白花蛇舌草總黃酮為唯一活性部位在制備治療腦膜微循環(huán)障礙、腦缺血藥物中的應用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種白花蛇舌草總黃酮為唯一活性部位在制備治療腦膜微循環(huán)障礙、腦缺血藥物中的應用，所述的白花蛇舌草總黃酮是，將白花蛇舌草粉碎成粗粉，先石油醚回流提取，脫脂；藥渣揮干石油醚，用乙醇浸泡，回流提取2次，合并濾液，減壓回收乙醇至無醇味，加蒸餾水分散成樣品液，上AB?8型大孔吸附樹脂，先蒸餾水洗脫，棄去水液；用10%乙醇洗脫，再用80%乙醇洗脫，收集80%乙醇洗脫液，減壓回收乙醇至無醇味，冷凍干燥，粉碎，得白花蛇舌草總黃酮，本發(fā)明具有改善腦膜微循環(huán)障礙、腦缺血之功效，作為唯一活性部位有效用于制備治療腦膜微循環(huán)障礙、腦缺血藥物，是治療腦膜微循環(huán)障礙、腦缺血藥物上的創(chuàng)新。
【專利說明】
白花蛇舌草總黃酬為唯一活性部位在制備治療腦膜微循環(huán)障 礙、腦缺血藥物中的應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及醫(yī)藥，特別是白花蛇舌草總黃酬為唯一活性部位在制備治療腦膜微循 環(huán)障礙、腦缺血藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 微循環(huán)直接給細胞供血、供氧、供能量及有關的營養(yǎng)物質，同時還排出對人體有害 的代謝產物，是人體的內環(huán)境，是生命的最基本的保證。人體的任何器官，任何部位(包括屯、 臟在內）都必須要有一個正常的健康的微循環(huán)，否則就會出現(xiàn)相應器官的病變。
[0003] 正常情況下，微循環(huán)血流量與人體組織、器官代謝水平相適應，使人體內部各器官 生理功能得W正常進行。若微循環(huán)不通楊，就好像一塊秩田的水渠堵塞，禾苗得不到水分就 會枯死一樣，人體臟器也會因新陳代謝不正常而出現(xiàn)疾病和衰老等。當腦膜微循環(huán)出現(xiàn)障 礙時，就會出現(xiàn)短暫性腦缺血等癥狀。
[0004] 短暫性腦缺血發(fā)作(TIA)是頸動脈或椎-基底動脈系統(tǒng)發(fā)生短暫性血液供應不足， 引起局灶性腦缺血導致突發(fā)的、短暫性、可逆性神經功能障礙。發(fā)作持續(xù)數分鐘，通常在30 分鐘內完全恢復，超過2小時常遺留輕微神經功能缺損表現(xiàn)，或CT及MRI顯示腦組織缺血征 象，男性多于女性。發(fā)病突然，多在體位改變、活動過度、頸部突然轉動或屈伸等情況下發(fā) 病。發(fā)病無先兆，有一過性的神經系統(tǒng)定位體征，一般無意識障礙，歷時5~20分鐘，可反復 發(fā)作，但一般在24小時內完全恢復，無后遺癥，但對身體健康卻有不同程度的不良影響?，F(xiàn) 雖有治療腦膜微循環(huán)、腦缺血的多種藥物，但由于種種原因，其使用和療效并不盡人意，因 此，研制和開發(fā)新的藥物勢在必行。

【發(fā)明內容】

[0005] 針對上述情況，為克服現(xiàn)有技術之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種白花蛇舌草 總黃酬為唯一活性部位在制備治療腦膜微循環(huán)障礙、腦缺血藥物中的應用，可有效解決白 花蛇舌草總黃酬的制備，及在制備治療腦膜微循環(huán)障礙、腦缺血藥物中的應用問題。
