穩(wěn)定的胰高血糖素類似物以及用于治療低血糖的用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及包含置換Imp1和His3、與賴氨酸的側(cè)鏈共價連接的具有三至十個帶負(fù)電荷部分的取代基的胰高血糖素類似物的衍生物及其中間體和組合物，以及它們在醫(yī)學(xué)中的用途。
【專利說明】穩(wěn)定的膜高血糖素類似物從及用于治療低血糖的用途
[0001] 本發(fā)明設(shè)及膜高血糖素類似物的新型衍生物W及它們在醫(yī)學(xué)中，例如在低血糖治 療中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 人們早已了解到膜高血糖素對于治療由膜島素作用引起的低血糖是有效的。膜高 血糖素的升血糖效應(yīng)是刺激肝糖原分解成葡萄糖(糖原分解)和增加來源于氨基酸前體的 葡萄糖產(chǎn)生(糖異生)從而導(dǎo)致從肝輸出的葡萄糖增加的結(jié)果。
[0003] 用于治療嚴(yán)重低血糖的可商購的膜高血糖素作為藥盒提供，該藥盒包含具有凍干 的膜高血糖素的小瓶和預(yù)先裝有水的一次性注射器巧li Lilly和Novo Nordisk)。使用前， 必須通過將注射器中的水添加至具有膜高血糖素的小瓶中來重建膜高血糖素。隨后必須輕 輕搖動小瓶直至所有膜高血糖素溶解，并且應(yīng)將所得到的溶液吸回注射器中，并注射至有 需要的人中。在嚴(yán)重的低血糖事件中，患者是無意識的或半無意識的，因此要依賴提供幫助 的人來施用膜高血糖素。
[0004] 糖尿病患者的親屬認(rèn)為所述重建步驟是麻煩的，并且該步驟會延遲或甚至可能妨 礙對嚴(yán)重低血糖事件的治療。
[0005] 預(yù)裝填的即用型裝置的主要障礙是膜高血糖素的固有不穩(wěn)定性。在溶解之后的數(shù) 小時內(nèi)膜高血糖素的溶液形成凝膠或原纖維。另外，膜高血糖素在pH 3-9的范圍內(nèi)具有固 有的低溶解度。膜高血糖素含有若干種不穩(wěn)定的氨基酸，并且膜高血糖素組合物的化學(xué)穩(wěn) 定性非常差，運(yùn)主要是由于脫酷胺化、異構(gòu)化、氧化和水解裂解。
[0006] 為了能夠開發(fā)預(yù)裝填的即用型裝置，需要開發(fā)新的不形成原纖維的膜高血糖素類 似物。另外，要求膜高血糖素具有改善的化學(xué)穩(wěn)定性W使溶液能夠在室溫下保持延長的一 段時間。此外，運(yùn)樣的膜高血糖素類似物應(yīng)當(dāng)在皮下（SC)或肌肉內(nèi)（IM)施用之后迅速起效 (諸如升血糖效應(yīng)）。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 在一個實施方案中，本發(fā)明設(shè)及一種膜高血糖素類似物的衍生物，或所述衍生物 的藥學(xué)上可接受的鹽、酷胺或醋，所述衍生物包含式I:
[0008] Imp-X2-His-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser_Asp-Xi〇-Ser-Xi2-Tyr-Leu-Xi5-Xi6-Ar 邑一Ar 邑一 Ala-X2〇-X2 廣陸 e-Val-X24-T 巧-Leu-X27-X28-枯 9-X3〇[I]
[0009] 其中
[0010] X2 為 Ser 或 Aib;
[0011] Xi 日為 Tyr、Leu、Ile 或化 1;
[0012] Xi2 為 Lys 或 Arg;
[0013] Xi 日為 Asp 或 Glu;
[0014] Xi6 為 56'、41日、1^611、1'虹、4化、116、化1或1^73;
[0015] X2 日為 Gln、Glu、Aib 或 Lys;
[0016] X21 為 Asp、Glu 或 Lys;
[0017] X24 為 6111、41日、6111、4化或1^73;
[001 引 X27 為 161、1^611或化1;
[0019] X28 為 Asn'Ser、!'虹、61]1、41日、617、6111或1^73;
[0020] X29 為 Τ'虹、617、56'、6111、41日、6111或1^73;且
[0021] X3Q不存在或為Lys;
[00剖并且其中所述衍生物包含與在式1的位置《12^16心2日^21心24^28心2減乂3日處的賴 氨酸的側(cè)鏈的氮原子共價連接的取代基，其中所述取代基具有式II:
[002；3] Y 廣 Y2-Y3-Y4-Y 己-Y6-Y7-Y8-Y9-Y10-Y1廣 Yi廣山]
[0024]其中Yi為氨或表示C2-6酷基基團(tuán)或班巧酷基部分，并且
[002引其中Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、村、Yl()、Yl域Yl2單獨地不存在或單獨地表示選自Ser殘 基、Ala殘基、Gly殘基、式i、式ii、式iii、式iv和式V的氨基酸殘基：
[0026]
[0027] 其中式i、i i、i i i和iv單獨地具有立體化學(xué)L或D，
[0028] 并且條件是所述取代基具有Ξ至十個帶負(fù)電荷的部分。
[0029] 在一個實施方案中，本發(fā)明設(shè)及一種膜高血糖素類似物形式的中間產(chǎn)物，或其藥 學(xué)上可接受的鹽、酷胺或醋，該中間產(chǎn)物與膜高血糖素 (SEQ ID Ν0:1)相比包含W下修飾：
[0030] (i) [ Impl，Aib2，His3，Leul6，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0031] (ii) [Impl，Aib2，His3，Glul5，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0032] (iii)[ Impl, Aib2，His3，LeulO，Glul5，Lys24, Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0033] (iv) [ Impl，Aib2，His3，Glul5，Ala24，Leu27，Lys28]-膜高血糖素；
[0034] (V) [ Impl，His3，Glul5，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0035] (vi)[Impl，His3，Glul5，Glu21，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0036] (vii)[Impl，Aib2，His3，Glul5，Glu21，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0037] (viii) [ Impl，His3，Leul6，Glu21，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0038] (ix) [ Impl，His3，Leul6，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0039] (X) [ Impl，Aib2，His3，化116，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0040] (xi)[Impl，His3，Glul5，Lysl6，Glu21，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0041 ] (xii) [Impl，His3，Glul5，Lys20，Glu21，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0042] (xiii) [Impl，His3，Glul5，Lys21，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0043] (xiv)[Impl，His3，Glul5，Glu21，Leu27，Lys28]-膜高血糖素；
[0044] (XV) [ Impl，His3，Glul5，Glu21，Leu27，Ser28，Lys29]-膜高血糖素；
[0045] (xvi)[Impl，His3，Glul5，Glu21，Leu27，Ser28，Lys30]-膜高血糖素。
[0046] 在一個實施方案中，本發(fā)明設(shè)及一種包含本發(fā)明的衍生物W及一種或多種藥學(xué)上 可接受的賦形劑的組合物。
[0047] 在一個實施方案中，本發(fā)明設(shè)及如本發(fā)明所定義的衍生物，其用于在醫(yī)學(xué)中使用。
【具體實施方式】
[0048] 在一個實施方案中，本發(fā)明設(shè)及膜高血糖素類似物的新型快速作用衍生物，即可 在例如低血糖的治療中使用的膜高血糖素類似物的衍生物，其中需要在施用后生物作用快 速起效。
[0049] 本發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的衍生物在溶液中具有改善的化學(xué)和物理穩(wěn)定性， 同時保持對人膜高血糖素受體的良好效力和升血糖效應(yīng)的迅速起效。因此，本發(fā)明的衍生 物能夠獲得一種液體組合物，其具有包含所述衍生物的所述液體組合物的長期儲存穩(wěn)定 性。
[0050] 所述衍生物包含在位置1的氨基酸置換咪挫并丙酷基(Imp)和在位置3的氨基酸置 換組氨酸。所述衍生物進(jìn)一步包含具有3-10個帶負(fù)電荷的部分的取代基，其中所述取代基 與氨基酸的側(cè)鏈如賴氨酸側(cè)鏈的氮原子共價連接。
[0051] 在一個實施方案中，本發(fā)明設(shè)及一種膜高血糖素類似物的衍生物，或所述衍生物 的藥學(xué)上可接受的鹽、酷胺或醋，所述衍生物包含式I:
[0052] Imp_X2_His_Gly_Thr_Phe_Thr_Ser_Asp_Xio_Ser_Xi2_Tyr_Leu_Xi5_Xi6_Ar 邑 _Ar 邑一 Ala-X2〇-X2 廣陸 e-Val-X24-T 巧-Leu-X27-X28-X29-X3〇[I]
[0化3] 其中 [0化4] X2 為 Ser 或 Aib;
[0化5] Xi 日為 Tyr、Leu、Ile 或化 1;
[0化6] Xi2 為 Lys 或 Arg;
[0化7] Xi 日為 Asp 或 Glu;
[0化引 Xi6 為 56'、41日、1^611、1'虹、4化、116、化1或1^73;
[0化9] X2 日為 Gln、Glu、Aib 或 Lys;
[0060] X21 為 Asp、Glu 或 Lys;
[0061] X24 為 6111、41日、6111、4化或1^73;
[0062] X27 為 161、1^611或化1;
[0063] X28 為 Asn'Ser、!'虹、Gln、Ala、Gly、Glu 或 Lys;
[0064] X29 為 Τ'虹、617、56'、6111、41日、6111或1^73;且 [00化]Χ3日不存在或為Lys;
[0066] 并且其中所述衍生物包含與在式1的位置乂12^16心2日^21心24^28心2減乂3日處的賴 氨酸的側(cè)鏈的氮原子共價連接的取代基，
[0067] 其中所述取代基具有式II:
[006引 Y 廣 Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Y7-Y8-Y9-Y10-Y1廣 Yi廣[I。
[0069] 其中Yi為氨或表示C2-6酷基基團(tuán)或班巧酷基部分，并且
[0070] 其中Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、村、Yl()、Yl域Yl2單獨地不存在或單獨地表示選自Ser殘 基、Ala殘基、Gly殘基、式i、式ii、式iii、式iv和式V的氨基酸殘基：
[0071]
[0072] 其中式和iv單獨地具有立體化學(xué)L或D，
[0073] 并且條件是所述取代基具有Ξ至十個帶負(fù)電荷的部分。
[0074] 在一個實施方案中，當(dāng)本文在化學(xué)結(jié)構(gòu)的圖中使用符號(或者可替代的波浪 線)時，其表示與該衍生物中相鄰位置的連接點。
[0075] 膜高血糖素膚和類似物
[0076] 如本文使用的術(shù)語"膜高血糖素膚"是指人膜高血糖素(其序列作為SEQ ID NO: 1 包括在序列表中），或其類似物(例如式I的膜高血糖素類似物）。具有SEQ ID NO: 1的序列的 膚在本文中還可被稱為"膜高血糖素"。在一個實施方案中，如本文使用的術(shù)語"膜高血糖 素"是指 His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Ar 邑- Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-T;rp-Leu-Met-Asn-T虹（SEQ ID N0:1)。
[0077] 本發(fā)明的衍生物包括膜高血糖素類似物。如本文使用的術(shù)語"膜高血糖素類似物" 是指作為膜高血糖素 (SEQ ID NO: 1)的變體的膚或化合物。在一個實施方案中，該膜高血糖 素類似物包含式I:
