用于修復(fù)子宮內(nèi)膜損傷的干細(xì)胞復(fù)合膠原支架試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于修復(fù)子宮內(nèi)膜損傷的干細(xì)胞復(fù)合膠原支架試劑盒及其制備方法，其由人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和膠原支架組成。其制備方法包括臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞傳代、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與膠原支架復(fù)合培養(yǎng)的步驟。本發(fā)明試劑盒采用膠原支架臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行內(nèi)膜修復(fù)，與傳統(tǒng)子宮內(nèi)膜損傷后修復(fù)方法相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：膠原支架存在可為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞提供附著位點(diǎn)，使其定位于內(nèi)膜損傷部位，有利于局部組織修復(fù)，提高修復(fù)有效性并減低細(xì)胞移位帶來的危險(xiǎn)性；同時(shí)膠原支架可促進(jìn)細(xì)胞分化。
【專利說明】
用于修復(fù)子宮內(nèi)膜損傷的干細(xì)胞復(fù)合膠原支架試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于婦產(chǎn)科學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)計(jì)一種用于修復(fù)子宮內(nèi)膜損傷的干細(xì)胞復(fù)合膠原支架試劑盒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]子宮內(nèi)膜嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)內(nèi)膜功能性修復(fù)障礙，代之以結(jié)締組織增生修復(fù)，子宮前后壁發(fā)生纖維化，瘢痕形成，臨床上主要表現(xiàn)為宮腔粘連、閉經(jīng)及子宮性不孕等。如何重建這些患者的內(nèi)膜并使其恢復(fù)正常的形態(tài)及功能是當(dāng)今再生醫(yī)學(xué)的難題之一。在研究的過程中，學(xué)者們提出過多種不同的治療方式，如宮內(nèi)節(jié)育器使用，球囊導(dǎo)管，粘連分離術(shù)后雌激素或者透明質(zhì)酸應(yīng)用等，各種治療方式各有其優(yōu)缺點(diǎn)，縱觀文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果，這些治療效果存在爭(zhēng)議并且令人失望。因此，針對(duì)子宮內(nèi)膜損傷亟需新型治療方法。
[0003]隨著多種不同來源的人體干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)和鑒定，干細(xì)胞的治療應(yīng)用可能性也在不斷被發(fā)掘，并建立了再生醫(yī)學(xué)這個(gè)新的醫(yī)學(xué)分支，旨在利用干細(xì)胞治療目前尚不能用藥物治愈的疾病。
[0004]間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)為間質(zhì)組織來源的與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)生物學(xué)性狀相似，具有多向分化潛能的細(xì)胞。MSCs是多潛能的成體基質(zhì)細(xì)胞，能分化為多種間質(zhì)起源的組織，如成骨、軟骨和脂肪細(xì)胞，在特殊環(huán)境下，還能橫向分化為肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝胰細(xì)胞等多種其他組織細(xì)胞。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSCs)即是MSCs的一種。與BM-MSCs相比，UC-MSCs的SH2、CD106和HLA-1表達(dá)低，OCT mRNA表達(dá)陽性，這說明臍帶UC-MSCs是一種更原始的MSCs群。大量的體外實(shí)驗(yàn)證明，在不同誘導(dǎo)條件下，UC-MSCs不僅可以向多種中胚層來源的組織細(xì)胞分化，如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成肌細(xì)胞等，還可以向外胚層和內(nèi)胚層來源的神經(jīng)元樣細(xì)胞和肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化。這提示我們可以利用UC-MSCs進(jìn)行子宮內(nèi)膜的修復(fù)。
[0005]由于人類子宮空腔結(jié)構(gòu)的特殊性，利用干細(xì)胞的治療很難將細(xì)胞定位到受損內(nèi)膜處，細(xì)胞易隨著血液、體液等流動(dòng)發(fā)生組織擴(kuò)散及損失，其臨床應(yīng)用的有效性和安全性受到制約，這要求在修復(fù)的同時(shí)能夠?yàn)榧?xì)胞在局部組織附著提供條件。膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，其具有來源廣泛、生物相容性良好、可降解、制備工藝簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證實(shí)膠原支架可為細(xì)胞提供附著位點(diǎn)并且能夠促進(jìn)細(xì)胞的分化。
