橄欖葉提取物以及包含該提取物的化妝品的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種橄欖葉提取物，其中包括質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％?50％的羥基酪醇，還可以包括橄欖苦甙(Oleuropein)和毛蕊花糖苷(Verbascoside)中的任意一種或幾種組合。本發(fā)明還提供一種橄欖葉提取物的制備方法以及在化妝品中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的橄欖葉提取物具有較強的抗衰老作用，這是因為其能夠大幅提高人體真皮層中膠原蛋白的含量，而使人體皮膚保持彈性，從根本上抑制皺紋的出現(xiàn)。此外，本發(fā)明提供的橄欖葉提取物還能夠明顯抑制自由基(DPPH)的生成，可作為制品或添加劑應(yīng)用于食品、藥品、護膚品和/或化妝品中，發(fā)揮抗氧化抗衰老的雙重效果。
【專利說明】
橄欖葉提取物以及包含該提取物的化妝品
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種提取物及包含該提取物的化妝品，尤其涉及一種 橄欖葉提取物及包含該橄欖葉提取物的化妝品。
【背景技術(shù)】
[0002] 大劑量紫外線輻射可導(dǎo)致不可逆的DNA損傷，致使細(xì)胞直接發(fā)生壞死，甚至癌變； 而小劑量紫外線長期照射可誘使細(xì)胞核染色體斷裂、mtDNA突變和氧化應(yīng)激損傷，使得細(xì)胞 內(nèi)活性氧自由基(R0S)、其他氧化應(yīng)激標(biāo)記物等水平升高，從而啟動細(xì)胞的損傷和老化過 程。
[0003] 衰老是指機體各器官功能普遍的、逐漸降低的過程，隨著年齡的增長，衰老不可避 免，但是，良好的生活習(xí)慣和保健措施可以有效地延緩衰老。目前社會上針對抗衰老的產(chǎn)品 也層出不窮。
[0004] 油橄欖(Olea europaea L.)屬木犀科(Oleaceae)、木犀欖屬(Olea)常綠喬木，油 橄欖用途廣泛，果實可榨油，做罐頭、蜜餞和果醬等，橄欖油可配制各種軟膏、抗生素和維生 素注射劑，還可以作為添加劑，添入乳制品、肉及魚罐頭中，改善了保存性及風(fēng)味。
[0005] 橄欖葉具有重要的應(yīng)用價值，目前在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用較多，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)其對包括病原 體造成的疾病，如感冒、流感、皰疹，帶狀皰疹，腦膜炎，結(jié)核病，泌尿道感染，瘧疾，血液中毒 和手術(shù)部位感染等具有較好的治療作用?，F(xiàn)在醫(yī)學(xué)上還認(rèn)為它有助于降低血壓和促進血液 循環(huán)。此外，它還有減少壞膽固醇，同時增加好膽固醇的功效。但是其在化妝品中的應(yīng)用目 前還比較少，且對其作用機理的研究也不夠透徹。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供一種橄欖葉提取物，并研究了該提取物在 化妝品領(lǐng)域中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的第一個方面在于提供一種橄欖葉提取物，所述橄欖葉提取物中包括羥基 酪醇，所述羥基酪醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%_50%，如8%、40%，優(yōu)選為10-30%，如15%、20%、 25 % 等。
[0008] 作為本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，所述橄欖葉提取物中還可以包括橄欖苦苷 (Oleuropein)和毛蕊花糖苷(Verbascoside)中的任意一種或幾種組合。
[0009] 作為本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，所述橄欖苦苷的含量為1-10%，如2.5%，7.8% 等。
[0010] 作為本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，所述毛蕊花糖苷的含量為1-10%，如3%，6%等。
[0011] 作為本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，所述橄欖葉提取物可以是物理粉碎粉末、浸膏中 的任意一種或幾種的組合。
[0012] 作為本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，所述橄欖葉提取物可以是水提物、醇提物、油提物 和超臨界C02提取物中的任意一種或幾種的組合。
[0013] 作為本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，所述醇提物優(yōu)選為水提取物、乙醇提取物、甲醇提 取物中的一種或幾種組合。
[0014] 本發(fā)明的第二個方面在于提供一種橄欖葉提取物的制備方法，所述制備方法包括 如下步驟：
[0015] 步驟1、提供清潔的橄欖葉粉末，以溶媒:原料= 5-20:1的體積比，提取至少1次，提 取結(jié)束后混合每次的提取液，得到混合提取液；
[0016] 步驟2、將步驟1中過濾后的提取液經(jīng)過濃縮制備成所述橄欖葉提取物。
[0017] 作為本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，所述制備方法包括如下步驟：
[0018] 步驟1、提供清潔的橄欖葉粉末，以橄欖葉粉末:溶媒=lg: (5-20)mL比例，在50°c-120°C溫度下提取至少1次，每次提取0.5-10h，提取結(jié)束后混合每次的提取液，得到混合提 取液；
[0019] 步驟2、濃縮所述混合提取液，制備得到所述橄欖葉提取物。
[0020] 作為本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，步驟1中所述橄欖葉粉末為橄欖葉經(jīng)過包含二氧 化氯的清水清洗、消毒，并粉碎至200目以下得到。
[0021] 作為本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，步驟1中提取橄欖葉的溶媒為水、甲醇水溶液、乙 醇水溶液等中的任意一種或幾種組合。
[0022]作為本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，所述甲醇水溶液的體積濃度為30%_100%，如 40 %、95 % ;優(yōu)選為50 % -90 %，如60 %、70 %、80 %等，其中體積濃度為100 %時，所述溶媒即 為無水甲醇。
[0023]作為本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，所述乙醇水溶液的體積濃度為30%_100%，如 40 %、95 % ;優(yōu)選為50 % -90 %，如60 %、70 %、80 %等，其中體積濃度為100 %時，所述溶媒即 為無水乙醇。
[0024]作為本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，所述橄欖葉粉末在0.2-0.8MPa壓力下提取，如 0 · 3MPa、0 · 6MPa，優(yōu)選為 0 · 4-0 · 5MPa，如0 · 45MPa。
[0025] 作為本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，所述橄欖葉粉末在1.2-1.8MPa壓力下提取，如 1 · 3MPa、1 · 6MPa，優(yōu)選為 1 · 4-1 · 5MPa，如 1 · 45MPa。
[0026] 作為本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，所述制備方法中，步驟2為，將所述混合提取液第 一次濃縮，得到濃縮液一，所述濃縮液一經(jīng)過層析柱進行純化，第二次濃縮，得到所述橄欖 葉粉末。
