一種pH與溫度雙重敏感性的納米囊泡及其制備方法和應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于高分子化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，具體公開(kāi)了一種pH與溫度雙重敏感性的聚合物，所述聚合物由親水段聚乙二醇段和疏水段聚(天冬氨酸?二乙基乙二胺?co?組胺?co?二異丙基乙二胺)段構(gòu)成；所述親水段和疏水段的比例為1：10～1：12。所述pH與溫度雙重敏感性的聚合物可用于制備負(fù)載親水性抗腫瘤藥物或/和超聲造影劑的納米囊泡，該囊泡能用于制備腫瘤診斷藥物或腫瘤治療藥物。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種pH與溫度雙重敏感性的納米囊泡及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及高分子化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，具體地，涉及一種pH與溫度雙重敏 感性的聚合物納米囊泡及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域之中，癌癥作為一類(lèi)復(fù)雜的疾病模型，隨著研究者們對(duì)材料化學(xué)和納 米醫(yī)學(xué)的探索研究，納米載體的長(zhǎng)期創(chuàng)新發(fā)展已經(jīng)徹底改變了癌癥的診斷與治療的方式。 這也反過(guò)來(lái)也促進(jìn)了許多新型的依托于癌癥的診斷與治療的納米載體的設(shè)計(jì)與發(fā)展。尤其 是響應(yīng)于腫瘤微環(huán)境的刺激敏感型的納米載體層出不窮，由原來(lái)的單功能性納米載體逐漸 發(fā)展為雙重或多重響應(yīng)型納米載體，后來(lái)多重響應(yīng)型多重功能的納米載體逐漸受到研究者 們的追捧。這使得癌癥的診斷與治療更加小型化、更加方便、靈敏和準(zhǔn)確，這在科研方面和 臨床方面都具有重要的研究意義。
[0003] 隨著納米輸送體系的發(fā)展，由于能夠在特定的靶點(diǎn)和特定的時(shí)間釋放所負(fù)載的藥 物，刺激響應(yīng)型納米載體用于癌癥的治療越來(lái)越受到人們的歡迎。這類(lèi)納米載體以病變部 位作為靶點(diǎn)，響應(yīng)于局部刺激釋放藥物，大大地增加了局部治療藥物的濃度，改善了治療的 效果。眾所周知，腫瘤組織相對(duì)于正常組織來(lái)說(shuō)，在實(shí)體腫瘤和炎癥部位具有較低的pH值和 較高的溫度，同時(shí)這些組織也展現(xiàn)了高濃度的谷胱甘肽和區(qū)別于正常組織的特殊的各種酶 的過(guò)表達(dá)等。這些局限于腫瘤組織內(nèi)部的刺激因素我們稱(chēng)之為內(nèi)在刺激。相似的，一些刺激 被外部誘導(dǎo)促進(jìn)負(fù)載藥物的釋放，比如局部的加熱、超聲或者近紅外光照射，這一類(lèi)的刺激 被稱(chēng)之為外在刺激。這些內(nèi)部和外部的刺激作為敏感型納米載體的靶點(diǎn)，可以被用于癌癥 的靶向治療。
[0004] 眾所周知，腫瘤組織特殊的微環(huán)境與正常組織的pH有很大差異，其中在正常組織 細(xì)胞外pH為7.4，細(xì)胞內(nèi)pH為7.2，血液循環(huán)過(guò)程中pH為7.4;在腫瘤組織內(nèi)部細(xì)胞外pH為6.5 ~7.2，早期內(nèi)涵體pH為6.0~6.5，晚期內(nèi)涵體pH為5.0~6.0，溶酶體的pH為4.5~5.0。目 前，利用腫瘤特殊的pH響應(yīng)性設(shè)計(jì)應(yīng)用于腫瘤治療的敏感型納米載體是最為常見(jiàn)的?；?對(duì)這一點(diǎn)的認(rèn)識(shí)，研究者們通常利用腫瘤特殊的酸敏響應(yīng)性來(lái)設(shè)計(jì)納米載體實(shí)現(xiàn)腫瘤的靶 向。
[0005] 超聲技術(shù)由于易實(shí)施、成本較低、重復(fù)使用的安全性高和同時(shí)具有成像和治療的 能力，尤其具有吸引力。然而，超聲技術(shù)盡管具有以上優(yōu)點(diǎn)且作為一種成像診斷工具被廣泛 應(yīng)用，但是相比其他醫(yī)學(xué)成像工具(例如CT和MRI)，超聲技術(shù)在區(qū)分正常組織和病變軟組織 方面具有相對(duì)較低的分辨率和靈敏度，因此在早期癌癥檢測(cè)中具有一定的局限性。但是超 聲造影劑的引入克服了這種超聲波成像的內(nèi)在限制。包氣微泡(氟碳?xì)怏w)作為最常見(jiàn)的超 聲造影劑，已經(jīng)應(yīng)用于臨床實(shí)踐，其能夠增強(qiáng)超聲波反向散射的程度，提高了較小的目標(biāo)區(qū) 域的成像分辨率和信噪比，在心血管疾病、組織灌注和腫瘤血管生成等常見(jiàn)疾病診斷中得 到廣泛應(yīng)用。但包氣微泡也存在難以克服的缺陷，比如粒徑太大(通常平均直徑1~10M1)， 很難穿過(guò)新生血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙（尺寸小于700 nm)進(jìn)入靶向組織內(nèi)部，故不能在靶向組織 內(nèi)部實(shí)施超聲造影。正因?yàn)槿绱?，包氣微泡的主要作用僅限于血管內(nèi)的成像和診斷，這使得 研究人員不得不去探索研究新型的納米級(jí)超聲造影劑。納米粒子通過(guò)EPR效應(yīng)在腫瘤部位 富集的最理想尺寸為200 nm以下，而這一尺寸對(duì)于有良好超聲響應(yīng)性的造影劑來(lái)說(shuō)是非常 大的挑戰(zhàn)。因此，在腫瘤超聲造影劑的各種設(shè)計(jì)中，粒徑成為一個(gè)非常重要的考慮因素。應(yīng) 用于腫瘤診療的納米級(jí)超聲造影劑，既要能實(shí)現(xiàn)血液長(zhǎng)循環(huán)并在腫瘤組織富集，又要能在 腫瘤組織實(shí)施超聲造影與藥物控釋?zhuān)@是成功實(shí)現(xiàn)腫瘤超聲診斷與治療的關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種pH與溫度雙重敏感性的聚合物。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述pH與溫度雙重敏感性的聚合物的制備方法。
