FOXM1蛋白氮端（1-234 aa）的表達及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了依據FOXM1蛋白氮端1?234位氨基酸殘基序列所產生的蛋白肽段的應用，其目的是提供一種以FOXM1為靶標開發(fā)蛋白類抗腫瘤藥物的候選者。所述蛋白肽段具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質：1）序列表中SEQ ID NO：1；2）將序列表中SEQ ID NO：1取代、缺失、插入和/或添加一個、兩個或數個氨基酸殘基，實現(xiàn)抑制或降低FOXM1的活性和功能的蛋白質。本發(fā)明依照FOXM1蛋白氮端1?234位氨基酸序列所制備的具有穿膜能力的FOXM1?氮端（1?234aa）重組蛋白，表現(xiàn)出對多種腫瘤細胞的抑制作用，有望成為抗腫瘤蛋白類藥物的候選者，將對研發(fā)具有自主知識產權的抗腫瘤藥物具有重要意義。
【專利說明】
F0XM1蛋白氮端(1 -234aa)的表達及其用途
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程學和腫瘤學領域，設及一種人類F0XM1蛋白氮端（l-234aa)的 表達及其用途。
【背景技術】
[0002] 對多種人瘤樣本進行基因表達分析后發(fā)現(xiàn)，轉錄因子F0XM1在腫瘤細胞中表達增 高，對其表達水平的檢測，已被用于多種腫瘤的診斷和預后（US 7056674、7081340、 7308364、7526387、7531300、〔肥01510355817.5)。從基因功能角度^(^]\11首先被確認是一 個調控細胞周期和細胞增殖的蛋白（Mol Cell Biol 1997.17:1626-1641)。在細胞增殖過 程中，F(xiàn)0XM1參與調節(jié)細胞周期相關的多個基因轉錄，從而控制細胞的DNA復制與有絲分裂 過程（Mol Cell Biol 1999.19:8570-8580，Proc rfetlAcadSciUSA 2002.99:16881- 16886，Mol Cell Biol 2005.25:10875-10894)，還與DNA損傷修復有關(Mol Cell Biol 2007.27:1007-1016，Cell Prolif 2010.43:494-504)，抑制其表達能有效終止細胞周期、 阻斷細胞生長（Proc Natl Acad Sci U S A 2002.99:16881-16886，Mol Cell Biol 2005.25:10875-10894,Genes Dev 2004.18:830-850,Developmental Biology 2004.276: 74-88，Proc 化tl Acad Sci U S A 2001.98:11468-11473)。此外，F(xiàn)OXMl被確立是一個參 與細胞干性維持的新因子(Nucleic Acids Res 2010.38:8027-8038)，抑制FOXMl導致無法 獲得誘導多能干細胞（iPSCs)，說明F0XM1是iPSCs重編程過程中的必須因子（PLoS One 2014.9: e92304)。同時，F(xiàn)OXMl還被發(fā)現(xiàn)是刺激腫瘤細胞發(fā)生上皮間質轉化的關鍵分子，抑 審化0XM1可阻止癌細胞轉移(化ncer Lett 2013.340:104-112)。在活體水平，不同器官中有 條件敲除FOXMl可抑制肝癌、肺癌、結直腸癌等實體瘤的發(fā)生和發(fā)展(Genes Dev 2004.18: 830-850,Cancer Res 2006.66:2153-2161,Gastroenterology 2007.132:1420-1431)。由 于FOXMl在刺激細胞增殖、增強DNA損傷修復能力、促進細胞遷移、維持細胞干性等方面發(fā)揮 主導作用，抑制FOXMl可有效抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，因此FOXMl被認為是腫瘤治療藥物開 發(fā)的有效祀標(Biochim Bio地ys Acta 2007.1775:92-102) eWFOXMl為祀基因，通過腺病 毒介導特異性干擾FOXMl的表達，從而實現(xiàn)腫瘤基因治療的可能性已在多種實體瘤(肝癌、 乳腺癌、鼻咽癌等）基因治療研究中被證實(J Gene Med 2012.14:231-240,Cancer Gene Ther 2013.20:117-124，Cancer Gene Ther 2014.21:133-138)。抑制FOXMl的小分子藥物 篩選工作也取得一定進展，其中，Thiostrepton、抗菌素 Siomycin A等小分子化合物被發(fā)現(xiàn) 能選擇性抑制FOXMl的轉錄活性，從而抑制了腫瘤（PLoS One 2009.4:e5592,化t Commun 2014.5:5165,Mol Cancer Ther 2008.7:2022-2032,(Mincer Res 2006.66:9731-9735)。本 發(fā)明提出WFOXMl為祀標，開發(fā)抑制或降低FOXMl活性和功能的蛋白類藥物，用于預防、治療 或延緩人類腫瘤。