[0027] 作為本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，所述純化過程為大孔吸附樹脂純化、液相色譜柱 層析純化、硅膠吸附純化中的任意一種或幾種組合。
[0028] 作為本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，所述大孔吸附樹脂純化過程的條件為:溫度為25 。(:-50°C，優(yōu)選為30°C-40°C，所述大孔吸附樹脂的型號為AB-8型、D-101、ADS-5中的任意一 種或幾種。
[0029] 作為本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，所述大孔吸附樹脂吸附過程的pH值= 3-9,優(yōu)選為 pH值=4-8，更優(yōu)選為pH值=5-6。
[0030] 作為本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，大孔吸附樹脂吸附后，使用乙醇和/或水的混合溶 液洗脫，所述混合溶液的體積比為乙醇:水=1: (0-10)，優(yōu)選為乙醇:水=1: (1-5)。
[0031] 作為本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，所述洗脫過程中，所述混合溶液的流速為2-4BV/ 11，洗脫溫度為30°050°(：。
[0032]作為本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，還包括將得到的浸膏滅菌，所述滅菌步驟采用輻 射滅菌、70%乙醇溶液、50%甲醇水溶液中的任意一種或幾種組合。
[0033]作為本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，所述輻射滅菌的條件為鈷60-γ射線，所述浸膏的 吸收劑量為10_30kGy，如15kGy、20kGy、25kGy等，輻射滅菌后所述橄欖葉提取物的Sal值小 于等于1〇_ 5，優(yōu)選為小于等于1〇_6，如2X 10-7、5Χ10Λ
[0034]作為本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，步驟2中，第二次濃縮后，經(jīng)過干燥，得到所述橄欖 葉提取物，所述干燥的方法為電加熱干燥、噴霧干燥、熱空氣干燥中的任意一種或幾種組 合，優(yōu)選為噴霧干燥。
[0035]作為本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，所述噴霧干燥過程中，高壓栗在80_120MPa壓力下 將所述過濾液通過霧化器形成100-200μπι的顆粒，與所述顆粒接觸的熱空氣的溫度為60-100°C，接觸時間為5-50s。
[0036]本發(fā)明的第三個方面在于提供上述任意一種橄欖葉提取物的應(yīng)用。
[0037]所述橄欖葉提取物優(yōu)選為施用于皮膚外表面，更優(yōu)選為應(yīng)用于制備涂覆于皮膚外 表面的制品。
[0038]其中，本發(fā)明所述橄欖葉提取物應(yīng)用于制備日化用品，優(yōu)選為應(yīng)用于制備化妝品 和/或護膚品。
[0039]作為本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，所述化妝品中橄欖葉提取物的含量為0.001%-50%，如0.003%，40%，優(yōu)選為0.005%-30%，如 10%、20%等。
[0040] 本發(fā)明的第四個方面在于提供一種包含上述任意一種橄欖葉提取物的日化用品， 優(yōu)選為包含上述任意一種橄欖葉提取物的化妝品和/或護膚品，更優(yōu)選為所述化妝品和/或 護膚品中，優(yōu)選為化妝品和/或護膚品中，還可以包括營養(yǎng)性添加劑。
[0041] 其中，所述營養(yǎng)性添加劑可以是選自如下組分中的一種或幾種組合：甲殼素、殼聚 糖、絲肽、絲素、卵磷脂、表皮細(xì)胞生長因子、海藻糖、乳糖、珍珠粉、膠原蛋白、膠原水解物、 透明質(zhì)酸及其鹽、蛋膜素、植物留醇、氯化溶菌酶、硫酸軟骨素鈉、蜂乳、蜂膠、蜂蜜、甘草酸、 甘草次酸、γ-亞麻酸、曲酸及其酯、赤霉酸、甘氨酸、L-天冬氨酸及其鹽、L-胱氨酸及其鹽、 DL-丙氨酸、L-絲氨酸、DL-絲氨酸、L-蛋氨酸、DL-蛋氨酸、L賴氨酸鹽酸鹽、L蘇氨酸、肌醇、麥 芽醇、泛酸鹽、D-泛醇、視黃醇醋酸酯、尿囊素、吡哆醇鹽酸鹽、可的松、煙酰胺、維生素、雌激 素、蘇木素、尿酸、乳清酸、蘆薈苷、壬二酸、松香酸、松蘿酸、昆布氨酸、胸腺素、茜草素、檸檬 烯、黃芩黃素、脫氧膽酸、愈瘡木萸、橙皮素、鞣酸、二硫化硒、茶皂苷、檸檬酸三乙酯、丁基羥 基甲苯、植酸、聚氯化二甲基二烯丙基銨。
[0042] 作為本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，所述化妝品和/或護膚品中，還可以包括:表面活 性劑、香精與香料、色素、防腐劑、抗氧劑、保濕劑、紫外線吸收劑、螯合劑、收斂劑、助滲劑 和pH值調(diào)節(jié)劑中的任意一種或幾種組合。
[0043] 其中，所述表面活性劑可以是：1)陰離子表面活性劑，如：(：12-14脂肪醇硫酸銨、 C12-14脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸鹽、十二烷基硫酸二乙醇胺鹽、(：12- 14脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸 銨、十二烷基硫酸三乙醇胺、醇醚鄰苯二甲酸單酯鈉鹽、酰化肽、月桂酸單乙醇酰胺硫酸鈉、 正辛醇聚氧丙烯醚琥珀酸單酯磺酸鹽、十六醇琥珀酸單酯磺酸鹽、磺基琥珀酸單酯二鈉鹽、 琥珀酸單十八酯二鈉鹽、醇醚磺基琥珀酸單酯二鈉鹽、脂肪醇聚氧乙烯醚(鈉)磺基琥珀酸 單酯銨鹽、油酰胺磺基琥珀酸單酯二鈉鹽、N-?；劝彼徕淃}、吡咯烷酮羧酸鈉、聚丙烯酸 鈉、脂肪醇聚氧乙烯醚磷酸酯、脂肪醇聚氧乙烯醚磷酸單酯及其鹽、脂肪醇聚氧乙烯醚磷酸 單酯乙醇胺鹽、烷基酚聚氧乙烯醚磷酸單酯及其鹽、壬基酚醚磷酸單酯乙醇胺鹽、烷基磷酸 酯鹽、鄰苯二甲酸單月桂醇酯鹽、十一碳烯酸鋅、陰離子型氨基酸表面活性劑、N-C 12-18?；?谷氨酸鈉、N-月桂酰L-丙氨酸鈉、N-硬脂酰基谷氨酸單鈉鹽、N-椰子?；劝彼釂吴c鹽、N-混合脂肪?；劝彼釂吴c鹽、長直鏈烷基芳醚磺酸鈉 TH;2)非離子表面活性劑，如：油醇聚 氧乙烯醚(如乳化劑V0系列）、烷基酚聚氧乙烯醚(如乳化劑ΟΡΕ系列）、硬脂酸聚氧乙烯酯、 乙二醇單硬脂酸酯、二硬脂酸乙二醇酯、聚乙二醇單硬脂酸酯、聚乙二醇雙硬脂酸酯、聚乙 二醇雙月桂酸酯、雙硬脂酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、蔗糖硬脂酸酯、聚氧乙烯甘油醚單硬 脂酸酯、Ν-月桂?；劝彼犭p烷醇酯、苯甲酸脂肪醇酯、山梨醇單脂肪酸酯（司盤，Span，如 司盤-20、司盤60、司盤65、司盤-80、司盤-83、司盤-85)、聚氧乙稀醚山梨醇單脂肪酸酯（吐 溫，Tween，如吐溫-20、吐溫-40、吐溫-60、吐溫-61、吐溫-80 )、二乙醇胺、三乙醇胺、脂肪酸 單乙醇酰胺(如椰子油酸單乙醇酰胺、月桂酸單乙醇酰胺、棕櫚酸單乙醇酰胺）、椰子油酸二 乙醇酰胺、月桂酸二乙醇酰胺、甲基葡萄糖苷硬脂酸酯、聚氧乙烯甲基葡萄糖苷硬脂酸酯、 乙二醇葡萄糖苷硬脂酸酯、丙二醇基葡萄糖苷硬脂酸酯、C 8-16烷基葡萄糖苷、甘油葡萄糖苷 硬脂酸酯、琥珀酸月桂醇醚單酯、月桂醇甘油酯聚氧乙烯醚、硬脂酸甘露醇酐酯、聚氧乙烯 貂油、貂油酸甲酯、貂油酸異丙酯;3)陽離子表面活性劑，如氯化C 12-18烷基三烷基銨(如氯化 十六烷基二甲基烷基銨、氯化十八烷基三甲基銨、氯化十六烷基三甲基銨）、氯化油酰胺丙 基二羥丙基二甲基銨、氯化二羥丙基二甲基十二烷基銨、氯化二甲基二烯丙基銨/丙烯酰胺 共聚物、氯化油酰胺丙基-2,3-二羥丙基二甲基銨、乙基硫酸油酰胺丙基二甲基乙基銨、氯 化雙C 12-18基二甲基銨、聚季銨-11調(diào)理劑、M-505聚季銨-7調(diào)理劑、貂油酰胺丙基胺-殼聚 糖、貂油酰胺丙基胺-水解蛋白、陽離子蛋白肽、瓜爾膠-羥丙基三甲基氯化銨鹽、聚纖維素 醚季銨鹽、單油酸三乙醇胺酯、DNP系列;4)兩性離子表面活性劑，如C 12-18烷基二羥乙基甜菜 喊、N_Ci2-i8烷基-N_(2_輕乙基)_N_(2_甲醜胺基乙基）錢乙酸鹽、Ci2-i8烷氧基輕丙基甜菜 堿、氧化椰油酰胺基丙基胺、椰油羥乙基磺酸鈉、氧化十八烷基二甲基胺、椰油酰二乙醇胺 氧化胺、N-烷基-β-氨基丙酰二乙醇胺、氧化月桂酰基丙胺、N-C 12-18?；劝彼帷⒘u乙基癸酸 咪唑啉甜菜堿、羥乙基肉豆蔻酸咪唑啉甜菜堿、羥乙基棕櫚酸咪唑啉甜菜堿。
