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一種具有生物活性的無菌膠原液和無菌膠原貼敷料的制備方法

文檔序號:10620099閱讀:627來源:國知局
一種具有生物活性的無菌膠原液和無菌膠原貼敷料的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有生物活性的無菌膠原液和無菌膠原貼敷料的制備方法;無菌膠原液的制備方法為將動物的筋腱進行脫脂、切片、消毒、低溫粉碎,再進行酸溶酶解、過濾除渣得膠原原液;再將其鹽析、純化,即可得到高純度的具有生物活性的無菌膠原液;無菌膠原貼敷料的制備方法為將上述無菌膠原液灌裝入含有非織造布鋁箔袋中,封口、冷凍,再進行低溫輻照滅菌即可得到具有生物活性的無菌膠原貼敷料。本發(fā)明在低溫條件下輻照,保持了膠原的活性,避免了膠原因輻照而變性或者發(fā)生交聯(lián)反應(yīng);本發(fā)明采用超濾純化代替?zhèn)鹘y(tǒng)的透析純化,縮短了純化的時間;采用自動化系統(tǒng)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的半自動操作,避免了人手污染,保證了產(chǎn)品的潔凈度、純度、生物活性。
【專利說明】
一種具有生物活性的無菌膠原液和無菌膠原貼敷料的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種具有生物活性的無菌膠原液和無菌膠原貼敷料的制備方法。【背景技術(shù)】
[0002]膠原由三條肽鏈擰成螺旋形的纖維狀的細胞外蛋白質(zhì),占全身蛋白質(zhì)的30%以上,具有獨特的生理活性。膠原蛋白富含人體必需的甘氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸等氨基酸,是細胞外基質(zhì)中最重要的組成部分,具有強的生物活性及生物功能,能參與細胞的迀移、分化和增殖,使骨腱、軟骨和皮膚具有一定的機械強度,且由于其微弱的抗原性和良好的生物相容性,在燒傷、創(chuàng)傷、眼角膜疾病、美容、硬組織修復(fù)、創(chuàng)面止血等醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域用途廣泛。
[0003]膠原是哺乳動物體內(nèi)含量最多的蛋白質(zhì),廣泛分布于角膜、皮膚、骨骼、韌帶、腱等部位,是組成結(jié)締組織的重要結(jié)構(gòu)蛋白。因此從動物組織提取膠原是獲得膠原的重要途徑。 在提取膠原的生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生一些副產(chǎn)品明膠,明膠是由膠原變性解螺旋后不再具有生物活性的肽鏈組成。膠原之所以具有生物活性,主要取決于它的三螺旋結(jié)構(gòu),所以明膠是沒有生物活性的。
[0004]目前,膠原的提取方法主要有堿法、酸法、鹽法及酶法。堿法提取的優(yōu)點在于反應(yīng)迅速徹底,其缺點在于造成膠原肽鍵水解,破壞膠原的三螺旋結(jié)構(gòu),使含有羥基和巰基的氨基酸破壞且產(chǎn)生消旋。其產(chǎn)生的D型氨基酸有毒,有的甚至有致癌、致畸和致突變的危害, 因此,堿法提取膠原不適合用于生物醫(yī)用材料用膠原的提取。酸法提取膠原主要是通過低離子濃度及酸性環(huán)境破壞膠原分子間的鹽鍵和Schiff鍵,從而使膠原纖維溶脹、溶解來提取膠原。其優(yōu)點在于最大限度的保持膠原分子的三螺旋結(jié)構(gòu),即生物活性,其缺點主要是產(chǎn)率低。中性鹽法提取膠原的主要缺點是其工藝不穩(wěn)定,使得提取的膠原分子結(jié)構(gòu)也不穩(wěn)定。