[0003] 總結針對FOXMl的膚段提出的腫瘤治療手段，包括W下已公開的發(fā)明：1)鑒定可結 合于HLA-A2的源自FOXMl的膚W活化可殺死癌細胞的人殺傷T細胞和細胞毒性T淋己細胞 (C T L )，提供對于高水平表達F 0 XM 1的癌癥患者實現(xiàn)癌癥免疫治療的手段 化肥01510127580.5、115201514729752、〔肥01080017145.2)。2)^化^1。的0魁結合區(qū)原核 重組質粒誘導表達獲得的蛋白為祀標，從隧菌體隨機膚庫篩選和獲得一組祀向化xMlc的高 效結合多膚，該類多膚可潛在作為先導分子用于腫瘤等相關疾病的治療藥物研發(fā)和診斷 (CN201010515471.8)〇
[0004] W胞內祀標開發(fā)的抗腫瘤蛋白類藥物都需要進入腫瘤細胞發(fā)揮作用，因此必須具 備穿透細胞膜進入細胞的能力。細胞穿膜膚keU-pene化ating P邱tides，CPPs)是由氨基 酸組成且具有穿透細胞膜能力的多膚，最早從人HIV-1的TAT蛋白中發(fā)現(xiàn):該蛋白中包含具 有穿膜能力的特殊膚段區(qū)域（Proc Natl Acad Sci U S A 1991.88:1864-1868，Cell 1988.55:1189-1193);此后，其他天然蛋白也被發(fā)現(xiàn)包含穿膜能力的膚段（J Biol Chem 1994.269:10444-10450)。W此為基礎，人們相繼篩選和開發(fā)了包含不同蛋白來源穿膜膚序 列的嵌合體穿膜膚(如付曰郵9〇的曰11)(。4566 1 1998.12:67-77)和純人工合成的穿膜膚(如 多聚精氨酸膚段R8或R9等）（J Biol Chem 2001.276:5836-5840)，并可對其加 W修飾提高 穩(wěn)定性和穿膜效率(Nucleic Acids Res 2011.39:3972-3987)。由于具備穿膜能力，穿膜膚 一經發(fā)現(xiàn)就被認為可用于介導生物活性物質、特別是大分子量的蛋白質、核酸等分子進入 細胞發(fā)揮作用，成為一種具有轉染效率高、細胞對象類型廣、細胞毒性低、方法簡便等突出 優(yōu)點的藥物遞送方法(Ther De 1 iV 2013.4:573-591) (CN200680049953、200810155949)。一 般認為，穿膜膚介導藥物進入細胞的模式主要通過是能量依賴型的細胞內吞機制(J Biol Chem 2003.278:585-590)，也有研究表明可通過直接細胞膜轉位(J Biol Chem 2009.284: 33957-33965)或物理內吞方式進入細胞（Int J Biochem Cell Biol 2012.44:869-875)， 隨后逃逸出內涵體并釋放于細胞質中（Int J Biochem Cell Biol 2012.44:869-875)，實 現(xiàn)藥物功能。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術問題是:本發(fā)明WF0XM1為祀標開發(fā)蛋白類抗腫瘤藥物，具 體地，是從F0XM1蛋白序列中選定其氮端1-234位氨基酸，制備了 F0XM1-氮端（l-234aa)重組 蛋白，證明此段蛋白能抑制腫瘤細胞、成為抗腫瘤蛋白類藥物的候選者。
[0006] 本發(fā)明與已公開發(fā)明的區(qū)別，體現(xiàn)在從F0XM1蛋白序列中選定其氮端1-234位氨基 酸，制備了F0XM1-氮端（l-234aa)重組蛋白，并證明此段蛋白能抑制腫瘤細胞、成為抗腫瘤 蛋白類藥物的候選者?；谔烊籉0XM1蛋白的氮端抑制F0XM1轉錄活性的發(fā)現(xiàn)（Oncogene 2008.27:1696-1704，M〇1 Cell Biol 2008.28:3076-3087)，本發(fā)明運用CMV啟動子介導 F0XM1-氮端（l-234aa)轉錄的真核表達質粒，在腫瘤細胞中高表達F0XM1-氮端（l-234aa)蛋 白，可有效抑制F0XM1的轉錄激活功能。該蛋白區(qū)段還參與介導了F0XM1與腫瘤促進因子 Smad3的相互作用，運一蛋白互作對腫瘤進程具有重要影響（J Clin Invest 2014.124: 564-579)，因此在腫瘤細胞中增高FOXMl-氮端蛋白區(qū)段，能競爭性阻礙FOXMl全長蛋白與 Smad3的互作，從而干預F0XM1的促瘤功能。另夕hFOXMl蛋白受多種信號通路調節(jié)，如Cdkl等 憐酸激酶可憐酸化FOXMl蛋白的氮端，激活FOXMl的轉錄活性（J Biol畑em 2009.284: 30695-30707)，因此增高FOXMl-氮端蛋白區(qū)段，可充當競爭性底物，阻礙促瘤信號通路對 FOXMl的修飾活化作用。