[0044]其中，所述香精與香料可以是選自：1)天然香料，如苦艾油、桉葉油、八角茴香油、 白檸檬油、白丁香浸膏、丁香油、白蘭花油、白蘭花浸膏、白蘭葉油、柏木油、薄荷油、蒼術(shù)硬 月旨、草木犀浸膏、橙葉油、丁香羅勒油、大花茉莉浸膏、冬青油、當(dāng)歸油、當(dāng)歸浸膏、地衣酸、地 檀香油、玳玳花油、玳玳葉油、風(fēng)信子浸膏、楓香浸膏、芳樟油、黃樟油、甘松油、桂花浸膏、紅 橘油、胡蘿卜籽油、海貍香、黃葵油、黃蘭油、藿香油、黃蒿油、九里香浸膏、金合歡浸膏、姜油、 橘子油、椒樣薄荷油、菊花浸膏、枯茗油、龍涎香、留蘭香油、靈貓香、臘梅油、鈴蘭浸膏、木香 根油、米蘭花油、玫瑰香葉油、玫瑰油、茉莉浸膏、牡油、墨紅浸膏、墨紅油、梓檬桉葉油、梓 檬油、七里香浸膏、楠葉油、芹菜籽油、肉豆蔻油、肉桂油、山蒼子油、水貂香膏酊、水仙浸膏、 松針油、樹苔浸膏、素馨浸膏、麝香、麝鼠香膏、甜橙油、檀香油、晚香玉油、晚香玉浸膏、萬壽 菊精油、小茴香油、血檜木油、香茅油、香葉油、康乃馨油、紫蘇油、香紫蘇油、香附油、香檸檬 薄荷油、巖蘭草油、香薷油、香薷草浸膏、懸鉤子薔薇花油、懸鉤子薔薇花浸膏、薰衣草油、月 桂葉油、依蘭依蘭油、芫荽籽油、魚香草油、巖薔薇浸膏、巖桂油、柚皮油、鳶尾油、煙草花油、 香櫞葉油、梔子花浸膏、紫穗槐油、紫羅蘭葉浸膏、愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng) 木酚、天然香蘭素、樟腦;2)合成香精，如檸檬烯、長葉烯、乙位石竹烯、異長葉烯、異長葉烯 酮、異長葉烷酮、溴代蘇合香烯、二苯甲烷、二苯醚、間甲基二苯醚、丁香酚、異丁香酚、乙位 萘甲醚、乙位萘乙醚、對甲基茴香醚、異丁香酚芐醚、玫瑰醚、檀香醚、水仙醚(或茉莉醚）、降 龍涎香醚、甲基柏木醚、環(huán)氧柏木烷、埃林塔爾、埃林塔爾N、3-己烯醇、癸醇、月桂醇、苯甲 醇、苯乙醇、對甲氧基芐醇、肉桂醇、二甲基芐基甲醇、香葉醇、橙花醇、芳樟醇、玫瑰醇、松油 醇、香茅醇、消旋薄荷腦、薄荷腦、冰片、柏木醇、柏木烷酮、甲基柏木酮、3,4-二氧亞甲基苯 甲醇、α-甲基-3，4-二氫亞甲基苯丙醛、2-叔丁基-4-甲基環(huán)己醇、香紫蘇醇、檀香醇、3-甲 基-5-(2'，2'，3'_三甲基環(huán)戊烯-Γ-基)戊-2-醇、苯甲醛、苯乙酮、苯乙酸、對甲基苯乙酮二 苯甲酮、月桂醛、肉桂醛、肉桂酸、戊基-β_苯基丙烯醛、苯基丙醛、鈴蘭醛、新鈴蘭醛、兔 耳草醛、3，4-二氧亞甲基苯甲醛、3，7-二甲基-6-辛烯醛、3，7-二甲基-7-羥基辛醛、檸檬醛、 乙位環(huán)高檸檬醛、艾薇醛、柑青醛、4-羥基-3-甲氧基苯甲醛、α-二氫突厥酮、β-突厥烯酮、紫 羅蘭酮、6-甲基紫羅蘭酮、橙花酮、香芹酮、胡椒基丙酮、覆盆子酮、藥草酮、順式茉莉酮、庚 醛乙二醇縮醛、苯乙醛二甲縮醛、辛醛二甲縮醛、α-戊基桂醛二甲縮醛、檸檬醛二甲縮醛、檸 檬醛二乙縮醛、茴香醛二甲縮醛、蘑菇醛、葉青素、風(fēng)信子素、蘋果酯、吉普縮酮、甲酸香葉 酯、甲酸香茅酯、阿弗曼酯、乙酸葉醇酯、乙酸芐酯、乙酸苯乙酯、乙酸肉桂酯、乙酸松油酯、 乙酸龍腦酯、乙酸芳樟酯、乙酸香葉酯、乙酸對叔丁基環(huán)己酯、乙酸鄰叔丁基環(huán)己酯、乙酸香 根酯、乙酸琥珀酯、乙酸阿弗曼酯、乙酸十氫萘酯、乙酸柏木酯、丙酸香葉酯、乙酸三氯甲基 苯甲酯、丁酸芐酯、丁酸葉醇酯、丁酸香葉酯、2-甲基戊酸苯乙酯、異丁酸對甲酚酯、2-壬烯 酸甲酯、苯甲酸乙酯、苯甲酸甲酯、苯甲酸葉醇酯、苯甲酸芐酯、苯乙酸乙酯、苯乙酸對甲酚 酯、肉桂酸乙酯、水楊酸丁酯、水楊酸異丁酯、水楊酸異戊酯、水楊酸葉醇酯、水楊酸己酯、水 楊酸芐酯、水楊酸苯乙酯、水楊酸環(huán)己酯、茉莉素、茉莉酯、2-戊基環(huán)戊酮醋酸甲酯、橙花素、 γ -壬內(nèi)酯、γ-十一內(nèi)酯、香豆素、D引噪、3-甲基吲哚、3,7_二甲基-2,6_辛二烯腈、對甲氧基 苯甲腈、二甲苯麝香、酮麝香、2，6_二硝基-3-甲氧基-4-叔丁基甲苯、1，1_二甲基-4-乙酰 基-6-叔丁基茚滿、六甲基三環(huán)異色滿麝香、1，1，2,3,3,6_六甲基-5-乙?；釢M、麝香-Τ、 麝香-Μ、麝香-L、麝香-F、ll-氧雜環(huán)十六內(nèi)酯、吐納麝香;3)香精，玫瑰香精、茉莉香精、檀香 香精、白蘭香精。
[0045] 其中，所述色素可以是選自如下組分中的一種或幾種:二氧化鋯、醋酸鉛、硝酸銀、 葉綠素、葉綠素銅、亞鐵氰化鐵、鳥嘌呤、堅牢紅、食品紅I、還原紅I、胭脂紅、食用楊梅紅、食 用櫻桃紅、食品紅17、莧菜紅、堅牢綠、食品黃3、食用檸檬黃、食用蘇丹黃、食用靛藍(lán)、食品藍(lán) 2、焚光桃紅、β_胡蘿卜素、指甲花、梔子紅色素、梔子綠色素、梔子藍(lán)色素、梔子黃色素、鈦云 母珠光顏料、氧化鐵紅、氧化鐵黃、氧化鐵黑、氧化鉻綠、氧氯化鉍、堿性桃紅、銀朱R、喹啉 黃、紫草寧、紫膠紅色素、群青、酸性紅87、酸性綠25、酸性熒光黃、酸性橙7、金光紅53、立索 爾寶紅ΒΚ、立索爾寶紅2R、永固橙。
[0046] 其中，所述防腐劑可以是選自如下組分中的一種或幾種組合：山梨酸及其鹽、丙酸 鹽、對羥基苯甲酸酯、苯甲醇、苯甲酸及其鹽、5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、卡松、咪唑烷基脲、脫氫醋酸及其鹽、亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、 2,2_溴-2-硝基-1，3-丙二醇(布羅波爾）、異抗壞血酸及其鹽、曲酸及其酯、壬二酸、松蘿酸、 間苯二酚。
[0047] 其中，所述抗氧劑可以是選自如下組分中的一種或幾種組合：S0D、丁基羥基茴香 醚、沒食子酸酯、抗壞血酸及其鹽、異抗壞血酸及其鹽、谷留醇、蘆丁、生育酚。
[0048] 其中，所述保濕劑可以是選自如下組分中的一種或任意幾種組合：1，2_丁二醇、山 梨醇、木糖醇、甘油、乳酸鹽、聚乙二醇、DL-吡咯烷酮羧酸鹽、D-葡萄糖、曲酸及其酯、尿酸、 乳清酸、果膠酸、昆布氨酸、膠原蛋白、海藻糖、12、羥基硬脂酸膽留醇酯。
[0049] 其中，所述紫外線吸收劑可以是選自如下組分中的一種或幾種組合:吡哆醇鹽酸 鹽、曲酸及其酯、蘆丁、蘆薈苷、咖啡氨酸、橙皮素、2-乙基己基水楊酸酯、2-乙基己基對二甲 基氨基苯酸酯、2-乙基己基對甲氧基肉桂酸酯、水楊酸苯酯、蓋基鄰氨基苯甲酸酯、2-羥 基-4-甲氧基二苯甲酮、2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮-5-磺酸、2-羥基-4-辛氧基二苯甲酮。
[0050] 其中，所述螯合劑可以是選自如下組分中的一種或幾種組合:EDTA二鈉鹽、雙吡啶 硫酮鋅、硫代硫酸鈉。
[0051] 其中，所述收斂劑可以是選自如下組分中的一種或幾種組合:苯酚對磺酸鋅、羥基 氯化鋁、硫酸鋁、硫酸鋁鉀、硫酸鋅、氯化鋁、氯化鋅、卡拉明。
[0052] 其中，所述助滲劑可以是選自如下組分中的一種或幾種組合:二甲基亞砜、1-正十 二烷基氮雜環(huán)庚-2-酮、2-氨基乙醇。
[0053] 作為本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，所述橄欖葉提取物作為添加劑分散于基質(zhì)原料 中。
[0054] 其中，所述基質(zhì)原料可以是油質(zhì)原料、粉質(zhì)原料、膠質(zhì)原料、溶劑原料中的任意一 種或幾種。