[0006]在本發(fā)明之前，尚無UC-MSCs修復(fù)子宮內(nèi)膜損傷的相關(guān)研究報(bào)道。膠原支架作為一種生物材料已經(jīng)SFDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床皮膚及口腔黏膜修復(fù)中，具有良好的生物相容性、可降解性及安全性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是用于修復(fù)子宮內(nèi)膜損傷的干細(xì)胞復(fù)合膠原支架試劑盒，為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞提供附著位點(diǎn)，使其定位于內(nèi)膜損傷部位，有利于局部組織修復(fù)，提高修復(fù)有效性并減低細(xì)胞移位帶來的危險(xiǎn)性。
[0008]—種用于修復(fù)子宮內(nèi)膜損傷的干細(xì)胞復(fù)合膠原支架試劑盒，由人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和膠原支架組成。
[0009]所述人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院遺傳所干細(xì)胞庫分離與培養(yǎng)，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞表面抗原鑒定:顯示⑶14、⑶34和⑶45為陰性，⑶29、⑶44和⑶105為陽性，呈現(xiàn)為間質(zhì)干細(xì)胞的特征。
[0010]所述膠原支架由煙臺(tái)正海生物技術(shù)有限公司提供，已經(jīng)SFDA批準(zhǔn)應(yīng)用于皮膚及口腔黏膜修復(fù)。
[0011]所述的嚴(yán)重子宮內(nèi)膜損傷是指各種原因造成的子宮內(nèi)膜過度損傷，內(nèi)膜功能性修復(fù)障礙，代之以結(jié)締組織增生修復(fù)，子宮壁發(fā)生纖維化，瘢痕形成。
[0012]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種上述用于修復(fù)子宮內(nèi)膜損傷的干細(xì)胞復(fù)合膠原支架試劑盒的制備方法，其技術(shù)方案如下:
[0013]—種用于修復(fù)子宮內(nèi)膜損傷的干細(xì)胞試劑盒的制備方法，包括以下步驟:
[0014](I)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇:將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞解凍，加入完全培養(yǎng)液，接種于培養(yǎng)瓶中；
[0015](2)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞傳代:將上述步驟得到的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)，進(jìn)行傳代；
[0016](3)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與膠原支架復(fù)合培養(yǎng):將膠原支架剪裁，取上一步得到的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，胰酶消化后制備單細(xì)胞懸液，取細(xì)胞懸液均勻滴加到膠原支架上，從而制得用于修復(fù)子宮內(nèi)膜損傷的干細(xì)胞試劑盒。
[0017]所述步驟(I)的具體步驟是:取出裝有人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存管，立即放入水浴中，搖動(dòng)，使其解凍，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，加入完全培養(yǎng)液，混合均勻；離心，棄上清；加入DMEM/F12完全培養(yǎng)液，接種于培養(yǎng)瓶中。
[0018]所述步驟(I)中，水浴溫度為40°C，離心條件為:常溫、1200rpm，5min。
[0019]所述步驟(2)的具體步驟為:培養(yǎng)每?jī)商彀肓繐Q液一次，培養(yǎng)至貼壁細(xì)胞90%融合時(shí)，進(jìn)行傳代；吸除培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的舊培養(yǎng)液；加入磷酸鹽緩沖液(PBS)，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，以洗去殘留在瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液，吸除磷酸鹽緩沖液(PBS);培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入胰酶，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細(xì)胞表面；在倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大后，立即加入完全培養(yǎng)液終止消化；反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，細(xì)胞脫離瓶壁后形成細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液吸入離心管，離心，棄上清；用DMEM/F12完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度，接種于培養(yǎng)瓶中；置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0020]所述步驟(2)中，離心的條件是:常溫1200rpm，5min。
[0021]所述步驟(2)中，置于37°C、5% CO2、飽和濕度0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0022]所述步驟⑵中，用DMEM/F12完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2 X 15個(gè)細(xì)胞/mL。
