一種人工血管及其制備方法
【專利摘要】一種人工血管及其制備方法，屬于器官制造及生物材料技術領域。該人工血管包括外皮層、成纖維細胞層、平滑肌細胞層、內(nèi)皮細胞層和內(nèi)腔。本發(fā)明利用等離子噴涂、電噴涂、電紡絲、倒模和3D打印綜合技術實現(xiàn)內(nèi)皮層、平滑肌細胞層、成纖維細胞層和外皮層在三維空間的有序排布，采用抗凝血因子增強人工血管的抗凝血性，采用生長因子控釋的辦法實現(xiàn)其中干細胞的分步誘導分化，并經(jīng)脈動反應器對人工血管進行培養(yǎng)，使其在結(jié)構(gòu)和功能上模擬天然動物血管，為血管移植修復提供相應的替代品，本發(fā)明對于其他管狀組織和器官，如食管、氣管、輸卵管、膽管、尿道和膀胱等同樣適用。
【專利說明】
_種人工血管及其制備方法
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及一種人工血管及其制備方法，屬于器官制造及生物材料技術領域。【背景技術】
[0002]據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，心血管類疾病是全球發(fā)病率、死亡率最高的疾病之一，全球每年約有超過1，700萬人死于心臟疾病。在歐洲發(fā)達國家心血管類疾病已成為最大的致死原因，每年造成至少200萬人死亡，約占總死亡人數(shù)的40%。僅美國每年的血管移植物就超過140萬例。在我國，隨著當代心腦血管疾病的增多，下肢靜脈病發(fā)病率和冠狀動脈搭橋手術也逐年增加，僅北京阜外醫(yī)院每年手術1000例左右，且以20%的速度遞增。我國先天性心臟病的發(fā)病率是6.7%。，每年有數(shù)以萬計的病人接受手術治療，其中大多數(shù)需要人工血管和帶有血管通道的瓣膜。臨床上對人工血管移植物的需求日益突出。隨之而來的問題便是人工血管的制作工藝和移植物的選取。臨床上血管移植物一般應具備以下幾個特性:①良好的血液相容性，無血栓形成。②足夠的力學性能和抗縫合強度。③良好的生物可降解性和組織再生能力。④溶出物、滲出物及降解物無毒、無免疫排異反應。⑤制備方法簡單、材料來源廣泛、價格低廉。
[0003]目前臨床上血管移植主要采取自體移植或同種異體移植，供體來源受到很大的限制。利用組織工程或3D打印技術可以制備出一些血管類似物，但此類產(chǎn)品性能均存在著嚴重的缺陷[Nerem RM，et al.Ann Rev B1med Eng 2001 ;3:225]〇
[0004]如抗縫合強度很差、急慢性栓塞、內(nèi)膜增生、動脈瘤形成、易感染等，臨床上還沒有一種滿意的小直徑血管替代產(chǎn)品[Bordenave L, et al.Clin Hemorheol Microcirc 2005 ; 33:227]。例如，美國哥倫比亞大學的Norotte教授等開發(fā)出了一種基于三維自動電腦輔助沉積的生物凝膠球體3D打印技術，應用于無支架的小直徑血管成形，只體現(xiàn)了成形技術的快速、可重復和可量化等優(yōu)勢[Norotte C，et al.B1materials, 2009, 30:5970]。美國 Clemson大學Mironov V等利用改裝的噴墨打印機將一層基質(zhì)材料上打印一層血管內(nèi)皮細胞，形成了類似面包圈的準三維立體結(jié)構(gòu)[Mironov V，et al.Trends B1technol.，2003; 21:157]。只體現(xiàn)了噴墨打印機響應速度較快，成形精度高、成形速度快，成形材料粘度低等特點。新加坡南洋理工大學(Nanyang Technological University)的Leong等利用選擇性激光燒結(jié)(Selective laser sintering，SLS)制造血管支架結(jié)構(gòu)，研究了適合于SLS 技術的聚合物以及其成形結(jié)構(gòu)的特性[Leong KF，et al.B1materials, 2003, 24:2363]，這種支架離人工血管相距甚遠。又如，美國猶他大學Skardal等利用FabOhome公司購進的儀器打印透明質(zhì)酸溶液并用四面體聚乙二醇四丙烯酸酯交聯(lián)制備血管修復材料[Skardal A，et al.B1materials, 2010, 31:6173]。美國南卡羅來納醫(yī)科大學Kasyanov等利用同類設備FabOCTI打印硅滴和組織塊，模擬腎中分支血管部分[Kasyanov V，et al.Virtual and Physical Prototyping, 2011，6 (4):197]。