[0008] 本發(fā)明的另一目的在于提供pH與溫度雙重敏感性的聚合物在制備負(fù)載親水性抗 腫瘤藥物或/和超聲造影劑的納米囊泡中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種負(fù)載親水性抗腫瘤藥物納米囊泡。
[0010] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種負(fù)載超聲造影劑的納米囊泡。
[0011] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種負(fù)載親水性抗腫瘤藥物和超聲造影劑的納米囊 泡。
[0012] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述負(fù)載親水性抗腫瘤藥物和超聲造影劑的納米囊 泡在制備腫瘤診斷藥物或腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。
[0013] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過(guò)以下方案予以實(shí)現(xiàn)的： 一種pH與溫度雙重敏感性的聚合物，所述聚合物由親水段聚乙二醇段和疏水段聚(天 冬氨酸_二乙基乙二胺_CO -組胺-CO -二異丙基乙二胺)段構(gòu)成;所述未水段和疏水段的比 例為1:10~1:12。
[0014]親水的PEG段能夠延長(zhǎng)整個(gè)藥物載體的血液循環(huán)時(shí)間，以避免被網(wǎng)狀內(nèi)皮組織系 統(tǒng)排泄出去，疏水段PAsp(DEA-C〇 -His-C〇 -DIP)具有良好的鏈柔順性、生物相容性和生物 可降解性，疏水段具有酸敏響應(yīng)性，能發(fā)生pH值敏感的親-親水性的轉(zhuǎn)換。優(yōu)選地，聚乙二醇 段數(shù)均分子量為2 kD，聚（天冬氨酸-二乙基乙二胺-C〇 -組胺-⑶-二異丙基乙二胺)段數(shù) 均分子量為20~24 kD。
[0015] 作為優(yōu)選實(shí)施方式，上述pH與溫度雙重敏感性的聚合物的制備方法，具體包括如 下步驟： 51. 以天冬氨酸和苯甲醇為原料制備jS-天門(mén)冬氨酸芐酯； 52. 以jS-天門(mén)冬氨酸芐酯為原料，緩慢加入三光氣，回流制備得到芐氧羰基天冬氨酸 酸酐； 53. 以mPEG-NH2作為引發(fā)劑，引發(fā)開(kāi)環(huán)聚合芐氧羰基天冬氨酸酸酐得到聚合物mPEG-PBLA； 54. mPEG-PBLA為原料，依次與二乙基乙二胺、組胺和二異丙基乙二胺進(jìn)行氨解反應(yīng)，合 成聚合物聚乙二醇-聚(天冬氨酸-二乙基乙二胺-組胺-二異丙基乙二胺）。
[0016] 如上所述pH與溫度雙重敏感性的聚合物在制備負(fù)載親水性抗腫瘤藥物或/和超聲 造影劑的納米囊泡中的應(yīng)用。
[0017] -種負(fù)載親水性抗腫瘤藥物的納米囊泡，由以下方法制備得到：將如上所述的聚 乙二醇-聚(天冬氨酸-二乙基乙二胺-組胺-⑶-二異丙基乙二胺)溶于無(wú)水氯仿中；將 溶解有親水性抗腫瘤藥物的少量水在超聲作用下加入上述氯仿溶液中，形成初次乳化液； 將初次乳化液在同樣條件下逐滴滴加到PBS中，超聲后形成二次乳化液;將二次乳化液去除 氯仿，透析除去未包裹的藥物后即得。
[0018] 本發(fā)明在制備負(fù)載親水性抗腫瘤藥物的納米囊泡時(shí)，以聚合物和親水性藥物為材 料，在pH值為10的條件下，聚合物自組裝形成中間層交聯(lián)的納米囊泡，然后將pH調(diào)至7.4,形 成最終包載親水性抗腫瘤藥物的載藥納米囊泡。在自組裝過(guò)程中，PAsp(DEA-C(9 -His-C(9 -DIP)段自發(fā)地形成囊泡的親水性外殼，PEG段位于該殼的外表面，其內(nèi)部含有親水性抗腫瘤 藥物。
[0019] -種負(fù)載超聲造影劑的納米囊泡，由以下方法制備得到:將如上所述的聚乙二醇-聚（天冬氨酸-二乙基乙二胺-組胺-⑶-二異丙基乙二胺)溶于無(wú)水氯仿中；將少量水 在超聲作用下加入上述氯仿溶液中，形成初次乳化液;將初次乳化液在同樣條件下逐滴加 到PBS中，超聲后形成二次乳化液;將二次乳化液去除氯仿，過(guò)濾即得空納米囊泡溶液;調(diào)節(jié) 空納米囊泡溶液的pH至6.8，加入少量異丙醇混合均勻；在上述溶液中添加超聲造影劑，震 蕩過(guò)夜;再加入pH 6.8的PBS水溶液震蕩30min，靜止分層后取水層溶液，用pH 7.4的PBS溶 液透析，過(guò)濾后即得。