[0006] 本發(fā)明解決的技術方案是，一種白花蛇舌草總黃酬為唯一活性部位在制備治療腦 膜微循環(huán)障礙、腦缺血藥物中的應用，所述的白花蛇舌草總黃酬是，將白花蛇舌草粉碎成粗 粉，先石油酸回流提取，脫脂;藥渣揮干石油酸，用乙醇浸泡，回流提取2次，合并濾液，減壓 回收乙醇至無醇味，加蒸饋水分散成樣品液，上AB-8型大孔吸附樹脂，先蒸饋水洗脫，棄去 水液;用10 %乙醇洗脫，再用80 %乙醇洗脫，收集80 %乙醇洗脫液，減壓回收乙醇至無醇味， 冷凍干燥，粉碎，得白花蛇舌草總黃酬。
[0007] 本發(fā)明總黃酬是從白花蛇舌草中提取的活性部位，具有改善腦膜微循環(huán)障礙、腦 缺血之功效，作為唯一活性部位有效用于制備治療腦膜微循環(huán)障礙、腦缺血藥物，開拓了白 花蛇舌草的新用途，是治療腦膜微循環(huán)障礙、腦缺血藥物上的創(chuàng)新，有顯著的經濟和社會效 益。
【具體實施方式】
[0008] W下結合具體情況對本發(fā)明的【具體實施方式】作詳細說明。
[0009] -種白花蛇舌草總黃酬為唯一活性部位在制備治療腦膜微循環(huán)障礙、腦缺血藥物 中的應用，所述的白花蛇舌草總黃酬是，將白花蛇舌草粉碎成過30目篩的粗粉，先加粗粉10 倍重量石油酸回流提取化，脫脂，棄去石油酸，得藥渣;藥渣揮干石油酸，每次加10倍重量、 質量濃度80%乙醇浸泡0.化，回流提取2次，每次化，濾過，合并濾液，減壓回收乙醇至無醇 味，加蒸饋水分散成相當于含生藥量0.3g/ml，得樣品液;樣品液上AB-8型大孔吸附樹脂，先 用2倍柱體積蒸饋水洗脫，棄去水液;繼用4倍柱體積、質量濃度10 %乙醇洗脫，棄去洗脫液； 再用6倍柱體積、質量濃度80%乙醇洗脫，收集80%乙醇洗脫液，減壓回收乙醇至無醇味，冷 凍干燥，粉碎，得白花蛇舌草總黃酬。
[0010] 本發(fā)明制備的白花蛇舌草總黃酬作為唯一活性部位，具有改善腦膜微循環(huán)、抗腦 缺血之功效，并經實驗得到了充分證明，有關試驗資料如下：
[0011] 實驗一白花蛇舌草總黃酬對小鼠腦膜微循環(huán)的影響
[0012] 1實驗材料
[0013] 1.1實驗藥物
[0014] 白花蛇舌草總黃酬，由河南中醫(yī)學院化學室提供，含量為62%;尼莫地平片，亞寶 藥業(yè)集團股份有限公司生產(每片含20mg);腦絡通膠囊，吉林金寶藥業(yè)股份有限公司生產 (每粒 0.5g)。
[00巧]1.2儀器
[0016] 散斑全帖實時掃描成像系統(tǒng)，PIM3廠商:帕瑞醫(yī)學科技(北京)有限公司。
[0017] 1.4實驗動物
[001引 KM小鼠70只，SPF，雌雄各半，體重18-22g，購自河南省實驗動物中屯、，本批小鼠合 格證號:N0.41003100001113。
[0019] 2實驗方法
[0020] 2.1造模與給藥
[0021 ] 取18-22g健康小鼠70只，雌雄各半，稱重，隨機均分為:空白組，模型組，腦絡通組， 尼莫地平組，白花蛇舌草總黃酬大、中、小劑量組，共7組，每組12只。除空白組外，其余6組造 小鼠雙側頸總動脈結扎模型。尼莫地平組（陽性藥，按O.lml/lOg配成3mg/ml的混懸液， 30mg/kg，臨床用量的15倍）；腦絡通膠囊組（陽性藥，按0.1 ml/lOg配成75mg/ml的混懸液， 750mg/kg，臨床用量的15倍）；白花蛇舌草總黃酬大、中、小劑量組(按0.1 ml/lOg配成40mg/ ml、20mg/ml、lOmg/ml的混懸液，400mg/kg、200mg/kg、lOOmg/kg，臨床用量的 15倍）；術前，給 予各對應組小鼠尼莫地平、腦絡通、白花蛇舌草總黃酬大、中、小劑量的混懸液灌服，空白 組、模型組只灌服同量簇甲基纖維素鋼(0.5%CMC)，1次Id,連服7d。