[0007] 在本申請中，本發(fā)明人運用CMV啟動子介導FOXMl-氮端（l-234aa)轉錄的真核表達 質粒，在腫瘤細胞中高表達FOXMl-氮端（l-234aa)蛋白，抑制了FOXMl的轉錄激活功能。在穿 膜膚的選擇上，本發(fā)明中運用原核表達體系制備了融合多聚精氨酸R9穿膜膚的綠色巧光蛋 白（R9-GFP)，證實其有效穿膜并分布于細胞質和細胞核，表明R9穿膜膚是介導外源蛋白進 入胞內的有效工具。W此為基礎，本發(fā)明人結合多聚精氨酸R9穿膜膚，構建了穿膜膚融合人 FOXMl蛋白氮端（l-234aa)的原核表達質粒;采用原核表達系統(tǒng)和化S標簽親和純化手段，規(guī) ?；苽浯┠つw融合人FOXMl蛋白氮端（l-234aa)的重組蛋白（命名為R9-F0XM1-N)。體外 EMSA實驗證實，R9-F0XM1-N可抑制FOXMl與其DNA結合位點的結合，表明R9-F0XM1-N蛋白具 備抑制FOXMl轉錄活性的潛能。進一步運用R9-F0XM1-N直接處理腫瘤細胞，制備細胞裂解液 進行Western Blotting檢測，證明R9-F0XM1-N可有效進入細胞；該重組蛋白進入細胞后也 抑制了腫瘤細胞中的FOXMl轉錄活性。本發(fā)明人選擇了不同類型的腫瘤細胞（乳腺癌10八- MB-231、MCF-7、肺癌A549、肝癌HepG2等)開展實驗，研究R9-F0XM1-N的不同處理劑量和處理 時間對腫瘤細胞的抑制效果，證實了 R9-F0XM1-N對腫瘤細胞的抑制作用。選擇乳腺癌MDA- MB-436細胞作為細胞模型，對比R9-F0XM1-N與已知FOXMl小分子抑制劑TMostrepton的抑 瘤效果，發(fā)現(xiàn)二者對腫瘤細胞具有類似的半致死劑量（l-2ymol/L);在相同工作濃度下，二 者都能明顯抑制MDA-MB-436細胞的成球能力，減弱腫瘤干細胞特征，表明在細胞水平R9- F0XM1-N運一蛋白分子表現(xiàn)出與小分子藥物相媳美的藥效。為探討R9-F0XM1-N如何抑制 FOXMl功能，我們初步考察了R9-F0XM1-N與腫瘤細胞中的目標蛋白是否發(fā)生相互作用，發(fā)現(xiàn) R9-F0XM1-N可與FOXMl全長蛋白、已知的FOXMl互作蛋白Smad3發(fā)生互作，提示了 R9-F0XM1-N 發(fā)揮抑瘤作用的可能機制。
[000引更具體地，本發(fā)明提供了如下：
[0009] [1]一個來源于FOXMl蛋白氮端的片段，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1所 /J、- 〇
[0010] [2][1]中的蛋白片段，取代、缺失、插入和/或添加一個、兩個或數個氨基酸，實現(xiàn) 抑制或降低FOXMl的活性和功能。
[0011] [3]編碼[1]所述蛋白片段的DM序列。
[001^ [4]根據[3]所述的DNA序列，其特征在于：其DNA序列如序列表中SEQ ID N0:2所 /J、- 〇
[0013] [引含[3]所述DM序列的表達載體。
[0014] [6] -種表達[1]所述蛋白片段的方法，是將含所述蛋白片段的DNA序列與表達穿 膜膚的DNA序列形成融合開放閱讀框，構建重組表達載體導入宿主細胞，表達得到具有穿膜 能力的所述蛋白片段。
[001引[7]根據[6]所述的方法，其特征在于：所述重組表達載體為pHis-F0XMl(l- 234aa)-R9〇
[0016] [引根據[6]或[7]所述的方法，其特征在于:所述宿主為大腸桿菌時，需加入IPTG 進行誘導表達，所加入IPTG的濃度為祉Μ，誘導時間為6小時。
[0017] [9巧日[6]所述的方法用于制備治療和/預防和/或輔助治療癌癥或者抗腫瘤的藥 物中的用途。
[0018] [10]-種抗腫瘤的藥物，它的活性成分為[1]所述蛋白片段。
【附圖說明】
[0019] 圖1顯示了融合多聚精氨酸R9穿膜膚的EGFP重組蛋白（R9-GFP)可有效進入腫瘤細 胞。