[0078] Imp-X2-His-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser_Asp-Xi〇-Ser-Xi2-Tyr-Leu-Xi5-Xi6-Ar 邑一Ar 邑一 Ala-X2〇-X2 廣陸 e-Val-X24-T 巧-Leu-X27-X28-枯 9-X3〇[I]
[0079] 其中
[0080] X2 為 Ser 或 Aib;
[0081 ] Xi 日為 Tyr、Leu、Ile 或化 1;
[0082] Xi2 為 Lys 或 Arg;
[0083] Xi 日為 Asp 或 Glu;
[0084] Xi6 為 56'、41日、1^611、1'虹、4化、116、化1或1^73;
[0085] X2 日為 Gln、Glu、Aib 或 Lys;
[0086] X21 為 Asp、Glu 或 Lys;
[0087] X24 為 6111、41日、6111、4化或1^73;
[008 引 X27 為 161、1^611或化1;
[0089] X28 為 Asn'Ser、!'虹、Gln、Ala、Gly、Glu 或 Lys;
[0090] X29 為 Τ'虹、617、56'、6111、41日、6111或1^73;且
[0091] Χ3日不存在或為Lys。
[0092] 可參考W下各項來描述本發(fā)明的衍生物的膜高血糖素類似物：i)人膜高血糖素 (SEQ ID NO: 1)中對應(yīng)于被修飾的氨基酸殘基（即在膜高血糖素 (SEQ ID NO: 1)中的相應(yīng)位 置)的氨基酸殘基的數(shù)目，W及ii)實際的修飾。W下是合適的類似物命名的非限制性實例。
[0093] 換言之，所述膜高血糖素類似物是與人膜高血糖素 (SEQ ID NO: 1)相比具有多個 氨基酸殘基修飾的膜高血糖素膚。運(yùn)些修飾可w獨立地代表一個或多個氨基酸置換、添加 和/或缺失。例如，? Imp 1，Hi S3，Glul 5，Ly s24，Leu27，Ser 28 ]-膜高血糖素"表示運(yùn)樣的膜高 血糖素 (SEQ ID NO: 1)，其中在位置1的氨基酸已被置換為Imp,在位置3的氨基酸已被置換 為化S，在位置15的氨基酸已被置換為Glu，在位置24的氨基酸已被置換為Lys，在位置27的 氨基酸已被置換為Leu,并且在位置28的氨基酸已被置換為Ser。
[0094]與SEQ ID NO: 1相比，"包含"某些指定變化的類似物可W包含進(jìn)一步的變化。在特 定的實施方案中，該類似物"具有"指定的變化。
[00M]從W上的實例中可W明顯看出，氨基酸殘基可用其全名、其單字母密碼和/或其Ξ 字母密碼來表示。運(yùn)Ξ種方式是完全等同的。在一個實施方案中，根據(jù)IUPAC-IUB命名法使 用標(biāo)準(zhǔn)的單字母或Ξ字母密碼來描繪膚類似物及其衍生物。
[0096] 可使用表述"位置"或"相應(yīng)位置"來表征膜高血糖素類似物序列相對于膜高血糖 素 (SEQ ID N0:1)的變化的位點。例如，通過簡單的書寫和目測容易推斷出變化的位置W及 變化的數(shù)目。
[0097] 例如在本發(fā)明衍生物的膜高血糖素類似物的上下文中使用的術(shù)語1太"是指包含 通過酷胺(或膚)鍵互相連接的一系列氨基酸的化合物。本發(fā)明的膚包含至少五個通過膚鍵 連接的組成氨基酸。在特定的實施方案中，所述膚a)包含i)29個或ii)30個氨基酸，或者b) 由i)29個或ii)30個氨基酸組成。在進(jìn)一步的特定實施方案中，所述膚由通過膚鍵互相連接 的氨基酸組成。
[0098] 氨基酸是含有氨基基團(tuán)和簇酸基團(tuán)W及任選的一個或多個通常被稱為側(cè)鏈的附 力睡團(tuán)的分子。如本文使用的術(shù)語"氨基酸"包括編碼的氨基酸(其中有20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸似 及非編碼的氨基酸。編碼的氨基酸是由遺傳密碼編碼的那些氨基酸（IUPAC表1 3AA-1部分， http: //www. chem. qmul. ac.址/iupac/AminoAcid/AAln2. html#AAl)。非編碼的氨基酸是在 天然的膚和/或蛋白質(zhì)中未發(fā)現(xiàn)的，或者不是由標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞機(jī)器產(chǎn)生的（例如，它們可能已 經(jīng)經(jīng)歷翻譯后修飾）。非編碼的氨基酸的非限制性實例是Aib(a-氨基異下酸）、脫氨基組氨 酸（別名為咪挫并丙酸，縮寫為Imp) W及編碼的氨基酸的D-異構(gòu)體。在此，Imp被稱為氨基 酸，雖然它不含有氨基基團(tuán)。
[0099] 在下文中，沒有規(guī)定光學(xué)異構(gòu)體的膜高血糖素膚的所有氨基酸應(yīng)理解為意指心異 構(gòu)體(除非另有說明）。
[0100] 該膜高血糖素膚可W是運(yùn)樣的膜高血糖素類似物(SEQ ID NO: 1):與膜高血糖素 相比，其具有總計最多15個氨基酸差異(在本文中也被稱為修飾），例如一個或多個添加 、一 個或多個缺失和/或一個或多個置換。
[0101] 在一個實施方案中，該膜高血糖素類似物由式I組成。在一個實施方案中，X2為 Ser。在一個實施方案中，Χ?ο為Tyr。在一個實施方案中，Xi2為Lys。在一個實施方案中，Xi5為 Asp。在一個實施方案中，Xi6為Ser。在一個實施方案中，X20為Gin。在一個實施方案中，X21為 Asp。在一個實施方案中，X24為Gin。在一個實施方案中，X27為Met。在一個實施方案中，X28為 Asn。在一個實施方案中，X29為化r。在一個實施方案中，X30不存在。在一個實施方案中，)(2為 Aib。在一個實施方案中，Χ?ο為Leu。在一個實施方案中，Xi5為Glu。在一個實施方案中，Xi6為 Leu。在一個實施方案中，Xi6為Val。在一個實施方案中，X20為Lys。在一個實施方案中，X21為 Glu。在一個實施方案中，X24為Lys。在一個實施方案中，X24為Ala。在一個實施方案中，X27為 Leu。在一個實施方案中，X28為Ser。在一個實施方案中，X28為Lys。在一個實施方案中，X29為 Lys。在一個實施方案中，該膜高血糖素類似物不包含C-末端酷胺。在一個實施方案中，該膜 高血糖素類似物或衍生物不包含添加至X30的C-末端的氨基酸殘基。
[0102] 在一個實施方案中，該膜高血糖素類似物與膜高血糖素 (SEQ ID NO: 1)相比在所 述膜高血糖素類似物中包含3-15個氨基酸殘基修飾，如置換或添加。在一個實施方案中，該 膜高血糖素類似物與膜高血糖素 (SEQ ID NO: 1)相比包含3-15個氨基酸殘基修飾，如置換 或添加。在一個實施方案中，該衍生物與膜高血糖素 (SEQ ID NO: 1)相比在所述膜高血糖素 類似物中包含最多14個如最多13個或最多12個氨基酸殘基修飾，如置換或添加。在一個實 施方案中，該膜高血糖素類似物與膜高血糖素 (SEQ ID NO: 1)相比在所述膜高血糖素類似 物中包含最多11個如最多10個或最多9個氨基酸殘基修飾，如置換或添加。在一個實施方案 中，該膜高血糖素類似物與膜高血糖素 (SEQ ID NO: 1)相比在所述膜高血糖素類似物中包 含最多8個如最多7個或最多6個氨基酸殘基修飾，如置換或添加。
[0103] 膜高血糖素衍生物
[0104] 本發(fā)明設(shè)及膜高血糖素類似物的衍生物。如本文在膜高血糖素膚的上下文如膜高 血糖素類似物中使用的術(shù)語"衍生物"，意指化學(xué)修飾的膜高血糖素膚，其中一個或多個取 代基已與該膜高血糖素膚共價連接。如本文使用的術(shù)語"取代基"意指替代氨原子的化學(xué)部 分或基團(tuán)。該衍生物可包含一個或多個選自酷胺、碳水化合物、烷基基團(tuán)、酷基基團(tuán)、醋等的 修飾。
[010引在一個實施方案中，所述衍生物包含與在式1的位置乂12^16心2日^21心24^28心29或 X30處的賴氨酸的側(cè)鏈的氮原子共價連接的取代基。在一個實施方案中，該取代基具有式II:
[0106] Y 廣 Y2-Y3-Y4-Y 已-Y6-Y 廣 Y8-Y9-Y10-Y1廣 Yi廣[Π ]
[0107] 其中Yl為氨或表示C2-6酷基基團(tuán)或班巧酷基部分，并且其中Y2、Y3、Y4、Ys、Y6、Y7、Y8、 Υ9、Υιο、Υιι或Y12單獨地不存在或單獨地表示選自Ser殘基、Ala殘基、Gly殘基、式i、式ii、式 iii、式iv和式V的氨基酸殘基：
[010 引
[0109] 其中式i、i i、i i i和i V單獨地具有立體化學(xué)L或D。
[0110] 在一個實施方案中，Υ?2與在所述衍生物的位置乂12^16心2日^21心24^28心29或乂30處 的賴氨酸的側(cè)鏈的氮原子連接。在一個實施方案中，所述取代基與賴氨酸的側(cè)鏈的ε-氮原 子共價連接。在一個實施方案中，所述取代基與在位置Χ?2、Χ?6或枯0處的賴氨酸連接。在一個 實施方案中，所述取代基與在位置Χ21、枯4或Χ28處的賴氨酸連接。在一個實施方案中，所述取 代基與在位置Χ29或Χ30處的賴氨酸連接。在一個實施方案中，所述取代基與在位置枯4處的賴 氨酸連接。所述取代基可經(jīng)由Υ?2與賴氨酸的側(cè)鏈的ε-氮原子共價連接。所述取代基可經(jīng)由 Υ?2與在位置Χ?2、Χ?6或Χ20處的賴氨酸連接。所述取代基可經(jīng)由Υ?2與在位置Χ21、Χ24或Χ28處的 賴氨酸連接。所述取代基可經(jīng)由Υ?2與在位置拉9或X30處的賴氨酸連接。所述取代基可經(jīng)由Υ?2 與在位置拉4處的賴氨酸連接。
[0111] 在一個實施方案中，Yi為氨或表示C2-6酷基基團(tuán)或班巧酷基部分。如本文使用的術(shù) 語乂2-6酷基基團(tuán)"是指具有二至六個碳原子的支鏈或無支鏈的酷基基團(tuán)，諸如：
敦在一個實施方案中，Yi為乙酷基基團(tuán)。如本文使用的術(shù)語"班巧酷基"是指W下
[0112]
〇
部分：
[0113] 在一個實施方案中，Yi為班巧酷基部分。在一個實施方案中，Yi為氨。 0
[0114] 在一個實施方案中，￥2、￥3心、￥5、￥6、￥7、￥8、￥9、￥1〇、￥11和￥12(如果存在)經(jīng)由酷胺鍵 連接。在一個實施方案中，Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Yl0、Yll或Yl2不存在。在一個實施方案中， Y2、Y3、Y4、Y日、Y6、Y7、Y8、Y9、Yl0、Yll或Yl2為Ser殘基。在一個實施方案中，Y2、Y3、Y4、Y日、Y6、Y7、Y8、 Υ9、Υιο、Υιι 或 Υ?2 為 Ala 殘基。在一個實施方案中，￥2、￥3^4、￥日^6、￥7、￥8、￥9^1日、￥11或￥12為617 殘基。在一個實施方案中，￥2、￥3、￥4、￥5、￥6、￥7、￥8、￥9、￥10八11或￥12為式1。在一個實施方案中， ￥2、￥3^4、￥5^6、￥7^8、￥9^10、￥11或￥12為式11。在一個實施方案中瓜、￥3^4、￥5^6、￥7^8、￥9、 Υιο、Υιι或Υ?2為式iii。在一個實施方案中，￥2、￥3^4、￥日^6、￥7^8、￥9^1日、￥11或￥12為式1￥。在一 個實施方案中，Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Yl()、Yl減Yl2為式V。在一個實施方案中，所述取代基 包含3-10個如3-5個或4個式i的殘基。
[0115] 在一個實施方案中，所述取代基具有Ξ至十個帶負(fù)電荷的部分。在一個實施方案 中，所述取代基具有3、4、5、6、7、8、9或10個帶負(fù)電荷的部分。在一個實施方案中，所述取代 基具有Ξ至十個帶負(fù)電荷的部分。在一個實施方案中，所述取代基具有3-10個如3-7或3-5 個帶負(fù)電荷的部分。如本文使用的術(shù)語"帶負(fù)電荷的部分"意指可帶負(fù)電荷的化學(xué)部分，諸 如但不限于氨基酸部分(例如Glu、丫-Glu、Asp或β-Asp、簇酸、橫酸或四挫部分）。在一個實 施方案中，在生理抑(pH 7.4)下測定"帶負(fù)電荷的部分"的數(shù)目。在一個實施方案中，"帶負(fù) 電荷的部分"為簇酸基團(tuán)。
[0116] 在一個實施方案中，所述取代基為W下部分：
[0117]
[0118] 在一個實施方案中，所述取代基為W下部分：
[0124] 在一個實施方案中，所述衍生物為妒24-[ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4- 乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷 基]-[Impl，Aib2，His3，Leul6，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素
[0125] 化學(xué)式1:
[0126]
[0127]在一個實施方案中，所述衍生物為妒24-[ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4- 乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷 基]-[1111口1，4比2，化33,611115，1^7324，1^61127,56^8]-膜高血糖素 [012引化學(xué)式2:
[0129] ?
