述聚乙二醇通過亞胺鍵連接。
[0009] 優(yōu)選的，所述介孔娃納米粒子為疏基功能化介孔娃納米粒子，其粒徑為80-120nm。
[0010] 優(yōu)選的，所述殼聚糖的分子量在30000以下、3500以上。
[0011]優(yōu)選的，所述聚乙二醇為醛基化聚乙二醇，其重均分子量為1900。
[0012] 本發(fā)明還提供一種具有腫瘤引發(fā)靶向能力的藥物運(yùn)載控釋系統(tǒng)的制備方法，其包 括如下步驟：
[0013] SI.包含模板CTAB的巰基功能化介孔硅納米粒子(CTAB0MSN-SH)的制備；
[0014] S2.雙硫功能化介孔硅納米粒子（Ctabomsn-SS-NH2)的制備：將步驟si制得的 CTABiMSN-SH加入溶劑中并充分分散，CTABiMSN-SH與溶劑的用量比為600mg: 120-150mL，繼 續(xù)加入與(^六8關(guān)5^5!1等質(zhì)量的8-(2-氨乙?guī)€基）-2-巰基吡啶鹽酸鹽（5-(2-aminoethylthio)-2_thiopyridine hydrochloride)并充分?jǐn)埶?，反?yīng)于室溫下進(jìn)行24h， 離心并用水和甲醇清洗數(shù)次，真空干燥，即得；
[0015] S3.炔基修飾的介孔硅納米粒子(CTABiMSN-SS-alkyne)的制備:將步驟S2制得的 CTABiMSN-SS-NH2加入溶劑中并充分分散，CTABiMSN-SS-NH2與溶劑的用量比為450mg :80-120mL，加入適量溴丙炔并攪拌混合，CTABiMSN-SS-NH2與溴丙炔的用量比為450mg: 3-4mL， 反應(yīng)于室溫下進(jìn)行24h，離心并用水和甲醇清洗數(shù)次，真空干燥，即得；
[0016] S4.去除模板CTAB的介孔硅納米粒子(MSN-SS-alkyne)的制備:將步驟S3制得的 CTABiMSN-SS-al kyne加入甲醇與濃鹽酸的混合溶液中，CTABiMSN-SS-a I kyne與混合溶液的 用量比為500mg:80-100mL，混合溶液由濃鹽酸和甲醇按體積比為1:15-20混合而成，回流 48h，然后用水和甲醇超聲多次洗滌，冷凍干燥，即得；
[0017] S5.葉酸修飾的疊氮化殼聚糖(N3-CHI-FA)的制備:將N3CH2COOH和CHI溶解在適量 水中，N3CH2COOH、CHI和水的用量比為180mg: 1400-1500mg: IOOmU加入適量EDC · HCl后室溫 下攪拌活化24h，再加入適量FA室溫避光下劇烈攪拌24h，其中EDC · HCUFA與N3CH2COOH的質(zhì) 量之比為480:200:180，反應(yīng)結(jié)束后抽濾不溶物質(zhì)并將濾液用分子量3500的透析袋透析，冷 凍干燥，即得；
[0018] S6.殼聚糖包裹的載藥介孔硅納米粒子的制備(D0X麵SN-SS-CHI-FA):將步驟S4制 得的MSN-SS-aIkyne加入甲醇與水的混合液中并充分分散，甲醇與水的體積比為1:4-5， MSN-SS-alkyne與混合液的用量比為200mg:20-25mL，加入適量鹽酸阿霉素(D0X · HC1)，室 溫下劇烈攪拌24h，然后加入葉酸修飾的疊氮化殼聚糖、五水硫酸銅以及抗壞血酸鈉，葉酸 修飾的疊氮化殼聚糖和五水硫酸銅的質(zhì)量均與MSN-SS-alkyne質(zhì)量相等，DOX · HCl與MSN-SS-alkyne質(zhì)量比為1:4,抗壞血酸鈉與MSN-SS-alkyne的質(zhì)量比為1.7:1，反應(yīng)在氮?dú)獗Ｗo(hù) 和室溫下反應(yīng)3天，離心并用水和甲醇清洗數(shù)次，真空干燥，即得；
[0019] S7.具有腫瘤引發(fā)靶向能力的藥物運(yùn)載控釋系統(tǒng)(DOXiMSN-SS-CHI-FA-PEG)的制 備:將S5制備的DOX麵SN-SS-CHI-FA與等質(zhì)量的醛基化聚乙二醇加入pH=7.4的PBS溶液中 并充分分散，DOXiMSN-SS-alkyne與PBS溶液的用量比為200mg:50mL，室溫下攪拌反應(yīng)24h， 然后用水多次超聲洗滌，冷凍干燥后，即得。