[0020] 圖2顯示了在腫瘤細胞中過表達F0XM1氮端可抑制F0XM1的轉錄活性。
[0021] 圖3顯示了 R9穿膜膚融合人F0XM1蛋白氮端（l-234aa)的重組蛋白R9-F0XM1-N的規(guī) ?；苽?。
[0022] 圖4顯示了 R9-F0XM1-N重組蛋白可抑制F0XM1與其DNA結合位點的結合。
[0023] 圖5顯示了 R9-F0XM1-N重組蛋白可抑制腫瘤細胞中的F0XM1轉錄活性。
[0024] 圖6顯示了 R9-F0XM1-N重組蛋白對不同類型腫瘤細胞增殖的抑制作用。
[0025] 圖7顯示了對比R9-F0XM1-N重組蛋白與F0XM1小分子抑制劑Thiostr邱ton的抑瘤 效果。
[0026] 圖8顯示了 R9-F0XM1-N重組蛋白與腫瘤細胞中的特定蛋白發(fā)生互作。
【具體實施方式】
[0027] 下面通過【具體實施方式】的詳細描述來進一步闡明本發(fā)明，但并不是對本發(fā)明的限 審IJ，僅僅作示例說明。
[0028] 實施例1驗證多聚精氨酸R9穿膜膚的有效穿膜，證實融合多聚精氨酸R9穿膜膚的 EGFP重組蛋白（R9-GFP)可有效進入腫瘤細胞。
[00巧]1.原核表達載體祀T1化-R9-GFP的構建
[0030] 1)R9-GFP基因片段的擴增
[0031] 設計引物，PCR擴增GFP基因片段，引物序列為：
[0032] 引物1(上游引物）：GCG CCC ATG GTG CAT CAC CAT CAC CAT CAC ATG GTG AGC AAG GGC GA
[0033] 引物2(下游引物）：GCG CCA TAT GCT ACC TTC TCC TTC TCC TTC TCC TTC TCC TGA TCC GGT GGA TCC CGG
[0034] W祀GFP-C2為模板，在引物1和引物2的引導下PCR擴增GFP，反應體系為:克隆質粒 pEGFP-C2(80ng/yLHyL、10X PCR Buffer for K0D-化us-Neo(The;rmo Scientific)f5yL、 dNTPs (2mM each)扣L、MgS04溶液（25mM) 4化、KOD-PLus-Neo (1. OU/yLHwL、引物 1Π 0.0μΜ ) 1 化、引物2(:1(卿11^)化^0150化^加去離子水補充至反應體系50化。？0?反應條件：先941： 5min;再95°C30sec，57°C30sec，68°C50sec，共30 個循環(huán)；然后 68°C 1〇111；[]1，4°[5111；[]1。反應結 束后，對PCR擴增產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，回收并純化擴增的目的片段，純化產物 溶于40μΙ TE緩沖液中，-20°C凍存?zhèn)溆谩?br>[00巧]2)PCR產物及祀T-1加載體的酶切處理
[0036] 利用NcoI、NdeI限制性內切酶切出克隆片段及載體的粘性末端。酶切體系：目的片 段（150ng/yL)或祀T-15b質粒（150ng/yL)6.化L、化〇1 限制性內切酶(Thermo Scientific) 0.扣L、NdeI 限制性內切酶（Thermo Scientific)0.扣L、10X hstDigest BuffeHThermo Scientif icHyL，加去離子水至總體積10jiL，37°C水浴反應30min。
[0037] 3)原核表達載體祀ΤΙ化-R9-GFP的獲得
[0038] 將步驟2)獲得的經NcoI、NdeI限制性內切酶處理的目的片段和載體進行連接，連 接體系：酶切載體4.化L、酶切目的片段3.：3yL、T4DNA Ligase lyL(5U/yL)、10X T4 DNA Ligase Buffer(T0Y0B0HμL，加去離子水至反應體系10化。22°C反應20min，-20°C凍存?zhèn)?用。
[0039] 取一管DH5a感受態(tài)細胞置于冰上溶解，待感受態(tài)完全溶解后，加入liiL的連接片 段，混勻后冰上放置30min。熱激轉化過程:42 °C 90sec，冰上放置2min;加入1血的LB培養(yǎng)基， 37 °C振蕩培養(yǎng)45min;取2(Κ)化細胞涂布LB平板(含25yg/mL氨節(jié)青霉素），37 °C培養(yǎng)過夜;任 意挑取一個單克隆，接種到5mL的LB培養(yǎng)液（含25yg/mL氨節(jié)青霉素），37°C振蕩培養(yǎng)過夜 (12-1化）。用質粒小提試劑盒(OMEGA BI0-TEK)提取質粒，用限制性內切酶NcoI、NdeI進行 酶切鑒定后，保種并分裝測序。
[0040] 2.祀T1化-R9-GFP的表達及檢測