[0055] 所述油質(zhì)原料可以是下述基質(zhì)原料中的任意一種或幾種組合:大豆油、橄欖油、 杏仁油、蓖麻油、花生油、棉籽油、茶籽油、霍霍巴油、鱷梨油、椰子油、棕櫚油、可可脂、米糠 油、月見草油、小麥胚芽油、玉米胚芽油、棕櫚蠟、木蠟、水貂油、海龜油、蛇油、蛋黃油、牛脂、 馬脂、豬脂、鹿脂、卵磷脂、羊毛脂、蜂蠟、鯨蠟、蟲膠蠟、石蠟、凡士林、微晶蠟、地蠟、角鯊?fù)椤?羊毛脂蠟、羊毛脂醇、羊毛脂醇酯化物、乙?；蛎?、乙?；蛎肌⒀蛎?、羊毛脂 酸酯化物、聚氧乙烯羊毛脂、聚氧乙烯羊毛醇醚、聚氧丙烯羊毛醇醚、氫化羊毛脂、烷氧基化 氫化羊毛脂、硅油（如：二甲基硅油、八甲基硅油、甲基苯基聚硅氧烷）、聚硅氧烷-聚氧烷基 嵌段共聚物、甲基含氫硅油、Cn脂肪酸及其酯、Cn脂肪醇及其酯;其中，η彡10,并優(yōu)選為10-24,更優(yōu)選為 12-20,如 14、16、17、18。
[0056]所述Cn脂肪酸如：月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、芥酸、癸酸。
[0057]所述Cn脂肪醇如：月桂醇、鯨蠟醇、硬脂醇、異硬脂醇、油醇、椰油醇。
[0058]所述Cn脂肪酸酯、Cn脂肪醇酯如：肉豆蔻酸異丙酯、肉豆蔻酸肉豆蔻酯、十四醇乳 酸酯、十六醇乳酸酯、棕櫚酸異丙酯、棕櫚樹異辛酯、硬脂酸丁酯、硬脂酸異辛酯、硬脂酸單 甘油脂、硬脂酸聚乙二醇酯、油酸癸酯、辛酸甘油酯、癸酸甘油酯、甘油三油酸酯。
[0059]所述粉質(zhì)原料可以是下述基質(zhì)原料中的任意一種或幾種組合:云母、碳酸鎂、鈦白 粉、鋅白粉、氫氧化鈣、碳酸鈣、高嶺土、硬脂酸鈣、硬脂酸鋅、硬脂酸鎂、滑石粉、二氧化硅、 氫氧化鋁、焦磷酸鈣、碳酸氫鈣、膨潤土。
[0060]其中，所述油脂原料可以是植物油質(zhì)原料、動物油質(zhì)原料、礦物油質(zhì)原料、合成油 質(zhì)原料、半合成油質(zhì)原料中的任意一種或幾種。如：淀粉、環(huán)糊精、黃原膠、角叉膠、瓜爾豆 膠、阿拉伯膠、黃芪膠、瓊脂、蟲膠、海藻酸鈉、明膠、甲基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素 鈉、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、聚纖維素醚季銨鹽、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯 酸鈉、聚氧乙烯、乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物、卡波樹脂、硅酸鋁鎂、&2-15醇苯甲酸 酯。
[0061] 所述溶劑原料可以是下述基質(zhì)原料中的任意一種或幾種組合:水、乙醇、丙醇、異 丙醇、異丁醇、乙二醇、1，2_丙二醇、環(huán)己烷、二氯二氟甲烷、四氟二氯乙烷、乙二醇單乙醚、 二甘醇單乙醚、丙酮、甲基異丁基甲酮、醋酸乙酯、醋酸丁酯、乙酸戊酯、鄰苯二甲酸二丁酯。
[0062] 本發(fā)明提供的橄欖葉提取物具有較強的抗衰老作用，這是因為其能夠大幅提高 人體真皮層中膠原蛋白的含量，而使人體皮膚保持彈性，從根本上抑制皺紋的出現(xiàn)。此外， 本發(fā)明提供的橄欖葉提取物還能夠明顯抑制自由基(DPPH)的生成，可作為制品或添加劑應(yīng) 用于食品、藥品、護膚品和/或化妝品中，發(fā)揮抗氧化抗衰老的雙重效果。
【附圖說明】
[0063] 圖1為自然狀態(tài)下橄欖葉提取物對I型膠原蛋白分泌的影響；
[0064] 圖2為過氧化氫對細(xì)胞存活率的影響；
[0065] 圖3為橄欖葉提取物對過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞存活率的影響；
[0066] 圖4為橄欖葉提取物對過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞MMP-1含量的影響；
[0067]圖5為橄欖葉提取物對DPPH清除率的影響；
[0068] 圖6為橄欖葉提取物對透明質(zhì)酸含量的影響。
【具體實施方式】
[0069] 橄欖葉提取物的制備方法
[0070] 實施例1-4
[0071] 將新采摘的橄欖葉，清水清洗2次，清洗時向清水中注入濃度為lOOppm的二氧化 氯，對橄欖葉清洗、殺菌，并使用65°C熱風(fēng)干燥清洗過的橄欖葉，得到含水量在5%以下的干 橄欖葉，并將制備的干橄欖葉粉碎，備用。
[0072] 取粉碎后的干橄欖葉10kg，并向其中加入一定體積倍量的50%甲醇水溶液為溶 媒，65°C、1.0IMPa提取3次，每次2h，提取結(jié)束后，混合每次的提取液，得到混合提取液，混合 提取液在5kPa、微沸條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)0.5h，去除其中的甲醇，得到濃縮液。
[0073]使用1M的鹽酸調(diào)節(jié)濃縮液至pH值=4,將濃縮液使用玻璃色譜柱層析提純，然后用 體積比為甲醇：乙醇:水= 2:5:3的混合溶液作為洗脫液洗脫，洗脫液的流速為3BV/h，洗脫 溫度為25°C。將洗脫后得到的洗脫液在60°C加熱，進一步濃縮制倍橄欖葉提取物，該提取物 為溶液。
[0074]將該橄欖葉提取物加入10倍體積水稀釋，使用高效液相色譜，C18色譜柱，在35°C、 282nm波長下檢測，以乙腈:水= 22:78作為流動相，分析可知，各物質(zhì)的含量如下：
[0075]表1、橄欖葉在不同溶媒比下的提取結(jié)果
[0076]
[0077] 由表1可知，在橄欖葉粉末與甲醇水溶液比例從lg: (5_20)mL過程中，隨著甲醇水 溶液量的增加，羥基酪醇和總多酚的含量均逐漸增加，甲醇水溶液增至15mL/g橄欖葉粉末 時，羥基酪醇和總多酚的含量增加緩慢。
[0078] 實施例5-13
[0079]將新采摘的橄欖葉，清水清洗2次，清洗時向清水中注入濃度為lOOppm的二氧化 氯，對橄欖葉清洗、殺菌，并使用65°C熱風(fēng)干燥清洗過的橄欖葉，得到含水量在5%以下的干 橄欖葉，并將制備的干橄欖葉粉碎，備用。
[0080]取粉碎后的干橄欖葉10kg，向其中加入10倍體積倍量的溶媒，110°C、1.5MPa下提 取3次，每次2h，提取結(jié)束后，混合每次的提取液，得到混合提取液，混合提取液在5kPa、微沸 條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)〇. 5h，得到濃縮液。
[0081 ] 使用0.8M的硫酸調(diào)節(jié)濃縮液pH值=3，將濃縮液使用D-101大孔吸附樹脂在40 °C吸 附2h，吸附飽和，然后采用不同濃度乙醇梯度洗脫，洗脫液的流速為2BV/h，洗脫溫度為35 °C。將洗脫后得到的洗脫液在5kPa、20°C-30°C微沸狀態(tài)下濃縮去除其中的乙醇，制備橄欖 葉提取物，該橄欖葉提取物的性狀為溶液。
[0082]將該橄欖葉提取物加入10倍體積水稀釋，使用高效液相色譜，C18色譜柱，在35°C、 282nm波長下檢測，以乙腈:水= 22:78作為流動相，分析可知，各物質(zhì)的含量如下：
[0083] 表2、橄欖葉在不同種類、不同濃度溶媒下提取結(jié)果
[0084]
[0085]
[0086] 由表2可知，去離子水比甲醇水溶液和乙醇水溶液更利于提取羥基酪醇及其他多 酚類物質(zhì)。
[0087] 實施例 14-18
[0088]將新采摘的橄欖葉，清水清洗2次，清洗時向清水中注入濃度為lOOppm的二氧化 氯，對橄欖葉清洗、殺菌，并使用65°C熱風(fēng)干燥清洗過的橄欖葉，得到含水量在5%以下的干 橄欖葉，并將制備的干橄欖葉粉碎，備用。
[0089]取粉碎后的干橄欖葉10kg，向其中加入10體積倍量的去離子水為溶媒，65°C、不同 壓力下提取3次，每次2h，提取結(jié)束后，混合每次的提取液，得到混合提取液，混合提取液在 5kPa、微沸條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)0.5h，去除其中的甲醇，得到濃縮液。