[0020] 整個制備過程的反應(yīng)路線如下所示：
[0021]
[0022] 進(jìn)一步，步驟SI的CTABiMSN-SH為包含模板CTAB的MCM-41型巰基功能化介孔硅納 米粒子。
[0023]具體的，步驟S2與S3中的所述溶劑為甲醇或乙醇，步驟S4中使用的濃鹽酸的質(zhì)量 分?jǐn)?shù)為37 %。
[0024]優(yōu)選的，步驟S7中使用的醛基化聚乙二醇的制備方法如下：將重均分子量為1900 的帶有端氨基的聚乙二醇溶解在干燥的二氯甲烷中，繼續(xù)加入適量對醛基苯甲酸、二環(huán)己 基碳二亞胺和4-二甲氨基吡啶，其中帶有端氨基的聚乙二醇、對醛基苯甲酸、二環(huán)己基碳二 亞胺、4-二甲氨基吡啶與二氯甲烷的用量比為5.0g :3.0g:4.2g:0.32g:150mL，室溫下反應(yīng) 24h，過濾，濾液旋蒸得白色粉末，白色粉末加水溶解后用二氯甲烷多次萃取，萃取時(shí)有機(jī)層 加無水硫酸鈉除水，最后用冷乙醚沉淀，即得。
[0025] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的具有腫瘤引發(fā)靶向能力的藥物運(yùn)載控釋系統(tǒng)及其 制備方法的優(yōu)點(diǎn)為：
[0026] 1)、采用百納米尺寸的MSN作為抗癌藥物的納米存儲器，賦予載體"被動祀向"的能 力，同時(shí)也利用其具有良好生物相容性、大的比表面積及孔隙體積可以裝載大量藥物的特 點(diǎn)。
[0027] 2)、選用殼聚糖（CHI)作為"閥門"材料，以分子鏈覆蓋的方式包覆在MSN的表面， CHI來源豐富，是地球上產(chǎn)量第二大的天然高分子材料，作為唯一的堿性天然多糖，CHI富含 的氨基不僅可以用于改性，也能因其所帶正電荷幫助載體粘附并穿透細(xì)胞膜進(jìn)入癌細(xì)胞， 同時(shí)對比其他合成聚陽離子，CHI的生物相容性更加優(yōu)秀。
[0028] 3)、以氧化-還原敏感的雙硫鍵連接MSN及CHI以實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞內(nèi)釋藥，載體進(jìn)入癌細(xì) 胞后，在細(xì)胞內(nèi)還原環(huán)境（因GSH作用）下雙硫鍵斷開，包覆在載體表面的CHI脫落，從而釋放 藥物;在進(jìn)入腫瘤細(xì)胞前，體內(nèi)的氧化環(huán)境能保證雙硫鍵的穩(wěn)定，保證藥物不會被提前釋 放。
[0029] 4)、葉酸(FA)是一種廣泛分布的水溶性維生素。葉酸分子結(jié)構(gòu)簡單，分子中含有羧 基活性高特別容易發(fā)生酰胺反應(yīng)。因此，大多數(shù)情況下通過酰胺反應(yīng)將葉酸分子引入藥物 載體使其產(chǎn)生靶向性。從而像發(fā)射"導(dǎo)彈"精準(zhǔn)地將藥物載體靶向到腫瘤細(xì)胞。在某些腫瘤 細(xì)胞的表面含有過度表達(dá)的葉酸受體。本發(fā)明的"閥門"材料殼聚糖(CHI)的表面接枝有葉 酸(FA)，其可與腫瘤細(xì)胞的葉酸受體特異性結(jié)合，從而使本發(fā)明提供的藥物載運(yùn)控釋系統(tǒng) 更容易與腫瘤細(xì)胞的親和，增加了"腫瘤引發(fā)靶向"能力。
[0030] 5 )、將苯甲醛封端的帶有端氨基的聚乙二醇(mPEG)通過pH敏感的亞胺鍵接枝在 CHI表面，賦予載體"腫瘤引發(fā)靶向"的能力，通過亞胺鍵連接PEG的保護(hù)可以保證膠束載體 在正常的血液循環(huán)中"隱形"，以擁有足夠的循環(huán)時(shí)間在腫瘤部位通過"被動靶向"富集，當(dāng) 載體到達(dá)腫瘤組織時(shí)，低的pH使亞胺鍵斷裂，PEG保護(hù)層脫落裸露出葉酸，配體的靶向FA能 力被"激活"。
【附圖說明】
[0031] 圖1為本發(fā)明提供的具有腫瘤引發(fā)靶向能力的藥物運(yùn)載控釋系統(tǒng)的藥物裝置及控 釋過程的示意圖；