[0020] 研究發(fā)現(xiàn)許多靜脈注射的負(fù)載氟碳?xì)怏w的超聲造影劑，由于體內(nèi)肺部換氣和血壓 改變等原因，在血液循環(huán)過(guò)程中非常不穩(wěn)定，容易造成超聲造影劑的粒徑變大甚至外殼的 破裂，致使所負(fù)載的藥物泄漏滲透到正常組織造成毒性，這也限制了其在臨床應(yīng)用的潛力。 正因?yàn)槿绱耍?fù)載氟碳液體的超聲造影劑深受研究者們喜愛(ài)。由于負(fù)載在載體內(nèi)部的氟碳 液體非常穩(wěn)定，在血液循環(huán)時(shí)不會(huì)對(duì)納米載體結(jié)構(gòu)造成影響。但當(dāng)溫度達(dá)到氟碳液體的沸 點(diǎn)時(shí)，液體發(fā)生氣化，致使載體納米粒子發(fā)生膨脹，此時(shí)在革向部位施加超聲福照，載體內(nèi) 部壓力增大，脹破載體外殼產(chǎn)生"空化效應(yīng)"，這不僅能夠用于超聲成像而且還能實(shí)現(xiàn)藥物 控釋的目的。這種采用相變模式(液體轉(zhuǎn)變?yōu)闅怏w)設(shè)計(jì)的超聲造影劑已然受到越來(lái)越多的 關(guān)注。但是，現(xiàn)有技術(shù)均是使用雙乳化自組裝的方法將液體氟碳包裹在空腔內(nèi)，而本發(fā)明是 使用液體置換法將液體氟碳負(fù)載在納米囊泡中。
[0021] -種負(fù)載親水性抗腫瘤藥物和超聲造影劑的納米囊泡，由以下方法制備得到：將 如上所述的聚乙二醇-聚（天冬氨酸-二乙基乙二胺-⑶-組胺-⑶-二異丙基乙二胺）溶于 無(wú)水氯仿中；將溶解有親水性抗腫瘤藥物的少量水在超聲作用下加入上述氯仿溶液中，形 成初次乳化液;將初次乳化液在同樣條件下逐滴滴加到ros中，超聲后形成二次乳化液;將 二次乳化液去除氯仿，透析除去未包裹的藥物后即得負(fù)載親水性抗腫瘤藥物的納米囊泡溶 液；調(diào)節(jié)負(fù)載親水性抗腫瘤藥物的納米囊泡溶液的pH至6.8，加入少量異丙醇混合均勻;在 上述溶液中添加超聲造影劑，震蕩過(guò)夜;再加入pH 6.8的PBS水溶液震蕩30min，靜止分層后 取水層溶液，用pH 7.4的PBS溶液透析，過(guò)濾后即得。
[0022]優(yōu)選地，所述超聲造影劑為全氟戊烷(PFP)或五氟丁烷(PFB)。
[0023] 優(yōu)選地，所述親水性抗腫瘤藥物為阿霉素。
[0024] 如上所述的負(fù)載親水性抗腫瘤藥物和超聲造影劑的納米囊泡在制備腫瘤診斷藥 物和/或腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。
[0025] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果： 本發(fā)明提供了一種pH與溫度雙重敏感性的聚合物，所述聚合物用于制備負(fù)載親水性抗 腫瘤藥物或/和超聲造影劑的納米囊泡，所述納米囊泡平均粒徑為175 nm，該納米囊泡由聚 乙二醇與聚天冬氨酸的兩親性共聚物制成，PEG作為親水段能夠延長(zhǎng)載藥囊泡的血液循環(huán) 時(shí)間，而聚天冬氨酸作為疏水段則具有合適的鏈柔順度和優(yōu)良的生物活性，有利于在體內(nèi) 的血液循環(huán)和腫瘤組織滲透。該納米囊泡具有腫瘤微環(huán)境特殊的酸敏性，能夠在pH 6.8時(shí) 囊泡粒徑發(fā)生膨脹，增大到具有很好超聲響應(yīng)性的尺寸。該納米囊泡由于負(fù)載了液體氟碳， 當(dāng)升溫達(dá)到氟碳的沸點(diǎn)時(shí)，氟碳發(fā)生氣化也使囊泡膨脹粒徑增大到具有很好超聲響應(yīng)性的 尺寸。由于上述納米囊泡具有酸敏性和負(fù)載液體氟碳，可使納米囊泡粒徑處在很好超聲響 應(yīng)性的尺寸，此時(shí)施加超聲輻照會(huì)檢測(cè)到良好的超聲成像信號(hào)，同時(shí)可以釋放出負(fù)載的藥 物用于腫瘤的治療，低頻超聲還可以增加藥物的深層組織滲透，在腫瘤深處發(fā)揮治療作用。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1.聚合物PEG-PAsp(DEA_co -His-co -DIP)的核磁譜圖。
[0027] 圖2·負(fù)載阿霉素和PFP的PEG-PAsp(DEA-co-His-co-DIP)囊泡在pH7·4條件下 的動(dòng)態(tài)光散射柱狀圖。
[0028] 圖3·負(fù)載阿霉素和PFP的PEG-PAsp(DEA-co-His-co-DIP)囊泡在pH6·8條件下 的動(dòng)態(tài)光散射柱狀圖。
[0029] 圖4.負(fù)載阿霉素和PFP的PEG-PAsp(DEA-co -His-co -DIP)囊泡在pH 7.4 + 45 ° (：條件下的動(dòng)態(tài)光散射柱狀圖。
[0030] 圖5.負(fù)載阿霉素和PFP的PEG-PAsp(DEA-co -His-co -DIP)囊泡在pH 6.8 + 45 ° (：條件下的動(dòng)態(tài)光散射柱狀圖。
[0031] 圖6.負(fù)載阿霉素和PFP的PEG-PAsp(DEA-co -His-co -DIP)囊泡熱失重分析圖； 圖7.負(fù)載阿霉素和PFP的PEG-PAsp(DEA-co -His-co -DIP)囊泡阿霉素的熒光敏感釋 放曲線。
[0032] 圖8.負(fù)載阿霉素和PFP的PEG-PAsp(DEA-co -His-co -DIP)囊泡阿霉素的體外釋 放曲線。
[0033] 圖9.負(fù)載阿霉素和PFP的PEG-PAsp(DEA-co -His-co -DIP)囊泡血清穩(wěn)定性圖。
[0034] 圖10.負(fù)載阿霉素和PFP的PEG-PAsp(DEA-co -His-co -DIP)囊泡體外能量多普 勒?qǐng)D像。