[0090] 使用0.8M的硫酸調(diào)節(jié)濃縮液pH值=3，將濃縮液使用玻璃色譜柱層析提純，然后用 體積比為甲醇：乙醇:水=1:3:6的混合溶液作為洗脫液多次洗脫，洗脫液的流速為2BV/h， 洗脫溫度為35°C。將洗脫后得到的洗脫液加熱，進一步濃縮制備浸膏，采用輻射法對制備的 浸膏滅菌30min，滅菌的浸膏經(jīng)噴霧干燥，制備得到橄欖葉提取物，該橄欖葉提取物的Sal值 為5X 10-6。
[0091] 其中，噴霧干燥的條件為：高壓栗在lOOMPa壓力下將滅菌的濃縮液經(jīng)霧化器形成 100μπι的顆粒，霧化后的小顆粒在80°C熱空氣條件下干燥20s。
[0092] 將該橄欖葉提取物加入10倍體積水稀釋，使用高效液相色譜，C18色譜柱，在35 °C、282nm波長下檢測，以乙腈:水= 22:78作為流動相，分析可知，各物質(zhì)的含量如下：
[0093]表3、橄欖葉在不同壓力下提取結(jié)果
[0094]
[0095] 由表3可知，壓力偏離大氣壓越多，得到的橄欖葉提取物中總多酚和羥基酪醇的含 量相對更高。
[0096] 實施例 19-23
[0097]將新采摘的橄欖葉，清水清洗2次，清洗時向清水中注入濃度為lOOppm的二氧化 氯，對橄欖葉清洗、殺菌，并使用65°C熱風(fēng)干燥清洗過的橄欖葉，得到含水量在5%以下的干 橄欖葉，并將制備的干橄欖葉粉碎，備用。
[0098]取粉碎后的干橄欖葉10kg，向其中加入10體積倍量的去離子水為溶媒，65 °C、 0.2MPa下提取3次，每次2h，提取結(jié)束后，混合每次的提取液，得到混合提取液，混合提取液 在5kPa、微沸條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)0.5h，得到濃縮液。
[0099] 使用0.8M的硫酸調(diào)節(jié)濃縮液pH值=3，將濃縮液使用D-101型大孔吸附樹脂吸附 2h，吸附溫度為40°C，然后使用不同濃度的乙醇水溶液梯度洗脫，乙醇水溶液的流速為2BV/ h，洗脫溫度為35°C。將洗脫后得到的洗脫液在10kPa、20°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)lh，以除去其中的乙 醇。進一步濃縮制備浸膏，采用鈷60-γ射線，控制浸膏的吸收劑量為10-30kGy福射滅菌lh， 滅菌的浸膏經(jīng)噴霧干燥，制備得到橄欖葉提取物，該橄欖葉提取物的Sal值為5X 10-6。
[0100]其中，噴霧干燥的條件為：高壓栗在120MPa壓力下將滅菌的濃縮液經(jīng)霧化器形成 300μπι的顆粒，霧化后的小顆粒在80°C熱空氣條件下干燥20s。
[0101] 將該橄欖葉提取物加入10倍體積水稀釋，使用高效液相色譜，C18色譜柱，在35 °C、282nm波長下檢測，以乙腈:水= 22:78作為流動相，分析可知，各物質(zhì)的含量如下：
[0102] 表4、橄欖葉提取物在不同洗脫液下的濃度
[0103]
[0104] 表4中所述"洗脫液經(jīng)濃縮后二次洗脫"是指濃縮液經(jīng)過不同濃度的乙醇及其水溶 液洗脫后，取得到的洗脫液，二次濃縮去除其中的乙醇，將經(jīng)過二次濃縮的溶液在相同的純 化條件下純化。
[0105]由表4可知，經(jīng)低濃度的乙醇水溶液洗脫，得到的橄欖葉提取物中總多酚和羥基酪 醇的含量相對更高。
[0106] 實施例24-28
[0107] 將新采摘的橄欖葉，清水清洗2次，清洗時向清水中注入濃度為lOOppm的二氧化 氯，對橄欖葉清洗、殺菌，并使用65°C熱風(fēng)干燥清洗過的橄欖葉，得到含水量在5%以下的干 橄欖葉，并將制備的干橄欖葉粉碎，備用。
[0108] 取粉碎后的干橄欖葉10kg，向其中加入10體積倍量的去離子水為溶媒，1.8MPa、不 同溫度下提取2次，每次2h，提取結(jié)束后，混合每次的提取液，得到混合提取液，混合提取液 在5kPa、微沸條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)0.5h，得到濃縮液。
[0109] 使用0.8M的硫酸調(diào)節(jié)濃縮液pH值=3,將濃縮液使用D-101型大孔吸附樹脂吸附 2h，吸附溫度為40°C，然后使用不同濃度的乙醇水溶液洗脫，乙醇水溶液的流速為2BV/h，洗 脫溫度為35°C。將洗脫后得到的洗脫液在10kPa、20°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)lh，以除去其中的乙醇。進 一步濃縮制備浸膏，采用鈷60-γ射線，控制浸膏的吸收劑量為10-30kGy輻射滅菌lh，滅菌 的浸膏經(jīng)噴霧干燥，制備得到橄欖葉提取物，該橄欖葉提取物的Sal值為5X 10-6。
[0110] 其中，噴霧干燥的條件為：高壓栗在120MPa壓力下將滅菌的濃縮液經(jīng)霧化器形成 300μπι的顆粒，霧化后的小顆粒在80°C熱空氣條件下干燥20s。
[0111] 將該橄欖葉提取物加入10倍體積水稀釋，使用高效液相色譜，C18色譜柱，在35°C、 282nm波長下檢測，以乙腈:水= 22:78作為流動相，分析可知，各物質(zhì)的含量如下：
[0112] 表5、橄欖葉提取物在不同溫度下的提取結(jié)果
[0113]
[0114] 由表5可知，反應(yīng)溫度越高，得到的橄欖葉提取物中羥基酪醇和總多酚的含量越 尚。
[0115]綜合考慮溫度和壓力對提取物的影響，選擇在較高的壓力和較高的溫度下提取橄 欖葉。
[0116] 對比實施例
[0117] 取10kg含水量在4%以下的干橄欖葉除雜后，去離子水清洗2次，使用65°C熱風(fēng)干 燥，然后粉碎，并用10倍體積的稀鹽酸水溶液浸提2h，稀氫氧化鈉水溶液中和多余的鹽酸， 離心過濾，濾液經(jīng)旋蒸脫水后經(jīng)過AB-8大孔吸附樹脂吸附純化，吸附的溫度為35°C，吸附 2h。然后使用無水乙醇以3BV/h的流速洗脫。經(jīng)純化的濾液在5kPa、20 °C下旋蒸，除去其中的 乙醇，剩余提取液經(jīng)真空干燥得到含15%羥基酪醇的橄欖葉提取物。其中，真空干燥過程 中，先將剩余提取液在_l〇°C預(yù)凍4h，凍結(jié)成固態(tài)，然后于-10°C、20Pa條件下干燥至恒重，得 到含總多酚35%、羥基酪醇15%的橄欖葉提取物。
[0118] 橄欖葉提取物對人HDF細(xì)胞和Hacat細(xì)胞存活率的影響
[0119] 材料與試劑
[0120] MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）； 人真皮成纖維細(xì)胞（HDF) I型膠原蛋白 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 細(xì)胞培養(yǎng)箱 離心機 酶標(biāo)儀：
[0121] 吸光度測量儀 超聲波細(xì)胞粉碎機 BCA蛋白檢測試劑盒 加熱鍋 細(xì)胞培養(yǎng)液 DMSO
[0122] 測試步驟
[0123] 取對數(shù)生長期的濃度為105個/mL的人HDF細(xì)胞或Hacat細(xì)胞，將細(xì)胞接種于96孔板 中，每孔細(xì)胞液lOOyL。
[0124] 將96孔板置于37°C的細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)6h。
[0125] 將終濃度為lmg/mL、0 . lmg/mL和0.01mg/mL的本發(fā)明提供的橄欖葉提取物加入到 96孔板中，向?qū)φ战M加入等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液。于37°C、包含5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育 48h；
[0126] 然后向每孔中加入0.5mg/mL的MTTlOOyL，于37°C、包含5%⑶2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中黑 暗條件下孵育4h。去除上清液，加入150yL DMS0，震蕩以570nm為實驗波長，630nm為參照波 長，檢測吸光光度值；
[0127] 計算細(xì)胞存活率，結(jié)果如表6所示：
[0128] 表6，橄欖葉提取物對人HDF細(xì)胞和HaCat細(xì)胞存活率的影響