[0032] 圖2為巰基功能化的介孔納米粒子(MSN-SH)的TEM圖；
[0033]圖3為實(shí)施例1制備的具有腫瘤引發(fā)發(fā)靶向能力的藥物運(yùn)載控釋系統(tǒng)（DOX^SN-SS-CHI-FA-PEG)的 TEM 圖；
[0034] 圖4為實(shí)施例1制備的DOXiMSN-SS-CHI-FA-PEG在pH=6.5條件下的Zeta電位隨浸 泡時(shí)間變化關(guān)系圖；
[0035] 圖5為實(shí)施例1制備的DOXiMSN-SS-CHI-FA-PEG在不同濃度GSH還原條件下DOX藥物 的釋放情況。
[0036] 圖6為實(shí)施例1制備的D0X0MSN-SS-CHI-FA-PEG在不同pH(7.4和6.5)、不同DOX濃度 條件下與人類宮頸癌(HeLa)細(xì)胞共培養(yǎng)后HeLa細(xì)胞的存活率。
[0037] 圖7為實(shí)施例1制備的DOXiMSN-SS-CHI-FA-PEG在不同pH(7.4和6.5)條件下與HeLa 細(xì)胞共培養(yǎng)后D0X0MSN-SS-CHI-FA-PEG進(jìn)入細(xì)胞的情況。測試結(jié)果經(jīng)流式細(xì)胞儀獲得，以相 對熒光強(qiáng)度(MFI)為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 以下結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解 釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0039] 本發(fā)明提供一種具有腫瘤引發(fā)靶向能力的藥物運(yùn)載控釋系統(tǒng)，具有三層核殼結(jié) 構(gòu)，內(nèi)層為載藥的介孔硅納米粒子，中間層為葉酸修飾的殼聚糖，外層為聚乙二醇。其中，所 述介孔娃納米粒子(MSN)與所述葉酸修飾的殼聚糖通過雙硫鍵連接，雙硫鍵的一端與介孔 硅納米粒子(MSN)連接，另一端與小分子連接，小分子再通過化學(xué)鍵與葉酸修飾的殼聚糖連 接，所述葉酸修飾的殼聚糖與所述聚乙二醇通過亞胺鍵連接，具體結(jié)構(gòu)及載藥和控釋過程 如圖1所示。
[0040] 本發(fā)明所用到的方法中未作特殊說明，則均為常規(guī)方法，如無特殊規(guī)定，均為市售 產(chǎn)品。
[0041 ]以下實(shí)施例中使用的包含模板CT AB的巰基功能化介孔硅納米粒子(CTAB0MSN-SH)，可使用市售產(chǎn)品，也可按照現(xiàn)有技術(shù)自行制備:先將NaOH(0.28g)與CTAB(I.Og)溶解在 480mL二次水中并升溫至80°C，然后將TE0S(5mL)緩慢逐滴滴加至體系中，20分鐘后繼續(xù)向 體系中滴加MPTMS(0.97mL)，再繼續(xù)攪拌2h，產(chǎn)生白色沉淀物，反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物離心出來 并用去離子水和甲醇超聲多次洗滌，冷凍干燥后便得到包含模板CTAB的介孔硅納米顆粒 (CTAB0MSN-SH)，所述CTAB0MSN-SH的TEM如圖 2所示。
[0042]以下實(shí)施例中使用的醛基化聚乙二醇（mTOG-CHO)，可通過下述方法自行制備： 5. Og mPEG(Mw = 1900Da，2.6mmo 1)溶解在150mL干燥后的二氯甲烷中。加入3. Og對醛基苯甲 酸，4.2g DCC和0.32g的DMAP在室溫下反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后過濾，濾液的溶劑旋蒸獲得的白 色粉末溶在50mL去離子水中。再用二氯甲烷萃取6次（100毫升X6)，有機(jī)層加入無水Na2SO4 干燥，最后通過200mL的冷乙醚沉淀得到白色固體mPEG-CHO。
[0043] 以下通過本發(fā)明提供的方法制備具有腫瘤引發(fā)靶向能力的藥物運(yùn)載控釋系統(tǒng)。
[0044] 實(shí)施例1