美國伊利諾伊大學厄巴納-香檳分校Wu 等人用自制的3D打印設備先直寫有機石蠟，然后用環(huán)氧樹脂浸泡形成有分支結(jié)構(gòu)的液體可以進出的血管網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)[Wu W，et al.Soft Matter, 2010,6:739]。美國賓夕法尼亞大學Miller等人首先將碳水化合物玻璃打印成網(wǎng)格狀模板，用澆注法復合載細胞溶液形成管道狀血液通路[Miller JS，et al.Nature Materials, 2012,11:768]。美國華盛頓大學zhang等用類似的石刻技術在天然膠原基質(zhì)中形成內(nèi)皮化微流通道[Zhang Y，et al.PNAS，2012, 109(24):9342]。這些制品從不同角度體現(xiàn)了天然血管的某些特性，但在抗凝血性、抗縫合性、生長修復能力方面均不能滿足人工血管移植替換要求。其中材料的抗凝血性、抗縫合強度和生長能力是制約各種不同人工血管修復材料臨床應用的主要屏障，也是未來發(fā)展的主要方向。
[0005]利用再生醫(yī)學原理來構(gòu)建人工血管已經(jīng)成為目前醫(yī)學和工程領域的研究熱點。現(xiàn)有的工程技術，如倒模和三維打印技術并不能制備可與人體動靜脈血管直接相連的可植入型人工血管修復材料。這些因素促使我們對各種不同技術進行有機結(jié)合，利用復合多噴頭 3D打印、電噴涂、倒模、電紡絲等綜合技術實現(xiàn)各種生物材料，制備與天然血管結(jié)構(gòu)和功能相匹配的人工血管替代物，為大量病患者提供福音。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種人工血管及其制備方法，使其在結(jié)構(gòu)和功能上模擬天然血管，用于各種動靜脈管直接移植和替換，達到修復再生的目的。
[0007]本發(fā)明的技術方案如下:
[0008]—種人工血管，其特征在于:所述的人工血管從外至內(nèi)依次包括外皮層、成纖維細胞層、平滑肌細胞層、內(nèi)皮細胞層和內(nèi)腔；所述的外皮層是采用合成高分子溶液經(jīng)等離子噴涂、電噴涂或電紡絲技術噴射合而成；所述的成纖維細胞層、平滑肌細胞層和內(nèi)皮細胞層是采用含細胞的天然高分子溶液經(jīng)倒模技術灌注或3D打印技術堆積而成；天然高分子溶液中復合質(zhì)量百分比為〇.01-1 %的生長因子和抗凝血因子，所述的內(nèi)腔的直徑為〇.l-8mm。
[0009]本發(fā)明所述的一種人工血管，其特征在于:所述的內(nèi)皮細胞層的厚度為 0? 001-0.2mm ;所述的平滑肌細胞層的厚度為0? 01-5mm ;所述的成纖維細胞層的厚度為 0.001-0.2mm〇
[0010]本發(fā)明的上述技術方案中，其特征在于:所述的成纖維細胞層、平滑肌細胞層和內(nèi)皮細胞層的天然高分子溶液采用質(zhì)量百分比為〇.1?20%的明膠、海藻酸鈉、右旋糖、膠原、纖維蛋白原、活性肽、殼聚糖、透明質(zhì)酸、細胞外基質(zhì)、瓊酯糖、層粘連蛋白、硫酸軟骨素、 卡拉膠和蛋白多糖溶液中的至少一種；天然高分子溶液中溶劑為磷酸鹽緩沖液、細胞培養(yǎng)液、生理鹽水、血清和體液中的至少一種；所述外皮層的合成高分子溶液采用質(zhì)量體積百分比為0.1-30%的聚氨酯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚己內(nèi)酯、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚乳酸-羥基乙酸共聚物和聚酯和聚羥基酸酯中的至少一種；合成高分子溶液的溶劑為四乙二醇或1，4-二氧六環(huán)。
[0011]優(yōu)選地，本發(fā)明所述的天然高分子溶液中復合量百分比為1-10%的凍存因子，在天然高分子溶液中的細胞密度為1 X 102 7個/mL。
[0012]本發(fā)明所述的內(nèi)皮細胞層的天然高分子溶液所含細胞為內(nèi)皮細胞，或干細胞與內(nèi)皮細胞混合物，或干細胞與內(nèi)皮細胞生長因子混合物；平滑肌細胞層的天然高分子溶液所含細胞為平滑肌細胞，或干細胞與平滑肌細胞混合物，或干細胞與平滑肌細胞生長因子混合物；成纖維細胞層的天然高分子溶液所含細胞為成纖維細胞，或干細胞與成纖維細胞混合物，或干細胞與成纖維細胞生長因子混合物；所述的干細胞為間充質(zhì)干細胞、骨髓干細胞、臍帶血干細胞、胚胎干細胞和誘導多能干細胞中的至少一種。