于第6d晚上8點按批禁 食不禁水，第7d上午8點按批稱重給藥Ih后，開始試驗。首先啟動計算機和其它外周設備，然 后啟動化rimed儀器，預熱5分鐘，當儀器的L抓燈停止閃爍時可W開始監(jiān)測，雙擊桌面上的 PIMsoft軟件，選擇化riCam PSI系統(tǒng)。點擊工具，設置操作距離為10cm，監(jiān)測區(qū)域的寬度和 高度為2cm，步長設為中，頻率設為23張/s。小鼠用5%水合氯醒0.06ml/10g腹腔注射麻醉 (小鼠的翻正反射消失），俯邸位固定，將煩骨正中皮膚矢狀切開，用止血錯將兩側皮膚拉 開，用標記筆在小鼠腦部矢狀縫與冠狀縫交叉處作一標記，將小鼠置于儀器的推薦距離范 圍內，并使儀器與監(jiān)測部位平行，光束照在標記處，并與檢測部位垂直，調整儀器距離與設 定距離相一致，圈定掃描面積點擊記錄按鈕開始記錄，記錄小鼠平靜后2分鐘內血流灌注 量。松開小鼠，仰邸位固定，每一側頸總動脈結扎(空白組即假手術組只分離雙側頸總動脈， 不做結扎處理），然后松開小鼠，并俯邸位固定，記錄小鼠平靜后2分鐘內血流灌注量。
[0022] 2.2檢測指標
[0023] 取截扎前1分50秒一2分鐘的血流灌注量平均值作為截扎前的平均灌注量，取3分 50秒一4分鐘的血流灌注量平均值作為截扎后的平均灌注量，用結扎后的血流灌注量減去 結扎前的血流灌注量除W結扎前的血流灌注量得出腦血流的下降率。
[0024] 2.2.1測定方法
[0025] 除空白組外，其余小鼠均做雙側頸總結扎，然后于術前分批給藥1小時后開始試 驗，啟動計算機和其它外周設備，然后啟動化rimed儀器，預熱5分鐘，當儀器的L抓燈停止閃 爍時可W開始監(jiān)測，雙擊桌面上的PIMsoft軟件，選擇化riCam PSI系統(tǒng)。點擊工具，設置操 作距離為10cm，監(jiān)測區(qū)域的寬度和高度為2cm，步長設為中，頻率設為23張/s。小鼠用5%水 合氯醒0.06ml/10g腹腔注射麻醉(小鼠的翻正反射消失），俯邸位固定，將煩骨正中皮膚矢 狀切開，用止血錯將兩側皮膚拉開，用標記筆在小鼠腦部矢狀縫與冠狀縫交叉處作一標記， 將小鼠置于儀器的推薦距離范圍內，并使儀器與監(jiān)測部位平行，光束照在標記處，并與檢測 部位垂直，調整儀器距離與設定距離相一致，圈定掃描面積點擊記錄按鈕開始記錄，記錄小 鼠平靜后2分鐘內血流灌注量。松開小鼠，并仰邸位固定，每一側頸總動脈結扎(空白組即假 手術組只分離雙側頸總動脈，不做結扎處理），然后松開小鼠，并俯邸位固定，記錄小鼠平靜 后2分鐘內血流灌注量，導出報告，進行分析。
[00%] 3.統(tǒng)計學處理方法
[0027]數據分析用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包進行數據資料的統(tǒng)計學處理，計量資料:平均數 ±標準差(：^±s)，各組間比較:單因素方差分析，方差齊用最小顯著差數化SD)法，方差不齊 用 Games-Howel 1 法檢驗。
[002引4實驗結果
[0029] 4.1白花蛇舌草總黃酬對小鼠腦膜微循環(huán)的影響
[0030] 表1白花蛇舌草總黃酬對小鼠腦膜微循環(huán)的影響(?出S)
[0031]
[0032] 注:相比模型組，用藥組具有顯著性差異(*沖<0.01)，明顯性差異(沖<0.05)