[0023]所述步驟(3)的具體步驟為:膠原支架剪裁成合適大小，UP面朝下，置于6孔板中，用培養(yǎng)基充分濕潤(rùn)，適當(dāng)擠壓去除內(nèi)部空氣；用無菌紗布將多余培養(yǎng)基吸干；取生長(zhǎng)良好的第五代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，胰酶消化后制備單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度；取細(xì)胞懸液均勻滴加到膠原支架上，將6孔板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0024]步驟(3)中，取細(xì)胞懸液均勻滴加到膠原支架上，細(xì)胞數(shù)量約I X 106/cm2,將6孔板放入37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15min。
[0025]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明試劑盒采用膠原支架臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行內(nèi)膜修復(fù)，與傳統(tǒng)子宮內(nèi)膜損傷后修復(fù)方法相比具有以下優(yōu)點(diǎn):膠原支架存在可為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞提供附著位點(diǎn)，使其定位于內(nèi)膜損傷部位，有利于局部組織修復(fù)，提高修復(fù)有效性并減低細(xì)胞移位帶來的危險(xiǎn)性；同時(shí)膠原支架可促進(jìn)細(xì)胞分化。臍帶間充質(zhì)干細(xì)直接分化為內(nèi)膜組織或是分泌多種細(xì)胞因子促進(jìn)內(nèi)膜再生都可參與內(nèi)膜損傷后修復(fù)，達(dá)到重建內(nèi)膜目的。本發(fā)明所用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞已有商品化產(chǎn)品、膠原支架已經(jīng)SFDA批準(zhǔn)應(yīng)用于皮膚及口腔黏膜修復(fù)技術(shù)可控，安全性好，有利于干細(xì)胞治療嚴(yán)重子宮內(nèi)膜損傷的科學(xué)研究，保護(hù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利。
【附圖說明】
[0026]圖1為流式細(xì)胞術(shù)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記測(cè)定；
[0027]圖2為術(shù)后8、12周大體組織外觀；
[0028]圖3為術(shù)后8、12周離體組織手術(shù)區(qū)域HE染色觀察；
[0029]圖4為術(shù)后8、12周離體組織手術(shù)區(qū)域平滑肌免疫組化染色觀察；
[0030]圖5為術(shù)后8、12周離體組織手術(shù)區(qū)域腺體免疫組化染色觀察；
[0031]圖6為術(shù)后8、12周離體組織手術(shù)區(qū)域血管免疫組化染色觀察。
【具體實(shí)施方式】
[0032]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0033]實(shí)施例
[0034]用于修復(fù)子宮內(nèi)膜損傷的干細(xì)胞復(fù)合膠原支架試劑盒，由人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和膠原支架組成。
[0035]人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院遺傳所干細(xì)胞庫分離與培養(yǎng)，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞表面抗原鑒定:顯示⑶14、⑶34和⑶45為陰性，⑶29、⑶44和⑶105為陽性，呈現(xiàn)為間質(zhì)干細(xì)胞的特征。
[0036]膠原支架由煙臺(tái)正海生物技術(shù)有限公司提供，已經(jīng)SFDA批準(zhǔn)應(yīng)用于皮膚及口腔黏膜修復(fù)。
[0037]嚴(yán)重子宮內(nèi)膜損傷是指各種原因造成的子宮內(nèi)膜過度損傷，內(nèi)膜功能性修復(fù)障礙，代之以結(jié)締組織增生修復(fù)，子宮壁發(fā)生纖維化，瘢痕形成。
[0038]上述用于修復(fù)子宮內(nèi)膜損傷的干細(xì)胞復(fù)合膠原支架試劑盒的制備方法為:
[0039]步驟1，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇:取出凍存管，立即放入40°C水浴中，搖動(dòng)，迅速解凍；將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管，加入5mL完全培養(yǎng)液，混勾；離心(常溫1200rpm，5min)，棄上清；加入DMEM/F12完全培養(yǎng)液，接種于培養(yǎng)瓶中。