[0045] 取600mg上述制備出的CTABiMSN-SH分散于135mL甲醇中，超聲使其分散均勻。然后 加入600mg s-(2-氨乙?guī)€基)-2-巰基吡啶鹽酸鹽并劇烈攪拌，反應(yīng)于室溫下進(jìn)行24h。離心 (10000r/min X IOmin)并用二次水和甲醇清洗數(shù)次，真空干燥后得到包含模板CTAB的雙硫 功能化介孔硅納米粒子(Ctabomsn-SS-NH 2 )。
[0046] 取450mg上述制備出的CTABiMSN-SS-NH2分散于IOOmL甲醇中，超聲使其分散均勻。 然后加入3mL溴丙炔，反應(yīng)于室溫下進(jìn)行24h。離心（10,000r/minX IOmin)并用二次水和甲 醇清洗數(shù)次，真空干燥后得到含有CTAB的炔基修飾的雙硫功能化介孔硅納米顆粒(CTAB0 MSN-SS-alkyne)〇
[0047] 為了去除模板CTAB，取0 · 5g上述得到的CTABiMSN-SS-alkyne在包含有4 · 5mL濃鹽 酸的甲醇(SOmL)中回流48h，然后用二次水和甲醇超聲多次洗滌，冷凍干燥后得到MSN-SS-alkyne〇
[0048] 葉酸修飾的疊氮化殼聚糖(N3-CHI-FA)的制備，先將180mg N3CH2COOH和1.43g CHI 溶解在100mL去離子水中，加入0.48gEDC·HCl后室溫下攪拌活化24h，再加入200mgFA室 溫避光下劇烈攪拌24h，反應(yīng)結(jié)束后抽濾不溶物質(zhì)并將濾液用分子量3500的透析袋透析，冷 凍干燥，即得N 3-CHI-FA。
[0049] 取200mg上述制備出的MSN-SS-alkyne分散于5mL甲醇與20mL去離子水的混合溶液 中，超聲分散均勻后，加入50mg鹽酸阿霉素(D0X · HC1)，并將反應(yīng)混合物在室溫下劇烈攪拌 24h。然后加入200mg上述制備出的N3-CHI-FA、200mg CuS〇4 · 5H20以及340mg抗壞血酸鈉，反 應(yīng)在氮?dú)夥諊Ｗo(hù)下與室溫反應(yīng)3天。經(jīng)過離心并用二次水和甲醇清洗數(shù)次，真空干燥后得 到殼聚糖包裹的載藥介孔硅納米粒子(D0X0MSN-SS-CHI-FA)
[0050]取200mg上述制備的mPEG-CHO和200mg DOXiMSN-SS-CHI-FA超聲分散在50mL pH = 7.4的PBS中，室溫下攪拌24h。然后用二次水超聲多次洗滌，冷凍干燥后得到具有腫瘤引發(fā) 靶向能力的藥物運(yùn)載控釋系統(tǒng)(DOXiMSN-SS-CHI -FA-PEG )，制備出的DOXiMSN-SS-CHI -FA-PEG的TEM圖像如圖3所示。
[0051 ] 實(shí)施例2
[0052] 取600mg上述制備出的CTABiMSN-SH分散于120mL甲醇中，超聲使其分散均勻。然后 加入600mgs-(2-氨乙?guī)€基）-2-巰基吡啶鹽酸鹽并劇烈攪拌，反應(yīng)于室溫下進(jìn)行24h。離心 (10000r/min X IOmin)并用二次水和甲醇清洗數(shù)次，真空干燥后得到包含模板CTAB的雙硫 功能化介孔硅納米粒子(Ctabomsn-SS-NH 2 )。
[0053] 取450mg上述制備出的CTABiMSN-SS-NH2分散于80mL甲醇中，超聲使其分散均勻。 然后加入3mL溴丙炔，反應(yīng)于室溫下進(jìn)行24h。離心（10000r/min X IOmin)并用二次水和甲醇 清洗數(shù)次，真空干燥后得到含有表面活性劑的炔基修飾的雙硫功能化介孔硅納米顆粒 (CTABiMSN-SS-alkyne)。
[0054] 為了去除模板CTAB，取0 · 5g上述得到的CTABiMSN-SS-alkyne在包含有4 · 5mL濃鹽 酸的甲醇（67.5mL)中回流48h，然后用二次水和甲醇超聲多次洗滌，冷凍干燥后得到MSN- SS-alkyne〇