[0033] 由表1可知：頸總結扎前各組小鼠腦膜微循環(huán)血流量差異不明顯，說明分組均勻。 與假手術組比，模型組腦膜微循環(huán)血流量顯著減少(P<〇.01)，說明造模成功，但因側枝循環(huán) 和局部血液循環(huán)，雖結扎雙側頸總動脈，腦血流并未完全阻斷；與模型組比，大、中、小劑量 白花蛇舌草總黃酬組、尼莫地平組和腦絡通組均可顯著改善雙側頸總動脈結扎所致的小鼠 腦血流量減少(P<〇.01);與頸總結扎前比，頸總動脈結扎后各組小鼠腦膜微循環(huán)血流量均 顯著減少(p<0.01)。
[0034] 5 結論
[0035] 通過觀察小鼠頸總結扎前后兩分鐘腦部血流量變化，模型組腦血流量顯著下降， 尼莫地平組、腦絡通組、白花蛇舌草總黃酬大、中、小劑量組均可顯著改善小鼠腦血流量的 減少，實驗結果證明白花蛇舌草總黃酬各給藥組可促進雙側頸總結扎后小鼠側支循環(huán)和局 部血液循環(huán)，可顯著改善小鼠腦部微循環(huán)障礙和腦血流狀態(tài)，進而改善急性缺血后造成的 腦組織損傷。W白花蛇舌草總黃酬大劑量組最佳。
[0036] 實驗二白花蛇舌草總黃酬對小鼠反復腦缺血再灌注模型的影響
[0037] 1實驗材料 [003引 1.1實驗藥物
[0039] 白花蛇舌草總黃酬，由河南中醫(yī)學院化學室提供，總黃酬含量為62 % ;尼莫地平 片，亞寶藥業(yè)集團股份有限公司生產;腦絡通膠囊，吉林金寶藥業(yè)股份有限公司生產。
[0040] 1.2實驗試劑
[0041] 簇甲基纖維素鋼，天津市恒興化學試劑有限公司生產;LD訊式劑盒，廠家:南京建成 生物工程研究所生產;青霉素，華北制藥集團有限責任公司生產;水合氯醒，天津市致遠化 學試劑有限公司生產;生理鹽水，河南科倫藥業(yè)有限公司生產；甲醒溶液，分析純，煙臺市雙 雙化工有限公司生產;醫(yī)用乙醇，新鄉(xiāng)市Ξ偉制劑有限公司生產;MDA試劑盒，南京建成生物 工程研究所生產;NSE試劑盒，江蘇卡爾文生物科技有限公司生產;考馬斯亮藍測定試劑盒， 南京建成生物工程研究所生產;LD試劑盒，南京建成生物工程研究所;SOD試劑盒，南京建成 生物工程研究所;S-100的式劑盒，江蘇卡爾文生物科技有限公司;ATP試劑盒，南京建成生物 工程研究所生產。
[0042] 1.3 儀器
[0043] 紫外可見分光光度計，上海天美科學儀器有限公司，型號UV1000;電子天平，上海 精密科學儀器有限公司，型號FA2204B;可調式移液器，上海雷勃分析儀器有限公司；超聲波 清洗器，上?？茖С晝x器有限公司；玻璃勻漿器，鄭州玻璃儀器廠；臺式低速自動平衡離 屯、機，由長沙湘智離屯、機儀器公司提供，型號TD^40B;酶標儀，美國BI0-RAD公司，型號 BI0RAD-680。
[0044] 1.4實驗動物
[0045] KM種小鼠105只，SPF，雄性，體重28-31g，由河南省實驗動物中屯、提供，本批小鼠合 格證號:41003100001167。
[0046] 2實驗方法
[0047] 2.1造模與給藥
[004引取健康小鼠105只，雄性，體重28-31 g，稱重，隨機均分7組，每組15只，空白組、模型 組、腦絡通組、尼莫地平組、白花蛇舌草總黃酬大、中、小劑量組。除假手術組外，其余6組均 造小鼠反復腦缺血再灌注模型。尼莫地平組（陽性藥，按O.lml/lOg配成3mg/ml的混懸液， 30mg/kg，臨床用量的15倍）；腦絡通膠囊組（陽性藥，按0.1 ml/lOg配成75mg/ml的混懸液， 750mg/kg，臨床用量的15倍）；白花蛇舌草總黃酬大、中、小劑量組(按0.1 ml/lOg配成40mg/ ml、20mg/ml、lOmg/ml的混懸液，400mg/kg、200mg/kg、lOOmg/kg，臨床用量的 15倍）；術前，給 予各對應組小鼠尼莫地平、腦絡通、白花蛇舌草總黃酬大、中、小劑量的混懸液灌服，空白 組、模型組只灌服同量0.5%CMC，1次Id,連服7d。