[0129]
LU1W」 以細(xì)腿仔沽卒咼t80%為對人HUK細(xì)腿尤苺的稱準(zhǔn)，佛足橄欖葉提取物對HUK細(xì) 胞無毒的最高濃度〇. 01mg/mL，以細(xì)胞存活率高于80 %為對人HaCat細(xì)胞無毒的標(biāo)準(zhǔn)，確定 橄欖葉提取物對HaCat細(xì)胞無毒的最高濃度為0.1mg/mL，兩者選取濃度較低的一個，即選取 橄欖葉提取物濃度〇. 01mg/mL為后續(xù)的試驗濃度。
[0131]橄欖葉提取物的抗衰老性能
[0132] 自然狀態(tài)下橄欖葉提取物對HDF細(xì)胞膠原蛋白分泌的影響
[0133] 本測試分為實驗組、對照實驗組、空白組和標(biāo)準(zhǔn)組。
[0134] 取對數(shù)生長期濃度為105個/mL細(xì)胞，每孔100yL，于37°C、含有⑶2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)24h，之后取出上清液，以3000rpm的速度離心10min，取上清液。
[0135] 向?qū)嶒灲M中加入10yL上清液和40yL本發(fā)明提供的橄欖葉提取物的稀釋液，向?qū)φ?實驗組中加入l〇yL上清液和40yL采用對比實施例所述方法制備的橄欖葉提取物的稀釋液， 空白組中不加樣品，向標(biāo)準(zhǔn)組中加入50yL標(biāo)準(zhǔn)液，分別于37°C孵育lh，并洗板5次。
[0136] 向四組樣品中分別加入生物素標(biāo)記的抗-lgG抗體50yL，于37°C溫育30min，洗滌5 次。
[0137] 向四組樣品中分別加入50yL的鏈霉素和素-HRP，輕輕震蕩混勻，于37 °C溫育 30min，洗滌5次。
[0138] 向四組樣品中分別加入顯色劑A和顯色劑B各50yL，輕輕震蕩混勻，于37°C避光孵 育30min，向四組樣品中加入終止液50yL。
[0139] 以空白組調(diào)零，在終止反應(yīng)后15min內(nèi)，在450nm波長測量各組的吸光度。并根據(jù)標(biāo) 準(zhǔn)品對應(yīng)的I型膠原蛋白的含量，計算出橄欖葉提取物中的膠原蛋白-I的含量，結(jié)果如表7 和圖1所示。
[0140]表7、橄欖葉提取物對HDF細(xì)胞膠原蛋白分泌的影響
[0141]
[0142] 膠原蛋白主要包括I型膠原和III型膠原，外界誘導(dǎo)促使真皮細(xì)胞中氧化水平提 高是細(xì)胞損傷的主要因素，氧化水平提高的直接結(jié)果是降低了 I型膠原蛋白的表達及I型膠 原蛋白被基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-1降解，兩種情況造成的結(jié)果均為I型膠原蛋白在皮膚中的含 量減少，而I型膠原蛋白含量減少是皮膚形成皺紋的主要原因。
[0143 ]由表7和圖1可知，向人HDF細(xì)胞中添加本發(fā)明提供的橄欖葉提取物后，皮膚中的I 型膠原蛋白含量比未添加橄欖葉提取物時提高了 21%，采用現(xiàn)有技術(shù)制備的橄欖葉提取物 在促進I型膠原蛋白分泌方面比未添加橄欖葉提取物時提高了6.58%，說明采用本發(fā)明提 供的制備方法得到的橄欖葉提取物對I型膠原蛋白的分泌具有更顯著的促進作用，能夠顯 著促進I型膠原蛋白的表達，是潛在的抗老化添加劑。
[0144] 過氧化氫對HDF細(xì)胞存活率的影響
[0145] 選取不同濃度的過氧化氫，如 50μΜ、100μΜ、200μΜ、400μΜ、600μΜ、800μ]\^Ρ1000μΜ， 與HDF細(xì)胞共同孵育不同時間，如3h、6h和9h等，采用ΜΤΤ法檢測不同濃度的過氧化氫對HDF 細(xì)胞存活率的影響。
[0146] 材料與試劑
[0147] 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 MTT
[0148] 細(xì)胞培養(yǎng)液 細(xì)胞培養(yǎng)箱
[0149] DMS0 吸光度測量儀
[0150] 測試步驟
[0151] 取培養(yǎng)至濃度為105個/mL的HDF細(xì)胞，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100yL。于37 °C、含有C02的培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)6h。
[0152]使用不同濃度的過氧化氫分別孵育造模3h、6h和9h;向每個樣品孔中加入濃度為 0.5mg/mL的MTT 100yL，于37°C、含有C02的培養(yǎng)箱中，黑暗條件下孵育4h。
[0153] 去除上清液，向樣品中加入150yL DMS0,震蕩，以570nm為實驗波長，630nm為參照 波長，檢測每個樣品的吸光度，計算細(xì)胞存活率。
[0154] 細(xì)胞存活率曬 則R午備鋌啜光度均逋 ^
[0155] 測試結(jié)果如圖2所示，人HDF細(xì)胞于濃度為50-800μΜ的過氧化氫共孵育3-9h后，人 HDF細(xì)胞的存活率明顯下降，當(dāng)孵育濃度超過400μΜ時，細(xì)胞存活率低于50% dOOyM過氧化 氫作用6h后，細(xì)胞存活率降到70 %。
[0156] 橄欖葉提取物對過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞存活率的影響
[0157] 本試驗分為空白組、實驗組、陽性對照組和對照試驗組。
[0158] 取培養(yǎng)至密度為105個/mL的HDF細(xì)胞接種于96孔板，每孔100yL，每孔設(shè)3個復(fù)孔。 于37°C，含有C0 2的培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)6h。
[0159] 空白組中不加入樣品，實驗組中加入本發(fā)明提供的橄欖葉提取物，對照實驗組加 入對比實施例制備的橄欖葉提取物，陽性對照組中加入維甲酸。
[0160] 實驗組、陽性對照組和對照實驗組利用過氧化氫損傷建模。
[0161] 向四組試驗中的每孔加入0.5mg/mL的MTT 100yL，于37°C、5%C02的黑暗條件下孵 育4h。去除上清液，加入DMS0 150yL，震蕩檢測吸光度，計算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率采用如 下計算公式：
[0162]
[0163] 其中，空白組既未加入過氧化氫，也未加入橄欖葉提取物。
[0164] 表8,橄欖葉提取物對過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞存活率的影響
[0165]
[0166] 由表8陰性對照組數(shù)據(jù)可知，經(jīng)過過氧化氫損傷后，HDF細(xì)胞的存活率降低至70% 以下，而向經(jīng)過氧化氫損傷過的HDF細(xì)胞中加入維甲酸后，HDF細(xì)胞的存活率提高至89%，如 表8中陽性對照組所述。向經(jīng)過過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞中加入本發(fā)明提供的橄欖葉提取物 后，人HDF細(xì)胞的存活率達到85.75%，向經(jīng)過氧化氫損傷過的HDF細(xì)胞中加入現(xiàn)有技術(shù)制備 的橄欖葉提取物后，人HDF細(xì)胞的存活率為76%，即本發(fā)明提供的橄欖葉提取物相對于現(xiàn)有 技術(shù)制備的橄欖葉提取物，其修復(fù)受損肌膚的能力與維甲酸接近，能夠顯著修復(fù)過氧化氫 對HDF細(xì)胞造成的損傷。
[0167] 橄欖葉提取物對過氧化氫損傷HDF細(xì)胞MMP-1分泌量的影響
[0168] 材料與試劑
[0169] 細(xì)胞培養(yǎng)液 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板
[0170] 細(xì)胞培養(yǎng)箱 過氧化氫
[0171] 離心機 ELISA試劑盒
[0172] 測試步驟