[0055] 葉酸修飾的疊氮化殼聚糖(N3-CHI-FA)的制備，先將180mg N3CH2COOH和1.43g CHI 溶解在100mL去離子水中，加入0.48gEDC·HCl后室溫下攪拌活化24h，再加入200mgFA室 溫避光下劇烈攪拌24h，反應(yīng)結(jié)束后抽濾不溶物質(zhì)并將濾液用分子量3500的透析袋透析，冷 凍干燥，即得N 3-CHI-FA。
[0056] 取200mg上述制備出的MSN-SS-alkyne分散于4.2mL甲醇與21mL去離子水的混合溶 液中，超聲分散均勻后，加入50mg鹽酸阿霉素(D0X · HC1)，并將反應(yīng)混合物在室溫下劇烈攪 拌24h。然后加入200mg上述制備出的FA-CHI-N3、200mg CuS〇4 · 5H20以及340mg抗壞血酸鈉， 反應(yīng)在氮?dú)夥諊Ｗo(hù)下與室溫反應(yīng)3天。經(jīng)過離心并用二次水和甲醇清洗數(shù)次，真空干燥后 得到殼聚糖包裹的載藥介孔硅納米粒子(D0X0MSN-SS-CHI-FA)
[0057] 取200mg上述制備的mPEG-CHO和200mg DOXiMSN-SS-CHI-FA超聲分散在50mL pH = 7.4的PBS溶液中，室溫下攪拌24h。然后用二次水超聲多次洗滌，冷凍干燥后得到具有腫瘤 引發(fā)靶向能力的藥物運(yùn)載控釋系統(tǒng)(D0X0MSN-SS-CHI-FA-PEG).
[0058] 實(shí)施例3
[0059] 取600mg上述制備出的CTABiMSN-SH分散于150mL甲醇中，超聲使其分散均勻。然后 加入600mgs-(2-氨乙?guī)€基）-2-巰基吡啶鹽酸鹽并劇烈攪拌，反應(yīng)于室溫下進(jìn)行24h。離心 (10000r/min X IOmin)并用二次水和甲醇清洗數(shù)次，真空干燥后得到包含模板CTAB的雙硫 功能化介孔硅納米粒子(Ctabomsn-SS-NH 2 )。
[0060] 取450mg上述制備出的CTABiMSN-SS-NH2分散于120mL甲醇中，超聲使其分散均勻。 然后加4mL溴丙炔，反應(yīng)于室溫下進(jìn)行24h。離心（10000r/minX IOmin)并用二次水和甲醇清 洗數(shù)次，真空干燥后得到含有表面活性劑的炔基修飾的雙硫功能化介孔硅納米顆粒(CTAB0 MSN-SS-alkyne)〇
[0061 ] 為了去除模板CTAB，取0.5g上述得到的CTABiMSN-SS-alkyne在包含有5mL濃鹽酸 的甲醇（95mL)中回流48h，然后用二次水和甲醇超聲多次洗滌，冷凍干燥后得到MSN-SS-alkyne。
[0062] 葉酸修飾的疊氮化殼聚糖(N3-CHI-FA)的制備，先將180mg N3CH2COOH和1.43g CHI 溶解在100mL去離子水中，加入0.48gEDC·HCl后室溫下攪拌活化24h，再加入200mgFA室 溫避光下劇烈攪拌24h，反應(yīng)結(jié)束后抽濾不溶物質(zhì)并將濾液用分子量3500的透析袋透析，冷 凍干燥，即得N 3-CHI-FA。
[0063] 取200mg上述制備出的MSN-SS-alkyne分散于4mL甲醇與16.5mL去離子水的混合溶 液中，超聲分散均勻后，加入50mg鹽酸阿霉素(D0X · HC1)，并將反應(yīng)混合物在室溫下劇烈攪 拌24h。然后加入200mg上述制備出的FA-CHI-N3、200mg CuS〇4 · 5H20以及340mg抗壞血酸鈉， 反應(yīng)在氮?dú)夥諊Ｗo(hù)下與室溫反應(yīng)3天。經(jīng)過離心并用二次水和甲醇清洗數(shù)次，真空干燥后 得到殼聚糖包裹的載藥介孔硅納米粒子(DOXOMSN-SS-CHI-FA)
[0064] 取200mg上述制備的mPEG-CHO和200mg DOXiMSN-SS-CHI-FA超聲分散在50mL pH = 7.4的PBS中，室溫下攪拌24h。然后用二次水超聲多次洗滌，冷凍干燥后得到具有腫瘤引發(fā) 靶向能力的藥物運(yùn)載控釋系統(tǒng)(DOXOMSN-SS-CHI-FA-PEG)。