[0005]現(xiàn)有常規(guī)的酶法具有水解反應(yīng)快、對環(huán)境友好等優(yōu)點,而且提取的膠原純度高、物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,酶解可切除膠原分子端肽的非螺旋區(qū),降低膠原的抗原性,但其缺點是水解不夠徹底,制備出的膠原的生物活性低。
[0006]目前醫(yī)用的膠原對微生物限度具有嚴格的要求,基本上所有的產(chǎn)品都要求達到無菌級別,但提供工藝上目前很難實現(xiàn)。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了解決上述存在問題,本發(fā)明通過研究,采用最終滅菌法來控制膠原及其產(chǎn)品的微生物限度,使其達到無菌的同時也不改變其生物活性,從而使其應(yīng)用更加安全,有效。
[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種具有生物活性的無菌膠原液的制備方法。
[0009]本發(fā)明的另一目的在于提供一種具有生物活性的無菌膠原貼敷料的制備方法。
[0010]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:一種具有生物活性的無菌膠原液的制備方法,包括如下步驟:1)將動物的筋腱進行脫脂、切片、消毒;2)將上述消毒后的筋腱在超低溫條件下進行粉碎,得到細絲狀的筋腱纖維;3)將粉碎后的筋腱組織進行酸溶酶解,再過濾除渣得膠原原液;4)將膠原原液進一步鹽析、純化,即可得到高純度的具有生物活性的無菌膠原液。
[0011]進一步的,上述筋腱為牛筋腱、豬筋腱或鼠尾筋腱。
[0012]進一步的,上述步驟2)中所述的粉碎溫度為-150°C?_60°C。
[0013]進一步的,上述步驟3)中所述的酸溶酶解的具體操作為:將所獲得的筋腱纖維加入冰醋酸和胃蛋白酶的混合液中,以10~50rpm的攪拌速度攪拌3~10小時。
[0014]進一步的,上述純化是采用超濾純化系統(tǒng)進行的純化,超濾系統(tǒng)純化的條件為:進口端壓力為l〇~40psi,回流端壓力為0~10psi,進行恒體積的6~12倍超濾。
[0015]進一步的,上述具有生物活性的無菌膠原液的整個制備過程均在萬級環(huán)境下進行。
[0016]—種具有生物活性的無菌膠原貼敷料的制備方法,包括以下步驟:1)將權(quán)利要求1~6中任一制備的具有生物活性的無菌膠原液在十萬級或以上潔凈環(huán)境下灌裝入含有非織造布鋁箱袋中,封口;2)將上一步封口好的鋁箱袋進行冷凍;3)將冷凍后的鋁箱袋放入裝有干冰或超低溫冰盒的泡沫箱或保溫箱中并密封,進行低溫輻照滅菌,解凍后即可得到具有生物活性的無菌膠原貼敷料。
[0017]進一步的,上述步驟2)中所述冷凍的溫度為_80°C?-10°C,冷凍時間為18? 72h〇
[0018]進一步的,上述步驟3)中所述低溫輻照滅菌的輻照劑量為15~40kGy,溫度為-75°C?0°C。
[0019]上述任一制備的具有生物活性的無菌膠原貼敷料在皮膚損傷修復(fù)產(chǎn)品、創(chuàng)面修復(fù)產(chǎn)品、醫(yī)學(xué)美容產(chǎn)品或化妝品中的應(yīng)用。
[0020]本發(fā)明的有益效果是:1)本發(fā)明在低溫條件下對膠原液或膠原貼敷料進行輻照滅菌,可使產(chǎn)品達到無菌(無菌保證水平SAL=10 6)的同時,保持膠原的活性,避免了膠原在輻照的過程中變性失活或者發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)造成的功能下降甚至失活。
[0021]2)本發(fā)明采用超濾純化代替?zhèn)鹘y(tǒng)的透析純化,效果是縮短了純化的時間,另外采用自動化系統(tǒng)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的半自動操作,避免了人手污染,保證了產(chǎn)品的潔凈度、純度、生物活性。