[0130] 在一個實施方案中，所述衍生物為Νε24-[ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4- 乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷 基]-[1111口1，4比2，化33，1^61110,611115，1^7324，1^61127,56^8]-膜高血糖素
[0131] 化學(xué)式3:
[0132]
[0133] 在一個實施方案中，所述衍生物為妒28-[ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4- 乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷 基]-[1111口1，4比2，化33,611115,41日24，1^61127，1^7328]-膜高血糖素
[0134] 化學(xué)式4:
[0135]
[0136] 在一個實施方案中，所述衍生物為Νε24-[ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4- 乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷 基]-[111191，化33,611115，1^7324，1^61127,56^8]-膜高血糖素
[0137] 化學(xué)式5:
[013 引
[0139] 在一個實施方案中，所述衍生物為Νε24-[ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4- 乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷 基]-[1111口1，化33,611115,611121，1^7324，1^61127,56^8]-膜高血糖素
[0140] 化學(xué)式6:
[0141]
[0142] 在一個實施方案中，所述衍生物為Νε24-[ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4- 乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷 基]-[1111口1，4比2，化33,611115,611121，1^7324，1^61127,56^8]-膜高血糖素
[0143] 化學(xué)式7:
[0144]
[0145] 在一個實施方案中，所述衍生物為Νε24-[ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4- 乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷 基]-[Impl，His3，Leul6，Glu21，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素
[0146] 化學(xué)式8:
[0147]
[0148] 在一個實施方案中，所述衍生物為Νε24-[ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4- 乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷 基]-[111191，化33，1^61116，1^7324，1^61127,56^8]-膜高血糖素
[0149] 化學(xué)式9:
[0150]
[0151 ]在一個實施方案中，所述衍生物為Νε24-[ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4- 乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷 基]-[Impl，Aib2，His3，化116，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素
[0152] 化學(xué)式10;
[0153]
[0154] 在一個實施方案中，所述衍生物為Νε16-[ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4- 乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷 基]-[111191，化33,611115，1^7316,611121，1^61127,56^8]-膜高血糖素
[0155] 化學(xué)式11:
[0156]
[0157] 在一個實施方案中，所述衍生物為妒2〇-[ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4- 乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷 基]-[111191，化33,611115，1^7320,611121，1^61127,56^8]-膜高血糖素
[015引化學(xué)式12:
[0159]
[0160] 在一個實施方案中，所述衍生物為Νε21-[ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4- 乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷 基]-[111191，化33,611115，1^7321，1^61127,56^8]-膜高血糖素
[0161] 化學(xué)式13:
[0162]
[0163] 在一個實施方案中，所述衍生物為Νε28-[ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4- 乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷 基]-[111191，化33,611115,611121，1^61127，1^7328]-膜高血糖素
[0164] 化學(xué)式14:
[01 化]
[0166] 在一個實施方案中，所述衍生物為妒29-[ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4- 乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷 基]-[1111口1，化33,611115,611121，1^61127,56的8，1^7329]-膜高血糖素
[0167] 化學(xué)式15:
[016 引
ο
[0169] 在一個實施方案中，所述衍生物為 Nα([Impl，His3，Glul5，Glu21，Leu27，Ser28]- 膜高血糖素基)-Ne[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨 基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]Lys
[0170] 化學(xué)式16:
[0171]
[0172] 在一個實施方案中，所述衍生物為N"4-[2-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4- [[(4S)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]乙酷基]-[111191，化33,611115,611121，1^7324，1^61127,56^8]-膜高血糖素
[0173] 化學(xué)式17:
[0174]
〇
[0175] 在一個實施方案中，所述衍生物為NeM-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酷氨基- 4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[Impl，His3，Glul5，Glu21, Lys24，Leu27，Ser2引-膜高血糖素
[0176] 化學(xué)式18:
[0177]
[017引在一個實施方案中，所述衍生物為Νε24-[ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4- [[(4S)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[111191，化33,611115,611121，1^7324，1^61127,56的8]-膜高 血糖素
[0179] 化學(xué)式19:
[0180]
[0181 ]在一個實施方案中，所述衍生物為Νε24-[ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4- 乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷 基]-[Impl，His3，Alal6，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素
[0182] 化學(xué)式20:
[0183]
[0184] 在一個實施方案中，所述衍生物為Νε24-[ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4- 乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷 基]-[Impl，His3，Aibl6，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素
[0185] 化學(xué)式21:
[0186]
[0187]在一個實施方案中，所述衍生物為Νε24-[ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4- 乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷 基]-[1111口1，化33,611115,611121，1^7324，1^61127,611128]-膜高血糖素 [018引化學(xué)式22:
[0189]
[0190] 藥學(xué)上可接受的鹽、酷胺、醋或簇酸
[0191] 本發(fā)明的衍生物、類似物和中間產(chǎn)物可W是藥學(xué)上可接受的鹽、酷胺、簇酸或醋的 形式。例如通過堿與酸之間的化學(xué)反應(yīng)形成鹽，例如：2畑3+也S04^(N也)2S〇4。該鹽可W是堿 式鹽、酸式鹽，或者它可W兩者都不是（即為中性鹽）。堿式鹽在水中產(chǎn)生氨氧根離子，而酸 式鹽在水中產(chǎn)生水合氨離子。在一個實施方案中，所述衍生物為所述衍生物的藥學(xué)上可接 受的鹽、酷胺或醋。
[0192] 本發(fā)明衍生物的鹽可通過分別在陰離子或陽離子基團(tuán)之間添加陽離子或陰離子 來形成。運(yùn)些基團(tuán)可位于膜高血糖素類似物部分，和/或位于本發(fā)明衍生物的取代基中。
[0193] 本發(fā)明衍生物的陰離子基團(tuán)的非限制性實例包括在取代基（如果有的話）中W及 在膜高血糖素類似物部分中的游離簇酸基團(tuán)。膜高血糖素類似物部分通常在C-末端處包含 游離簇酸基團(tuán)，并且它還可W在內(nèi)部酸性氨基酸殘基如Asp和Glu處包含游離簇酸基團(tuán)。
[0194] 膜高血糖素類似物部分中的陽離子基團(tuán)的非限制性實例包括內(nèi)部堿性氨基酸殘 基如化s、A巧和Lys的任何游離氨基基團(tuán)。
[01M]本發(fā)明衍生物的醋例如可通過游離簇酸基團(tuán)與醇或苯酪的反應(yīng)來形成，該反應(yīng)導(dǎo) 致至少一個徑基基團(tuán)被烷氧基或芳氧基基團(tuán)所替代。
[0196] 所述醋的形成可設(shè)及在膜高血糖素類似物的C-末端處的游離簇酸基團(tuán)，和/或在 取代基中的任何游離簇酸基團(tuán)。
[0197] 本發(fā)明衍生物的酷胺例如可通過游離簇酸基團(tuán)與胺或取代的胺的反應(yīng)或通過游 離或取代的氨基基團(tuán)與簇酸的反應(yīng)來形成。
[0198] 所述酷胺的形成可設(shè)及在膜高血糖素類似物的C-末端處的游離簇酸基團(tuán)，在取代 基中的任何游離簇酸基團(tuán)，在膜高血糖素類似物的N-末端處的游離氨基基團(tuán)，和/或膜高血 糖素類似物和/或取代基的任何游離或取代的氨基基團(tuán)。在一個實施方案中，所述衍生物不 包含膜高血糖素類似物的C-末端酷胺。
[0199] 在一個實施方案中，除非另有說明，本發(fā)明的衍生物包含C-末端簇酸基團(tuán)。在一個 實施方案中，本發(fā)明設(shè)及該衍生物的藥學(xué)上可接受的鹽、酷胺或醋。術(shù)語"藥學(xué)上可接受的 鹽"意在表示對患者無害的鹽。在一個實施方案中，該衍生物為藥學(xué)上可接受的鹽的形式。 在一個實施方案中，該衍生物的簇酸是在膜高血糖素類似物的C-末端處包含酷胺基團(tuán)的衍 生物，即膜高血糖素類似物。在另一個特定的實施方案中，該衍生物為藥學(xué)上可接受的酷胺 的形式，優(yōu)選在膜高血糖素類似物的C-末端處具有酷胺基團(tuán)。在進(jìn)一步特定的實施方案中， 該膜高血糖素類似物或衍生物為藥學(xué)上可接受的醋的形式。
[0200] 膜高血糖素膚的衍生物的制備
[0201] 本發(fā)明的衍生物可通過W下描述的方法制備。
[020。SPPS通用方法
[0203]將要使用的Fmoc保護(hù)的氨基酸衍生物可W是W下推薦的標(biāo)準(zhǔn)品：由例如Anaspec、 Bachem、Iris Biotech或NovabioQiem提供的Fmoc-Ala-〇HJmoc-Arg^bf)-0山化〇。-八311 (T;rt)-OH、Fmoc-Asp(0tBu)-OH、Fmoc-Cys(T;rt)-OH、Fmoc-Gln(T;rt)-OH、Fmoc-Glu(0tBu)- (^、尸111〇(3-617-(^、化〇(3-化3(時1:)-(^^111〇(3-116-(^、化〇(3-1^611-(^、化〇(3-1^73(130〇-(^、 Fmoc-Met-〇H、Fmoc-Phe-〇H、Fmoc-P;r〇-〇H、Fmoc-Se;r(tBu Τ'巧（BOC) -OH、Fmo c-Tyr (tBu) -OH、Fmo c-Va 1 -OH 和 Fmoc-Ly s (Mt t) -OH。使用 3- (N-1苯甲 基-咪挫-4-基)-丙酸來引入Imp。
[0204]可使用基于Fmoc 的化學(xué)法在來自 Protein Technologies(Tucson, AZ85714U.S.A.)的Prelude固相膚合成儀(陸ase Peptide Synthesizer)上進(jìn)行SPPS。用于 制備C-末端簇酸的合適的樹脂是預(yù)加載有氨基酸的Wang樹脂，諸如Fmoc-T虹(tBu) -Wang樹 月旨(低負(fù)載，〇.35mmol/g)。在取代基與C-末端賴氨酸連接的情況下，合適的樹脂為預(yù)加載的 fmoc-Lys(Mtt)-Wang。用于制備C-末端膚酷胺的合適的樹脂為H-Rink Amide-化emMatrix 樹脂（加載例如0.52nmol/g)或Rink Amide AM聚苯乙締樹脂（Novabiochem，加載例如 0.62mmo 1 /g)等。采用在NMP中的20 %贓晚來實現(xiàn)化OC脫保護(hù)。在沒有預(yù)激活的情況下通過 使用DIC/HOAt/S甲基化晚（collidine)或DIC/Oxyma Pure/S甲基化晚進(jìn)行膚偶聯(lián)。將氨 基酸/冊At或氨基酸/Oxyma化re溶液(在3-10倍摩爾過量下在NMP中0.3M/0.3M)添加至樹 脂中，然后添加相同摩爾當(dāng)量的DIC(在NMP中3M)，接著添加 Ξ甲基化晚(在NMP中3M)。例如， 對于W下規(guī)模的反應(yīng)，每一偶聯(lián)可W使用W下量的0.3M氨基酸/HOAt溶液：規(guī)模/mL， 0.05mmol/l. 5mL、0. lOmmol/3.0mL、0.25mmol/7.5mL?？赏ㄟ^用HFIP/DCM(75: 25)洗涂樹脂 (2x 2min)，用DCM洗涂并將樹脂懸浮于HFIP/DCM(75:25)中（2x 20min)，并隨后用贓晚/NMP (20:80)、DCM( lx)、NMP( lx)、DCM( lx)、NMP( lx)依次洗涂來去除Mtt基團(tuán)。
[02化]取代基的連接
[0206] 可通過如上所述的Prelude膚合成儀，使用適當(dāng)保護(hù)的結(jié)構(gòu)單元在逐步程序中引 入取代基，其中伴隨氨基酸和簇酸衍生物的修飾，包括化oc-Ado-OHJmoc-Glu-OtBu和乙 酸、丙酸、異下酸、下酸、戊酸、己酸或4-甲基戊酸。在每個偶聯(lián)步驟之后，可使用過量的乙酸 酢和Ξ甲基化晚(〉10個當(dāng)量)對未反應(yīng)的膚中間體加帽。
[0207] 使用受Ml:t保護(hù)的賴氨酸巧moc-Lys(Mtt)-OH)實現(xiàn)在賴氨酸的ε-氮上引入取代 基?；蛘撸捎茫篬￥0(16基團(tuán)保護(hù)賴氨酸的6-氮巧1]10(3-1^73。￥〇(16)-(^)?？赏ㄟ^與氨基酸。1]10(3- Glu-0巧u偶聯(lián)實現(xiàn)在取代基中并入丫 -Glu部分。
[0208] 可使用延長的偶聯(lián)時間（lx 6小時）接著用乙酸酢或可替代的乙酸/DIC/HOAt/S 甲基化晚加帽來實現(xiàn)每個部分在取代基中的引入。在NMP中使用乙酸?。?0個當(dāng)量)和Ξ甲 基化晚(20個當(dāng)量)實現(xiàn)取代基上末端氮的乙酷化。
[0209] 從樹脂上切割
[0210] 在合成之后用DCM洗涂樹脂，并且通過用TFA/TIS/水(95/2.5/2.5)處理2-3小時接 著用二乙酸沉淀，將膚從樹脂上切割下來。用二乙酸洗涂沉淀物。 腳。純化和定量
[0212] 將粗膚溶解于水和MeCN的適當(dāng)混合物如水/MeCN(4:1)中，并在含有C18-硅膠的柱 上通過反相制備型冊LC( Waters Del taprep 4000或Gil son)進(jìn)行純化。采用逐漸增加的 MeCN在含有0.1 % TFA的水中的梯度進(jìn)行洗脫。通過分析型HPLC或UPLC檢查相關(guān)級分。將含 有純的祀膚的級分混合并減壓濃縮。分析化PLC，LCMS)所得溶液，并使用化學(xué)發(fā)光氮特異性 HPLC檢測器(Antek 8060HPLC-化ND)或通過測量280nm處的UV吸收對產(chǎn)物（即衍生物)進(jìn)行 定量。將產(chǎn)物分配至玻璃小瓶中。給小瓶蓋上Millipore玻璃纖維預(yù)濾器。冷凍干燥得到呈 白色固體的膚Ξ氣乙酸鹽。
[0213] 中間產(chǎn)物
[0214] 在一個實施方案中，本發(fā)明設(shè)及一種膜高血糖素類似物形式的中間產(chǎn)物，或其藥 學(xué)上可接受的鹽、酷胺或醋，該中間產(chǎn)物與膜高血糖素 (SEQ ID N0:1)相比包含W下修飾： 惦15] (i) [ Impl，Aib2，His3，Leul6，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素； 惦16] (ii)[Impl，Aib2，His3，Glul5，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素； 惦17] (iii)[ Impl, Aib2，His3，LeulO，Glul5，Lys24, Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[021 引（iv)[Impl，Aib2，His3，Glul5，Ala24，Leu27，Lys28]-膜高血糖素；