[0040]步驟2，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞傳代:培養(yǎng)每?jī)商彀肓繐Q液一次，培養(yǎng)至貼壁細(xì)胞90%融合時(shí)，進(jìn)行傳代；吸除培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液；加入PBS lmL，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，以洗去殘留在瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液，吸除PBS ;培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入胰酶lmL，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細(xì)胞表面；在倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大后，立即加入完全培養(yǎng)液ImL終止消化；反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，細(xì)胞脫離瓶壁后形成細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液吸入離心管，離心(常溫1200rpm，5min)，棄上清；用DMEM/F12完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2 X 15個(gè)細(xì)胞/mL，接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶5mL ;置37°C、5% CO2、飽和濕度CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0041]步驟3，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與膠原支架復(fù)合培養(yǎng):膠原支架剪裁成合適大小，UP面朝下，置于6孔板中，用培養(yǎng)基充分濕潤(rùn)，適當(dāng)擠壓去除內(nèi)部空氣，用無菌紗布將多余培養(yǎng)基吸干；取生長(zhǎng)良好的第五代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，胰酶消化后制備單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度；取適量細(xì)胞懸液均勻滴加到膠原支架上，細(xì)胞數(shù)量約IX 1fVcm2，將6孔板放入37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15min。
[0042]采用本發(fā)明制得的試劑盒進(jìn)行試驗(yàn)，分別做自然修復(fù)組、空白膠原支架修復(fù)組、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞膠原支架修復(fù)組，進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如下:
[0043]圖2-6分別為術(shù)后8、12周大體組織外觀、離體組織手術(shù)區(qū)域HE染色觀察、離體組織手術(shù)區(qū)域平滑肌免疫組化染色觀察、離體組織手術(shù)區(qū)域腺體免疫組化染色觀察、離體組織手術(shù)區(qū)域血管免疫組化染色觀察。
[0044]圖2中，A、B、C 術(shù)后8周；C、D、E 術(shù)后12周；其中，A、D 自然修復(fù)組；B、E—一空白膠原支架修復(fù)組；C、F—一臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞膠原支架修復(fù)組；
[0045]圖3中，A-D:術(shù)后8周；E_H:術(shù)后12周；其中，A、E——正常子宮組織；B、F——自然修復(fù)組；C、G一一空白膠原支架修復(fù)組；D、H臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞膠原支架修復(fù)組。A-H，20 X，標(biāo)尺長(zhǎng)度為1000 μ m。
[0046]圖4中，A-D:術(shù)后8周；E_H:術(shù)后12周；其中，A、E——正常子宮組織；B、F——自然修復(fù)組；C、G一一空白膠原支架修復(fù)組；D、H臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞膠原支架修復(fù)組。A-H，20 X，標(biāo)尺長(zhǎng)度為1000 μ m。
[0047]圖5 中，A-D、A’ -D’:術(shù)后 8 周；E-H、E’-H’:術(shù)后 12 周；其中，A、A’、E、E’ ——正常子宮組織；B、B’、F、F’——自然修復(fù)組；C、C’、G、G’——空白膠原支架修復(fù)組；D、H臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞膠原支架修復(fù)組。A-H，20X，標(biāo)尺長(zhǎng)度為1000 μm，A’-H’，100X，標(biāo)尺長(zhǎng)度為 500 μπ?ο
[0048]圖6 中，A-D、A’ -D’:術(shù)后 8 周；Ε-Η、Ε’-H’:術(shù)后 12 周；其中，Α、Α’、Ε、Ε’ ——正常子宮組織；Β、B’、F、F’——自然修復(fù)組；C、C’、G、G’——空白膠原支架修復(fù)組；D、H臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞膠原支架修復(fù)組。A-H，20X，標(biāo)尺長(zhǎng)度為1000 μm，A’-H’，100X，標(biāo)尺長(zhǎng)度為 500 μπ?ο