[0022]3)本發(fā)明將動物組織在超低溫條件下進行粉碎,破碎組織成粉末狀或細絲狀,使組織在酸溶酶解的過程中大大的增加了反應(yīng)的接觸面積,使反應(yīng)的時間縮短且提高產(chǎn)率, 有利于膠原保持完好的生物活性?!靖綀D說明】
[0023]圖1為實施例1制備的膠原液和實施例制備的膠原貼敷料人SDS-PAGE電泳檢測, M為sigma標(biāo)準品,1為實施例1制備的膠原液,2為實施例2制備的膠原貼敷料。【具體實施方式】
[0024]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明,但并不局限于此。
[0025]實施例1具有生物活性的無菌膠原液的制備方法1)新鮮的健康牛筋腱,切除油脂去筋膜,清洗去除雜質(zhì),冷凍后切片,消毒、保存?zhèn)溆?)取上述消毒過后的牛筋腱在_80°C?_60°C條件下進行粉碎,得到細絲狀的筋腱纖維;3)在筋腱纖維中加入100倍體積的0.5mol/L的冰醋酸和400mg/L的胃蛋白酶的混合液中,持續(xù)攪拌3小時,環(huán)境溫度范圍為25?28°C,攪拌速度50rpm ;將上述混合液過濾除渣得膠原原液;4)將上述膠原原液加入等體積的1.4mol/L的氯化鈉溶液進行鹽析,取沉淀,將沉淀重新加入0.5mol/L的冰醋酸進行溶解,通過超濾設(shè)備進行純化,超濾系統(tǒng)的條件為:口端壓力為40psi,回流端為lOpsi,進行恒體積的6倍超濾即可得到高純度的具有生物活性的無菌膠原液。
[0026]實施例2:具有生物活性的無菌膠原貼敷料的制備方法1)將實施例1中制備的具有生物活性的無菌膠原液在十萬級或以上潔凈環(huán)境下采用半自動灌裝設(shè)備進行灌裝,灌裝入裝有非織造布鋁箱袋中,封口;其中每個鋁箱袋裝入 30ml的膠原液,非織造布的形狀為方形,尺寸為20cmX 10cm ;6)將上述封口好的鋁箱袋在-18°C以下進行冷凍24小時;7)將上述冷凍好的鋁箱袋裝入保溫箱中,保溫箱中裝入4片超低溫冰盒,使保溫箱的溫度維持〇°C以下狀態(tài),密封保溫箱,送到輻照中心進行40kgy的輻照,室溫解凍后即可得到具有生物活性的膠原貼敷料。
[0027]上述具有生物活性的無菌膠原貼敷料可應(yīng)用于創(chuàng)面的修復(fù),如燒傷創(chuàng)面、燙傷創(chuàng)面、激光美容等。
[0028]實施例3具有生物活性的無菌膠原液的制備方法1)新鮮的健康豬筋腱,切除油脂去筋膜,清洗去除雜質(zhì),冷凍后切片,消毒、保存?zhèn)溆?)取上述消毒過后的筋腱在_150°C?-100°C條件下進行粉碎,得到細絲狀的筋腱纖維;3)在筋腱纖維中加入150倍體積的0.4mol/L的冰醋酸和300mg/L的胃蛋白酶的混合液中,持續(xù)攪拌10小時,環(huán)境溫度范圍為25?27°C,攪拌速度lOrpm ;將上述混合液過濾除渣得膠原原液;4)將上述膠原原液加入等體積的1.4mol/L的氯化鈉溶液進行鹽析,取沉淀,將沉淀重新加入0.4mol/L的冰醋酸進行溶解,通過超濾設(shè)備進行純化,超濾系統(tǒng)的條件為:進口端壓力為30psi,回流端為5psi,進行恒體積的12倍超濾即可得到高純度的具有生物活性的無菌膠原液。
[0029]實施例4:具有生物活性的無菌膠原貼敷料的制備方法1)將實施例3中制備的具有生物活性的無菌膠原液在十萬級或以上潔凈環(huán)境下進行灌裝,裝入含有非織造布的鋁箱袋中,封口;其中每個鋁箱袋裝入25ml的膠原液,非織造布為圓形,直徑為21.5cm ;2)將上述封口好的鋁箱袋-80°C冷凍18小時以上;3)將上述冷凍好的鋁箱袋裝入保溫箱中,保溫箱中裝入4kg的干冰,使保溫箱的溫度維持〇°C以下低溫狀,密封保溫箱,送到輻照中心進行15kgy的輻照,室溫解凍后即可得到具有生物活性的無菌膠原貼敷料。