[0219] (v)[Impl，His3，Glul5，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0220] (vi)[Impl，His3，Glul5，Glu21，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0221] (vii) [Impl, Aib2，His3，Glul5，Glu21，Lys24, Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0222] (viii) [ Impl，His3，Leul6，Glu21，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0223] (ix) [ Impl，His3，Leul6，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0224] (X) [ Impl，Aib2，His3，化116，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[02 巧](xi)[Impl，His3，Glul5，Lysl6，Glu21，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[02%] (xii) [Impl，His3，Glul5，Lys20，Glu21，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0227] (xiii) [Impl，His3，Glul5，Lys21，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0228] (xiv)[Impl，His3，Glul5，Glu21，Leu27，Lys28]-膜高血糖素；
[02巧](XV) [ Impl，His3，Glul5，Glu21，Leu27，Ser28，Lys29]-膜高血糖素；
[0230] (xvi)[Impl，His3，Glul5，Glu21，Leu27，Ser28，Lys30]-膜高血糖素。在一個實施 方案中，本發(fā)明設(shè)及一種膜高血糖素類似物形式的中間產(chǎn)物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、酷胺 或醋，該中間產(chǎn)物與膜高血糖素 (SEQ ID NO: 1)相比包含W下修飾：
[0231] (xvii) [Impl, His3，Alal6, Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0232] (xviii)[Impl，His3，Aibl6，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0233] (xix)[Impl，His3，Glul5，Glu21，Lys24，Leu27，Glu28]-膜高血糖素。
[0234] 在一個實施方案中，本發(fā)明設(shè)及一種中間產(chǎn)物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、酷胺或 醋，其中膜高血糖素類似物選自W下的膜高血糖素 (SEQ ID NO: 1)類似物：
[0235] (i-a) [ Impl，Aib2，His3，Leul6，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0236] (ii-a) [ Impl，Aib2，His3，Glul5，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0237] (iii-a) [Impl，Aib2，His3，LeulO，Glul5，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[023引（iv-a) [ Impl，Aib2，His3，Glul5，Ala24，Leu27，Lys28]-膜高血糖素；
[0239] (v-a) [ Impl，His3，Glul5，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0240] (vi-a)[Impl，His3，Glul5，Glu21，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0241] (vii-a) [Impl, Aib2，His3，Glul5，Glu21，Lys24, Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0242] (viii-a)[Impl，His3，Leul6，Glu21，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0243] (ix-a) [ Impl，His3，Leul6，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0244] (x-a) [ Impl，Aib2，His3，化116，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0245] (xi-a)[Impl，His3，Glul5，Lysl6，Glu21，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0246] (xii-a) [ Impl，His3，Glul5，Lys20，Glu21，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0247] (xiii-a)[Impl，His3，Glul5，Lys21，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0248] (xiv-a)[Impl，His3，Glul5，Glu21，Leu27，Lys28]-膜高血糖素；
[0249] (xv-a) [ Impl，His3，Glul5，Glu21，Leu27，Ser28，Lys29]-膜高血糖素；
[02 加](xvi-a)[Impl，His3，Glul5，Glu21，Leu27，Ser28]-膜高血糖素。在一個實施方案 中，本發(fā)明設(shè)及一種中間產(chǎn)物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、酷胺或醋，其中膜高血糖素類似物 選自W下的膜高血糖素 (SEQ ID N0:1)類似物：
[0巧 1 ] (xvii-a) [ Impl，His3，Alal6，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0巧2] (xviii-a) [ Impl，His3，Aibl6，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0 巧 3] (xix-a)[Impl，His3，Glul5，Glu21，Lys24，Leu27，Glu28]-膜高血糖素。
[0254] 可通過W下的逐步合成法來制備本發(fā)明的膜高血糖素衍生物，該方法包括（i)中 間膜高血糖素類似物的制備，W及隨后的（ii)取代基的連接?？墒褂檬鼙Ｗo(hù)的氨基酸，使用 如實驗部分中描述的標(biāo)準(zhǔn)固相合成來實現(xiàn)本方法的步驟(i);從樹脂上切割后，可如本文實 驗部分中所述使用制備型HPLC使膜高血糖素類似物經(jīng)歷純化，W得到中間產(chǎn)物。或者，可使 用如W02009/083549中所述的半重組合成來進(jìn)行本方法的步驟(i)，即中間產(chǎn)物的制備?？?使用W02009/083549中描述的方法來實現(xiàn)本方法的步驟(ii)，即，取代基與中間產(chǎn)物連接而 產(chǎn)生最終產(chǎn)物，W及取代基本身的制備。
[0255] 功能性質(zhì)
[0256] 在第一功能性實施方案中，本發(fā)明的衍生物是化學(xué)穩(wěn)定的。而且，或者備選地，在 第二功能性實施方案中，該衍生物是物理穩(wěn)定的。而且，或者備選地，在第Ξ功能性實施方 案中，該衍生物對膜高血糖素受體具有良好的受體結(jié)合和效力。而且，或者備選地，在第四 功能性實施方案中，該衍生物是快速作用的衍生物。而且，或者備選地，在第五功能性實施 方案中，該衍生物具有高溶解度。而且，或者備選地，在第六功能性實施方案中，該衍生物具 有其對化P-1受體的EC50與其對膜高血糖素受體的EC50之間的高比值(或等于人膜高血糖 素 (SEQ ID NO: 1)的比值）。在一個實施方案中，在功能性實施方案中的作用是相對于人膜 高血糖素 (SEQ ID NO:1)而確定的。
[0巧7]化學(xué)穩(wěn)定性
[0258] 如本文使用的術(shù)語膚組合物的"化學(xué)穩(wěn)定性"是指膚結(jié)構(gòu)中的化學(xué)共價變化，其導(dǎo) 致與天然膚(例如人膜高血糖素)結(jié)構(gòu)相比具有潛在較低的生物效力和/或潛在增強(qiáng)的免疫 原性性質(zhì)的化學(xué)降解產(chǎn)物的形成。可根據(jù)天然膚的類型和性質(zhì)W及該膚所暴露的環(huán)境而形 成各種化學(xué)降解產(chǎn)物?；瘜W(xué)降解很可能不能完全避免，并且在延長的儲存過程中經(jīng)常看到 化學(xué)降解產(chǎn)物的量增加。大多數(shù)的膚傾向于脫酷胺，即谷氨酷胺酷基或天冬酷胺酷基殘基 中的側(cè)鏈酷胺基團(tuán)水解W形成游離簇酸的過程。其他降解途徑包括高分子量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的形 成，其中兩個或更多個膚分子通過轉(zhuǎn)酷胺基作用和/或二硫鍵相互作用彼此共價結(jié)合，從而 導(dǎo)致共價結(jié)合的二聚體、寡聚體和聚合物降解產(chǎn)物的形成（Stability of Protein Pharmaceuticals,Ahern.T.J.&Manning Μ.C.,Plenum Press,New Yorkl992)。（例如甲硫 氨酸殘基的）氧化可作為化學(xué)降解的另一變型而提及。含有天冬酷胺或天冬氨酸的膚可能 傾向于經(jīng)由中間體天冬氨酷亞胺的形成而異構(gòu)化，從而產(chǎn)生相應(yīng)的異天冬氨酸異構(gòu)體，其 中可形成〇-和心異構(gòu)體兩者。天冬氨酷亞胺中間體還可W導(dǎo)致D-天冬氨酸異構(gòu)體的形成。 (Formulation Consideration for Proteins Susceptible to Asparagine Deamidation and Aspartate Isomerization,Wakankar和Borchardt,Journal ofPharmaceutical Sciences,2006，Vol.95，no. 11，p 2321)。最后，膚還可W經(jīng)歷水解裂解，其中膚片段或單個 氨基酸通過膚鍵的水解而裂解。
[0259] 可通過在暴露于不同的環(huán)境條件(通?？赏ㄟ^例如提高溫度來加速降解產(chǎn)物的形 成)之后的各個時間點測量化學(xué)降解產(chǎn)物的量來評估組合物的化學(xué)穩(wěn)定性。通常通過使用 各種色譜技術(shù)(例如SE-HPLC和/或RP-UPLC)根據(jù)分子大小和/或電荷分離降解產(chǎn)物，來確定 每個單獨的降解產(chǎn)物的量。
[0260] 因此，如上所概述的，"穩(wěn)定的組合物"是指具有增強(qiáng)的物理穩(wěn)定性、增強(qiáng)的化學(xué)穩(wěn) 定性或增強(qiáng)的物理和化學(xué)穩(wěn)定性的組合物。通常，組合物在使用和儲存過程中（按照推薦的 使用和儲存條件)必須是穩(wěn)定的，直到達(dá)到失效期。
[0261] 可通過本文描述的試驗（IV)中的化學(xué)降解的測定來測量所述衍生物的化學(xué)穩(wěn)定 性。在一個實施方案中，化學(xué)穩(wěn)定的衍生物具有小于5%如小于4%、小于3 %或小于2 %的化 學(xué)降解，其中所述化學(xué)降解可通過本文描述的試驗(IV)來測定。在一個實施方案中，所述衍 生物具有小于5%如小于4%、小于3%或小于2%的化學(xué)降解，其中所述化學(xué)降解可通過本 文描述的試驗(IV)來測定。
[026。物理穩(wěn)定性
[0263]膚可能經(jīng)歷物理狀態(tài)的各種變化。膚可能由于在某一組條件下缺乏溶解性而沉 淀，例如由于因抑的變化而引起的氨基酸側(cè)鏈上排斥電荷的中和而沉淀。另一個物理變化 是淀粉樣原纖維的形成，其包括構(gòu)象變化成富含β-折疊的大分子纖維結(jié)構(gòu)?？赏ㄟ^因聚集 引起的較少的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)重復(fù)而形成其他的大分子結(jié)構(gòu)。在后兩種情況下，最終可觀察到作 為沉淀物的膚物質(zhì)。實際上，運(yùn)些物理變化可能在一定程度上是相關(guān)的，例如溶解度相對于 pH 與原纖維形成是相關(guān)的[Schmitt schmitt 和Scholtz , Protein Science ,12,10,2374- 2378，2003]。此外，僅通過目測很難區(qū)分運(yùn)些現(xiàn)象，因此通常通過通用術(shù)語"沉淀物"來描述 運(yùn)些變化的結(jié)果。
[0264] 物理狀態(tài)的其他變化包括作為溶液中膚含量損失而觀察到的向表面上的吸附，和 液體溶液到凝膠的變化。然而，不論沉淀物的性質(zhì)或凝膠的形成如何，當(dāng)沉淀物為藥物可注 射的形式時在其儲存和使用期間，對該沉淀物的觀察是一個問題。
[0265] 膜高血糖素在中性pH下具有非常低的水溶解度，運(yùn)使藥物組合物在中性pH下失 效。即使在酸性抑下溶解時，膜高血糖素也可根據(jù)濃度和溫度而經(jīng)歷不同的相變，并且因此 是非常物理不穩(wěn)定的。在膜高血糖素樣品溶解在鹽酸中之后，可能出現(xiàn)滯后期，此時樣品的 粘度低并且溶液完全透明。若干小時之后粘度開始增加一一指示凝膠形成(Beaven等人， European J.Biochem. 11(1969)37-42)。在達(dá)到穩(wěn)定期之后，粘度可能開始再次下降，并且 同時原纖維可能出現(xiàn)并從溶液中沉淀出來。該過程是有可播性的（seedable)，添加少量預(yù) 形成的凝膠減少了滯后期。凝膠的形成和原纖維形成高度依賴于物理應(yīng)力，諸如加熱和搖 動，它們均增加該過程的速率。
[0266] 如本文使用的術(shù)語組合物的"物理穩(wěn)定性"是指由于膚和/或蛋白質(zhì)暴露于熱-機(jī) 械應(yīng)力和/或與不穩(wěn)定的界面和表面如疏水性表面和界面相互作用，使膚和/或蛋白質(zhì)形成 膚和/或蛋白質(zhì)的生物失活的和/或不可溶的聚集體的傾向。在裝在合適容器(例如筒厘或 小瓶）中的組合物在不同溫度下暴露于機(jī)械/物理應(yīng)力(例如攬拌)不同的時間段之后，借助 于目測和/或濁度測量來評估水性膚和/或蛋白質(zhì)組合物的物理穩(wěn)定性。在暗背景下采用銳 聚焦光進(jìn)行組合物的目測。通過對濁度的程度進(jìn)行排序的例如在0至3范圍上的目測得分來 表征組合物的濁度（顯示沒有濁度的組合物對應(yīng)于目測得分0,而在日光下顯示可見濁度的 組合物對應(yīng)于目測得分3)。當(dāng)組合物在日光下顯示可見濁度時，將該組合物歸類為就蛋白 質(zhì)聚集而言物理不穩(wěn)定的?；蛘?，可通過技術(shù)人員公知的簡單濁度測量來評估組合物的濁 度。水性膚和/或蛋白質(zhì)組合物的物理穩(wěn)定性還可W通過使用該膚和/或蛋白質(zhì)的構(gòu)象狀態(tài) 的光譜劑或探針來評估。該探針優(yōu)選為優(yōu)先與該膚和/或蛋白質(zhì)的非天然構(gòu)象異構(gòu)體結(jié)合 的小分子。膚和/或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的小分子光譜探針的一個實例是硫代黃素 T。硫代黃素 T是已 經(jīng)廣泛用于檢測淀粉樣原纖維的巧光染料。在原纖維W及可能的其他膚和/或蛋白質(zhì)構(gòu)型 的存在下，硫代黃素 T當(dāng)與原纖維膚和/或蛋白質(zhì)形式結(jié)合時產(chǎn)生了在約450nm處的新的最 大激發(fā)和在約48化m處的增強(qiáng)的發(fā)射。未結(jié)合的硫代黃素 T在運(yùn)些波長處基本上是非巧光 的。
[0267] 其他小分子可W用作膚和/或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)從天然到非天然狀態(tài)的變化的探針。例 如，優(yōu)先與膚和/或蛋白質(zhì)的暴露的疏水小片化ydrophobic patch)結(jié)合的"疏水小片"探 針。疏水小片通常掩埋在天然狀態(tài)的膚和/或蛋白質(zhì)的Ξ級結(jié)構(gòu)內(nèi)，但隨著膚和/或蛋白質(zhì) 開始展開或變性而變得暴露。運(yùn)些小分子、光譜探針的實例是芳香族疏水性染料，諸如蔥、 叮晚、菲咯嘟等。
[0268] 可通過本文描述的試驗（III)即ThT原纖維形成試驗中的回收率和/或滯后時間來 確定所述衍生物的物理穩(wěn)定性。在一個實施方案中，在本文描述的試驗（III)中，物理穩(wěn)定 的衍生物具有大于70%的回收率和/或大于7小時的滯后時間。
[0269] 在一個實施方案中，在化T原纖維形成試驗如本文描述的試驗（III)中，所述衍生 物具有大于70%的回收率。在一個實施方案中，在ThT原纖維形成試驗如本文描述的試驗 (III)中，所述衍生物具有大于90%如大于95%或大于98%的回收率。在一個實施方案中， 在化T原纖維形成試驗如本文描述的試驗(III)中，所述衍生物具有約100%的回收率。
[0270] 在一個實施方案中，在化Τ原纖維形成試驗如本文描述的試驗（III)中，所述衍生 物具有大于7小時如大于20小時或大于45小時的滯后時間。
[0271] 受體結(jié)合和效力
[0272] 本發(fā)明的衍生物是膜高血糖素受體激動劑?？蓪⑹荏w激動劑定義為與受體結(jié)合并 引起天然配體典型的響應(yīng)的衍生物。在一個實施方案中，如本文使用的術(shù)語"膜高血糖素受 體"意指人膜高血糖素受體。
[0273] 在一個實施方案中，本發(fā)明的衍生物是膜高血糖素受體激動劑和/或具有膜高血 糖素受體活性。在一個實施方案中，本發(fā)明的膜高血糖素類似物是膜高血糖素受體激動劑 和/或具有膜高血糖素受體活性。在一個實施方案中，所述膜高血糖素膚是膜高血糖素受體 激動劑和/或具有膜高血糖素受體活性。術(shù)語"膜高血糖素受體活性"是指與膜高血糖素受 體結(jié)合并激活細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的能力，諸如激活腺巧酸環(huán)化酶和增加細(xì)胞內(nèi)cAMP水 平，從而介導(dǎo)如本領(lǐng)域已知的生理效應(yīng)。例如，可使用本文描述的試驗（I)(b)或試驗（II) (b)測試本發(fā)明的衍生物或類似物的膜高血糖素受體活性。