[0041 ] 將R9-GFP原核表達載體祀T1化-R9-GFP轉化大腸桿菌Rostta DE3感受態(tài)細胞，37 。(:培養(yǎng)過夜，隨機挑選一個單克隆，接種到5mL的LB培養(yǎng)基(含25yg/mL氨節(jié)青霉素和25yg/ mL氯霉素）中，37°C振蕩培養(yǎng)4-化，將菌液加到lOOmL的LB培養(yǎng)液(含25yg/mL氨節(jié)青霉素和 25yg/mL氯霉素)37 °C振蕩培養(yǎng)過夜，取菌液檢測0D6日日值，調整0〇6日日值至0.8-1，加入IPTG誘 導劑(終濃度祉M)，30°C誘導振蕩培養(yǎng)化。
[0042] 4000rpm離屯、20min收集菌體，用 15血 Binding Buffer(20mM 化3P〇4,500mM NaCl, 20mM imidazole ,ρΗ 7.4)重懸菌體，超聲40min(超3sec，停2sec)破碎菌體。用Ni-Beads (GE)親和純化系統(tǒng)進行純化(按照商品化Ni-Beads親和純化實驗流程），純化后產物用SDS- PAGE電泳檢測，獲得融合多聚精氨酸膚段R9穿膜膚的綠色巧光蛋白（R9-GFP)(圖1，A，箭頭 所示）。
[0043] 3.R9穿膜膚-綠色巧光蛋白化GFPKR9-GFP)穿膜效果驗證。
[0044] R9-GFP( 1皿oL/L)處理U20S腫瘤細胞4她，PBS清洗后4 %甲醒固定，巧光顯微鏡觀 察重組蛋白在細胞內的分布(400X)。發(fā)現(xiàn)該重組蛋白能有效穿膜并分布于細胞質和細胞核 (圖1，B)。
[0045] 實施例2驗證F0XM1 -氮端（1 -234aa)可抑制F0XM1的激活轉錄能力。
[0046] 1.真核表達載體 pCMV-F0XMl-N(l-234aa)的構建
[0047] 1 )F0XM1-N( l-234aa)基因片段的擴增
[004引設計引物，PCR擴增F0XM1-N( l-234aa)基因片段，引物序列為：
[0049]引物3(上游引物）：GCT CTA GAA TGG GTA AGC CTA TCC CTA ACC CTC TCC TCG GTC TCG ATT CTA CGA TGA AAA CTA GCC CCC GTC G
[0化0]引物4(下游引物）：GCC TCG AGC TAA GAC ACA GAG TTC TGC CAGG
[0化1] WpcDNA3.1-F0XMl為模板，在引物3和引物4的引導下PCR擴增F0XMl-N(l-234aa) 反應體系：克隆質粒pcDNA3.1-F0XMl(80ngAiLHyL、10X PCR Buffer for KOD-PLus-化0 (ThermoScientific)5化、dNTPs(2mMeach)5化、MgS04溶液（25mM)4化、K0D-PLus-Neo (1 .OUAiLHwL、引物1( lODgM)化L、引物2U0.0,uMMyL、DMS0化L，加去離子水補充至反應 體系 50化。？〇?反應條件:先 94°C5min;再 95°C30sec，57°C30sec，68°C50sec，共 30 個循環(huán);然 后68 °C lOmin，4 °C 5min。反應結束后，對PCR擴增產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化 擴增的目的片段，純化產物溶于40μΙ TE緩沖液中，-20°C凍存?zhèn)溆谩?br>[0052] 2)PCR產物及pcDNA3.1載體的酶切處理
[005引利用Xbal、趾01限制性內切酶切出克隆片段及載體的粘性末端。酶切體系：目的片 段（1 SOng/yL)或PCDNA3.1 質粒（1 SOng/yL) 6.化L、化01 限制性內切酶(Thermo Scientifi C) 0.扣L、NdeI 限制性內切酶（Thermo Scientific)0.扣L、10X hstDigest BuffeHThermo Scientif icHyL，加去離子水至總體積10jiL，37°C水浴反應30min。
[0054] 3)真核表達載體 pCMV-F0XMl-N(l-234aa)的獲得
[0055] 將步驟2)獲得的經XbaI、XhoI限制性內切酶處理的目的片段和載體進行連接，連 接體系：酶切載體5.12化、酶切目的片段2.87化、T4DNA Ligase(5U/yL) lyL、10X T4DNA Ligase Buffer(T0Y0B0HμL，加去離子水至反應體系10化。22°C反應20min，-20°C凍存?zhèn)?用。