[0065] 測試?yán)?br>[0066] 以實(shí)施例1制備出的終產(chǎn)物DOXiMSN-SS-CHI-FA-PEG為檢測對象，37°C在pH = 6.5 的PBS溶液中檢測zeta電位數(shù)據(jù)，以觀察PEG從DOXiMSN-SS-CHI-FA-PEG表面脫離受pH的控 制情況，測試結(jié)果如圖4所示。圖4表明，在pH = 6.5的條件下，隨著時(shí)間增長，本發(fā)明制備的 DOXiMSN-SS-CHI-FA-PEG納米顆粒的zeta電位明顯增加，在30min內(nèi)升至+15. ImV并保持增 長，在24h內(nèi)上升到+26 · 8mV，與DOXiMSN-SS-CHI-FA (+27 · 5mV)接近，這表明PEG和CHI間的亞 胺鍵在弱酸性(pH=6.5)環(huán)境下慢慢斷裂，PEG慢慢脫離納米粒子從而裸露出CHI-FA。
[0067] 以實(shí)施例1制備出的終產(chǎn)物DOX麵SN-SS-CHI-FA-PEG為檢測對象，在含有還原性多 肽GSH的pH=7.4的PBS溶液中檢測雙硫鍵斷裂，DOX藥物釋放的情況用紫外光譜進(jìn)行監(jiān)測， 試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。圖5表明，在roS = 7.4和不同濃度的GSH溶液中DOX麵SN-SS-CHI-FA-PEG的DOX釋放量不同：在沒有GSH時(shí)，DOX麵SN-SS-CHI-FA-PEG納米粒子的孔道被CHI通過穩(wěn) 定的雙硫鍵封堵，因此，120h內(nèi)DOX釋放量小于8 % ;而當(dāng)GSH的濃度為1mmo 1時(shí)，120h內(nèi)DOX的 釋放量超過39% ;當(dāng)GSH的濃度增加至IOmmol時(shí)，藥物釋放速率大大加快，在24h內(nèi)DOX釋放 量約37%，120h內(nèi)DOX釋放的累積釋放約為81 %。藥物釋放速率隨GSH的濃度增加而增加。 GSH在細(xì)胞內(nèi)的濃度比在細(xì)胞外高100-1000倍，因此DOXiMSN-SS-CHI-FA-PEG納米粒子在進(jìn) 入細(xì)胞之前不會釋放DOX而在進(jìn)入細(xì)胞后釋放藥物D0X。
[0068] 以實(shí)施例1制備的DOXiMSN-SS-CHI-FA-PEG為檢測對象測試其對腫瘤細(xì)胞的治療 效果，控制DOX麵SN-SS-CHI-FA-PEG在不同測試標(biāo)液中的加入量以最終區(qū)分出不同的DOX濃 度(假定DOX完全釋放）。圖6為DOXiMSN-SS-CHI-FA-PEG在不同pH(7.4和6.5)、不同DOX濃度 條件下與HeLa細(xì)胞共培養(yǎng)后HeLa細(xì)胞的存活率。HeLa細(xì)胞的存活率隨DOX的濃度增加而降 低。作為對照標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)PH = 6.5時(shí)，當(dāng)DOX的濃度為8mg/L時(shí)，僅僅只有約9.8 %的HeLa細(xì)胞的 存活。將適量實(shí)施例1制備的DOXiMSN-SS-CHI-FA-PEG納米粒子與HeLa細(xì)胞在pH=7.4時(shí)共 培養(yǎng)48h后，DOX濃度為1.25mg/L時(shí)HeLa細(xì)胞的存活率高達(dá)約86 %，繼續(xù)培養(yǎng)至DOX濃度升至 較大（約為8mg/L)時(shí)，HeLa細(xì)胞的存活率也有約37%。另外，將與上述用量相同的DOXiMSN-SS-CHI-FA-PEG納米粒子與HeLa細(xì)胞在pH = 6.5條件下培養(yǎng)，當(dāng)DOX濃度達(dá)到約為8mg/L時(shí)， HeLa細(xì)胞的存活率低于10%。這說明了藥物載體粒子控釋系統(tǒng)可以在正常血液(pH在7.35-7.45之間）循環(huán)中"隱形"、在腫瘤部位(弱酸性性和還原環(huán)境)脫除PEG裸露出葉酸，從而"激 活"其主動靶向能力，幫助DOX麵SN-SS-CHI-FA-PEG進(jìn)入腫瘤細(xì)胞并最終抑制和殺死腫瘤細(xì) 胞。