[0013]本發(fā)明提供了一種所述人工血管的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟:
[0014]1)首先配制質(zhì)量百分比為0.1-20%的天然高分子溶液，在天然高分子溶液中加入質(zhì)量百分比為〇.01-1 %的抗凝血因子；在含有抗凝血因子的天然高分子溶液中分別加入內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞、干細胞、或干細胞與生長因子混合物，制備成含不同細胞的天然高分子溶液，其中細胞在天然高分子溶液中的密度為1 x 102 7個/mL ;
[0015]2)制備一系列直徑不同的空心圓柱模具，將第一空心圓柱模具外部套上一個直徑較大的第二空心圓柱模具，兩模具中間留有縫隙，用滴管或注射器將含內(nèi)皮細胞，或干細胞與內(nèi)皮細胞混合物，或干細胞與內(nèi)皮細胞生長因子混合物的天然高分子溶液灌注到兩模具間的縫隙中，利用交聯(lián)劑或聚合劑使其中天然高分子交聯(lián)或聚合，形成內(nèi)皮細胞層；
[0016]3)在步驟2)的基礎上去掉第二空心圓柱模具，在內(nèi)皮細胞層外面套上一個直徑較大的第三空心圓柱模具，中間留有縫隙，采用步驟2)的方法將含平滑肌細胞，或干細胞與平滑肌細胞混合物，或干細胞與平滑肌細胞生長因子混合物的天然高分子溶液灌注到內(nèi)皮細胞層和第三空心圓柱模具間的縫隙中，利用交聯(lián)劑或聚合劑使其中天然高分子交聯(lián)或聚合，形成平滑肌細胞層；
[0017]4)在步驟3)的基礎上去掉第三空心圓柱模具，在平滑肌細胞層外面套上一個直徑較大的第四空心圓柱模具，中間留有縫隙，采用步驟2)或3)的方法將含成纖維細胞，或干細胞與成纖維細胞混合物，或干細胞與成纖維細胞生長因子混合物的天然高分子溶液灌注到平滑肌細胞層和第四空心圓柱模具間的縫隙中，利用交聯(lián)劑或聚合劑使其中天然高分子交聯(lián)或聚合，形成成纖維細胞層；
[0018]5)去掉第一空心圓柱模具和第四空心圓柱模具，利用等離子噴涂、電噴涂或電紡絲技術在成纖維細胞層外面噴涂一層質(zhì)量體積百分比為〇.1-30%的合成高分子溶液，萃取有機溶劑形成外皮層；
[0019]6)將步驟5)中制備的人工血管放入脈動生物反應器的培養(yǎng)盒中，進行脈動培養(yǎng)， 細胞培養(yǎng)液從培養(yǎng)盒中通過；在脈動培養(yǎng)過程中，在細胞培養(yǎng)液中依次加入內(nèi)皮細胞生長因子、平滑肌細胞生長因子和成纖維細胞生長因子，使人工血管中的干細胞由里向外依次轉(zhuǎn)化為內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞，脈動頻率控制在每分鐘1-100次。
[0020]本發(fā)明提供的另一種所述人工血管的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟:
[0021]1)首先配制質(zhì)量百分比為0.1-20%的天然高分子溶液，在天然高分子溶液中加入質(zhì)量百分比為0.01-1 %的抗凝血因子；在含有抗凝血因子的中天然高分子溶液中分別加入內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞、干細胞、或干細胞與生長因子混合物，制備成含不同細胞的天然高分子溶液，其中細胞在天然高分子溶液中的密度為1 X 102 7個/mL ;
[0022]2)采用3D打印技術從內(nèi)到外逐層打印內(nèi)皮細胞層、平滑肌細胞層和成纖維細胞層，利用交聯(lián)劑或聚合劑使其中天然高分子交聯(lián)或聚合，并形成中空的圓柱狀三維結(jié)構(gòu)；內(nèi)皮細胞層為含內(nèi)皮細胞，或干細胞與內(nèi)皮細胞混合物，或干細胞與內(nèi)皮細胞生長因子混合物的天然高分子溶液；平滑肌細胞層為含平滑肌細胞，或干細胞與平滑肌細胞混合物，或干細胞與平滑肌細胞生長因子混合物的天然高分子溶液；成纖維細胞層為含成纖維細胞，或干細胞與成纖維細胞混合物，或干細胞與成纖維細胞生長因子混合物的天然高分子溶液；
[0023]3)利用等離子噴涂、電噴涂或電紡絲技術在成纖維細胞層外面噴涂一層質(zhì)量體積百分比為0.1-30%的合成高分子溶液，萃取有機溶劑形成外皮層，最終形成具有三維結(jié)構(gòu)的人工血管；
[0024]4)將步驟3)中制備的人工血管放入脈動生物反應器的培養(yǎng)盒中，進行脈動培養(yǎng)， 細胞培養(yǎng)液從培養(yǎng)盒中通過；在脈動培養(yǎng)過程中，在細胞培養(yǎng)液中依次加入內(nèi)皮細胞生長因子、平滑肌細胞生長因子和成纖維細胞生長因子，使人工血管中的干細胞由里向外依次轉(zhuǎn)化為內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞，脈動頻率控制在每分鐘1-100次。