[0056] 取一管DH5a感受態(tài)細胞置于冰上溶解，待感受態(tài)完全溶解后，加入liiL的連接片 段，用拇指輕彈混勻，冰上放置30min。熱激過程:42 °C熱激90min，冰上放置2min;加入1血的 LB培養(yǎng)基，37 °C放置45min;取20化L涂布LB平板(含25yg/mL氨節(jié)青霉素），37 °C培養(yǎng)過夜 (12-1化）；任意挑取一個單克隆，接種到20mL的LB培養(yǎng)液(含25yg/mL氨節(jié)青霉素)37°C振蕩 過夜培養(yǎng)(12-16h)。提取質粒，用限制性內切酶甜al、化〇1進行酶切鑒定，保種并分裝測序。
[0057] 3.在腫瘤細胞中過表達F0XM1氮端可抑制F0XM1的轉錄活性。
[0化引巧光素酶報告基因檢測實驗:運用pCMV-FOXMl和pCMV-F0XMl-N(l-234aa)真核表 達載體，與pCdc25B promoter-Luciferase報告基因質粒共轉染U20S腫瘤細胞，4化后檢測 不同劑量的pCMV-FOXM 1-N (0.扣g、化g、化g)對F0XM1刺激Cdc2 5B啟動子轉錄作用的抑制效 果（圖2，A)dF0XM1氮端抑制F0XM1對Cdc25B的上調功能：共轉染pCMV-FOXMl表達質粒（化邑） 和pCMV-F0XMl-N( l-234aa)表達質粒(0.5yg、lyg、2yg)進U20S細胞4她后，制備細胞裂解液。 運用Western 化otting分別檢測Cdc25B、F0XMl(Santa Cruz SC-502抗體識別F0XM1 碳端） 與F0XM1氮端（San化化UZ SC-500抗體識別F0XM1氮端)蛋白的表達水平，同時檢測β-actin 蛋白水平作為上樣對照（圖2，B)。
[0059] 實施例3構建并規(guī)?；苽淞舜┠つw融合人F0XM1蛋白氮端（l-234aa)的重組蛋白 R9-F0XM1-N。
[0060] 1.原核表達載體pHis-F0XMl(l-234aa)-R9 的構建
[0061 ] 1)R9-F0XM1-N基因片段的擴增
[0062] 設計引物，PCR擴增基因片段，引物序列為：
[0063] 引物5(上游引物）：GCG CCC ATG GTG CAT CAC CAT CAC CAT CAC ATG AAA ACT AGC CCC CGT CG
[0064] 引物6(下游引物）：GCG GAT CCC TAC CTT CTC CTT CTC CTT CTC CTT CTC CTA GAC ACA GAG TTC TGC CAG G
[0065] WpcDNA3.1-F0XMl為模板，在引物5和引物6的引導下PCR擴增R9-F0XM1-N反應體 系為：克隆質粒PCDNA3.1-F0XM1 (80叫/化）1化、10乂 PCR Buffer for KOD-PLus-Neo (Thermo Scientific)5化、dNTPs(2mM each)5化、MgS〇4溶液（25mM)4化、KOD-PLus-Neo (l.OU/yLHyL、引物K ΙΟ.ΟμΜ)!化、引物2(1卿μΜ)化L、DMS0化L，加去離子水補充至反應 體系 50化。？〇?反應條件:先 94°C5min;再 95°C30sec，57°C30sec，68°C50sec，共 30 個循環(huán);然 后68 °C lOmin，4 °C 5min。反應結束后，對PCR擴增產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化 擴增的目的片段，純化產物溶于40μΙ TE緩沖液中，-20°C凍存?zhèn)溆谩?br>[0066] 2)PCR產物及祀T-1加載體的酶切處理
[0067] 利用NcoI、BamHI限制性內切酶切出克隆片段的粘性末端。酶切體系：目的片段 (150ngAiL)或祀T-1 化質粒（150ngAiL)6.化L、化〇1 限制性內切酶（Thermo Scientific)0.5 化、BamHI限制性內切酶（Thermo Scientific)0.f5yL、10X hstDigest BuffeHThermo Scientif icHyL，加去離子水至總體積10jiL，37°C水浴反應30min。
[006引 3)原核表達載體pHis-FOXMl (l-234aa)-R9的獲得