[0035] 圖11.負(fù)載阿霉素和PFP的PEG-PAsp(DEA_co -His-co -DIP)囊泡在老鼠體內(nèi)對(duì) 腫瘤的治療效果的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，所述實(shí)施例 只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無(wú)特 殊說(shuō)明，均為常規(guī)分子生物學(xué)方法;所使用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，為可從商業(yè)途徑 得到的試劑和材料，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上所做的任何非實(shí)質(zhì)性的變化及替 換均屬于本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍。
[0037] 實(shí)施例1 聚合物PEG-PAsp(DEA-co -His-co -DIP)的制備 1、jS-天門(mén)冬氨酸芐酯的合成，反應(yīng)機(jī)理及反應(yīng)過(guò)程如下：
首先準(zhǔn)備單口燒瓶（500 mL)，添加100 mL無(wú)水乙醚后，再緩慢滴加10 mL*H2S04 (98%)，邊滴加邊劇烈攪拌，等冷卻至室溫后，加入100 mL苯甲醇，充分?jǐn)嚢韬螅眯D(zhuǎn)蒸發(fā) 儀旋蒸掉乙醚。然后分3次加天冬氨酸共13.3 g至反應(yīng)瓶中。室溫均勻攪拌反應(yīng)24 h，再加 入200 mL 95%乙醇，并用滴液漏斗逐滴加入50 mL吡啶，邊滴邊劇烈攪拌。然后經(jīng)冰箱冷凍 過(guò)夜，抽慮后的固體，80°C下攪拌溶解后，熱過(guò)濾，濾液冷藏過(guò)夜。抽慮，按上述步驟重結(jié)晶2 次，凍干后得到純凈的jS-天門(mén)冬氨酸芐酯（。
[0038] 2、芐氧羰基天冬氨酸酸酐(BLA-NCA)的合成，反應(yīng)機(jī)理及反應(yīng)過(guò)程如下：
首先將500 mL的兩口瓶抽真空通氬氣來(lái)除水除氧，然后添加4.5 g的天冬氨酸芐酯，在 氬氣環(huán)境中加入300 mL新蒸的無(wú)水乙酸乙酯，90°C下回流30 min。然后用恒壓滴液漏斗將 60 mL溶有2.7 g三光氣的新蒸乙酸乙酯緩慢滴加入，90 °C繼續(xù)回流直到溶液變澄清。溶液 變清后，利用冰鹽浴將反應(yīng)溶液快速冷卻（30 min)，然后用冷的飽和碳酸氫鈉溶液快速洗 滌3次，接著萃取液用冷的飽和氯化鈉溶液快速洗滌2次，再萃取分液，最后將乙酸乙酯溶液 用適量無(wú)水硫酸鎂室溫干燥30 min。過(guò)濾，濾液經(jīng)濃縮后，用新蒸的無(wú)水石油醚沉淀。冷凍 抽濾所得白色沉淀，用乙酸乙酯/石油醚混合溶液進(jìn)行重結(jié)晶，最終得到白色針狀晶體。 [0039] 3、聚合物PEG-PBLA的合成，反應(yīng)機(jī)理及反應(yīng)過(guò)程如下：
首先取50 mL的反應(yīng)瓶加入0.6 g的mPEG-NH2,在70Γ油浴卜抽具空干爍6 h后，待冷卻 至室溫后加入30 mL無(wú)水CH2C12攪拌溶解均勻。然后加入5mL溶有4.5g BLA-NCA的無(wú)水DMF溶 液至上述反應(yīng)瓶中，在磁力攪拌下35°C反應(yīng)72 h。反應(yīng)完后CH2C12溶液經(jīng)濃縮后緩慢滴加至 大量冷的無(wú)水乙醚中沉淀，冷凍后抽濾，干燥得淺黃色固體。
[0040] 4、聚合物mPEG-PAsp(DEA-co -His-co -DIP)的合成，反應(yīng)機(jī)理及反應(yīng)過(guò)程如下：
為了合成最終聚合物mPEG-PAsp(DEA-co -His-co -DIP)，取3 g mPEG-PBLA和378 mg DEA溶解在盛有15 mL無(wú)水DMSO的反應(yīng)瓶中進(jìn)行氨解反應(yīng)，這一反應(yīng)在35°C的氮?dú)猸h(huán)境下反 應(yīng)24 h。然后將15 mL溶有181 mg組胺的無(wú)水DMS0溶液加入反應(yīng)瓶，繼續(xù)反應(yīng)24 h。最后將 2.35 g DIP加入上述反應(yīng)瓶中，氨解反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行24h后，用甲醇進(jìn)行透析除雜72 h，經(jīng)旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到最終的聚合物mPEG-PAsp(DEA-co-His-co-DIP)(產(chǎn)率為66.6%)。
[0041 ] 5、聚合物mPEG-PAsp(DEA-co -His-co -DIP)的1H-NMR表征： 利用1H-NMR 300MHz儀器檢測(cè)上述各步反應(yīng)產(chǎn)物的核磁峰，核磁溶劑均用DMS〇-i?。由于 嵌段聚合物本身具有pH敏感響應(yīng)性，將聚合物mPEG-PAsp(DEA-co -His-co -DIP)溶于D20 中，利用氘代DC1調(diào)節(jié)pH，測(cè)試三種pH值下氫化學(xué)位移的變化。聚合物PEG-PAsp(DEA- C〇 -His-co -DIP)的核磁譜圖如圖1，3.5 ppm為PEG中的（-0C歷CH2-)，0.95 ppm為DIP上的末端 甲基(-C歷-)，1.05 ppm為側(cè)鏈上DEA的末端甲基峰(-C歷），6.8 ppm和7.5 ppm分別為側(cè)鏈上 組胺環(huán)上(-C洲-和-NHCVN -)，這些峰的位置與研究文獻(xiàn)報(bào)道的一致。通過(guò)計(jì)算PEG中的 亞甲基峰與上述特征峰的積分面積之比，得出聚合物mPEG-PAsp(DEA-C<9 -His-C<9 -DIP)中 DIP、DEA和His的重復(fù)單元數(shù)分別為50、20、5。