[0025]本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有以下優(yōu)點及突出性效果:①本發(fā)明利用倒模、等離子噴涂、電噴涂、電紡絲或3D打印等綜合技術實現(xiàn)不同細胞和高分子材料在空間的準確定位，能夠模仿人體血管的結(jié)構(gòu)和功能，實現(xiàn)了三維尺度上人工血管的構(gòu)建；②通過可控三維應力場對其中的細胞組織結(jié)構(gòu)進行訓練或培養(yǎng)，促使內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞按某一方向排列，形成不同組織區(qū)域，提高了人工血管的機械強度，使之在滿足細胞增殖生長及新陳代謝需要的同時，具備優(yōu)異的抗凝血功能、抗縫合功能和再生功能，完成了人工血管向天然血管方向的轉(zhuǎn)變，達到人體動靜脈血管修復再生的目的；③本發(fā)明對于其他管狀組織和器官，如食管、氣管、輸卵管、膽管、尿道和膀胱等同樣適用?！靖綀D說明】
[0026]圖1為人工血管三維結(jié)構(gòu)示意圖。
[0027]圖1中:101_外皮層；102-成纖維細胞層；103-平滑肌細胞層；104-內(nèi)皮細胞層； 105-內(nèi)腔。
[0028]圖2為脈動生物反應器的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0029]圖2中:1 一培養(yǎng)瓶；2—導管；3 —閥門；4一培養(yǎng)盒；5—活塞壓縮機構(gòu)；6—控制閥；7—脈動栗；8—滑塊；9 一電機。【具體實施方式】
[0030]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步的說明。
[0031]圖1為人工血管三維結(jié)構(gòu)示意圖，所述的人工血管從外至內(nèi)依次包括外皮層101、 成纖維細胞層102、平滑肌細胞層103、內(nèi)皮細胞層104和內(nèi)腔105 ;所述的外皮層101是采用合成高分子溶液經(jīng)等離子噴涂、電噴涂或電紡絲技術噴射合而成；所述的成纖維細胞層 102、平滑肌細胞層103和內(nèi)皮細胞層104是采用含細胞的天然高分子溶液經(jīng)倒模技術灌注或3D打印技術堆積而成；天然高分子溶液中復合質(zhì)量百分比為0.01-1 %的生長因子和抗凝血因子，所述的內(nèi)腔105的直徑為0.1-8_。所述的內(nèi)皮細胞層的厚度為0.001-0.2_ ; 所述的平滑肌細胞層的厚度為〇.〇1-5_ ;所述的成纖維細胞層的厚度為0.001-0.2_。
[0032]所述的成纖維細胞層、平滑肌細胞層和內(nèi)皮細胞層的天然高分子溶液采用質(zhì)量百分比為0.1?20%的明膠、海藻酸鈉、右旋糖、膠原、纖維蛋白原、活性肽、殼聚糖、透明質(zhì)酸、細胞外基質(zhì)、瓊酯糖、層粘連蛋白、硫酸軟骨素、卡拉膠和蛋白多糖溶液中的至少一種； 天然高分子溶液中溶劑為磷酸鹽緩沖液、細胞培養(yǎng)液、生理鹽水、血清和體液中的至少一種；所述外皮層的合成高分子溶液采用質(zhì)量體積百分比為〇.1-30%的聚氨酯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚己內(nèi)酯、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚乳酸-羥基乙酸共聚物和聚酯和聚羥基酸酯中的至少一種；合成高分子溶液的溶劑為四乙二醇或1，4-二氧六環(huán)。
[0033] 天然高分子溶液中還可以復合質(zhì)量百分比為1-10%的凍存因子，在天然高分子溶液中的細胞密度為1 X 102 7個/mL。內(nèi)皮細胞層的天然高分子溶液所含細胞為內(nèi)皮細胞，或干細胞與內(nèi)皮細胞混合物，或干細胞與內(nèi)皮細胞生長因子混合物；平滑肌細胞層的天然高分子溶液所含細胞為平滑肌細胞，或干細胞與平滑肌細胞混合物，或干細胞與平滑肌細胞生長因子混合物；成纖維細胞層的天然高分子溶液所含細胞為成纖維細胞，或干細胞與成纖維細胞混合物，或干細胞與成纖維細胞生長因子混合物；所述的干細胞為間充質(zhì)干細胞、 骨髓干細胞、臍帶血干細胞、胚胎干細胞和誘導多能干細胞中的至少一種。