以實(shí)施例1制備的終產(chǎn)物DOX麵SN-SS-CHI-FA-PEG納米粒子為檢測對象，利用流式細(xì)胞 儀定量分析HeLa細(xì)胞對DOXiMSN-SS-CHI-FA-PEG納米粒子的攝取行為，如圖7所示，在pH = 6.5時(shí)HeLa細(xì)胞攝取的納米粒子的量明顯高于pH=7.4時(shí)，其平均熒光強(qiáng)度(MFI)是pH=7.4 時(shí)的4.2倍。這些結(jié)果證明在pH=6.5時(shí)載體粒子脫除保護(hù)層PEG從而裸露出靶向葉酸，F(xiàn)A使 載體納米粒子順利進(jìn)入細(xì)胞。這也驗(yàn)證了本發(fā)明所提出的腫瘤引發(fā)靶向能力。
[0069]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和 原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有腫瘤引發(fā)靶向能力的藥物運(yùn)載控釋系統(tǒng)，其特征在于，具有三層核殼結(jié)構(gòu)， 內(nèi)層為載藥的介孔硅納米粒子，中間層為葉酸修飾的疊氮化殼聚糖，外層為聚乙二醇。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有腫瘤引發(fā)靶向能力的藥物運(yùn)載控釋系統(tǒng)，其特征在 于，所述介孔娃納米粒子與所述葉酸修飾的疊氮化殼聚糖通過雙硫鍵連接，所述葉酸修飾 的疊氮化殼聚糖與所述聚乙二醇通過亞胺鍵連接。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有腫瘤引發(fā)靶向能力的藥物運(yùn)載控釋系統(tǒng)，其特征在 于，所述介孔娃納米粒子為疏基功能化介孔娃納米粒子，其粒徑為80_120nm。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有腫瘤引發(fā)靶向能力的藥物運(yùn)載控釋系統(tǒng)，其特征在 于，所述葉酸修飾的疊氮化殼聚糖的分子量在30000以下、3500以上。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有腫瘤引發(fā)靶向能力的藥物運(yùn)載控釋系統(tǒng)，其特征在 于，所述聚乙二醇為醛基化聚乙二醇，其重均分子量為1900。6. -種具有腫瘤引發(fā)靶向能力的藥物運(yùn)載控釋系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，包括如 下步驟：51. 包含模板CTAB的巰基功能化介孔硅納米粒子CTAB麵SN-SH的制備；52. 雙硫功能化介孔硅納米粒子CTAB麵SN-SS-NH2的制備:將步驟S1制得的CTAB麵SN-SH 加入溶劑中并充分分散，CTABOMSN-SH與溶劑的用量比為600mg: 120-150mL，繼續(xù)加入與 CTAB麵SN-SH等質(zhì)量的s-(2-氨乙?guī)€基)-2-巰基吡啶鹽酸鹽并充分?jǐn)嚢?，反?yīng)于室溫下進(jìn)行 24h，離心并用水和甲醇清洗數(shù)次，真空干燥，即得； S3 .炔基修飾的介孔硅納米粒子CTABiMSN-SS-alkyne的制備：將步驟S2制得的CTABO MSN-SS-NH2加入溶劑中并充分分散，CTABiMSN-SS-NH2與溶劑的用量比為450mg: 80-120mL， 加入適量溴丙炔并攪拌混合，CTAB@MSN-SS-NH2與溴丙炔的用量比為450mg: 3-4mL，反應(yīng)于 室溫下進(jìn)行24h，離心并用水和甲醇清洗數(shù)次，真空干燥，即得；54. 去除模板CTAB的介孔硅納米粒子MSN-SS-alkyne的制備：將步驟S3制得的CTABO MSN-SS-alkyne加入甲醇與濃鹽酸的混合溶液中，CTABiMSN-SS-alkyne與混合溶液的用量 比為500mg:80-100mL，混合溶液由濃鹽酸和甲醇按體積比為1:15-20混合而成，回流48h,然 后用水和甲醇超聲多次洗滌，冷凍干燥，即得；55. 