[0042] 6、聚合物mPEG-PAsp(DEA-co -His-co -DIP)的FITR表征： 先將聚合物通過(guò)研缽碾壓成超細(xì)粉末，再加入少量超細(xì)的KBr粉末，兩者混合均勻后壓 片，進(jìn)行紅外掃描。紅外光譜分析儀的型號(hào)為附《?16丨/此11^ 670，背景為空白的〇^3064 cnf1是仲酰胺N-H對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)吸收峰，3282 cnf1是N-H不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)吸收峰；1650 cnf1 是酰胺鍵中C=0的伸縮振動(dòng)吸收峰，1730 cnf1酯鍵中C=0的伸縮振動(dòng)吸收峰;746 cnf1和695 cnf1是單取代苯的特征峰，是=C-H面外彎曲振動(dòng)吸收峰，這些特征說(shuō)明了氨解反應(yīng)的成功進(jìn) 行，聚合物mPEG-PAsp(DEA-C?9 -His-C?9 -DIP)的成功合成。
[0043] 實(shí)施例2載藥納米囊泡mPEG-PAsp(DEA_co -His-co -DIP)的制備 一種負(fù)載親水性抗腫瘤藥物的納米囊泡，由以下方法制備得到:取實(shí)施例1制備的聚合 物mPEG-PAsp(DEA-C0 -His-C0 -DIP)20 mg，用2 mL的無(wú)水CHC13溶解后，在冰浴環(huán)境下利 用超聲將溶解有阿霉素的0.2 mL水逐滴滴入氯仿中，形成第一次乳化液。然后將第一次乳 化液在同樣條件下逐滴滴加到10 mL PBS (pH 7.4，0.05 mol/L)中，超聲5分鐘后形成二 次乳化液。然后利用旋蒸除去氯仿，再利用14 KDa的透析袋在pH 7.4的PBS中透析，以除去 未包裹的阿霉素。最終囊泡溶液用450 nm的濾頭過(guò)濾，即得負(fù)載阿霉素的納米囊泡（簡(jiǎn)稱(chēng) D0X-PPEHD 囊泡）。
[0044] -種負(fù)載超聲造影劑的納米囊泡，由以下方法制備得到:取實(shí)施例1制備的聚合物 mPEG-PAsp(DEA-C0 -His-C0 -DIP)20 mg，用2 mL的無(wú)水CHC13溶解后，在冰浴環(huán)境下利用 超聲將0.2 mL水逐滴滴入氯仿中，形成第一次乳化液。然后將第一次乳化液在同樣條件下 逐滴滴加到10 mL PBS (pH 7.4, 0.05 mol/L)中，超聲5分鐘后形成二次乳化液。然后利用 旋蒸除去氯仿，用450 nm的濾頭過(guò)濾得空納米囊泡； 取空納米囊泡溶液，調(diào)節(jié)pH至6.8，然后添加到少量異丙醇中混合均勻，在上述溶液基 礎(chǔ)上添加全氟戊烷（PFP)，震蕩過(guò)夜。再加入10~15 ml、pH 6.8的PBS水溶液繼續(xù)震蕩 30min，后靜止分層，取水層溶液，在pH 7.4的PBS溶液透析，過(guò)濾后的溶液即為負(fù)載全氟戊 烷的納米囊泡(簡(jiǎn)稱(chēng)PFP-PPEHD囊泡）。
[0045] -種負(fù)載親水性抗腫瘤藥物和超聲造影劑的納米囊泡，由以下方法制備得到： 取實(shí)施例1制備的聚合物mPEG-PAsp(DEA-C0 -His-C0 -DIP)20 mg，用2 mL的無(wú)水 CHC13溶解后，在冰浴環(huán)境下利用超聲將溶解有阿霉素的0.2 mL水逐滴滴入氯仿中，形成第 一次乳化液。然后將第一次乳化液在同樣條件下逐滴滴加到10 mL PBS (pH 7.4，0.05 mol/L)中，超聲5分鐘后形成二次乳化液。然后利用旋蒸除去氯仿，再利用14 KDa的透析袋 在pH 7.4的PBS中透析，以除去未包裹的阿霉素。最終囊泡溶液用450 nm的濾頭過(guò)濾，即得 負(fù)載阿霉素的納米囊泡； 取負(fù)載阿霉素的納米囊泡溶液，調(diào)節(jié)pH至6.8,然后添加到少量異丙醇中混合均勻，在 上述溶液基礎(chǔ)上添加全氟戊烷，震蕩過(guò)夜。再加入10~15 ml、pH 6.8的PBS水溶液繼續(xù)震蕩 30min，后靜止分層，取水層溶液，在pH 7.4的PBS溶液透析，過(guò)濾后的溶液即為同時(shí)負(fù)載全 氟戊烷和阿霉素的納米囊泡(簡(jiǎn)稱(chēng)PFP/D0X-PPEHD囊泡）。
[0046] PFP/D0X-PPEHD囊泡的特點(diǎn)如下： 所得囊泡的粒徑大小采用動(dòng)態(tài)光散射系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)量。從動(dòng)態(tài)光散射柱狀圖可以看出， 負(fù)載阿霉素和PFP的納米囊泡的粒徑為175 nm，測(cè)試結(jié)果分別見(jiàn)圖2。
[0047] 如果將囊泡PBS(pH 7.4)溶液的pH值用HC1溶液調(diào)至6.8，囊泡會(huì)發(fā)生膨脹，平均粒 徑增大至400 nm，采用動(dòng)態(tài)光散射系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)量的粒徑見(jiàn)圖3;如果此時(shí)施加低頻超聲時(shí)， 囊泡破裂解體，平均粒徑為80 nm，采用動(dòng)態(tài)光散射系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)量的粒徑。