[0034] 本發(fā)明提供了一種所述人工血管的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟:
[0035] 1)首先配制質(zhì)量百分比為0.1-20%的天然高分子溶液，在天然高分子溶液中加入質(zhì)量百分比為〇.01-1 %的抗凝血因子；在含有抗凝血因子的天然高分子溶液中分別加入內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞、干細胞、或干細胞與生長因子混合物，制備成含不同細胞的天然高分子溶液，其中細胞在天然高分子溶液中的密度為1 X 102 7個/mL ;
[0036] 2)制備一系列直徑不同的空心圓柱模具，將第一空心圓柱模具外部套上一個直徑較大的第二空心圓柱模具，兩模具中間留有縫隙，用滴管或注射器將含內(nèi)皮細胞，或干細胞與內(nèi)皮細胞混合物，或干細胞與內(nèi)皮細胞生長因子混合物的天然高分子溶液灌注到兩模具間的縫隙中，利用交聯(lián)劑或聚合劑使其中天然高分子交聯(lián)或聚合，形成內(nèi)皮細胞層；
[0037]3)在步驟2)的基礎上去掉第二空心圓柱模具，在內(nèi)皮細胞層外面套上一個直徑較大的第三空心圓柱模具，中間留有縫隙，采用步驟2)的方法將含平滑肌細胞，或干細胞與平滑肌細胞混合物，或干細胞與平滑肌細胞生長因子混合物的天然高分子溶液灌注到內(nèi)皮細胞層和第三空心圓柱模具間的縫隙中，利用交聯(lián)劑或聚合劑使其中天然高分子交聯(lián)或聚合，形成平滑肌細胞層；
[0038]4)在步驟3)的基礎上去掉第三空心圓柱模具，在平滑肌細胞層外面套上一個直徑較大的第四空心圓柱模具，中間留有縫隙，采用步驟2)或3)的方法將含成纖維細胞，或干細胞與成纖維細胞混合物，或干細胞與成纖維細胞生長因子混合物的天然高分子溶液灌注到平滑肌細胞層和第四空心圓柱模具間的縫隙中，利用交聯(lián)劑或聚合劑使其中天然高分子交聯(lián)或聚合，形成成纖維細胞層；
[0039] 5)去掉第一空心圓柱模具和第四空心圓柱模具，利用等離子噴涂、電噴涂或電紡絲技術在成纖維細胞層外面噴涂一層質(zhì)量體積百分比為〇.1-30%的合成高分子溶液，萃取有機溶劑形成外皮層；
[0040]6)將步驟5)中制備的人工血管放入脈動生物反應器的培養(yǎng)盒中，進行脈動培養(yǎng)， 細胞培養(yǎng)液從培養(yǎng)盒中通過；在脈動培養(yǎng)過程中，在細胞培養(yǎng)液中依次加入內(nèi)皮細胞生長因子、平滑肌細胞生長因子和成纖維細胞生長因子，使人工血管中的干細胞由里向外依次轉(zhuǎn)化為內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞，脈動頻率控制在每分鐘1-100次。
[0041] 本發(fā)明提供的第二種所述人工血管的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟:
[0042] 1)首先配制質(zhì)量百分比為0.1-20%的天然高分子溶液，在天然高分子溶液中加入質(zhì)量百分比為0.01-1 %的抗凝血因子；在含有抗凝血因子的中天然高分子溶液中分別加入內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞、干細胞、或干細胞與生長因子混合物，制備成含不同細胞的天然高分子溶液，其中細胞在天然高分子溶液中的密度為1 x 102 7個/mL ;
[0043]2)采用3D打印技術從內(nèi)到外逐層打印內(nèi)皮細胞層、平滑肌細胞層和成纖維細胞層，利用交聯(lián)劑或聚合劑使其中天然高分子交聯(lián)或聚合，并形成中空的圓柱狀三維結(jié)構(gòu)；內(nèi)皮細胞層為含內(nèi)皮細胞，或干細胞與內(nèi)皮細胞混合物，或干細胞與內(nèi)皮細胞生長因子混合物的天然高分子溶液；平滑肌細胞層為含平滑肌細胞，或干細胞與平滑肌細胞混合物，或干細胞與平滑肌細胞生長因子混合物的天然高分子溶液；成纖維細胞層為含成纖維細胞，或干細胞與成纖維細胞混合物，或干細胞與成纖維細胞生長因子混合物的天然高分子溶液；
[0044]3)利用等離子噴涂、電噴涂或電紡絲技術在成纖維細胞層外面噴涂一層質(zhì)量體積百分比為0.1-30%的合成高分子溶液，萃取有機溶劑形成外皮層，最終形成具有三維結(jié)構(gòu)的人工血管；