[0049] 于第6d晚上8點分批禁食不禁水，第7d上午8點分批稱重給藥化后，按0.03ml/10g iplO%水合氯醒(小鼠的翻正反射消失），用醫(yī)用乙醇頸部消毒，然后用手術刀切頸部正中 偏左部位，分離周圍肌肉，用彎頭精密綴剝離旁邊神經，分離CCA，每一側頸總動脈用針灸針 鉤起來(直徑0.3mm)，角度約90，缺血lOmin，灌流lOmin，再缺血lOmin，去掉針灸針，手術處 敷撒青霉素粉，縫合頸部傷口。空白組只剝離血管，其它同造模組。
[0050] 2.2檢測指標及測定方法
[0化1] 2.2.1檢測指標
[0052] 所有小鼠再灌注2地后，取眼血清測NSE、S-100i3的含量。然后脫頸椎處死，迅速置 冰盒上取腦，矢狀切取一半置10%福爾馬林液中，固定一周，石蠟包埋，作肥染色；另一半用 生理鹽水沖洗血跡，再用濾紙吸凈生理鹽水，稱重，根據此重計算應加入的冰生理鹽水量， W生理鹽水(ml):腦組織(g)=9:l的比例，用勻漿器在盛有冰塊的大燒杯中配成10%的腦 勻漿，30(K)r/min 4°C，離屯、lOmin，取上清液于低于-20°C保存，分別按試劑盒說明書測定腦 勻漿中蛋白、LD、MDA的含量及LDH、SOD、ATP酶的活力。
[0053] 2.2.2考馬斯亮蘭蛋白的測定方法
[0054] 考馬斯亮蘭蛋白測定操作程序
[0化5]
[0056] 搖勻，等lOmin，595nm，1 cm光徑，調零，ii吸光度。
[0057]注:A，B，C分別為標準空白管，標準管，測定管
[0化引蛋白濃度(gpr0Vl) = (C值-A值)/(B值-A值)*0.563(標準品濃度甜rot/1)
[0化9] 2.2.3腦勻漿中LD的測定方法
[0060] LD測定操作順序表
[0061]
[00創(chuàng)搖勻，530nm，1cm光徑，調零，現(xiàn)順光度。
[0063] 注:A，B，C分別為標準空白管，標準管，測定管
[0064] 組織中LD含量(mmol/即rot) = (C值一A值)*標準濃度（3mmo 1/L) / (B值一A值）/樣 本中的蛋白含量(gprot/L)
[00化]2.2.4腦勻漿中LDH的測定方法
[0066] 腦組織LDH的操作方法
[0067]
[0068] 搖勻，置室溫放3分鐘，440nm，調零，1 cm光徑，測吸光度。
[0069] 注:A:標準管B:對照管C:測定管D:測定對照管
[0070] 組織中LD田舌力（U/即r 01) = (C值一D值)/ (A值-B值)*標準濃度（2mmo 1 /L) /樣品蛋 白含量(gprot/ml)
[0071] 2.2.5 ATP酶的測定方法
[0072] 腦勻漿中ATP酶測定方法
[0073]
[0074] 搖勻，離屯、(400化pm) 10分鐘，取上清0.2ml定憐
[0075] 定憐
[0076]
[0077] 搖勻，37度水浴30分鐘，冷至室溫，660nm，1cm光徑，蒸饋水調零比色
[007引注:A、B、C、D管分別為對照管、Na+K+-ATP酶管、MgH-ATP酶管、CaH-ATP酶管；
[0079]組織中 Na+r-ATP 酶、MgH-ATP 酶及 Ca^-ATP 酶活力（μL?ο IPi /mgprot/hour) = (B、C 及D值一A值)/標準值*標準管濃度(0.5ymol/ml)*反應體系中樣品稀釋倍數(2.5)X6/樣本 蛋白含量(m甜rot/ml)