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種用于修復(fù)子宮內(nèi)膜損傷的干細(xì)胞復(fù)合膠原支架試劑盒，其特征在于:由人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和膠原支架組成。2.一種用于修復(fù)子宮內(nèi)膜損傷的干細(xì)胞試劑盒的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇:將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞解凍，加入完全培養(yǎng)液，接種于培養(yǎng)瓶中； (2)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞傳代:將上述步驟得到的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)，進(jìn)行傳代； (3)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與膠原支架復(fù)合培養(yǎng):將膠原支架剪裁，取上一步得到的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，胰酶消化后制備單細(xì)胞懸液，取細(xì)胞懸液均勻滴加到膠原支架上，從而制得用于修復(fù)子宮內(nèi)膜損傷的干細(xì)胞試劑盒。3.如權(quán)利要求2所述的用于修復(fù)子宮內(nèi)膜損傷的干細(xì)胞試劑盒的制備方法，其特征在于:所述步驟(I)的具體步驟是:取出裝有人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存管，立即放入水浴中，搖動(dòng)，使其解凍，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，加入完全培養(yǎng)液，混合均勻；離心，棄上清；加入DMEM/F12完全培養(yǎng)液，接種于培養(yǎng)瓶中。4.如權(quán)利要求3所述的用于修復(fù)子宮內(nèi)膜損傷的干細(xì)胞試劑盒的制備方法，其特征在于:所述步驟(I)中，水浴溫度為40°C ;離心條件為:常溫，1200rpm，5min。5.如權(quán)利要求2所述的用于修復(fù)子宮內(nèi)膜損傷的干細(xì)胞試劑盒的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)的具體步驟為:培養(yǎng)每?jī)商彀肓繐Q液一次，培養(yǎng)至貼壁細(xì)胞90%融合時(shí)，進(jìn)行傳代；吸除培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的舊培養(yǎng)液；加入磷酸鹽緩沖液，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，以洗去殘留在瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液，吸除磷酸鹽緩沖液；培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入胰酶，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細(xì)胞表面；在倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大后，立即加入完全培養(yǎng)液終止消化；反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，細(xì)胞脫離瓶壁后形成細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液吸入離心管，離心，棄上清；用DMEM/F12完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度，接種于培養(yǎng)瓶中；置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。6.如權(quán)利要求5所述的用于修復(fù)子宮內(nèi)膜損傷的干細(xì)胞試劑盒的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中，離心的條件是:常溫，1200rpm，5min。7.如權(quán)利要求5所述的用于修復(fù)子宮內(nèi)膜損傷的干細(xì)胞試劑盒的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中，置于37°C、5% CO2、飽和濕度0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。8.如權(quán)利要求5所述的用于修復(fù)子宮內(nèi)膜損傷的干細(xì)胞試劑盒的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中，用DMEM/F12完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2 X 15個(gè)細(xì)胞/mL。9.如權(quán)利要求2所述的用于修復(fù)子宮內(nèi)膜損傷的干細(xì)胞試劑盒的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)的具體步驟為:膠原支架剪裁成合適大小，UP面朝下，置于6孔板中，用培養(yǎng)基充分濕潤(rùn)，適當(dāng)擠壓去除內(nèi)部空氣；用無菌紗布將多余培養(yǎng)基吸干；取生長(zhǎng)良好的第五代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，胰酶消化后制備單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度；取細(xì)胞懸液均勻滴加到膠原支架上，將6孔板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。10.如權(quán)利要求2所述的用于修復(fù)子宮內(nèi)膜損傷的干細(xì)胞試劑盒的制備方法，其特征在于:步驟(3)中，取細(xì)胞懸液均勻滴加到膠原支架上，細(xì)胞數(shù)量約I X 1fVcm2，將6孔板放入37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15min。
【文檔編號(hào)】A61L27/24GK105983133SQ201510051011
【公開日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2015年1月30日
【發(fā)明人】胡婭莉, 薛白, 曹昀, 顏桂軍, 戴建武
【申請(qǐng)人】南京鼓樓醫(yī)院