[0045]4)將步驟3)中制備的人工血管放入脈動生物反應器的培養(yǎng)盒中，進行脈動培養(yǎng)， 細胞培養(yǎng)液從培養(yǎng)盒中通過；在脈動培養(yǎng)過程中，在細胞培養(yǎng)液中依次加入內(nèi)皮細胞生長因子、平滑肌細胞生長因子和成纖維細胞生長因子，使人工血管中的干細胞由里向外依次轉(zhuǎn)化為內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞，脈動頻率控制在每分鐘1-100次。
[0046]圖2為脈動生物反應器的結(jié)構(gòu)示意圖，該脈動生物反應器包括一個培養(yǎng)瓶1、導管 2、閥門3、培養(yǎng)盒4、活塞壓縮機構(gòu)5、控制閥6、脈動栗7、滑塊8和電機9 ;其中培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)盒、脈動栗由導管連接，營養(yǎng)液從培養(yǎng)盒中通過；人工血管放在培養(yǎng)盒中。
[0047]實施例1: 一種小直徑血管及其制備方法
[0048]a)分別配制質(zhì)量百分比為0.1%的海藻酸鈉和20%的明膠溶液，將海藻酸鈉和明膠溶液按體積比1:1混合均勻，其中加入1%的抗凝血因子肝素及10%的細胞凍存因子二甲基亞砜；將內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞分別與該混合液混合，細胞在藻酸鈉與明膠混合液中的密度為1 X 102個/mL ;
[0049]b)將步驟a)中各種含細胞溶液裝載到3D打印設備的噴頭組件中，逐層打印內(nèi)腔直徑為0.1mm、由內(nèi)向外依次為內(nèi)皮細胞層、平滑肌細胞層和成纖維細胞層的空心圓柱體； 用質(zhì)量百分比為1 %的氯化鈣溶液交聯(lián)海藻酸鈉分子，使三維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；
[0050]c)利用等離子噴涂技術在步驟b)形成的三維結(jié)構(gòu)外部噴涂一層質(zhì)量體積百分比為30%的聚乙烯溶液，萃取有機溶劑形成外皮層；
[0051]d)將步驟c)制備的人工血管放入脈動生物反應器的培養(yǎng)盒中，分別使用含內(nèi)皮細胞生長因子、平滑肌細胞生長因子和成纖維細胞生長因子的培養(yǎng)液，按每分鐘100次頻率對人工血管進行脈動培養(yǎng)，增強細胞間的連接和抗張強度。
[0052]實施例2:—種大直徑血管及其制備方法
[0053]a)制備一系列直徑大于6_的空心圓柱模具，分別配制含骨髓干細胞、內(nèi)皮細胞和成纖維細胞的纖維蛋白原溶液，其中纖維蛋白原溶液質(zhì)量百分比為5%，細胞在纖維蛋白原溶液中的密度為1 X 107個/mL，在骨髓干細胞溶液中別加入質(zhì)量百分比為1 %的平滑肌細胞生長因子、1%的抗凝血因子肝素及10%的細胞凍存因子二甲基亞砜；
[0054]b)將一個直徑較小的第一空心圓柱模具外套上一個直徑較大的第二空心圓柱模具，兩模具中間留有縫隙，用滴管將含內(nèi)皮細胞和肝素的纖維蛋白原溶液注射到兩模具間的縫隙中，利用質(zhì)量百分比為10%凝血酶使其中纖維蛋白原聚合，形成內(nèi)皮細胞層；
[0055]c)在步驟b)的基礎上去掉第二空心圓柱模具，在內(nèi)皮細胞層外套上一個直徑較大的第三空心圓柱模具，中間留有縫隙，采用步驟b)的方法將含骨髓干細胞和肝素的纖維蛋白原溶液灌注到內(nèi)皮細胞層和第三空心圓柱模具間的縫隙中，利用利用質(zhì)量百分比為 10%凝血酶使其中纖維蛋白原聚合，形成平滑肌細胞層；
[0056]d)在步驟c)的基礎上去掉第三空心圓柱模具，在平滑肌細胞層外套上一個直徑較大的第四空心圓柱模具，中間留有縫隙，采用步驟b)或c)的方法將含成纖維細胞的纖維蛋白原溶液灌注到平滑肌細胞層和第四空心圓柱模具間的縫隙中，利用10%凝血酶使其中纖維蛋白原聚合，形成成纖維細胞層；
[0057]e)去掉第一空心圓柱模具和第四空心圓柱模具，利用電紡絲技術在成纖維細胞層外噴涂一層質(zhì)量百分比為〇.1 %聚乳酸_羥基乙酸共聚物合成高分子溶液，萃取有機溶劑形成外皮層。
[0058]f)將步驟e)制備的人工血管放入脈動生物反應器的培養(yǎng)盒中，按每分鐘1次頻率脈動培養(yǎng)，增強細胞間連接和抗張強度；分別讓含內(nèi)皮細胞生長因子、平滑肌細胞生長因子和成纖維細胞生長因子的培養(yǎng)液。
[0059]實施例3:—種中等直徑血管及其制備方法
[0060]a)制備一系列直徑在2_6mm間的空心圓柱模具，配制含脂肪干細胞的膠原溶液， 其中膠原溶液質(zhì)量百分比為1 %，脂肪干細胞在膠原溶液中的密度為1 X 105個/mL ;在三組脂肪干細胞溶液中分別加入質(zhì)量百分比為〇.01%的內(nèi)皮細胞生長因子、平滑肌細胞生長因子和成纖維細胞生長因子、0.01 %的抗凝血因子紫杉醇及1 %的細胞凍存因子甘油；