[0080] 2.2.6腦勻漿中總T-SOD的測定方法
[0081 ] 腦勻漿中總T-S0D測定順序表
[0082]
[0083] 搖勻，室溫10min，550nm處，1cm光徑，蒸饋水調零，比色。
[0084] 注:A:測定管B:對照管
[0085] 總SOD活力(U/m即rot) = (B值-A值)/B值/50%*反應液總體積/取樣量/待測樣本 蛋白濃度(m甜rot/ml)
[0086] 2.2.7腦勻漿中MDA的測定方法
[0087] 腦勻漿中MDA的操作方法
[008引
[0089]
[0090] 混勻，95°C水浴40分鐘，取出流水冷卻，W4000轉/分的轉速，離屯、lOmin，取上清液 于532nm，1 cm光徑處，蒸饋水調零，測各管0D值。
[0091] 注:A:空白管B:標準管C:測定管D:對照管
[0092] 組織中 MDA含量(nmo 1 /m即r 01) = (C值一D值)*標準品濃度（1 Onmo 1 /ml) / (B值一A 值)/蛋白含量(m甜rot/ml)
[0093] 2.2.8血清中N沈的測定方法
[0094]
[0095] 2.2.9血清中S-ΙΟΟβ的測定方法
[0096] 檢測原理、操作步驟：同NSE。
[0097] 3統(tǒng)計學處理方法
[009引數據分析用SPSS 17.0進行處理，計量資料:平均數±標準差（\±s)，各組間比較： 單因素方差分析，方差齊:最小顯著差數化SD)法，方差不齊:Games-化well法檢驗，等級資 料:Ridit檢驗。
[0099] 4實驗結果
[0100] 4.1對小鼠反復腦缺血再灌注死亡率的影響結果見表1。
[0101] 表1對小鼠腦缺血再灌注模型死亡率的影響
[0102]
[0103]
[0104] 由上表可看出，模型組死亡率最高，給藥各組死亡率均不同程度的降低，說明白花 蛇舌草總黃酬可降低小鼠死亡率，減少缺血區(qū)腦組織損傷，保護腦組織。
[0105] 4.2對小鼠腦缺血再灌注腦勻漿LD、MDA的影響結果見表2
[0106] 表2對小鼠反復腦缺血再灌注模型組織LD、MDA含量的影響（X + 5 )
[0107]
[0108] 注:相比模型組，用藥組具有顯著性差異(*沖<0.01)，明顯性差異(沖<0.05)
[0109] 由上表可看出，與假手術組相比，模型組腦勻漿中LD、MDA的含量提高均顯著（P< 0.01)，說明造模成功；與模型組相比，尼莫地平組、腦絡通組、白花蛇舌草總黃酬大、中、小 劑量組均能顯著降低腦組織LD、MDA的含量(P<0.01)，表明白花蛇舌草總黃酬各組對小鼠腦 缺血再灌注腦組織LD、MDA含量有顯著的調節(jié)作用，減輕腦組織的脂質過氧化程度，減輕乳 酸的堆積，尤其是白花蛇舌草總黃酬大劑量最佳。
[0110] 4.3對反復腦缺血再灌注模型小鼠腦勻漿中ATP酶活力的影響結果見3。
[011。 表3對小鼠腦缺血再灌注模型腦組織ATP酶活力的影響(:^±平）
[0112]
[0113]
[0114] 注:相比模型組，用藥組具有顯著性差異(*沖<0.01 )，明顯性差異(沖<0.05)