[0030]上述具有生物活性的無菌膠原貼敷料可應(yīng)用于創(chuàng)面的修復(fù),如燒傷創(chuàng)面、燙傷創(chuàng)面、激光美容等。
[0031]實施例5:具有生物活性的無菌膠原液的制備方法1)新鮮的健康鼠尾筋腱,切除油脂去筋膜,清洗去除雜質(zhì),冷凍后切段,消毒、保存?zhèn)溆?)取上述消毒過后的筋腱在-110°C?_90°C條件下進行粉碎,得到細絲狀的筋腱纖維;3)在筋腱纖維中加入200倍體積的0.lmol/L的冰醋酸和400mg/L的胃蛋白酶的混合液中,持續(xù)攪拌6小時,環(huán)境溫度范圍為25?28°C,攪拌速度15rpm ;將上述混合液過濾除渣得膠原原液;4)將上述膠原原液加入等體積的1.4mol/L的氯化鈉溶液進行鹽析,取沉淀,將沉淀重新加入0.2mol/L的冰醋酸進行溶解,通過超濾設(shè)備進行純化,超濾系統(tǒng)的條件為:口端壓力為30psi,回流端為Opsi,進行恒體積的8倍超濾即可得到高純度的具有生物活性的無菌膠原液。
[0032]實施例6具有生物活性的無菌膠原貼敷料的制備方法1)將實施例5中制備的具有生物活性的無菌膠原液在十萬級或以上潔凈環(huán)境下進行灌裝,裝入含有非織造布的鋁箱袋中,封口;其中每個鋁箱袋裝入35ml的膠原液,非織造布為橢圓形,直徑為9.5cmX 6cm ;2)將上述封口好的鋁箱袋在-10°C以下冷凍20小時;7)將上述冷凍好的鋁箱袋裝入保溫箱中,保溫箱中裝入6片超低溫冰盒,使保溫箱的溫度維持在_75°C以下低溫狀態(tài),密封保溫箱,送到輻照中心進行27kgy的輻照,室溫解凍后即可得到具有生物活性的無菌膠原貼敷料。
[0033]上述具有生物活性的無菌膠原貼敷料可應(yīng)用于創(chuàng)面的修復(fù),如燒傷創(chuàng)面、燙傷創(chuàng)面、激光美容等。
[0034]SDS-PAGE 電泳檢測下面分別對實施例1制備的具有生物活性的無菌膠原液、實施例2制備的具有生物活性的無菌膠原貼敷料進行SDS-PAGE電泳檢測,檢測結(jié)果查如果圖1所示。從圖1中可以看出,本發(fā)明制備的膠原液和膠原貼敷料中膠原蛋白具有良好的生物活性及純度。
[0035]細胞毒性檢測對上述實施例制備的具有生物活性的無菌膠原貼敷料進行生物性能檢測,結(jié)果顯示其細胞毒性計分不大于1,無致敏反應(yīng),無皮內(nèi)刺激反應(yīng)或極輕微刺激,無亞慢性全身毒性,且無遺傳毒性。
[0036]微生物及化學(xué)性能檢測對上述實施例制備的具有生物活性的無菌膠原貼敷料進行微生物檢測,結(jié)果顯示無菌。
[0037]對上述實施例制備的具有生物活性的無菌膠原貼敷料進行化學(xué)性能檢測,結(jié)果顯示,具有典型的I型膠原蛋白電泳圖譜,其重金屬總量不大于10 yg/g。
[0038]創(chuàng)面修復(fù)作用檢測利用上述實施例制備的具有生物活性的無菌膠原貼敷料治療淺II度燒傷創(chuàng)面隨機、 對照、多中心臨床實驗結(jié)果:本試驗樣本量為160例,共選擇6家臨床試驗機構(gòu)進行實驗,試驗器械為膠原貼敷料,對照器械為凡士林敷料,實驗結(jié)果顯示膠原貼敷料能較快縮短淺II 度燒傷創(chuàng)面的愈合時間、改善局部癥狀體征,促進創(chuàng)面愈合,提高創(chuàng)面的綜合愈合率,從而減輕患者在創(chuàng)面修復(fù)過程中的痛苦,值得臨床推廣應(yīng)用。