[0061]b)將一個直徑較小的第一空心圓柱模具外套上一個直徑較大的第二空心圓柱模具，兩模具中間留有縫隙，用滴管將含脂肪干細胞、內(nèi)皮細胞生長因子、紫杉醇和甘油的膠原溶液注射到兩模具間的縫隙中，利用質(zhì)量百分比為1%氫氧化鈉使其中膠原聚合，形成內(nèi)皮細胞層；
[0062]c)在步驟b)的基礎上去掉第二空心圓柱模具，在內(nèi)皮細胞層外套上一個直徑較大的第三空心圓柱模具，中間留有縫隙，采用步驟b)的方法將含脂肪干細胞、平滑肌細胞生長因子、紫杉醇和甘油的膠原溶液注射到內(nèi)皮層和第三空心圓柱模具間的縫隙中，利用質(zhì)量百分比為1 %氫氧化鈉使其中膠原聚合，形成平滑肌細胞層；
[0063]d)在步驟c)的基礎上去掉第三空心圓柱模具，在平滑肌細胞層外套上一個直徑較大的第四空心圓柱模具，中間留有縫隙，采用步驟b)或c)的方法將含脂肪干細胞、成纖維細胞生長因子、紫杉醇和甘油的膠原溶液注射到平滑肌細胞層和第四空心圓柱模具間的縫隙中，利用1%氫氧化鈉使其中膠原聚合，形成成纖維細胞層；
[0064]e)去掉第一空心圓柱模具和第四空心圓柱模具，利用電紡絲技術在成纖維細胞層外噴涂一層質(zhì)量百分比為1%聚氨酯溶液，萃取有機溶劑形成外皮層。
[0065]f)將步驟e)制備的人工血管放入脈動生物反應器的培養(yǎng)盒中，分別讓含內(nèi)皮細胞生長因子、平滑肌細胞生長因子和成纖維細胞生長因子的培養(yǎng)液按每分鐘80次頻率脈動培養(yǎng)，增強細胞間連接和抗張強度。
【主權項】
1.一種人工血管，其特征在于:所述的人工血管從外至內(nèi)依次包括外皮層(101)、成 纖維細胞層(102)、平滑肌細胞層(103)、內(nèi)皮細胞層(104)和內(nèi)腔(105);所述的外皮層 (101)是采用合成高分子溶液經(jīng)等離子噴涂、電噴涂或電紡絲技術噴射合而成；所述的成 纖維細胞層(102)、平滑肌細胞層(103)和內(nèi)皮細胞層(104)是采用含細胞的天然高分 子溶液經(jīng)倒模技術灌注或3D打印技術堆積而成；天然高分子溶液中復合質(zhì)量百分比為 0.01-1%的生長因子和抗凝血因子，所述的內(nèi)腔(105)的直徑為0.1-8mm。2.如權利要求1所述的一種人工血管，其特征在于:所述的內(nèi)皮細胞層的厚度為 0? 001-0.2mm ;所述的平滑肌細胞層的厚度為0? 01-5mm ;所述的成纖維細胞層的厚度為 0?001-0.2mm〇3.如權利要求1或2所述的一種人工血管，其特征在于:所述的成纖維細胞層、平滑肌 細胞層和內(nèi)皮細胞層的天然高分子溶液采用質(zhì)量百分比為〇.1?20%的明膠、海藻酸鈉、 右旋糖、膠原、纖維蛋白原、活性肽、殼聚糖、透明質(zhì)酸、細胞外基質(zhì)、瓊酯糖、層粘連蛋白、硫 酸軟骨素、卡拉膠和蛋白多糖溶液中的至少一種；天然高分子溶液中溶劑為磷酸鹽緩沖液、 細胞培養(yǎng)液、生理鹽水、血清和體液中的至少一種；所述外皮層的合成高分子溶液采用質(zhì)量 體積百分比為〇.1-30%的聚氨酯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚己內(nèi)酯、聚碳酸酯、聚乙二 醇、聚乳酸-羥基乙酸共聚物和聚酯和聚羥基酸酯中的至少一種；合成高分子溶液的溶劑 為四乙二醇或1，4-二氧六環(huán)。4.如權利要求3所述的一種人工血管，其特征在于:天然高分子溶液中復合質(zhì)量百分 比為1-10%的凍存因子，在天然高分子溶液中的細胞密度為IX 102 7個/mL。5.如權利要求1所述的人工血管，其特征在于:內(nèi)皮細胞層的天然高分子溶液所含細 胞為內(nèi)皮細胞，或干細胞與內(nèi)皮細胞混合物，或干細胞與內(nèi)皮細胞生長因子混合物；平滑肌 細胞層的天然高分子溶液所含細胞為平滑肌細胞，或干細胞與平滑肌細胞混合物，或干細 胞與平滑肌細胞生長因子混合物；成纖維細胞層的天然高分子溶液所含細胞為成纖維細 胞，或干細胞與成纖維細胞混合物，或干細胞與成纖維細胞生長因子混合物；所述的干細 胞為間充質(zhì)干細胞、骨髓干細胞、臍帶血干細胞、胚胎干細胞和誘導多能干細胞中的至少一 種。6.