[01巧]由上表可看出：模型組的小鼠腦組織中的化+K+-ATP酶、MgH-ATP酶、Ca"-ATP酶活 力比假手術組顯著降低(P<〇.01)，說明腦缺血再灌注模型成功；與模型組相比，尼莫地平 組、腦絡通組、白花蛇舌草總黃酬大、中劑量組顯著升高腦組織中Na+K+-ATP酶、Mg++-ATP酶、 化H-ATP酶活力(P<0.01);白花蛇舌草總黃酬小劑量組明顯升高腦組織中化+K+-ATP酶的活 力(P<0.05)，顯著升高腦組織中MgH-ATP酶、Ca"-ATP酶活力(P<0.01)。實驗結果證實：白花 蛇舌草總黃酬通過提高腦組織化V-ATP酶、MgH-ATP酶、Ca"-ATP酶的活力，進而抑制缺血 腦組織的能量代謝障礙，從而改善小鼠腦缺血再灌注損傷。尤其是白花蛇舌草總黃酬大劑 量最佳。
[0116] 4.4對反復腦缺血模型小鼠腦勻漿中LDH和SOD活力的影響見表4。
[0117] 表4對小鼠反復腦缺血模型腦勻漿中LDH和SOD活力的影響(亥± S )
[011 引
[0119] 注:相比模型組，用藥組具有顯著性差異(*沖<0.01)，明顯性差異(沖<0.05)
[0120] 由上表可看出，與假手術組相比，模型組小鼠缺血側腦組織中LD巧舌性和SOD水平 均顯著降低(P<〇.01)，說明小鼠反復腦缺血再灌注模型造模成功;與模型組比較，尼莫地平 組、腦絡通組、白花蛇舌草總黃酬大、中劑量組均能顯著升高腦組織中LDH的活性和SOD水平 (P<〇.01);白花蛇舌草總黃酬小劑量組可明顯升高腦組織中LDH的活性;且小鼠腦組織中 SOD的活力有明顯上升的趨勢(P〉0.05)。表明白花蛇舌草總黃酬可W顯著升高反復腦缺血 模型小鼠腦組織LDH的活性，白花蛇舌草總黃酬大中劑量組顯著提高腦組織超氧化酶的活 性，進而保護腦組織，尤其白花蛇舌草總黃酬大劑量效果最佳。
[0121] 4.5對反復腦缺血模型小鼠血清中NSE、S-100f3含量的影響見表5。
[0122] 表5對小鼠反復腦缺血模型血清中NSE、S-100i3含量的影響（i±s)
[0123]
[0124] 注:相比模型組，用藥組具有顯著性差異(*沖<0.01 )，明顯性差異(沖<0.05)
[01巧]從上表可看出：與假手術組比較，模型組小鼠血清中NSE、S-100i3含量顯著升高(P< 0.01)，說明反復腦缺血再灌注模型造模成功；與模型組比，尼莫地平組、腦絡通組、白花蛇 舌草總黃酬大、中、小劑量組均能顯著降低血清中NSE含量(P<0.01);尼莫地平組、腦絡通 組、白花蛇舌草總黃酬大劑量組均能顯著降低血清中S-ΙΟΟβ的含量；白花蛇舌草總黃酬中 劑量組明顯降低血清中S-ΙΟΟβ的含量；白花蛇舌草總黃酬小劑量組具有明顯降低血清中S- ΙΟΟβ的含量的趨勢(p〉0.05)。表明白花蛇舌草總黃酬可W減輕缺血損傷小鼠血清中的NSE、 S-ΙΟΟβ含量，進而保護缺血造成的小鼠神經元損傷和神經元壞死，尤其白花蛇舌草總黃酬 大劑量效果最佳。
[01%] 4.6對反復腦缺血再灌注小鼠腦組織海馬區(qū)病理改變的影響見表6。
[0127]表6對反復腦缺血再灌注小鼠腦組織海馬區(qū)病理改變的影響
[012 引
[0129] "-"神經細胞無損傷；大腦海馬區(qū)神經細胞輕微水腫，神經元個別變性，結構 模糊，胞漿淡染；"++"大腦海馬區(qū)神經細胞中度水腫，神經元多數變性甚至壞死，結構模 糊，胞漿淡染；"+++"大腦海馬區(qū)神經細胞重度水腫，神經元壞死。
[0130] 由上表可看知：空白組大腦海馬神經細胞無損傷;模型組大腦神經元壞死、海馬神 經細胞重度水腫;尼莫地平組大腦海馬少數神經元變性，神經細胞輕微水腫;腦絡通組大腦 海馬神經元個別變性，神經細胞輕微水腫;大劑量白花蛇舌草總黃酬組大腦海馬神經元個 別變性，神經細胞輕微水腫；中劑量白花蛇舌草總黃酬組大腦海馬神經元個別變性、部分神 經細胞水腫，結構模糊，胞漿淡染；小劑量白花蛇舌草總黃酬組大腦海馬神經元大面積變 性、神經細胞水腫、細胞核固縮、胞漿淡染。