[0274] 在一個實施方案中，所述衍生物是膜高血糖素受體的激動劑，其EC50不大于 20化M。在一個實施方案中，所述衍生物是膜高血糖素受體的激動劑，如通過例如本文描述 的試驗（I)(b)所測定的，其具有低于2(K)pM如低于l(K)pM或低于20pM的EC50。在另一個實施 方案中，所述衍生物是膜高血糖素受體的激動劑，如通過例如本文描述的試驗（I)(b)所測 定的，其具有低于lOpM如低于5pm的EC50。
[0275] 在一個實施方案中，所述衍生物對化P-1受體的EC50與其對膜高血糖素受體的 EC50的比值為至少50,諸如至少100、1000或5000,其中可使用本文描述的試驗（I) (a)和試 驗（I) (b)測定所述效力（即EC50)。
[0276] 在一個實施方案中，如通過本文描述的試驗（II)(b)所測定的，本發(fā)明的衍生物具 有低于1 OOnM如低于50nM、低于1 OnM或低于2nM的IC50。 腳7] 快速作用的衍生物
[0278] 在一個實施方案中，所述衍生物是快速作用的衍生物。在一個實施方案中，如本文 所用的"快速作用的衍生物"具有迅速起效的升血糖效應(yīng)。在一個實施方案中，"快速作用的 衍生物"在皮下或肌肉內(nèi)施用之后具有與膜高血糖素 (SEQ ID NO: 1)等同的升血糖效應(yīng)的 起效。
[0279] 在一個實施方案中，快速作用的衍生物在皮下或肌肉內(nèi)施用之后具有與人膜高血 糖素 (SEQ ID NO: 1)相比改善的生物利用度。
[0280] 溶解度
[0281] 本發(fā)明的衍生物可W是可溶的膜高血糖素受體激動劑。在一個實施方案中，所述 衍生物的溶解度為至少0. lmmol/1、至少0.2mmo 1/1或至少0.5mmol/l，諸如至少2mmol/l、至 少4mmol/l或至少8mmol/l，或諸如至少lOmmol/1或至少15mmol/l。在一個實施方案中，當(dāng)與 本發(fā)明的衍生物結(jié)合使用時，術(shù)語"可溶的"、"溶解度"和"水溶解度"是指所述衍生物1)在 水中，或2)在水性鹽或水性緩沖溶液例如lOmM憐酸鹽溶液中，或3)在含有其他化合物的水 溶液中的溶解度，并且其中可在6.5至8.5如7.0至8.5或7.4至8.2范圍內(nèi)的抑下測定所述溶 解度。
[0282] 在一個實施方案中，可溶的衍生物在pH在7.0-8.5如7.4-8.2范圍內(nèi)的lOmM憐酸鹽 溶液中具有至少0. lmmol/1的溶解度。
[0283] 在一個實施方案中，所述衍生物具有至少0. lmmol/1的溶解度。在一個實施方案 中，可在抑在7.4-8.2范圍內(nèi)的lOmM憐酸鹽緩沖液中，在包含所述衍生物的組合物中測定所 述衍生物的溶解度。
[0284] 藥物組合物
[0285] 在一個實施方案中，本發(fā)明設(shè)及一種包含本發(fā)明的衍生物W及一種或多種藥學(xué)上 可接受的賦形劑的藥物組合物。在一個實施方案中，該組合物適合于腸胃外施用，諸如SC、 IM或IV施用。術(shù)語"藥物組合物"和"組合物"在本文中可互換使用。
[0巧6]可通過常規(guī)技術(shù)，例如如Remington's Pharmaceutical Sciences,1985或 Remington:The Science and Practice ofPharmacy,第19版，1995中所述，來制備含有本 發(fā)明的衍生物的藥物組合物。
[0287] 在一個實施方案中，本發(fā)明設(shè)及一種包含本發(fā)明的衍生物的藥物組合物，其中所 述衍生物W約0 . Olmg/mL至約25mg/mL，諸如約0.05mg/mL至約5mg/mL和約0 . Img/mL至約 2mg/mL的濃度存在，并且其中所述組合物具有2.0至10.0的pH。該藥物組合物可包含本發(fā)明 的衍生物，其中所述衍生物W約0.0 lmg/mL至約50mg/mL的濃度存在，并且其中所述組合物 具有2.0至10.0的抑。
[0288] 在一個實施方案中，所述藥物組合物包含本發(fā)明的衍生物的水溶液和緩沖液，其 中所述衍生物W〇.〇lmg/mL或W上的濃度存在，并且其中所述組合物具有約2.0至約10.0的 pH。在另一個實施方案中，所述藥物組合物包含本發(fā)明的衍生物的水溶液和緩沖液，其中所 述衍生物W0.0 lmg/mL或W上的濃度存在，并且其中所述組合物具有約6.5至約8.5的pH。
[0289] 在一個實施方案中，本發(fā)明的組合物具有約2.0至約10.0的抑。在另一個實施方案 中，該組合物具有約6.5至約8.5的pH。在進(jìn)一步的實施方案中，該組合物具有約7.0至約8.5 如約7.2至約8.2的pH。
[0290] 所述組合物可進(jìn)一步包含緩沖系統(tǒng)、防腐劑、等滲劑、馨合劑、穩(wěn)定劑和表面活性 劑。在一個實施方案中，所述藥物組合物是水性組合物，即包含水的組合物。運(yùn)樣的組合物 通常是溶液或懸浮液。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實施方案中，所述藥物組合物是水溶液。將術(shù)語 "水性組合物"定義為包含至少50 % w/w水的組合物。同樣地，將術(shù)語"水溶液"定義為包含至 少50%w/w水的溶液。在一個實施方案中，所述組合物包含非水性有機(jī)溶劑。
[0291] 在另一個實施方案中，所述藥物組合物是冷凍干燥的組合物，在使用之前例如由 醫(yī)師或患者向其中添加溶劑和/或稀釋劑。
[0292] 在另一個實施方案中，所述藥物組合物是經(jīng)干燥(例如冷凍干燥或噴霧干燥)的組 合物，W供在沒有任何預(yù)先溶解的情況下使用。
[0293] 在一個實施方案中，本發(fā)明設(shè)及一種包含本發(fā)明的衍生物W及一種或多種其他活 性成分如化P-1、膜島素或其類似物和/或衍生物的組合物。在一個實施方案中，本發(fā)明設(shè)及 一種包含本發(fā)明的衍生物W及化P-1或其類似物和/或衍生物的組合物。在一個實施方案 中，本發(fā)明設(shè)及一種包含本發(fā)明的衍生物W及膜島素或其類似物和/或衍生物的組合物。包 含本發(fā)明的衍生物W及一種或多種其他活性成分的組合物可被稱為"聯(lián)合制劑（co- formulation)" 。在一個實施方案中 ，運(yùn)樣的聯(lián)合制劑是物理穩(wěn)定和 / 或化學(xué)穩(wěn)定的組合物。
[0294] 本發(fā)明的衍生物在中性pH下可W溶解運(yùn)一事實可W允許獲得具有膜島素的聯(lián)合 制劑，并允許更穩(wěn)定的血糖水平和次數(shù)減少的低血糖發(fā)作，w及降低的糖尿病相關(guān)并發(fā)癥 的風(fēng)險。
[02巧]藥物施用
[0296] 本發(fā)明的衍生物可W腸胃外施用于患者。該衍生物的施用途徑可W是肌肉內(nèi) (IM)、皮下（SC)或靜脈內(nèi)（IV)。推薦由醫(yī)師選擇將向患者施用的包含本發(fā)明衍生物的組合 物的劑量。
[0297] 可通過借助于注射器(任選地，筆狀注射器)進(jìn)行的皮下、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi) 注射進(jìn)行腸胃外施用。在一個實施方案中，可W使用包含本發(fā)明衍生物的組合物W備使用 筆裝置進(jìn)行膜高血糖素施用?；蛘撸山柚谳斪⒗圻M(jìn)行腸胃外施用。在一個實施方案中， 可W在用于膜高血糖素施用的累中使用包含本發(fā)明衍生物的組合物。腸胃外施用可W是經(jīng) 鼻施用。作為其他選擇，含有本發(fā)明衍生物的膜高血糖素制劑還可W適于經(jīng)皮施用，例如通 過無針注射或經(jīng)由貼劑(任選地，離子電滲貼劑），或跨粘膜例如經(jīng)頰施用。
[0298] 本發(fā)明的衍生物或組合物在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用時的典型劑量在每日約 0.0001至約Img/kg體重，優(yōu)選約0.001至約Img/kg體重，更優(yōu)選約0.005至約0.02mg/kg體重 的范圍內(nèi)。如上所述，本發(fā)明的衍生物可與一種或多種附加的治療活性化合物或物質(zhì)聯(lián)合 施用或使用，并且合適的附加化合物或物質(zhì)可W選自，例如，抗糖尿病藥、抗高血脂藥、減肥 藥、抗高血壓藥W及用于治療由糖尿病引起或與糖尿病有關(guān)的并發(fā)癥的藥劑。
[0299] 合適的抗糖尿病藥包括膜島素、膜島素衍生物或類似物、GLP-1(膜高血糖素樣膚- 1)衍生物或類似物[諸如在W0 98/08871(Novo Nordisk A/S)中公開的那些，或其他化P-1 類似物如艾塞那膚（8761:1日,6111^;[117/411171;[]1;4\^0010,5日]1〇門-4￥6]11:13)、他泊魯膚 (Taspoglutide) (Roche)、阿必魯泰（A化iglutide) (Sync;ria,GlaxoSmithKline)]、膜淀素 (amyl in)、膜淀素類似物(例如Symlin/Praml intide似及口服活性降血糖藥。
[0300] 藥物適應(yīng)證
[0301] 本發(fā)明還設(shè)及本發(fā)明的衍生物，其用于在醫(yī)學(xué)中使用。在一個實施方案中，所述衍 生物用于治療和/或預(yù)防低血糖。
[0302] 在一個實施方案中，本發(fā)明設(shè)及一種治療和/或預(yù)防低血糖的方法，其包括向有需 要的患者施用治療有效量的本發(fā)明的衍生物。
[0303] 在一個實施方案中，本發(fā)明的衍生物用于治療或預(yù)防低血糖、膜島素誘發(fā)的低血 糖、反應(yīng)性低血糖、糖尿病性低血糖、非糖尿病性低血糖、空腹低血糖、藥物誘發(fā)的低血糖、 胃旁路術(shù)誘發(fā)的低血糖、妊娠期低血糖、酒精誘發(fā)的低血糖、膜島瘤和/或Von Girkes病。
[0304] 在一個實施方案中，本發(fā)明的衍生物用于抑制胃腸道的運(yùn)動性，運(yùn)對于使用諸如 X-射線、CT-和NMR-掃描等技術(shù)進(jìn)行胃腸道的檢查而言是有用的。
[0305] 在一個實施方案中，所述衍生物用于治療β-阻滯劑中毒。在一個實施方案中，所述 衍生物用于治療或預(yù)防肝脂肪變性。在一個實施方案中，所述衍生物用于治療或預(yù)防低血 糖。在一個實施方案中，所述衍生物用于治療或預(yù)防膜島素誘發(fā)的低血糖。在一個實施方案 中，所述衍生物用于治療或預(yù)防反應(yīng)性低血糖。在一個實施方案中，所述衍生物用于治療或 預(yù)防糖尿病性低血糖。在一個實施方案中，所述衍生物用于治療或預(yù)防非糖尿病性低血糖。 在一個實施方案中，所述衍生物用于治療或預(yù)防空腹低血糖。在一個實施方案中，所述衍生 物用于治療或預(yù)防藥物誘發(fā)的低血糖。在一個實施方案中，所述衍生物用于治療或預(yù)防胃 旁路術(shù)誘發(fā)的低血糖。在一個實施方案中，所述衍生物用于治療或預(yù)防妊娠期低血糖。在一 個實施方案中，所述衍生物用于治療或預(yù)防酒精誘發(fā)的低血糖。在一個實施方案中，所述衍 生物用于治療或預(yù)防膜島瘤。在一個實施方案中，所述衍生物用于治療或預(yù)防Von Girkes 病。
[0306] 在一個實施方案中，所述衍生物W提供治療有效量的所述衍生物的劑量方案來施 用。如本文所用的，術(shù)語本發(fā)明衍生物的"治療有效量"是指足W治愈、減輕或部分抑制給定 疾病和/或其并發(fā)癥的臨床表現(xiàn)的量。將足W實現(xiàn)該目標(biāo)的量定義為"治療有效量"。用于各 個目的的有效量將取決于疾病或損傷的嚴(yán)重性W及患者的體重和整體狀況。將會理解，可 通過構(gòu)建值的矩陣并測試該矩陣中的不同的點，使用常規(guī)實驗來確定合適的劑量，所有運(yùn) 些均在受過訓(xùn)練的醫(yī)師或獸醫(yī)的普通技術(shù)水平之內(nèi)。
[0307] 如本文使用的術(shù)語"治療"、"處理"及其其他變型是指為了對抗?fàn)顩r如疾病或病癥 的目的而對患者的管理和照護(hù)。該術(shù)語意在包括對患者正在罹患的給定狀況的全范圍的治 療，諸如施用所討論的活性化合物W減輕其癥狀或并發(fā)癥，W延緩疾病、病癥或狀況的進(jìn) 展，W治愈或消除疾病、病癥或狀況，和/或W預(yù)防狀況，其中預(yù)防應(yīng)理解為為了對抗疾病、 狀況或病癥的目的而對患者的管理和照護(hù)，并且包括施用所討論的活性化合物W預(yù)防癥狀 或并發(fā)癥的發(fā)作。待治療的患者優(yōu)選為哺乳動物，尤其是人，但諸如狗、貓、牛、馬、綿羊、山 羊或豬等其他動物的治療也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0308] 在標(biāo)題為"特定實施方案"的部分中描述了本發(fā)明衍生物的另外的特定實施方案。
[0309] 特定實施方案
[0310] W下是本發(fā)明的非限制性特定實施方案：
[0311] 1.-種包含式I的膜高血糖素類似物的衍生物，或所述衍生物的藥學(xué)上可接受的 鹽、酷胺或醋：
[0312] Imp_X2_His_Gly_Thr_Phe_Thr_Ser_Asp_Xio_Ser_Xi2_Tyr_Leu_Xi5_Xi6_Ar 邑 _Ar 邑一 Ala-X2〇-X2 廣陸 e-Val-X24-T 巧-Leu-X27-X28-X29-X3〇[I]
[0313] 其中
[0314] X2 為 Ser 或 Aib;
[0；315] Xi 日為 Tyr、Leu、Ile 或化 1;
[0；316] Xi2 為 Lys 或 Arg;
[0317] X 化為 Asp 或 Glu;
[0318] Xi6 為 56'、41日、1^611、1'虹、4化、116、化1或1^73;
[0319] X2 日為 Gln、Glu、Aib 或 Lys;
[0320] X21 為 Asp、Glu 或 Lys;
[0321] X24 為 6111、41日、6111、4化或1^73;
[0322] X27 為 161、1^611或化1;
[0323] X28 為 Asn'Ser、!'虹、Gln、Ala、Gly、Glu 或 Lys;
[0324] X29 為 Τ'虹、617、56'、6111、41日、6111或1^73;并且 [03巧]Χ30不存在或為Lys;
[0326] 并且其中所述衍生物包含與在式1的位置《12^16心2日^21心24^28心2減乂3日處的賴 氨酸的側(cè)鏈的氮原子共價連接的取代基，
[0327]其中所述取代基具有式II:
[0；32 引 Y 廣 Y2-Y3-Y4-Y 己-Y6-Y7-Y8-Y9-Y10-Y1廣 Yi廣[Π ]
[0329] 其中Yi為氨或表示C2-6酷基基團(tuán)或班巧酷基部分，并且
[0330] 其中Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、村、Yl()、Yl域Yl2單獨地不存在或單獨地表示選自Ser殘 基、Ala殘基、Gly殘基、式i、式ii、式iii、式iv和式V的氨基酸殘基：
[0331]
[0332] 其中式和iv單獨地具有立體化學(xué)L或D，
[0333] 并且條件是所述取代基具有Ξ至十個帶負(fù)電荷的部分。
[0334] 2.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中所述膜高血糖素類似物由式I 組成。
[0335] 3.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中所述膜高血糖素類似物或衍生 物不包含添加至X30的C-末端上的氨基酸殘基。
[0336] 4.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中所述衍生物為所述衍生物的藥 學(xué)上可接受的鹽、酷胺或醋。
[0337] 5.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中所述膜高血糖素類似物與膜高 血糖素 (SEQ ID NO: 1)相比在所述膜高血糖素類似物中包含3-15個氨基酸殘基修飾，如置 換或添加。
[033引6.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中所述衍生物與膜高血糖素 (SEQ ID NO: 1)相比在所述膜高血糖素類似物中包含最多14個如最多13個或最多12個氨基酸殘 基修飾，如置換或添加。
[0339] 7.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中所述膜高血糖素類似物與膜高 血糖素 (SEQ ID NO: 1)相比在所述膜高血糖素類似物中包含最多11個如最多10個或最多9 個氨基酸殘基修飾，如置換或添加。
[0340] 8.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中所述膜高血糖素類似物與膜高 血糖素 (SEQ ID NO: 1)相比在所述膜高血糖素類似物中包含最多8個如最多7個或最多6個 氨基酸殘基修飾，如置換或添加。
[0%1] 9.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中X2為Ser。
[0342] 10.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中X10為Tyr。
[0343] 11.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中X12為Lys。
[0344] 12.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中X15為Asp。
[0345] 13.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中X16為Ser。
[0346] 14.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中X20為Gin。
[0347] 15.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中X21為Asp。
[0348] 16.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中X24為Gin。
[0349] 17.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中X27為Met。
[0350] 18.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中X28為Asn。
[0351] 19.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中X29為化r。
[0352] 20.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中X30不存在。
[0353] 21.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中X2為Aib。
[0354] 22.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中Xi日為Leu。