—種如權利要求1或2所述人工血管的制備方法，其特征在于該方法包括如下步 驟:1)首先配制質(zhì)量百分比為〇.1-20%的天然高分子溶液，在天然高分子溶液中加入質(zhì) 量百分比為0.01-1 %的抗凝血因子；在含有抗凝血因子的天然高分子溶液中分別加入內(nèi) 皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞、干細胞、或干細胞與生長因子混合物，制備成含不同細胞 的天然高分子溶液，其中細胞在天然高分子溶液中的密度為1 X 102 7個/mL ;2)制備一系列直徑不同的空心圓柱模具，將第一空心圓柱模具外部套上一個直徑較大 的第二空心圓柱模具，兩模具中間留有縫隙，用滴管或注射器將含內(nèi)皮細胞，或干細胞與內(nèi) 皮細胞混合物，或干細胞與內(nèi)皮細胞生長因子混合物的天然高分子溶液灌注到兩模具間的 縫隙中，利用交聯(lián)劑或聚合劑使其中天然高分子交聯(lián)或聚合，形成內(nèi)皮細胞層；3)在步驟2)的基礎上去掉第二空心圓柱模具，在內(nèi)皮細胞層外面套上一個直徑較大 的第三空心圓柱模具，中間留有縫隙，采用步驟2)的方法將含平滑肌細胞，或干細胞與平 滑肌細胞混合物，或干細胞與平滑肌細胞生長因子混合物的天然高分子溶液灌注到內(nèi)皮細胞層和第三空心圓柱模具間的縫隙中，利用交聯(lián)劑或聚合劑使其中天然高分子交聯(lián)或聚 合，形成平滑肌細胞層；4)在步驟3)的基礎上去掉第三空心圓柱模具，在平滑肌細胞層外面套上一個直徑較 大的第四空心圓柱模具，中間留有縫隙，采用步驟2)或3)的方法將含成纖維細胞，或干細 胞與成纖維細胞混合物，或干細胞與成纖維細胞生長因子混合物的天然高分子溶液灌注到 平滑肌細胞層和第四空心圓柱模具間的縫隙中，利用交聯(lián)劑或聚合劑使其中天然高分子交 聯(lián)或聚合，形成成纖維細胞層；5)去掉第一空心圓柱模具和第四空心圓柱模具，利用等離子噴涂、電噴涂或電紡絲技 術在成纖維細胞層外面噴涂一層質(zhì)量體積百分比為0.1-30%的合成高分子溶液，萃取有機 溶劑形成外皮層；6)將步驟5)中制備的人工血管放入脈動生物反應器的培養(yǎng)盒中，進行脈動培養(yǎng)，細胞 培養(yǎng)液從培養(yǎng)盒中通過；在脈動培養(yǎng)過程中，在細胞培養(yǎng)液中依次加入內(nèi)皮細胞生長因子、 平滑肌細胞生長因子和成纖維細胞生長因子，使人工血管中的干細胞由里向外依次轉(zhuǎn)化為 內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞，脈動頻率控制在每分鐘1-100次。7.—種如權利要求1或2所述人工血管的制備方法，其特征在于該方法包括如下步 驟:1)首先配制質(zhì)量百分比為〇.1-20%的天然高分子溶液，在天然高分子溶液中加入質(zhì) 量百分比為0.01-1%的抗凝血因子；在含有抗凝血因子的中天然高分子溶液中分別加入 內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞、干細胞、或干細胞與生長因子混合物，制備成含不同細 胞的天然高分子溶液，其中細胞在天然高分子溶液中的密度為1 X 102 7個/mL ;2)采用3D打印技術從內(nèi)到外逐層打印內(nèi)皮細胞層、平滑肌細胞層和成纖維細胞層，利 用交聯(lián)劑或聚合劑使其中天然高分子交聯(lián)或聚合，并形成中空的圓柱狀三維結(jié)構(gòu)；內(nèi)皮細 胞層為含內(nèi)皮細胞，或干細胞與內(nèi)皮細胞混合物，或干細胞與內(nèi)皮細胞生長因子混合物的 天然高分子溶液；平滑肌細胞層為含平滑肌細胞，或干細胞與平滑肌細胞混合物，或干細胞 與平滑肌細胞生長因子混合物的天然高分子溶液；成纖維細胞層為含成纖維細胞，或干細 胞與成纖維細胞混合物，或干細胞與成纖維細胞生長因子混合物的天然高分子溶液；3)利用等離子噴涂、電噴涂或電紡絲技術在成纖維細胞層外面噴涂一層質(zhì)量體積百分 比為0.1-30%的合成高分子溶液，萃取有機溶劑形成外皮層，最終形成具有三維結(jié)構(gòu)的人 工血管；4)將步驟3)中制備的人工血管放入脈動生物反應器的培養(yǎng)盒中，進行脈動培養(yǎng)，細胞 培養(yǎng)液從培養(yǎng)盒中通過；在脈動培養(yǎng)過程中，在細胞培養(yǎng)液中依次加入內(nèi)皮細胞生長因子、 平滑肌細胞生長因子和成纖維細胞生長因子，使人工血管中的干細胞由里向外依次轉(zhuǎn)化為 內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞，脈動頻率控制在每分鐘1-100次。
【文檔編號】A61F2/06GK105983134SQ201510097472
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年3月5日
【發(fā)明人】劉暢
【申請人】劉暢