[0173 ] 本測試分為實驗組、對照實驗組、陰性對照組、陽性對照組、空白組和標(biāo)準(zhǔn)組。
[0174] 取對數(shù)生長期的濃度為105個/mL的HDF細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔lmL，于37 °C，含有C0 2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h。
[0175] 向?qū)嶒灲M加入本發(fā)明提供的橄欖葉提取物，向?qū)φ諏嶒灲M中加入采用對比實施例 所述方法制備的橄欖葉提取物，向標(biāo)準(zhǔn)組加入50yL標(biāo)準(zhǔn)液，陽性對照組加入維甲酸，陰性對 照組中不加樣品，誘導(dǎo)建立過氧化氫損傷模型。
[0176] 空白組不加樣品，不建立過氧化氫損傷模型。
[0177] 小心吸取上清液培養(yǎng)基，離心，按照試劑盒說明書，取10此細(xì)胞懸液進行實驗。以 空白孔調(diào)零，在反應(yīng)終止后15min內(nèi)，用450nm波長測量各孔的吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的 MMP-1的濃度及對應(yīng)的吸光度值，計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣本的吸光度 值，在回歸方程上計算出實驗組中MMP-1的濃度，結(jié)果如表9和圖4所示。
[0178] 表9,橄欖葉提取物對過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞MMP-1表達的影響
[0179]
[0180] 經(jīng)過過氧化氫刺激后，HDF細(xì)胞中的MMP-1水平顯著上升至空白組的1.67倍，見表9 和圖4中的陰性對照組;加入維甲酸后，MMP-1的值降低至空白組的1.25倍，見表9中陽性對 照組；向HDF細(xì)胞中加入本發(fā)明提供的橄欖葉提取物后，MMP-1的含量降低至空白組的1.27 倍，與陽性對照組接近，而加入采用現(xiàn)有技術(shù)制備的橄欖葉提取物后，MMP-1的含量為空白 組的1.46倍，明顯高于實驗組中的MMP-1的濃度。這說明，在氧化應(yīng)激條件下，本發(fā)明提供的 橄欖葉提取物與現(xiàn)有技術(shù)制備的橄欖葉提取物相比，具有更優(yōu)異的抑制匪P-1表達的性 能，能夠更有效的修復(fù)受損皮膚。
[0181] 橄欖葉提取物對過氧化氫損傷HDF細(xì)胞內(nèi)MDA含量的影響
[0182] MDA在酸性條件下加熱時，可與硫代巴比妥酸(TBA)縮合，形成紅色產(chǎn)物3，5，5-三 甲基惡唑-2，4-二酮，在532nm處有最大吸收峰。因底物為硫代巴比妥酸(TBA)，故稱此法為 TBA 法。
[0183 ] 本測試分為實驗組、對照實驗組、陽性對照組、陰性對照組和空白組。
[0184] 取對數(shù)生長期、濃度為105個/mL的HDF細(xì)胞，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔2mL，培養(yǎng) 6h〇
[0185] 向?qū)嶒灲M加入經(jīng)新鮮培養(yǎng)基稀釋的本發(fā)明制備的橄欖葉提取物，向?qū)φ諏嶒灲M加 入采用對比實施例所述方法制備的橄欖葉提取物，陽性對照組加入維甲酸，陰性對照組不 加樣品，誘導(dǎo)建立過氧化氫損傷模型。
[0186] 空白組不加樣品，不建立過氧化氫損傷模型。
[0187] 以lOOOrpm離心10min，收集培養(yǎng)基上清液中的細(xì)胞及貼壁細(xì)胞，在細(xì)胞沉淀中加 入500yL PBS，輕輕顛倒混勻，于4°C下，以2000rpm離心10min，棄除上清液留存底部沉淀。向 沉淀中加入500yL PBS，超聲破碎細(xì)胞(400A，5s/次，間隙10s反復(fù)3~5次），制備細(xì)胞勻漿；
[0188] 按照試劑盒說明書進行實驗。將試劑混勻，用保鮮膜將試管口扎緊，用針頭刺孔透 氣，用鍋開蓋煮沸40min，取出后流水冷卻，以4000rpm離心10min，使沉淀完全。取上清液，采 用分光光度法測定532nm波長處的吸光度;利用BCA蛋白檢測試劑盒，按照說明書方法將本 發(fā)明提供的橄欖葉提取物稀釋適當(dāng)倍數(shù)，測定細(xì)胞中的蛋白質(zhì)含量；
[0189] 表10,橄欖葉提取物對過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞MDA含量的影響
[0190]
[0191] 由表10和圖5可知，將正常HDF細(xì)胞的MDA含量記為100,過氧化氫損傷后，MDA濃度 快速上升，6h時MDA含量增加至正常狀態(tài)的326%，如表10中陰性對照組所示;而加入維甲酸 后MDA含量的增加得到抑制，MDA濃度降低至262%，如表10中陽性對照組所示；向經(jīng)過過氧 化氫損傷的HDF細(xì)胞中加入本發(fā)明提供的橄欖葉提取物后，MDA含量明顯降低至224%，明 顯低于陽性對照組中MDA的含量;而加入采用現(xiàn)有技術(shù)制備的橄欖葉提取物后，經(jīng)過氧化氫 損傷的HDF細(xì)胞中MDA的含量為257%，這說明本發(fā)明提供的橄欖葉提取物對人HDF細(xì)胞損傷 具有顯著的修復(fù)作用，且對HDF細(xì)胞的修復(fù)作用明顯優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)制備的橄欖葉提取物。
[0192] 橄欖葉提取物去除自由基的性能
[0193] 1，1_二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)是一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基，它的穩(wěn)定性 主要來自3個苯環(huán)的共振穩(wěn)定作用及空間障礙，使夾在中間的氮原子上不成對的電子不能 發(fā)揮其應(yīng)有的電子成對作用。作為一種穩(wěn)定的自由基，其可以清除其他的自由基。目前廣泛 用于定量測定生物試樣和食品的抗氧化能力。此法是根據(jù)DPPH自由基有單電子，在517nm處 有一強吸收，其醇溶液呈紫色的特性。當(dāng)有自由基清除劑存在時，由于與其單電子配對而使 其吸收逐漸消失，其褪色程度與其接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，因而可用分光光度計進行 快速的定量分析。
[0194] 材料與試劑
[0195] DPPH 無水乙醇
[0196] dd 水 200yL 吸頭
[0197] 96孔板 8通道加樣槍
[0198] 酶標(biāo)儀
[0199] 測試步驟
[0200]用無水乙醇配置0.2mmol/L的DPPH溶液，避光保存，配置0.01mg/mL的表沒食子兒 茶素沒食子酸酯(EGCG)溶液，。
[0201]向?qū)嶒灲M添加20uL濃度為0 .Olmg/mL本發(fā)明提供的橄欖葉提取物溶液和0.2mmol/ L的DPPH乙醇溶液180uL至96孔板中，向空白組1中添加180uL無水乙醇與20uL本發(fā)明提供的 橄欖葉提取物溶液，向標(biāo)準(zhǔn)組中添加180uL DPPH溶液與20uL蒸餾水，每孔設(shè)置至少3個復(fù) 孔，分別搖勻，室溫下暗處靜置30min，測定各組的吸光度。
[0202]向?qū)φ赵囼灲M添加20uL濃度為0.0 lmg/mL采用現(xiàn)有技術(shù)制備的橄欖葉提取物溶液 和0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液180uL至96孔板中，向空白組2中添加180uL無水乙醇與20uL 采用現(xiàn)有技術(shù)制備的橄欖葉提取物溶液，每孔設(shè)置至少3個復(fù)孔，分別搖勻，室溫下暗處靜 置30min，測定各組的吸光度。
[0203] DPPH白由甚的諳除能力桉T忒丟元.