[03W] 23.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中Xi5為Glu。
[0356] 24.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中Xi6為Leu。
[0357] 25.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中Xi6為化1。
[035引26.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中X20為Lys。
[0359] 27.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中X21為Glu。
[0360] 28.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中X24為Lys。
[0361] 29.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中X24為Ala。
[0362] 30.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中X27為Leu。
[0363] 31.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中X28為Ser。
[0364] 32.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中X28為Lys。
[0365] 33.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中X29為Lys。
[0366] 34.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中Y12與在所述衍生物的位置 Xl2、Xl6、X2日、X21、X24、X28、拉減X3日處的賴氨酸的側(cè)鏈的所述氮原子連接。
[0367] 35.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中所述取代基與賴氨酸的側(cè)鏈 的ε-氮原子共價連接。
[0368] 36.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中所述取代基與在位置Χ?2、Χ?6 或拉0處的賴氨酸連接。
[0369] 37.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中所述取代基與在位置Χ2?、Χ24 或拉8處的賴氨酸連接。
[0370] 38.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中所述取代基與在位置Χ29或Χ30 處的賴氨酸連接。
[0371] 39.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中所述取代基與在位置Χ24處的 賴氨酸連接。
[0372] 40.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中所述取代基具有3、4、5、6、7、 8、9或10個帶負(fù)電荷的部分。
[0373] 41.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中所述取代基包含3-10個如3-5 個或4個式i的殘基。
[0374] 42.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中所述取代基的Yi為乙酷基基 團(tuán)。
[0375] 43.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中所述取代基選自W下部分：
[0376]
ο
[0377]
[0378] 44.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中所述取代基為W下部分：
[0379]
[0380] 45.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中所述衍生物選自：
[0381] 妒24-[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[Impl，Aib2，His3，Leul6， Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素
[0382] 化學(xué)式1:
[0383]
[0384] 妒24-[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[Impl，Aib2，His3，Glul5， Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素
[0385] 化學(xué)式2:
[0386]
[0387] 妒24-[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[Impl，Aib2，His3，LeulO， Glul5，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素
[038引化學(xué)式3:
[0389]
[0390] 妒28-[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[Impl，Aib2，His3，Glul5， Ala24，Leu27，Lys28 ]-膜高血糖素
[0391] 化學(xué)式4:
[0392]
[0393] 妒24-[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[Impl，His3，Glul5，Lys24, Leu27，Ser28 ]-膜高血糖素
[0394] 化學(xué)式5:
[0395]
[0396] 妒24-[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[Impl，His3，Glul5，Glu21, Lys24，Leu27，Ser2引-膜高血糖素
[0397] 化學(xué)式6:
[039引
[0399] 妒24-[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[Impl，Aib2，His3，Glul5， Glu21，Lys24，Leu27，Ser28 ]-膜高血糖素
[0400] 化學(xué)式7:
[0401]
?V
[0402] 妒24-[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[Impl ,His3,Leul6,Glu21, Lys24，Leu27，Ser2引-膜高血糖素
[0403] 化學(xué)式8:
[0404]
[0405] 妒24-[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[Impl，His3，Leul6，Lys24, Leu27，Ser28 ]-膜高血糖素
[0406] 化學(xué)式9:
[0407]
[040引妒24-[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[Impl，Aib2，His3，Vall6， Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素
[0409] 化學(xué)式10:
[0410]
5·
[0411] Nel6-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4義酷氨基-4-簇基T酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[Impl，His3，Glul5，Lysl6， Glu21，Leu27，Ser28]-膜高血糖素
[0412] 化學(xué)式11:
[0413]
[0414] 妒2〇-[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[Impl，His3，Glul5，Lys20, Glu21，Leu27，Ser28]-膜高血糖素
[041引化學(xué)式12:
[0416]
[0417] 妒21-[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[Impl，His3，Glul5，Lys21, Leu27，Ser28 ]-膜高血糖素
[0418] 化學(xué)式13:
[0419]
[0420] 妒28-[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[Impl，His3，Glul5，Glu21, Leu27，Ly s28 ]-膜高血糖素
[0421] 化學(xué)式14:
[0422]
[0423] 妒29-[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[Impl，His3，Glul5，Glu21, Leu27，Ser28，Lys29]-膜高血糖素
[0424] 化學(xué)式15:
[04 巧]
[04%]滬（[Impl，His3，Glul5，Glu21，Leu27，Ser28]-膜高血糖素基）-^(45)-4-[[(45)- 4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷 基]氨基]-4-簇基下酷基]Lys
[0427] 化學(xué)式16:
[0428]
[0429] 46.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中所述衍生物選自
[0430] n"4-[2-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨 基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]乙酷基]-[Impl， His3，Glul5，Glu21，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素
[0431] 化學(xué)式17:
[0432]
[0433] νε24-[ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷 基]氨基]-4-簇基下酷基]-[1111口1，化33,611115,611121，1^7324，1^61127,56的8]-膜高血糖素
[0434] 化學(xué)式18:
[0435]
[0436] n"4-[ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷 基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷 基]-[1111口1，化33,611115,611121，1^7324，1^61127,56^8]-膜高血糖素
[0437] 化學(xué)式19:
[0438]
[0439] 妒24-[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[Impl，His3，Alal6，Lys24, Leu27，Ser28 ]-膜高血糖素
[0440] 化學(xué)式20:
[0441]
[0442] 妒24-[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[Impl，His3，Aibl6，Lys24, Leu27，Ser2引-膜高血糖素
[0443] 化學(xué)式21:
[0444]
[0445] W及
[0446] 妒24-[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[Impl，His3，Glul5，Glu21, Lys24，Leu27，Glu28]-膜高血糖素
[0447] 化學(xué)式22:
[044引
[0449] 47.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中所述膜高血糖素類似物不包 含C-末端酷胺。
[0450] 48.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中所述衍生物是膜高血糖素受 體的激動劑，其EC50不大于20化M。
[0451] 49.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中所述衍生物在化T原纖維形成 試驗如本文描述的試驗(III)中具有大于70 %的回收率。
[0452] 50.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中所述衍生物在化T原纖維形成 試驗如本文描述的試驗(III)中具有大于7小時的滯后時間。
[0453] 51.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中所述衍生物具有如通過本文 所述的試驗(IV)測定的小于5%的化學(xué)降解。
[0454] 52.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中所述衍生物具有至少 O.lmmoVl的溶解度。
[0455] 53.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中所述溶解度可在抑在7.4-8.2 范圍內(nèi)的lOmM憐酸鹽緩沖液中在包含所述衍生物的組合物中測定。
[0456] 54.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的衍生物，其中所述衍生物對化P-1受體的 EC50效力與其對膜高血糖素受體的EC50效力的比值至少為50,其中所述效力可使用本文描 述的試驗（I)(a)和試驗（I)(b)來測定。
[0457] 55. -種膜高血糖素類似物形式的中間產(chǎn)物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、酷胺或醋， 該中間產(chǎn)物與膜高血糖素 (SEQ ID NO: 1)相比包含W下修飾：
[045引（i) [ Impl，Aib2，His3，Leul6，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0459] (ii) [Impl，Aib2，His3，Glul5，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0460] (iii)[ Impl, Aib2，His3，LeulO，Glul5，Lys24, Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0461 ] (iv) [ Impl，Aib2，His3，Glul5，Ala24，Leu27，Lys28]-膜高血糖素；
[0462] (V) [ Impl，His3，Glul5，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0463] (vi)[Impl，His3，Glul5，Glu21，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0464] (vii)[Impl，Aib2，His3，Glul5，Glu21，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[04化](viii)[ Impl，His3，Leul6，Glu21，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0466] (ix) [ Impl，His3，Leul6，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0467] (X) [ Impl，Aib2，His3，化116，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0468] (xi)[Impl，His3，Glul5，Lysl6，Glu21，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0469] (xii) [Impl，His3，Glul5，Lys20，Glu21，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0470] (xiii) [Impl，His3，Glul5，Lys21，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0471] (xiv) [Impl, His3，Glul5，Glu21，Leu27，Lys28]-膜高血糖素；
[0472] (XV) [ Impl，His3，Glul5，Glu21，Leu27，Ser28，Lys29]-膜高血糖素；
[0473] (xvi) [ Impl，His3，Glul5，Glu21，Leu27，Ser28，Lys30]-膜高血糖素。
[0474] 56. -種膜高血糖素類似物形式的中間產(chǎn)物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、酷胺或醋， 該中間產(chǎn)物與膜高血糖素 (SEQ ID NO: 1)相比包含W下修飾：
[04 巧](xvii)[Impl，His3，Alal6，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0476] (xviii)[Impl，His3，Aibl6，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0477] (xix)[Impl，His3，Glul5，Glu21，Lys24，Leu27，Glu28]-膜高血糖素。
[0478] 57.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的中間產(chǎn)物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、酷胺或 醋，其中所述膜高血糖素類似物選自W下膜高血糖素 (SEQ ID NO: 1)類似物：
[04巧](i-a) [ Impl，Aib2，His3，Leul6，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0480] (ii-a) [ Impl，Aib2，His3，Glul5，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0481 ] (iii-a) [Impl，Aib2，His3，LeulO，Glul5，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0482] (iv-a) [ Impl，Aib2，His3，Glul5，Ala24，Leu27，Lys28]-膜高血糖素；