[0069] 將步驟2)獲得的經化oI、BamHI限制性內切酶處理的目的片段和載體進行連接，連 接體系及反應條件為：酶切載體5.63化、酶切目的片段2.36^、Τ40ΝΑ Ligase (抓AiLHyL、 lOX T4DNA Ligase buffer(T0Y0B0HyL，加去離子水至反應體系 10化。22°(：反應20min，-20 °C凍存?zhèn)溆谩?br>[0070] 取一管DH5a感受態(tài)細胞置于冰上溶解，待感受態(tài)完全溶解后，加入liiL的連接片 段，用拇指輕彈混勻，冰上放置30min。熱激過程:42 °C熱激90min，冰上放置2min;加入1血的 LB培養(yǎng)基，37°C放置45min;取200化涂布LB平板(氨節(jié)青霉素濃度為25yg/mL)，37°C培養(yǎng)過 夜（12-16h);挑取單克隆，接種到5mL的LB培養(yǎng)液(含25yg/mL氨節(jié)青霉素）37°C振蕩培養(yǎng)過 夜（12-16h)。提取質粒，用限制性內切酶化oI、BamHI進行酶切鑒定，保種并分裝測序。P化S- F0XM1 (l-234aa)-R9原核表達質粒結構示意圖（圖3，A)。
[0071] 2.抑is-FOXMl (l-234aa)-R9 的表達及檢測
[0072] 將R9-F0XM1-N原核表達載體抑is-FOXMl(l-234aa)-R9轉化大腸桿菌Rostta DE3 感受態(tài)細胞，37°C培養(yǎng)過夜（12-16h)，隨機挑選一個單克隆，接種到5mL的LB培養(yǎng)基(含25μ g/mL氨節(jié)青霉素和25yg/mL氯霉素），37°C振蕩培養(yǎng)4-化。將菌液加到lOOmL的LB培養(yǎng)液(含 25yg/血氨節(jié)青霉素和25yg/mL氯霉素)37 °C振蕩培養(yǎng)過夜（12-16h)，取菌液檢測ODsgg值，調 整ODsqq值至0.8-1，加入IPTG誘導劑(終濃度祉M)，30°C誘導振蕩培養(yǎng)化。
[0073] 4000rpm離屯、20min收集菌體，用 15血 Binding Buffer(20mM 化3P〇4,500mM NaCl, 20mM imidazole ,ρΗ 7.4)重懸菌體，超聲40min(超3sec，停2sec)破碎菌體。用Ni-Beads (GE)親和純化系統(tǒng)進行純化(按照商品化Ni-Beads親和純化實驗流程），純化后產物用SDS- PAGE電泳檢測。
[0074] 3.R9穿膜膚融合人F0XM1蛋白氮端（l-234aa)的重組蛋白R9-F0XM1-N的規(guī)?；?備。運用原核誘導表達系統(tǒng)擴大培養(yǎng)規(guī)模，獲得細菌裂解液。通過AKTApurifier蛋白純化儀 結合化s-tag親和純化手段，采用不同洗脫強度收集純化蛋白，實現(xiàn)規(guī)?；苽浼兓┠つw 融合人F0XM1蛋白氮端（l-234aa)的重組蛋白R9-F0XM1-N，并獲得純化過程的HPLC分析譜圖 (圖3，B，箭頭所示該重組蛋白吸收峰）dSDS-PAGE凝膠電泳方法檢測蛋白制備不同階段的蛋 白樣品，上樣量均為lOyg(圖3，C，箭頭所示R9-F0XM1-N重組蛋白）。
[0075] 實施例4驗證R9-F0XM1-N可抑制F0XM1與其DNA結合位點的結合。
[0076] R9-F0XM1-N重組蛋白可抑制F0XM1與其DNA結合位點的結合。運用EMSA實驗，在 F0XM1全長重組蛋白與其巧光標記的DNA結合探針發(fā)生結合反應的體系中，按照摩爾比1:1、 1:10、1: 20加入R9-F0XM1-N重組蛋白，檢測R9-F0XM1-N重組蛋白對F0XM1蛋白結合DNA的干 擾作用（圖4)。結果表明，在摩爾比1:1的條件下，R9-F0XM1-N重組蛋白可顯著抑制F0XM1與 其DNA結合位點的結合，進一步增大摩爾比，R9-F0XM1-N重組蛋白能完全抑制F0XM1與其DNA 結合位點的結合。
[0077] 實施例5證實R9-F0XM1-N可有效進入腫瘤細胞并抑制F0XM1的轉錄活性。
[0078] R9-F0XM1-N重組蛋白可抑制腫瘤細胞中的F0XM1轉錄活性。不同濃度R9-F0XM1-N 重組蛋白（lymoL/L、3皿oL/L、5ymoL/L)處理U20S腫瘤細胞24h后，Western化otting實驗檢 測胞內的重組蛋白（Santa化UZ SC-500抗體識別F0XM1氮端），同時檢測β-actin蛋白水平 作為上樣對照（圖5，A)。巧光素酶報告基因檢測實驗：運用pCMV-FOXMl和pCdc25B promoter-Luciferase質粒共轉染細胞24h后，再分別用不同濃度R9-F0XM1-N重組蛋白或 R9-GFP重組蛋白（l皿oL/L、3皿oL/L、5皿oL/L)處理細胞，24h后檢測Luciferase的活性，考 察R9-F0XM1-N對F0XM1轉錄活性的抑制效果（圖5，B)。結果表明，R9-F0XM1-N重組蛋白在化 nK)L/L的處理濃度下就可有效進入細胞，并隨處理濃度增加，體現(xiàn)劑量依賴型地抑制F0XM1 激活基因轉錄的能力。