[0131] 經化dit檢驗，模型組相比假手術組有顯著的統(tǒng)計意義(P<0.01)，說明缺血再灌注 模型成功。與模型組相比，白花蛇舌草總黃酬大、中、小劑量組有明顯的統(tǒng)計學意義（p< 0.05);結果提示：白花蛇舌草總黃酬可改善缺血再灌注模型小鼠腦組織海馬區(qū)免受損傷從 而起到保護腦組織的作用。
[0132] 4.7對反復腦缺血再灌注小鼠腦皮質區(qū)病理改變的影響見表8
[0133] 表8對反復腦缺血再灌注小鼠腦組織皮質區(qū)病理改變的影響
[0134]
[01對"一"大腦皮質區(qū)無損傷；"+"大腦皮質區(qū)神經元個別壞死、神經細胞水腫；"++"大 腦皮質區(qū)神經元大部分壞死及神經細胞水腫；"+++"大腦皮質區(qū)重度水腫，神經元壞死。
[0136] 從上表可看出：空白組大腦皮質神經細胞無損傷;模型組大腦皮質神經元大部分 壞死、神經細胞重度水腫;尼莫地平組大腦皮質神經元少部分變性、神經細胞輕微水腫，結 構模糊，胞漿淡染;腦絡通組大腦皮質神經元少部分變性、神經細胞輕微水腫，結構模糊，胞 漿淡染;大劑量白花蛇舌草總黃酬組大腦皮質少數神經元變性、神經細胞水腫，結構模糊， 胞漿淡染；中劑量白花蛇舌草總黃酬組大腦皮質極個別神經元變性、神經細胞水腫、結構模 糊、胞漿淡染;小劑量白花蛇舌草總黃酬大腦皮質神經元大部分變性甚至壞死、神經細胞嚴 重水腫、胞漿淡染、結構模糊。
[0137] 經Ridit分析，模型組相比假手術組有顯著的統(tǒng)計學意義（P<0.01)，說明造模成 功;腦絡通組、尼莫地平組、大、中、小劑量白花蛇舌草總黃酬組與模型組相比有顯著的統(tǒng)計 學意義(P<0.01)，說明各用藥組均能顯著保護缺血再灌注小鼠腦組織皮質區(qū)免受損傷，因 此，對實驗小鼠做病理觀察具有直觀的診斷意義。
[013引 5結論
[0139] 通過觀察造模小鼠腦組織海馬區(qū)及皮質區(qū)的病理損傷變化，死亡率，血清中NSE、 S-ΙΟΟβ的含量變化，腦勻漿中的ATP酶活力、S0D、LDH的活性，提示白花蛇舌草總黃酬可降低 動物的死亡率;減少LD、MDA、NSE、S-ΙΟΟβ的含量;提高ATP酶、S0D、LDH的活力;減輕缺血再灌 注后引起的自由基生成增多;減輕因酸度過高對腦組織的損傷;改善能量代謝障礙，降低由 此引起的腦組織損傷級聯(lián)反應，改善腦組織皮質區(qū)及海馬區(qū)的神經細胞損傷，W白花蛇舌 草總黃酬大劑量組最佳。
【主權項】
1. 一種白花蛇舌草總黃酮為唯一活性成分在制備治療腦膜微循環(huán)障礙、腦缺血藥物中 的應用，所述的白花蛇舌草總黃酮是，將白花蛇舌草粉碎成過30目篩的粗粉，先加粗粉10倍 重量石油醚回流提取lh，脫脂，棄去石油醚，得藥渣；藥渣揮干石油醚，每次加10倍重量、質 量濃度80%乙醇浸泡0.5h，回流提取2次，每次lh，濾過，合并濾液，減壓回收乙醇至無醇味， 加蒸餾水分散成相當于含生藥量〇.3g/ml，得樣品液;樣品液上AB-8型大孔吸附樹脂，先用2 倍柱體積蒸餾水洗脫，棄去水液;繼用4倍柱體積、質量濃度10%乙醇洗脫，棄去洗脫液;再用 6倍柱體積、質量濃度80%乙醇洗脫，收集80%乙醇洗脫液，減壓回收乙醇至無醇味，冷凍干 燥，粉碎，得白花蛇舌草總黃酮。
【文檔編號】A61K36/748GK105998276SQ201610530776
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月7日
【發(fā)明人】苗明三, 方曉艷, 苗艷艷, 吳宿慧, 白明, 喬靜怡
【申請人】河南中醫(yī)學院