[0483] (v-a) [ Impl，His3，Glul5，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0484] (vi-a) [ Impl，His3，Glul5，Glu21，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[04 化](vii-a)[Impl，Aib2，His3，Glul5，Glu21，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[04 化](viii-a)[Impl，His3，Leul6，Glu21，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0487] (ix-a) [ Impl，His3，Leul6，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0488] (x-a) [ Impl，Aib2，His3，化116，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0489] (xi-a)[Impl，His3，Glul5，Lysl6，Glu21，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0490] (xii-a) [ Impl，His3，Glul5，Lys20，Glu21，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0491 ] (xiii-a) [ Impl，His3，Glul5，Lys21，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0492] (xiv-a)[Impl，His3，Glul5，Glu21，Leu27，Lys28]-膜高血糖素；
[0493] (xv-a) [ Impl，His3，Glul5，Glu21，Leu27，Ser28，Lys29]-膜高血糖素；
[0494] (xvi-a) [ Impl，His3，Glul5，Glu21，Leu27，Ser28，Lys30]-膜高血糖素。
[04M] 58.根據(jù)前述實施方案中任一個所述的中間產(chǎn)物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、酷胺或 醋，其中所述膜高血糖素類似物選自W下膜高血糖素 (SEQ ID NO: 1)類似物：
[0496] (xvii)[Impl，His3，Alal6，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0497] (xviii)[Impl，His3，Aibl6，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素；
[0498] (xix)[Impl，His3，Glul5，Glu21，Lys24，Leu27，Glu28]-膜高血糖素。
[0499] 59.-種組合物，其包含如前述實施方案中任一個所述的衍生物W及一種或多種 藥學(xué)上可接受的賦形劑。
[0500] 60.如前述實施方案中任一個所述的衍生物，其用于在醫(yī)學(xué)中使用。
[0501] 61.根據(jù)實施方案60所述的衍生物，其用于治療和/或預(yù)防低血糖。
[0502] 62.-種治療和/或預(yù)防低血糖的方法，該方法包括向有需要的患者施用治療有效 量的如前述實施方案中任一個所述的衍生物。
[0如引實施例
[0504]參考W下實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，運(yùn)些實施例并非旨在W任何方式限制所請求 保護(hù)的本發(fā)明的范圍。
[0如引縮寫列表
[0如6] B0C:叔下氧幾基
[0如7] DCM:二氯甲燒
[0如引 DIC:二異丙基碳二亞胺
[0如9] Fmoc:9-巧基甲氧幾基
[051日]冊41:1-徑基-7-氮雜苯并^挫
[051" HPLC:高效液相色譜法
[051^ LCMS:液相色譜質(zhì)譜法
[051引 MeCN:乙臘
[0514] Min:分鐘
[0515] 甲基Ξ苯甲基
[0516] NMP:N-甲基化咯燒酬
[0517] Oxyma化re:氯基-徑基亞氨基-乙酸乙醋 [051引 RP:反相
[化19] RP-HPLC:反相高效液相色譜法
[0520] RT:室溫
[0521] Rt:保留時間 郵剖 SPPS:固相膚合成
[0523] TFA:S氣乙酸
[0524] TIPS 異丙基硅烷
[化巧]UPLC:超高效液相色譜法
[0526] 10ΕΕ:10的幕(例如"10ΕΕ(ΧΓ指數(shù)字10的幕(X)或簡化為數(shù)字lO?，即5Χ10ΕΕ3為 5x10^) 腑7] 通用方法
[0528]該章節(jié)設(shè)及用于合成樹脂結(jié)合的膚的方法(SPI^法，其包括氨基酸脫保護(hù)方法、用 于從樹脂上切割膚的方法和膚純化方法似及用于檢測和表征所得膚的方法化CMS和UPLC 法)。
[化巧]SPPS通用方法
[0530] 該章節(jié)設(shè)及固相膚合成方法(SPI^法，其包括氨基酸脫保護(hù)方法、用于從樹脂上切 割膚的方法和膚純化方法）W及用于檢測和表征所得膚的方法化CMS和UPLC法）。所使用的 Fmoc保護(hù)的氨基酸衍生物為W下推薦的標(biāo)準(zhǔn)品：由例如Anaspec、Bachem、I;ris Biotech或 Novabiochem提供的Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(T;rt)-OH、Fmoc-Asp (化郵）-(^^1]1〇(3-切3(化1:)-0山化〇(3-61]1(化1:)-0山化〇(3-6111(011311)-(^少1]1〇(3-617-細(xì)、 Fmoc-His(Trt)-〇H、Fmoc-Ile-〇H、Fmoc-Leu-〇H、Fmoc-Lys(Boc)-〇H、Fmoc-Met-〇H、Fmoc- Tyr(tBu)-〇H或Fmoc-Val-OH等。當(dāng)沒有其他指定時，使用氨基酸的天然k形式。使用3-(N- 1苯甲基-咪挫-4-基)-丙酸來引入N-末端Imp。
[0531] 該章節(jié)"SPI^通用方法"中W下所述的所有操作在ΙΟΟ-μ mol合成規(guī)模下進(jìn)行。
[0532] 用于制備C-末端簇酸的合適的樹脂是預(yù)加載有氨基酸的Wang樹脂，如Fmoc-Thr (tBu)-Wang樹脂(低負(fù)載，0.35mmol/g)。在取代基與C-末端賴氨酸連接的情況下，合適的樹 脂是預(yù)加載的fmoc-Lys (Mtt) -Wang。
[05削在100-μηιο1規(guī)模下，使用相對于樹脂負(fù)載例如低負(fù)載Fmoc-Gly-Wang(0.35mmol/ g)六倍過量的Fmoc-氨基酸（在含有300mM HOAt或OxymaPii化愈的匪P中300mM)，在來自 Protein Technologies (Tucson ,ΑΖ 85714U. S.A.)的Prelude 固相膚合成儀上進(jìn)行SPPS。義 用在NMP中的20 %贓晚進(jìn)行Fmoc脫保護(hù)。使用在NMP中的3:3:3:4氨基酸/Oxymapure婚/DIC/ Ξ甲基化晚進(jìn)行偶聯(lián)。在脫保護(hù)與偶聯(lián)步驟之間進(jìn)行NMP和DCM頂部洗涂(各2x 2)。偶聯(lián)時 間通常為60或120分鐘。將一些氨基酸"雙偶聯(lián)"，意味著在第一次偶聯(lián)之后，排空樹脂并添 加更多試劑(氨基酸、化OAt或OxymaPure?)、DIC和Ξ甲基化晚），并使混合物再次反應(yīng)。
[0534] 取代基與樹脂結(jié)合的受保護(hù)的膚骨架的連接
[0535] 用Mtt保護(hù)待酷化的賴氨酸的ε氨基基團(tuán)。通過用六氣異丙醇/DCM(75:25,5x 20ml，各lOmin)處理然后如W上在"SPI^通用方法"章節(jié)中所述洗涂來進(jìn)行化t脫保護(hù)。
[化36] 如上所述使用化oc-Glu-〇tBu或結(jié)構(gòu)單元通過一個或多個自動化步驟在Prelude 膚合成儀上進(jìn)行賴氨酸的化學(xué)修飾。W每次偶聯(lián)120分鐘的反應(yīng)時間進(jìn)行雙偶聯(lián)。使用乙酸 酢實現(xiàn)乙酷化。
[化別從樹脂上切割
[053引在合成后用DCM洗涂樹脂，并且通過用TFA/TIS/水(95/2.5/2.5)處理2-3小時將膚 從樹脂上切割下來，隨后用二乙酸沉淀。用二乙酸洗涂沉淀物。
[化例純化和定量
[0540] 將粗膚溶解于水和MeCN的適當(dāng)混合物如水/MeCN(9:1)中，并在含有C18-硅膠的柱 上通過反相制備型冊LC( Waters Del taprep 4000或Gil son)進(jìn)行純化。采用逐漸增加的 MeCN在含有0.1 % TFA的水中的梯度進(jìn)行洗脫。通過分析型HPLC或UPLC檢查相關(guān)級分。將含 有純祀膚的級分混合并減壓濃縮。分析化PLC，LCMS)所得溶液，并使用化學(xué)發(fā)光氮特異性 HPLC檢測器(Antek 8060HPLC-化ND)或通過測量280皿處的UV吸收對產(chǎn)物進(jìn)行定量。將產(chǎn)物 分配至玻璃小瓶中。給該小瓶蓋上Millipore玻璃纖維預(yù)濾器。冷凍干燥得到呈白色固體的 膚Ξ氣乙酸鹽。
[0541 ] 檢測和表征方法
[0542] 方法：LCMS01
[0543]
[0544] 方法:UPLC01
[0549] 實施例1
[0550] 妒24-[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[Impl，Aib2，His3，Leul6， Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素
[0巧1] 化學(xué)式1:
[0552]
[ο 巧 3] UPLC01:IU = 10.2min
[Ο巧4] LCMSO1: lU = 1.99min;計算111八=4014.3;實測m/^3 = 1339;實測111/4 = 1004;實測111/ 5 = 803
[0巧5] 實施例2
[0556]妒24-[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[Impl，Aib2，His3，Glul5， Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素 [0巧7] 化學(xué)式2:
[055引
[0559] UPLC02:IU = 6.3min
[化 60] LCMS01:化=1.75min;計算111八=4002.3;實測m/^3 = 1335;實測111/4 = 1001;實測111/ 5 = 801
[0561] 實施例3
[0562] 妒24-[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[Impl，Aib2，His3，LeulO， Glul5，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素
[0563] 化學(xué)式3:
[化 64]
[05 化]UPLC02:IU = 6.7min
[0566] LCMS01: Rt = 1.8min;實測 m/1 = 3952.3;實測 m/3 = 1318;實測 m/4 = 989;實測 m/5 = 791
[0567] 實施例4 郵6引妒28-[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[Impl，Aib2，His3，Glul5， Ala24，Leu27，Lys28 ]-膜高血糖素 [0569] 化學(xué)式4:
[0570]
[0571] UPLC02:IU = 6.2min
[0572] LCMSO1: Rt = 1.7min;計算111八=3986.3;實測m/^3 = 1329;實測111/4 = 997;實測111/5 = 798
[0573] 實施例5
[0574] 妒24-[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[Impl，His3，Glul5，Lys24, Leu27，Ser28 ]-膜高血糖素
[化巧]化學(xué)式5:
[0576]
[0577] UPLC01:IU = 9.2min
[057引 LCMS01:化=1.8min;計算m/z = 4004.2;實測m/^3 = 1336;實測111/4= 1002;實測111/5 = 801
[0579] 實施例6
[0580] 妒24-[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[Impl，His3，Glul5，Glu21, Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素
[0581 ] 化學(xué)式6:
[0582]
[0583] UPLC01:IU = 9.4min
[化 84] LCMS01:化=1.82min;計算111八=4018.3;實測m/^3 = 1340;實測111/4 = 1005;實測111/ 5 = 804
[化化]實施例7
[0586] 妒24-[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[Impl，Aib2，His3，Glul5， Glu21，Lys24，Leu27，Ser28 ]-膜高血糖素
[0587] 化學(xué)式7:
[化8引
[0589] UPLC02:IU = 6.4min
[0590] LCMS01:化=1.7min;計算m/z = 4016.3;實測m/^3 = 1339;實測111/4= 1005;實測111/5 = 804
[0591 ] 實施例8
[0592] 妒24-[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[Impl ,His3,Leul6,Glu21, Lys24，Leu27，Ser2引-膜高血糖素
[0593] 化學(xué)式8:
[0594]
[0595] UPLC01:IU = 10.8min
[0596] LCMSOl: lU = 1.9min;計算m/z = 4030.3;實測m/^3 = 1344;實測111/4= 1008;實測111/5 = 807
[0597] 實施例9
[059引妒24-[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[Impl，His3，Leul6，Lys24, Leu27，Ser28 ]-膜高血糖素 [0599] 化學(xué)式9:
[0600]
[0601 ] UPLC01:IU = 10.5min
[0602] LCMSOl: lU = 1.9min;計算m/z = 4016.3;實測m/^3 = 1340;實測111/4= 1005;實測111/5 = 804
[0603] 實施例10
[0604] 妒24-[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[Impl，Aib2，His3，Vall6， Lys24，Leu27，Ser2引-膜高血糖素
[0605] 化學(xué)式10;
[0606]
[0607] UPLC01:IU = 10.3min
[060引 LCMS01:化=1.9min;計算m/z = 4000.3;實測m/^3 = 13：34;實測111/4= 1001;實測111/5 = 801
[0609] 實施例11
[0610] Nel6-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[Impl，His3，Glul5，Lysl6， Glu21，Leu27，Ser28]-膜高血糖素
[061" 化學(xué)式11:
[0612]
[0613] UPLC02:IU = 6.4min
[0614] LCMS01:化=3. Imin;計算m/z = 4059.3;實測m/^3 = 1354;實測111/4 = 1015;實測111/5 = 812
[061引實施例12
[0616] 妒2<>-[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[Impl，His3，Glul5，Lys20, Glu21，Leu27，Ser28]-膜高血糖素
[0617] 化學(xué)式12:
[061 引
[0619] UPLC02:IU = 6.4min
[0620] LCMS01:化=3.2min;計算m/z = 4018.3;實測m/^3 = 1340;實測111/4= 1005;實測111/5 = 804
[062。 實施例13
[0622] 妒21-[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[Impl，His3，Glul5，Lys21, Leu27，Ser2引-膜高血糖素
[0623] 化學(xué)式13:
[0624]
[0625] UPLC01:IU = 9.5min
[0626] LCMS01:化=3. Imin;計算m/z = 4017.3;實測m/^3 = 1340;實測111/4= 1005;實測111/5 = 804
[0627] 實施例14
[062引妒28-[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[Impl，His3，Glul5，Glu21, Leu27，Lys2引-膜高血糖素
[0629] 化學(xué)式14:
[0630]
[0631] UPLC02:IU = 6.2min
[0632] LCMSOl: lU = 3.2min;計算m/z = 4059.3;實測m/^3 = 1354;實測111/4= 1015;實測111/5 = 812
[0633] 實施例15
[0634] N。9-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4義酷氨基-4-簇基T酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[Impl，His3，Glul5，Glu21， Leu27，Ser28，Lys29]-膜高血糖素 [06對化學(xué)式15:
[0636]
[0637] UPLC01:IU = 9.4min
[063引 LCMS01:IU = 4.1min;計算 m/z = 4045.3;實iim/3 = l：M9;實iim/4=1012;實測 m/5 = 810
[0639] 實施例16
[0640] 滬（[Impl，His3，Glul5，Glu21，Leu27，Ser28]-膜高血糖素基）-N{Epsilon}[(4S)- 4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]- 4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]Lys
[0641 ] 化學(xué)式16:
[0642]
[0643] UPLC01:IU = 9.2min
[0644] LCMSOl:lU = 4. Imin;計算m/z = 4146.4;實測m/^3 = 1383;實測111/4= 1037;實測111/5 = 830
[0645] 實施例17