[0204]
[0205]其中，計算實驗組的DPPH清除率時，測試樣吸光度為實驗組的吸光度，空白組吸光 度分別為空白組1的吸光度；
[0206]計算對照實驗組的DPPH清除率時，測試樣吸光度為對照實驗組的吸光度，空白組 吸光度為空白組2的吸光度；
[0207]清除率越大表明抗氧化能力越強，結(jié)果如圖6所示，當(dāng)溶液中不存在DPPH自由基 時，空白組的DPPH清除率為0，EGCG對DPPH自由基的去除率為47.23%，本發(fā)明提供的橄欖葉 提取物對DPPH自由基的去除率為76.15%，采用現(xiàn)有技術(shù)制備的橄欖葉提取物對DPPH自由 基的去除率不足60%，說明橄欖葉提取物具有非常強的去除DPPH自由基的能力，且相對于 現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明制備的橄欖葉提取物具有更優(yōu)異的DPPH清除率。
[0208] 橄欖葉提取物對HDF細(xì)胞保濕能力的影響
[0209] 橄欖葉提取物對HDF細(xì)胞透明質(zhì)酸(HA)分泌的影響
[0210] 皮膚內(nèi)水分的含量的多少，直接影響皮膚的彈性、光澤度等，皮膚的表皮、真皮、皮 下組織均對皮膚維持水分起著不同的作用。在皮膚保濕過程中，主要有兩種機制影響皮膚 對水的維持作用：
[0211] 1)皮膚作為天然屏障，避免水分流失；
[0212] 皮膚表皮是人的天然屏障，其中透明層、顆粒層和角質(zhì)層對皮膚鎖水能力起到重 要作用。透明層含有磷脂類物質(zhì)和角質(zhì)蛋白，能夠防止水分及電解質(zhì)等透過皮膚。顆粒層的 細(xì)胞排列致密，對貯存水分、防止水分滲透具有重要的作用。角質(zhì)層是由角質(zhì)形成細(xì)的堅 韌、有彈性的板層結(jié)構(gòu)，細(xì)胞內(nèi)充滿了角蛋白。
[0213] 2)皮膚中存在許多保濕因子，吸收和鎖住水分。
[0214]在皮膚真皮層中，透明質(zhì)酸(HA)是含量較多的氨基多糖，HA粘稠度極高且能高比 例地結(jié)合水分子，HA的含量直接影響皮膚中水分的含量。作為皮膚內(nèi)重要的保濕成分，它 對皮膚細(xì)胞的增殖、分化有顯著作用，對維持皮膚細(xì)胞的正常新陳代謝至關(guān)重要。
[0215] 材料與試劑
[0216]細(xì)胞培養(yǎng)液 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板
[0217] 細(xì)胞培養(yǎng)箱 離心機
[0218] ELISA試劑盒 吸光度測量儀
[0219] 測試步驟
[0220] 本測試分為實驗組、對照實驗組、空白組和標(biāo)準(zhǔn)組。
[0221]取對數(shù)生長期的濃度為105個/mL的人HDF細(xì)胞，將培養(yǎng)的細(xì)胞接種于24孔板中，每 孔細(xì)胞液lmL，于37°C、含有C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h。
[0222] 向?qū)嶒灲M細(xì)胞液中加入一定量本發(fā)明提供的橄欖葉提取物，置于37°C、含有5% C02及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h;
[0223] 小心收集上清培養(yǎng)基，離心后得到上清液，備用。
[0224] 向標(biāo)準(zhǔn)組中加入50yL標(biāo)準(zhǔn)液，向?qū)嶒灲M中加入10yL上清液和40yL本發(fā)明提供的橄 欖葉提取物的稀釋液，向?qū)φ諏嶒灲M中加入l〇yL上清液和40yL采用對比實施例所述方法制 備的橄欖葉提取物的稀釋液，空白組中不加樣品，分別于37°C孵育lh，并洗板5次。
[0225] 向四組樣品中分別加入顯色劑A和顯色劑B各50yL，于37°C避光孵育30min，向四組 樣品中加入終止液50yL。
[0226] 以空白組調(diào)零，在終止反應(yīng)后15min內(nèi)，在450nm波長測量各組的吸光光度值。
[0227] 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)組的HA的含量與對應(yīng)的吸光光度值，計算標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程，再 根據(jù)樣本的吸光光度值，在回歸方程上計算出實驗組中HA的含量，結(jié)果如表11和圖6所示。
[0228] 表11，橄欖葉提取物對HA分泌的影響
[0229]
[0230]由表11可知，添加本發(fā)明提供的橄欖葉提取物后，人HDF細(xì)胞的HA分泌量比未加入 橄欖葉提取物時提高了 8.5%，比采用現(xiàn)有技術(shù)制備的橄欖葉提取物也更利于HA的分泌，說 明本發(fā)明提供的橄欖葉提取物能夠促進HDF細(xì)胞分泌HA，可以向化妝品中加入本發(fā)明提供 的橄欖葉提取物，以起到更強的保濕能力。
[0231]以上對本發(fā)明的具體實施例進行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限 制于以上描述的具體實施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進行的等同修改和 替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和 修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種化妝品和/或護膚品，其特征在于，所述化妝品和/或護膚品中包含橄欖葉提取 物，所述橄欖葉提取物的含量為0.001 % -50 %。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化妝品和/或護膚品，其特征在于，所述橄欖葉提取物中包括 羥基酪醇，橄欖葉提取物中所述羥基酪醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 % -50 %。3. -種橄欖葉提取物，其特征在于，所述橄欖葉提取物中包括羥基酪醇，所述羥基酪醇 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 %-50 %。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的橄欖葉提取物，其特征在于，所述橄欖葉提取物還包括橄欖苦 甙和毛蕊花糖苷中的任意一種或兩種組合。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的橄欖葉提取物，其特征在于，所述橄欖葉提取物為水提物、醇 提物、油提物、超臨界C02提取物中的任意一種或幾種的組合。6. -種如權(quán)利要求3-5任一項所述的橄欖葉提取物的制備方法，其特征在于，所述方法 包括如下步驟： 步驟1、提供原料清潔的橄欖葉粉末，以溶媒:原料= 5-20:1的體積比，在一定溫度下提 取，經(jīng)過濾得到提取液； 步驟2、將步驟1中過濾后的提取液濃縮、層析，得到層析液，將層析液進一步濃縮后制 備成浸膏，即得到所述橄欖葉提取物。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟2中，將層析液制備成浸膏后，還 包括滅菌步驟，所述滅菌步驟采用熱空氣滅菌、水蒸氣滅菌、輻射滅菌、5%石炭酸、70%乙 醇溶液、50%甲醇水溶液中的任意一種或幾種組合。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟2中還包括將制備得到的浸膏進 一步干燥，得到所述橄欖葉提取物，所述干燥的方法為電加熱干燥、噴霧干燥、熱空氣干燥 中的任意一種或幾種組合，優(yōu)選為噴霧干燥。9. 一種如權(quán)利要求3-5任一項所述的橄欖葉提取物的應(yīng)用，其特征在于，所述橄欖葉提 取物應(yīng)用于制備涂覆于皮膚外表面的制品。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的橄欖葉提取物的應(yīng)用，其特征在于，所述制品中橄欖葉提取 物的含量為0.001 %-50 %。
【文檔編號】A61K8/97GK105997703SQ201610520560
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月5日
【發(fā)明人】洪民華, 劉丹, 趙兆, 洪奇, 呂智, 盧艷花, 何浩
【申請人】上海相宜本草化妝品股份有限公司, 華東理工大學(xué)