[0048] 如果將囊泡roS(pH 7.4)溶液的溫度升高至45 °C時(shí)，囊泡會(huì)發(fā)生膨脹，平均粒徑 也增大至400 nm，采用動(dòng)態(tài)光散射系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)量的粒徑見(jiàn)圖4;如果將囊泡PBS(pH 7.4)溶 液的pH值用HC1溶液調(diào)至6.8，同時(shí)溫度升高至45 ° C時(shí)，囊泡會(huì)發(fā)生大的膨脹，平均粒徑也 增大至500 nm，采用動(dòng)態(tài)光散射系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)量的粒徑見(jiàn)圖5;如果此時(shí)施加低頻超聲時(shí)，囊 泡破裂解體，平均粒徑為80 nm，采用動(dòng)態(tài)光散射系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)量的粒徑。
[0049] 實(shí)施例3載藥納米囊泡mPEG-PAsp(DEA_co -His-co -DIP)的熱失重分析 PFP/D0X-PPEHD囊泡經(jīng)處理后，通過(guò)熱分析系統(tǒng)Pyrisis-1 (PerkineElmer, USA)，檢 測(cè)囊泡的熱失重。我們利用TGA來(lái)測(cè)定PFP/D0X-PPEHD囊泡的熱穩(wěn)定性，同時(shí)我們選取不包 載PFP的D0X-PPEHD囊泡作為對(duì)照組。如圖6所示，PFP/D0X-PPEHD囊泡在40 ° C到80 ° C之間 經(jīng)歷了第一次失重，而D0X-PPEHD囊泡在這一溫度段并無(wú)此失重發(fā)生，這一失重產(chǎn)生的原因 是PFP/D0X-PPEHD囊泡中所包載的PFP在此溫度段達(dá)到了沸點(diǎn)變?yōu)闅怏w，逐漸脹破囊泡釋放 出來(lái)。由失重率我們可以計(jì)算得出PFP的負(fù)載率為3.24%。在圖中我們發(fā)現(xiàn)PFP/D0X-PPEHD 囊泡和D0X-PPEHD囊泡均有一段從220 °C到300 °C左右之間急劇失重的現(xiàn)象，產(chǎn)生這一現(xiàn) 象的原因是兩聚合物的PEHD嵌段發(fā)生自身的熱分解。同時(shí)我們通過(guò)DLS測(cè)量在不同溫度下 囊泡粒徑的變化規(guī)律發(fā)現(xiàn)當(dāng)囊泡溶液溫度在大于40 ° C時(shí)，囊泡粒徑開(kāi)始發(fā)生變化，隨著溫 度的升高囊泡的粒徑逐漸增大，但是當(dāng)溫度升高到50 °C以上粒徑增大到一定值時(shí)，囊泡粒 徑不增反降，說(shuō)明PFP/DOX-PPEHD囊泡所能承受的粒徑變化具有一定限度。
[0050] 實(shí)施例4載藥納米囊泡的敏感性熒光釋放實(shí)驗(yàn) 囊泡溶液在下面九個(gè)條件下處理2 h:pH 7.4，pH 6.8，pH 7.4 + 45 °C，pH 6.8 + 45°C， pH 7.4 + LFUS， pH 6.8 + LFUS， pH 7.4 + 45 °C + LFUS， pH 6.8 + 45°C+ LFUS和pH 5.0。然后用相同pH的水溶液稀釋至5 mL。然后用PerkinElmer PE-LS55 (Waltham，USA)熒光光度計(jì)測(cè)其每個(gè)條件下的阿霉素的熒光光譜。選用485 nm作為激發(fā) 光，發(fā)射光譜選擇500 nm-750 nm。隨后，我們驗(yàn)證了LFUS時(shí)間對(duì)釋放量的影響實(shí)驗(yàn)。LFUS的 時(shí)間分別采用5 min，10 min，15 min，LFUS過(guò)后選用485 nm作為激發(fā)光，發(fā)射光譜選擇500 nm-750 nm測(cè)量溶液中阿霉素的熒光強(qiáng)度。經(jīng)過(guò)上述TEM和DLS測(cè)試驗(yàn)證了PFP/DOX-PPEHD囊 泡的溫度、pH和超聲敏感性之后，我們進(jìn)一步通過(guò)水溶性阿霉素的體外敏感釋放實(shí)驗(yàn)加以 驗(yàn)證，通過(guò)測(cè)量在各種刺激條件下囊泡水溶液中阿霉素的熒光光譜。正如圖7所示，pH 7.4 時(shí)，由于阿霉素在囊泡內(nèi)腔聚集產(chǎn)生的熒光淬滅效應(yīng)，溶液中阿霉素的熒光強(qiáng)度是非常低 的。當(dāng)pH被下調(diào)到6.8時(shí)，由于囊泡膨脹使粒徑增大并未破裂解體，所以溶液中阿霉素的熒 光強(qiáng)度雖略有增大但增大幅度很小。而當(dāng)在這兩個(gè)pH值下分別添加低頻超聲（LFUS)輻照 時(shí)，溶液中阿霉素的熒光強(qiáng)度均有增加;但是LFUS的效果與納米粒子的粒徑關(guān)系密切，所以 pH 6.8時(shí)囊泡粒徑增大到400nm以上，超聲輻照后囊泡破裂水溶性阿霉素得以釋放，故溶液 中阿霉素的熒光強(qiáng)度增大幅度非常大，幾乎和pH 5.0囊泡完全解體時(shí)溶液中阿霉素的熒光 強(qiáng)度接近。而pH 7.4的囊泡溶液中施加 LFUS所產(chǎn)生的效果很小，所以阿霉素?zé)晒鈴?qiáng)度增幅 較小。從上述結(jié)果可以看出，囊泡粒徑越大，所以釋放量也越大。隨后，我們進(jìn)行了低頻超聲 輻照時(shí)間對(duì)于阿霉素釋放量的影響實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在pH 6.8的溶液中超聲時(shí)間分別為5 min與 15 min時(shí)，阿霉素?zé)晒鈴?qiáng)度無(wú)明顯差別，說(shuō)明5 min的LFUS輻照時(shí)間足以使PFP/DOX-PPEHD 囊泡破裂解體。