[0039] 為本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員容易理解,以上所述僅為本發(fā)明專利的較佳實施例,并不用以限制本發(fā)明,凡本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等,均落在本發(fā)明要求的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種具有生物活性的無菌膠原液的制備方法,其特征在于:包括如下步驟:1)將動物的筋腱進行脫脂、切片、消毒;2)將上述消毒后的筋腱在超低溫條件下進行粉碎,得到細絲狀的筋腱纖維;3)將粉碎后的筋腱組織進行酸溶酶解,再過濾除渣得膠原原液;4)將膠原原液進一步鹽析、純化,即可得到高純度的具有生物活性的無菌膠原液。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有生物活性的無菌膠原液的制備方法,其特征在于: 所述筋腱為牛筋腱、豬筋腱或鼠尾筋腱。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有生物活性的無菌膠原液的制備方法,其特征在于: 步驟2)中所述的粉碎溫度為-150°C?_60°C。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有生物活性的無菌膠原液的制備方法,其特征在于: 步驟3)中所述的酸溶酶解的具體操作為:將所獲得的筋腱纖維加入冰醋酸和胃蛋白酶的 混合液中,以10~50rpm的攪拌速度攪拌3~10小時。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有生物活性的無菌膠原液的制備方法,其特征在 于:所述的純化是采用超濾純化系統(tǒng)進行的純化,超濾系統(tǒng)純化的條件為:進口端壓力為 10~40psi,回流端壓力為0~10psi,進行恒體積的6~12倍超濾。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有生物活性的無菌膠原液的制備方法,其特征在于: 上述具有生物活性的無菌膠原液的整個制備過程均在十萬級或以上環(huán)境下進行。7.—種具有生物活性的無菌膠原貼敷料的制備方法,其特征在于:包括以下步驟:1)將權(quán)利要求1~6中任一制備的具有生物活性的無菌膠原液在十萬級或以上潔凈環(huán) 境下灌裝入含有非織造布鋁箱袋中,封口;2)將上一步封口好的鋁箱袋進行冷凍;3)將冷凍后的鋁箱袋放入裝有干冰或超低溫冰盒的泡沫箱或保溫箱中并密封,進行低 溫輻照滅菌,解凍后即可得到具有生物活性的無菌膠原貼敷料。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種具有生物活性的無菌膠原貼敷料的制備方法,其特征在 于:步驟2)中所述冷凍的溫度為-80°C?-10°C,冷凍時間為18?72h。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種具有生物活性的無菌膠原貼敷料的制備方法,其特征在 于:步驟3)中所述低溫輻照滅菌的輻照劑量為15~40kGy,溫度為-75°C?0°C。10.權(quán)利要求7~9中任一制備的具有生物活性的無菌膠原貼敷料在制備皮膚損傷修復(fù) 產(chǎn)品、創(chuàng)面修復(fù)產(chǎn)品、醫(yī)學(xué)美容產(chǎn)品或化妝品中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K38/39GK105983094SQ201510070015
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月9日
【發(fā)明人】陳淡嫦, 李奕恒, 周小潔, 曾進朋
【申請人】廣州創(chuàng)爾生物技術(shù)股份有限公司
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