葉酸修飾的疊氮化殼聚糖N3-CHI-FA的制備：將N3CH2COOH和CHI溶解在適量水中， N3CH2COOH、CHI和水的用量比為180mg:1400-1500mg:100mL，加入適量EDC · HC1后室溫下攪 拌活化24h，再加入適量FA室溫避光下劇烈攪拌24h，其中EDC · HC1、FA與N3CH2COOH的質(zhì)量之 比為480: 200:180，反應(yīng)結(jié)束后抽濾不溶物質(zhì)并將濾液用截留分子量3500的透析袋透析，冷 凍干燥，即得；56. 殼聚糖包裹的載藥介孔硅納米粒子的制備DOXOMSN-SS-CHI-FA:將步驟S4制得的 MSN-SS-a 1 kyne加入甲醇與水的混合液中并充分分散，甲醇與水的體積比為1:4-5，MSN-SS-alkyne與混合液的用量比為200mg: 20-25mL，加入適量鹽酸阿霉素，室溫下劇烈攪拌24h，然 后加入N3-CHI-FA、五水硫酸銅以及抗壞血酸鈉，N3-CHI-FA和五水硫酸銅的質(zhì)量均與MSN-SS-alkyne質(zhì)量相等，鹽酸阿霉素與MSN-SS-alkyne質(zhì)量比為1:4,抗壞血酸鈉與MSN-SS-alkyne 的質(zhì)量比為 1.7:1，反應(yīng)在氮?dú)獗Ｗo(hù)和室溫下反應(yīng) 3 天，離心并用水和甲醇清洗數(shù)次， 真空干燥，即得；57. 具有腫瘤引發(fā)靶向能力的藥物運(yùn)載控釋系統(tǒng)DOXiMSN-SS-CHI-FA-PEG的制備:將S5 制備的DOX麵SN-SS-CHI-FA與等質(zhì)量的醛基化聚乙二醇加入pH=7.4的PBS溶液中并充分分 散，DOXiMSN-SS-CHI-FA與PBS溶液的用量比為200mg: 50mL，室溫下攪拌反應(yīng)24h，然后用水 多次超聲洗滌，冷凍干燥后，即得。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種具有腫瘤引發(fā)靶向能力的藥物運(yùn)載控釋系統(tǒng)的制備方 法，其特征在于，步驟S1的CTAB麵SN-SH為包含模板CTAB的MCM-41型巰基功能化介孔硅納米 粒子。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種具有腫瘤引發(fā)靶向能力的藥物運(yùn)載控釋系統(tǒng)的制備方 法，其特征在于，步驟S2與S3中的所述溶劑為甲醇或乙醇。9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種具有腫瘤引發(fā)靶向能力的藥物運(yùn)載控釋系統(tǒng)的制備方 法，其特征在于，步驟S4中使用的濃鹽酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37%。10. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種具有腫瘤引發(fā)靶向能力的藥物運(yùn)載控釋系統(tǒng)的制備方 法，其特征在于，步驟S7中使用的醛基化聚乙二醇的制備方法如下:將重均分子量為1900的 帶有端氨基的聚乙二醇溶解在干燥的二氯甲烷中，繼續(xù)加入適量對醛基苯甲酸、二環(huán)己基 碳二亞胺和4-二甲氨基吡啶，其中帶有端氨基的聚乙二醇、對醛基苯甲酸、二環(huán)己基碳二亞 胺、4-二甲氨基吡啶與二氯甲烷的用量比為5.(^ :3.(^:4.28:0.328:15〇1^，室溫下反應(yīng) 24h，過濾，濾液旋蒸得白色粉末，白色粉末加水溶解后用二氯甲烷多次萃取，萃取時(shí)有機(jī)層 加無水硫酸鈉除水，最后用冷乙醚沉淀，即得。
【文檔編號】A61K31/704GK105963702SQ201610269944
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年4月27日
【發(fā)明人】李草, 張敏, 江兵兵, 葉海峰, 郭莉, 陳學(xué)琴
【申請人】湖北大學(xué)