[0051] 實(shí)施例5載藥納米囊泡的藥物體外釋放 體外實(shí)驗(yàn)分為九種條件處理:PH 7.4，pH 6.8，pH 7.4 + 45 °C，pH 6.8 + 45°C， pH 7.4 + LFUS, pH 6.8 + LFUS, pH 7.4 + 45 °C + LFUS, pH 6.8 + 45Γ+ LFUS 和 pH 5.0。具體如下，每組5 mL包含20 mg PFP/DOX-PPEHD囊泡的溶液用1M的HC1調(diào)節(jié)pH至 6.8,根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組需要施加5 min的LFUS后，轉(zhuǎn)移進(jìn)14 KDa的透析袋在37 °C的搖床內(nèi)用30 mL相同pH的PBS透析。在一定的時(shí)間點(diǎn)，取5 mL透析袋外的溶液，同時(shí)補(bǔ)充同樣體積的PBS溶 液。取出的溶液用紫外分光光度計(jì)測(cè)量阿霉素在485 nm的吸收強(qiáng)度從而計(jì)算溶液中阿霉素 的含量。利用預(yù)先建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出藥物釋放的累積量，然后根據(jù)囊泡中釋放藥物的 百分比與時(shí)間繪制釋放曲線。從圖8可以看出，囊泡粒徑越大，所以釋放量也越大，這一結(jié)果 與PFP/DOX-PPEHD囊泡中阿霉素的敏感熒光釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。
[0052]實(shí)施例6載藥納米囊泡的血清穩(wěn)定性分析 對(duì)于納米粒子來(lái)說(shuō)，在動(dòng)物體內(nèi)應(yīng)用的前提條件是其本身的血清穩(wěn)定性要非常好，所 以在進(jìn)行具體的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)之前，我們先進(jìn)行了體外血清穩(wěn)定性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。如圖9所示，PFP/ D0X-PPEHD囊泡具有很好的血清穩(wěn)定性，在含有10% FBS的roS溶液中PFP/DOX-PPEHD囊泡在 96 h的長(zhǎng)時(shí)間檢測(cè)中粒徑幾乎沒(méi)有發(fā)生大的變化，這說(shuō)明了PFP/DOX-PPEHD囊泡具有很好 的血清穩(wěn)定性，為進(jìn)一步的體內(nèi)生物實(shí)驗(yàn)提供了可靠的依據(jù)。
[0053] 實(shí)施例7載藥納米囊泡在體外能量多普勒成像 為研究PFP/D0X-PPEHD囊泡的體內(nèi)/體外超聲顯像能力，分別在臨床超聲掃描儀 (Acuson Sequoia 512，Siemens, USA)，選擇power Doppler 模式（參數(shù)：頻率 10 MHz;增 益15 dB;聚焦在模型孔中央;選擇模具水平橫切面成像)下觀察pH 7.4和pH 6.8+45°C條件 下超聲成像效果。選取濃度5 mg/mL的PFP/D0X-PPEHD囊泡和對(duì)照組D0X-PPEHD囊泡和非酸 性敏感PEG-H)LLA囊泡負(fù)載PFP與DOX (PFP/DOX-ProLLA囊泡）分別加入到2% (w/v)瓊脂糖 凝膠模型中，在相同條件下觀察超聲成像。體外超聲成像使用15L8-W高頻線性探頭。從圖10 可以看出，為了驗(yàn)證所設(shè)計(jì)的D0X/PFP-PPEHD囊泡的超聲顯像能力，我們選擇在體外pH 7.4和pH 6.8+45°C條件下進(jìn)行能量多普勒成像的檢測(cè)。pH 7.4時(shí)，PFP/D0X-PPEHD囊泡在能 量多普勒模式激發(fā)下，只能看到微弱的信號(hào)，說(shuō)明超聲成像效果較差；而當(dāng)pH下調(diào)至6.8 時(shí)，囊泡的粒徑增大，我們?cè)诖嘶A(chǔ)上進(jìn)一步升溫至45° C時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)能量多普勒成像信號(hào)又 顯著增強(qiáng)，這一結(jié)果很好的驗(yàn)證了 PFP/D0X-PPEHD囊泡的酸性敏感性和溫度敏感性，并且在 這些刺激下粒徑增大至具有很好超聲響應(yīng)性的尺寸范圍。隨后我們進(jìn)行了非酸性敏感囊泡 負(fù)載PFP(PFP/DOX-PPDLLA組）在兩個(gè)pH下能量多普勒成像對(duì)照試驗(yàn)，由于PFP/D0X-PPDLLA 囊泡在兩個(gè)pH下并且升溫45°C未出現(xiàn)效果增強(qiáng)的現(xiàn)象。對(duì)照組未負(fù)載PFP的D0X-PPEHD囊 泡組幾乎檢測(cè)不到能量多普勒信號(hào)，且沒(méi)有隨pH和溫度的改變有信號(hào)增強(qiáng)的跡象。
[0054] 實(shí)施例8載藥納米囊泡在體內(nèi)對(duì)腫瘤的治療效果考察 取得了良好的體內(nèi)體外超聲成像效果之后，由于PFP/D0X-PPEHD囊泡內(nèi)包裹了水溶性 阿霉素，為研究PFP/D0X-PPEHD囊泡聯(lián)合LFUS輻照的抗癌療效，選用C6皮下移植瘤裸鼠模型 (開(kāi)始治療時(shí)腫瘤體積約為50 mm3)，并分成5組（各組n=6) :PFP/D0X-PPEHD+LFUS組，PFP/ D0X-PPEHD組，D0X-PPEHD+LFUS組，D0X-PPEHD組，以及PBS對(duì)照組。五組樣品每三天靜脈注 射一次，D0X劑量為2.5 mg D0X/kg體重，載體溶液體積為100yL，共治療5次。需要超聲輻照 協(xié)同治療組注射樣品后LFUS(參數(shù)如前所述)輻照5 miruPBS對(duì)照組小鼠在相同時(shí)間點(diǎn)每次 注射100 yL的PBS。腫瘤體積隔三天測(cè)量一次，計(jì)算公式為:體積=0.5 X LXW2 (L代表腫瘤長(zhǎng) 徑，W代表腫瘤寬徑）。應(yīng)用Kaplan-Meier法計(jì)算動(dòng)物生存率。