[0079] 實施例6證實R9-F0XM1-N對乳腺癌、肺癌、肝癌等腫瘤細胞的抑制作用。
[0080] R9-F0XM1-N重組蛋白對不同類型腫瘤細胞增殖的抑制作用。運用MTT實驗考察R9- F0XM1-N對腫瘤細胞增殖表型的影響:選擇乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7、肺癌A549、肝癌Η邱G2 細胞，用不同濃度的R9-F0XM1 -Ν( lymoL/L、3ymoL/L、5ymoL/L、7ymoL/L、9ymoL/L)進行處理， 24h時后檢測細胞的活性，R9-GFP處理作為對照，獲得劑量依賴曲線。針對所選細胞，固定 R9-F0XM1-N處理濃度（1皿化/L)，在處理后不同時間點（1天、2天、3天)檢測細胞活性，獲得 相關細胞的生長曲線（圖6)。結果表明，與R9-GFP對照處理的樣本相比，R9-F0XM1-N可明顯 抑制乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7、肺癌A549、肝癌HepG2細胞的增殖。
[0081 ] 實施例7對比發(fā)現(xiàn)R9-F0XM1-N與已知F0XM1小分子抑制劑TMostr邱ton對腫瘤細 胞具有類似的半致死劑量和抑瘤效果。
[0082] 對比R9-F0XM1-N重組蛋白與F0XM1小分子抑制劑化iostrepton的抑瘤效果。選擇 乳腺癌MDA-MB-436細胞作為細胞模型。不同濃度R9-F0XM1-N處理MDA-MB-436細胞2地后，通 過MTT實驗檢測細胞活性，確定該重組蛋白對此腫瘤細胞的半致死劑量（圖7，A)，半致死劑 量為1-化111〇1/1。1?9斗0乂]\11-則1皿化/1或2皿〇171)明顯抑制]\?^-]\?-436細胞的成球能力，預 示R9-F0XM1-N能抑制腫瘤干細胞特征（圖7，B)。不同濃度F0XM1小分子抑制劑化iostr邱ton 處理MDA-MB-436細胞24h后，通過MTT實驗檢測細胞活性（圖7，C)，發(fā)現(xiàn)其對此腫瘤細胞的半 致死劑量也接近1-24111〇1/1^少(^11小分子抑制劑化;[03化691:0]1(2皿地/]^)也顯示出對10八- MB-436細胞成球能力的抑制（圖7，D)。
[0083] 實施例8發(fā)現(xiàn)R9-F0XM1-N可與F0XM1全長蛋白、Smad3發(fā)生互作，提示了 R9-F0XM1-N 發(fā)揮抑瘤作用的可能機制。
[0084] R9-F0XM1-N重組蛋白與腫瘤細胞中的特定蛋白發(fā)生互作。R9-F0XM1-N重組蛋白含 有His標簽。乳腺癌MDA-MB-231細胞裂解液（Img)與R9-F0XM1-州障育后，加入Ni-beads進行 PulX-down實驗，Western化otting實驗檢測相關蛋白。R9-F0XM1-N與F0XM1全長蛋白發(fā)生 互作。分別用Santa Cruz SC-502抗體識別F0XM1全長蛋白（89KD)、San化Cruz SC-500抗體 識別F0XM1氮端蛋白（30?。▓D8，AKR9-F0XM1-N與Smad3發(fā)生互作。R9-GFP(含His標簽)作 為陰性對照（圖8，B)。
【主權項】
1. 一種抗腫瘤的藥物，它的活性成分為F0XM1蛋白氮端1-234位氨基酸殘基序列所示蛋 白肽。2. -種F0XM1蛋白氣端1_234位氣基酸殘基序列所不蛋白妝在制備抑制腫瘤細胞的抑 制劑中的用途。3. 如權利要求2所述的用途，其特征在于，所述蛋白肽與穿膜肽融合使用。4. 一個來源于F0XM1蛋白氮端的片段，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1所示。5. 編碼如權利要求4所述蛋白片段的DNA序列。6. 如權利要求5所述蛋白片段的DNA序列，其特征在于：其DNA序列如序列表中SEQ ID NO: 2所示。7. 含如權利要求5或6所述蛋白片段的DNA序列所述DNA序列的表達載體。8. -種表達如權利要求4所述片段的方法，是將含所述蛋白片段的DNA序列與表達穿膜 肽的DNA序列形成融合開放閱讀框，構建重組表達載體導入宿主細胞，表達得到具有穿膜能 力的所述蛋白片段。9. 如權利要求8所述的方法，其特征在于:其中穿膜肽是多聚精氨酸R9穿膜肽。10. 根據權利要求9所述的方法，其特征在于：所述重組表達載體為pHis-FOXMl(l-234aa)_R9〇
【文檔編號】C12N15/70GK105999227SQ201610439054
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年8月12日
【發(fā)明人】譚擁軍, 余景衛(wèi)
【申請人】湖南大學