[0055] 治療效果如圖11所示，PFP/D0X-PPEHD囊泡施加 LFUS組腫瘤體積抑制效果最明顯， 腫瘤增長(zhǎng)緩慢。第30天腫瘤體積為190 ± 60 mm3,較對(duì)照組明顯更小(PFP/D0X-PPEHD囊泡 未施加 LFUS組為630 ± 50 mm3，D0X_PPEHD囊泡施加 LFUS組為810 ± 50 mm3，D0X_PPEHD囊 泡未施加 LFUS組為850 ± 45 mm3，PBS對(duì)照組為1240 ± 40 mm3，p均小于〈0.05)。動(dòng)物生 存率結(jié)果也與腫瘤生長(zhǎng)抑制結(jié)果一致:在第33天，PBS對(duì)照組動(dòng)物已死;而PFP/D0X-PPEHD囊 泡加 LFUS組生存率最高，在40天以后仍達(dá)到87.5%存活。這一結(jié)果體現(xiàn)了我們所設(shè)計(jì)的PFP/ D0X-PPEHD囊泡在LFUS的配合下具有良好的腫瘤治療效果。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種pH與溫度雙重敏感性的聚合物，其特征在于，所述聚合物由親水段聚乙二醇段 和疏水段聚（天冬氨酸-二乙基乙二胺-⑶-組胺-⑶-二異丙基乙二胺）段構(gòu)成;所述親水 段和疏水段的比例為1:10~1:12。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚合物，其特征在于，聚乙二醇段數(shù)均分子量為2 kD，聚(天冬 氨酸-二乙基乙二胺-組胺-二異丙基乙二胺)段數(shù)均分子量為20~24 kD。3. 權(quán)利要求1或2所述的pH與溫度雙重敏感性的聚合物的制備方法，其特征在于，具體 包括如下步驟：51. 以天冬氨酸和苯甲醇為原料制備jS-天門(mén)冬氨酸芐酯；52. 以jS-天門(mén)冬氨酸芐酯為原料，緩慢加入三光氣，回流制備得到芐氧羰基天冬氨酸 酸酐； S3 .以mPEG-NH2作為引發(fā)劑，引發(fā)開(kāi)環(huán)聚合芐氧羰基天冬氨酸酸酐得到聚合物mPEG-PBLA； S4.mPEG-PBLA為原料，依次與二乙基乙二胺、組胺和二異丙基乙二胺進(jìn)行氨解反應(yīng)，合 成聚合物聚乙二醇-聚(天冬氨酸-二乙基乙二胺-組胺-二異丙基乙二胺）。4. 權(quán)利要求1或2所述pH與溫度雙重敏感性的聚合物在制備負(fù)載親水性抗腫瘤藥物或/ 和超聲造影劑的納米囊泡中的應(yīng)用。5. -種負(fù)載親水性抗腫瘤藥物的納米囊泡，其特征在于，由以下方法制備得到:將權(quán)利 要求1或2所述的聚乙二醇-聚（天冬氨酸-二乙基乙二胺- C〇 -組胺-C〇 -二異丙基乙二胺） 溶于無(wú)水氯仿中；將溶解有親水性抗腫瘤藥物的少量水在超聲作用下加入上述氯仿溶液 中，形成初次乳化液;將初次乳化液在同樣條件下逐滴滴加到PBS中，超聲后形成二次乳化 液;將二次乳化液去除氯仿，透析除去未包裹的藥物后即得。6. -種負(fù)載超聲造影劑的納米囊泡，其特征在于，由以下方法制備得到： 將權(quán)利要求1或2所述的聚乙二醇-聚(天冬氨酸-二乙基乙二胺-C〇 -組胺-C〇 -二異丙 基乙二胺）溶于無(wú)水氯仿中；將少量水在超聲作用下加入上述氯仿溶液中，形成初次乳化 液;將初次乳化液在同樣條件下逐滴加到PBS中，超聲后形成二次乳化液;將二次乳化液去 除氯仿，過(guò)濾即得空納米囊泡溶液； 調(diào)節(jié)空納米囊泡溶液的pH至6.8,加入少量異丙醇混合均勻；在上述溶液中添加超聲造 影劑，震蕩過(guò)夜;再加入pH 6.8的PBS水溶液震蕩30min，靜止分層后取水層溶液，用pH 7.4 的PBS溶液透析，過(guò)濾后即得。7. -種負(fù)載親水性抗腫瘤藥物和超聲造影劑的納米囊泡，其特征在于，由以下方法制 備得到： 將權(quán)利要求1或2所述的聚乙二醇-聚(天冬氨酸-二乙基乙二胺-C〇 -組胺-C〇 -二異丙 基乙二胺)溶于無(wú)水氯仿中；將溶解有親水性抗腫瘤藥物的少量水在超聲作用下加入上述 氯仿溶液中，形成初次乳化液;將初次乳化液在同樣條件下逐滴滴加到PBS中，超聲后形成 二次乳化液;將二次乳化液去除氯仿，透析除去未包裹的藥物后即得負(fù)載親水性抗腫瘤藥 物的納米囊泡溶液； 調(diào)節(jié)負(fù)載親水性抗腫瘤藥物的納米囊泡溶液的pH至6.8，加入少量異丙醇混合均勾;在 上述溶液中添加超聲造影劑，震蕩過(guò)夜;再加入pH 6.8的PBS水溶液震蕩30min，靜止分層后 取水層溶液，用pH 7.4的PBS溶液透析，過(guò)濾后即得。8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的納米囊泡，其特征在于，所述超聲造影劑為全氟戊烷或五 氟丁烷。9. 權(quán)利要求7所述的納米囊泡在制備腫瘤診斷藥物和/或腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K9/127GK105997879SQ201610548026
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年7月12日
【發(fā)明人】帥心濤, 張路, 邱晨, 黃毅, 左明祥, 程度
【申請(qǐng)人】中山大學(xué)