[0646] n"4-[2-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨 基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]乙酷基]-[Impl， His3，Glul5，Glu21，Lys24，Leu27，Ser28]-膜高血糖素
[0647] 化學(xué)式17:
[064引
[0649] UPLC01:IU = 9.6min
[0化0] LCMS01: Rt = 1.8min;計算m/z = 4075.3;實測ι?Λ = 1359.7;實測m/4 = 1020.0;實 iim/5 = 816.2 [0651] 實施例18
[0化2]妒24-[ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷 基]氨基]-4-簇基下酷基]-[1111口1，化33,611115,611121，1^7324，1^61127,56的8]-膜高血糖素 [0化3] 化學(xué)式18:
[0 化4]
[0化5] UPLC01:IU = 9.8min
[0 化 6] LCMS01:化=1.8min;計算m/z = 3889.2;實測m/^3 = 1297.3;實測111/4 = 973.2;實測 m/5 = 1178.8 [0化7] 實施例19
[Ο化引 ν"4-[ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷 基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷 基]-[1111口1，化33,611115,611121，1^7324，1^61127,56^8]-膜高血糖素 [0化9] 化學(xué)式19:
[0660]
[0661 ] UPLC01:IU = 9.8min
[0662] LCMS01: Rt = 1.8min;計算 m/z = 4147.4;實測 ι?Λ = 1383.4;實測 m/4 = 1037.7;實 iim/5 = 830.4
[0663] 實施例20
[0664] N。4-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酷氨基-4-簇基T酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[Impl，His3，Alal6，Lys24， Leu27，Ser2引-膜高血糖素
[06化]化學(xué)式20;
[0666]
[0667] UPLC01:IU = 10.2min
[066引 LCMS01:化=1.9min;計算m/z = 3974.2;實測m/^3 = 1325.6;實測111/4 = 994.5;實測 m/5 = 795.8
[0669] 實施例21
[0670] N。4-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酷氨基-4-簇基T酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[Impl，His3，Aibl6，Lys24， Leu27，Ser2引-膜高血糖素
[0671] 化學(xué)式21:
[0672]
[0673] UPLC01:IU = 10.6min
[0674] LCMSOl: lU = 2. Omin;計算m/z = 3988.2;實測m/^3 = 1330.0;實測111/4 = 998.0;實測 m/5 = 798.6
[06巧]實施例22
[0676] 妒24-[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-[[(45)-4-乙酷氨基-4-簇基下酷基]氨基]-4- 簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]氨基]-4-簇基下酷基]-[Impl，His3，Glul5，Glu21, Lys24，Leu27，Glu28]-膜高血糖素
[0677] 化學(xué)式22:
[067引
[0679] UPLC01:IU = 10.0min
[0680] LCMS01: Rt = 1.8min;計算m/z = 4060.3;實測ι?Λ = 1354.3;實測m/4 = 1016.0;實 iim/5 = 813.0
[0681 ]試驗(I) :GLP-1和膜高血糖素受體效力
[0682] 本試驗的目的在于測試本發(fā)明的衍生物的體外活性或效力。在全細(xì)胞試驗中，體 外效力分別是人GLP-1受體和/或膜高血糖素受體激活的量度。
[0683] 原理
[0684] 通過在報道基因試驗中分別測量人化P-1或膜高血糖素受體的響應(yīng)來測定體外效 力。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞系中進(jìn)行該試驗，該細(xì)胞系表達(dá)人GLP-1受體或人膜高血糖素受 體，并且包含與啟動子偶聯(lián)的cAMP響應(yīng)元件（CRE)的DNAW及蛋火蟲蛋光素酶(CRE蛋光素 酶）的基因。當(dāng)分別激活人化P-1或膜高血糖素受體時，導(dǎo)致cAMP的產(chǎn)生，運(yùn)轉(zhuǎn)而導(dǎo)致蛋光素 酶蛋白質(zhì)被表達(dá)。當(dāng)完成測定溫育時，添加蛋光素酶底物(蛋光素），并且該酶將蛋光素轉(zhuǎn)化 為氧化蛋光素并產(chǎn)生生物發(fā)光。測量發(fā)光作為該試驗的讀出。
[0685] (a)GLP-l 受體激活
[0686] 細(xì)胞培養(yǎng)和準(zhǔn)備
[0687] 本試驗中使用的細(xì)胞(克隆FCW467-12A/KZ10-1)為肌K細(xì)胞，WB皿TS13作為親本 細(xì)胞系。該細(xì)胞來源于表達(dá)人化P-1受體的克隆(FCW467-12A)，并且通過用CRE蛋光素酶進(jìn) 一步轉(zhuǎn)染w獲得當(dāng)前的克隆而建立。
[068引 將細(xì)胞在5%C02下在含有 10%FBS、lxGlutaMAX、lmg/mL G418、240nM MTX(甲氨蝶 嶺)和l%pen/strep(青霉素/鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。對細(xì)胞進(jìn)行等分并儲存在液氮 中。在每次測定之前，取出等份并將其在PBS中洗涂Ξ次，然后W所需濃度懸浮于測定緩沖 液中。對于96孔板，制備懸浮液W得至化X10EE3個細(xì)胞/孔的最終濃度。材料
[0689] 在該試驗中使用W下化學(xué)品：Pluronic F-68( 10% ) (Gibco 2404)、卵清蛋白 (Sigma A5503)、不含酪紅的DMEM(G化CO 11880-028)、1M Hepes(G化CO 15630)、Glutamax 100x(Gibco 35050)和steadylite plus(Perki址Imer 6016757)。
[0690] 測定培養(yǎng)基由不含酪紅的DMEM、10mM Hepes、lx GlutaMAX、2%卵清蛋白和0.2% Pluronic F-68組成。
[0691 ] 程序
[0692 ]將細(xì)胞儲備物在37 °C水浴中解凍。將細(xì)胞在PBS中洗涂Ξ次。對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)并調(diào) 整到在測定培養(yǎng)基中5x10邸3個細(xì)胞/5化1(1x10邸5個細(xì)胞/mL)。將細(xì)胞的50μ1等份轉(zhuǎn)移至 測定板的每個孔中。
[0693] 將測試化合物和參考化合物的儲備物在測定培養(yǎng)基中稀釋至0.2μΜ的濃度。將化 合物稀釋10倍W得到W下濃度：2χ10邸-6Μ、2χ10邸-7Μ、2χ10趾-8Μ;2χ10邸-9Μ、2χ10邸- 101、2^1066-1謹(jǐn)、2^10邸-121和社10趾-131。對于每種化合物，還包括空白測定緩沖液對 照。
[0694] 將化合物或空白的50μ1等份從稀釋板轉(zhuǎn)移至測定板中。在W下最終濃度下測試化 合物：lxl0EE-6M、lxl0EE-7M、lxl0EE-8M;lxl0EE-9M、lxl0EE-10M、lxl0邸-llM和lxl0邸- l2M和lxl0邸-13M。
[06巧]沿7C下將測定板在5%C02培養(yǎng)箱中溫前h。從培養(yǎng)箱中取出測定板并使其在室 溫下靜置15min。將steadylite plus試劑的10化1等份添加至該測定板的每個孔中（試劑是 光敏性的）。用侶錐覆蓋每個測定板W使其避光，并在室溫下?lián)u動30min。在Packard TopCountNXT儀器中讀取每個測定板。
[0696] 計算
[0697] 將來自TopCount儀器的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移至GraphPad Prism軟件。該軟件進(jìn)行非線性回歸 (log(激動劑)相對于響應(yīng)-可變斜率（四參數(shù)））。通過該軟件計算EC50值并WpM為單位記 5? 〇 幽](b)膜高血糖素受體激活
[0699] 細(xì)胞培養(yǎng)和準(zhǔn)備
[0700] 本試驗中使用的細(xì)胞(克隆pLJ6'-4-25)為BHK細(xì)胞，WBHK570作為表達(dá)CRE蛋光素 酶基因的親本細(xì)胞系(克隆BHK/KZ10-20-48)，并通過用人膜高血糖素受體進(jìn)一步轉(zhuǎn)染而建 立(在P監(jiān)-1載體中的克隆pLJ6'）。
[0701] 將細(xì)胞在5%C02下在含有 10%FBS、lxGlutaMAX、lmg/mL G418、240nM MTX(甲氨蝶 嶺)和l%pen/strep(青霉素/鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。對細(xì)胞進(jìn)行等分并儲存在液氮 中。在每次測定之前，取出等份并將其在PBS中洗涂Ξ次，然后W所需濃度懸浮于測定緩沖 液中。對于96孔板，制備懸浮液W得至化X10EE3個細(xì)胞/孔的最終濃度。材料
[0702] 在該試驗中使用W下化學(xué)品：Pluronic F-68( 10% ) (Gibco 2404)、卵清蛋白 (Sigma A5503)、不含酪紅的DMEM(G化CO 11880-028)、1M Hepes(G化CO 15630)、Glutamax 100x(Gibco 35050)和steadyliteplus(Perki址Imer 6016757)。
[0703] 測定培養(yǎng)基由不含酪紅的DMEM、10mM Hepes、lx GlutaMAX、2%卵清蛋白和0.2% Pluronic F-68組成。
[0704] 程序
[0705] 將細(xì)胞儲備物在37 °C水浴中解凍。將細(xì)胞在PBS中洗涂Ξ次。對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)并調(diào) 整到在測定培養(yǎng)基中5x10邸3個細(xì)胞/5化1(1x10邸5個細(xì)胞/mL)。將細(xì)胞的50μ1等份轉(zhuǎn)移至 測定板的每個孔中。
[0706] 將測試化合物和參考化合物的儲備物在測定培養(yǎng)基中稀釋至0.2μΜ的濃度。將化 合物稀釋10倍W得到W下濃度：2χ10邸-6Μ、2χ10邸-7Μ、2χ10趾-8Μ;2χ10邸-9Μ、2χ10邸- 101、2^1066-1謹(jǐn)、2^10邸-121和社10趾-131。對于每種化合物，還包括空白測定緩沖液對 照。
[0707] 將化合物或空白的50μ1等份從稀釋板轉(zhuǎn)移至測定板中。在W下最終濃度下測試化 合物：lxl0EE-6M、lxl0EE-7M、lxl0EE-8M;lxl0EE-9M、lxl0EE-10M、lxl0邸-llM和lxl0邸- l2M和lxl0邸-13M。
[070引在37Γ下將測定板在5%C02培養(yǎng)箱中溫育化。從培養(yǎng)箱中取出測定板并使其在室 溫下靜置15min。將steadylite plus試劑的10化1等份添加至測定板的每個孔中（試劑是光 敏性的）。用侶錐覆蓋每個測定板W使其避光，并在室溫下?lián)u動30min。在Packard TopCountNXT儀器中讀取每個測定板。
[0709] 計算
[0710] 將來自TopCount儀器的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移至GraphPad Prism軟件。該軟件進(jìn)行非線性回歸 (log(激動劑)相對于響應(yīng)-可變斜率（四參數(shù)））。通過該軟件計算EC50值并WpM為單位報 告。
[07川試驗（II) :GLP-1和膜高血糖素受體結(jié)合
[0712] (a)GLP-l 受體結(jié)合
[0713] 本試驗的目的在于測試本發(fā)明的膜高血糖素衍生物的體外受體結(jié)合活性。該受體 結(jié)合是化合物對人GLP-1受體的親和力的量度。
[0714] 原理
[0715] 在置換結(jié)合試驗中測量每種化合物與人GLP-1受體的受體結(jié)合。在運(yùn)一類型的試 驗中，使標(biāo)記的配體(在運(yùn)種情況下為125I-GLP-1)與受體結(jié)合。W-系列的濃度將每種衍 生物添加至含有人GLP-1受體的分離的膜中，并監(jiān)測標(biāo)記的配體的置換。將受體結(jié)合報告為 一半的標(biāo)記的配體從受體上置換時的濃度，即I巧0值。
[0716] 材料
[0717] 在該試驗中使用W下化學(xué)品：不含酪紅的DMEM(Gibco 11880-028)、Pen/strep (Invitrogen 15140-122)、G418(Invitrogen 10131-027)、1M Η邱es(Gibco 15630)、EDTA (Invihogen 15575-038)、PBS(Invi1:;rogen 14190-094)、胎牛血清（Invitrogen 16140- 071)、EGTA、MgC12(Merck 1.05832.1000)、吐溫20(Amresco 0850C335)、SPA顆粒(麥胚凝集 素（WGA)SPA珠 ，Perkin Elmer RPNQ0001)、[125I]-GLP-l]-(7-36)NH2(內(nèi)部生產(chǎn)的）、 0ptiPlateTM-96(Packard 6005290)〇
[071引緩沖液1由20mM Na-HE陽S加 lOmM邸ΤΑ組成，并且將抑調(diào)節(jié)至7.4。緩沖液2由20111]\1 船-皿陽巧日0.11111邸了4組成，并且將抑調(diào)節(jié)至7.4。測定緩沖液由5〇1111補(bǔ)充有5111]\166了4、5111]\1 MgCl2、0.005 %吐溫20的肥陽S組成，并且將pH調(diào)節(jié)至7.4。
[0719] 細(xì)胞培養(yǎng)和膜制備
[0720] 本試驗中使用的細(xì)胞(克隆FCW467-12A)為B皿細(xì)胞，WB皿TS13作為親代細(xì)胞系。 該細(xì)胞表達(dá)人GLP-1受體。
[07川使細(xì)胞在5%C02下在DMEM、10%胎牛血清、l%Pen/Strep(青霉素/鏈霉素）和 l.Omg/血選擇標(biāo)記G418中生長。為了進(jìn)行膜制備，使細(xì)胞生長至約80%匯合。將細(xì)胞在憐酸 鹽緩沖鹽水中洗涂兩次并收獲。使用短暫離屯、使細(xì)胞沉淀，并將細(xì)胞沉淀物保持在冰上。在 適量的緩沖液1 (例如，lOmL)中，將細(xì)胞沉淀物用ULTRA-THURRAX分散儀器勻漿化20-30秒。 將勻漿離屯、15分鐘。將沉淀物在lOmL緩沖液2中重懸（勻漿化)并離屯、。再一次重復(fù)該步驟。 將所得沉淀物重懸于緩沖液2中并測定蛋白質(zhì)濃度。對膜進(jìn)行等分并儲存在-8(TC下。
[0722] 程序
[0723] 1.對于受體結(jié)合試驗，將50μ1的測定緩沖液添加至測定板的每個孔中。
[0724] 2.連續(xù)稀釋測試化合物W得到W下濃度：8χ10ΕΕ-7Μ、8χ10ΕΕ-8Μ、8χ10ΕΕ-9Μ、 8x10邸-101、扣1066-1謹(jǐn)、扣10邸-121和扣1(^6-131。將2541添加至測定板的適當(dāng)?shù)目字小?br>[0725] 3.將細(xì)胞膜等份解凍并稀釋至其工作濃度。將50μ1添加至測定板的每個孔中。
[0726] 4.將WGA SPA珠 W20mg/mL懸浮于測定緩沖液中。在臨添加至測定板之前將懸浮液 在測定緩沖液中稀釋至lOmg/mL。將50μ1添加至測定板的每個孔中。
[0727] 5.通過將25μ1的480ρΜ[125Ι]-化Ρ-1]-(7-36)Ν此溶液添加至測定板的每個孔中 開始溫育。留下25μ1等份W用于測量總計數(shù)/孔。
[072引 6.測定板在30°C下溫育化。
[07巧]7.將測定板離屯、lOmin。
[0730] 8.在化ckard TopCountNXT儀器中讀取測定板。
[0731] 計算
[0732] 將來自TopCount儀器的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移至GraphPad Prism軟件。該軟件對重復(fù)測量的值 取平均，并進(jìn)行非線性回歸。通過該軟件計算IC50值并WnM為單位報告。 師](b)膜高血糖素受體結(jié)合
[0734]本試驗的目的在于測試本發(fā)明的膜高血糖素衍生物的體外受體結(jié)合活性。該受體 結(jié)合活性是衍生物對人膜高血糖素受體的親和力的量度。
[07對原理
[0736]在置換結(jié)合試驗中測量每種化合物與人膜高血糖素受體的受體結(jié)合。在運(yùn)一類型 的試驗中，使標(biāo)記的配體(在運(yùn)種情況下為1251-膜高血糖素)與受體結(jié)合。W-系列的濃度 將每種衍生物添加至含有人膜高血糖素受體的分離的膜中，并監(jiān)測標(biāo)記的配體的置換。將 受體結(jié)合報告為一半的標(biāo)記的配體從受體上置換時的濃度，即I巧0值。
[0737] 材料
[073引在該試驗中使用W下化學(xué)品：含有Glutamax的DMEM(Gibco 61965-026)、Pen/ strepdnvitrogen l5l40-l22)、G4l8(Invi1:;rogen 10131-027)、Versene(G;Lbco 15040)、 IM 胎pes(Gibco 15630)、PBS(Invit;rogen 14190-094)、胎牛血清（Invitrogen 16140- 071 )、MgCb(Merck 1.05832.1000)、抓TAQnvitrogen 15575-038)、CaCl2(Sigma，C5080)、 吐溫20(Amresco 0850C335)、卵清蛋白（Sigma A5503)、SPA顆粒(麥胚凝集素(WGA) SPA珠， Perkin Elmer RPNQOOOl)、[1251]-膜高血糖素（內(nèi)部生產(chǎn)的）、0ptiPlateTM-96(Packard 6005290)ο
[0739] 歷6緩沖液由25111]\1皿?68、2111]\11旨(：12和1111]\1抓了4組成，并且將抑調(diào)節(jié)至7.4。結(jié)合 緩沖液由50mM補(bǔ)充有5mM MgCb、ImM CaCl2、0.02 %吐溫20和0.1 %卵清蛋白的皿陽S組成， 并且將pH調(diào)節(jié)至7.4。
[0740] 細(xì)胞培養(yǎng)和膜制備。
[0741 ]本試驗中使用的細(xì)胞(克隆BHK hGCGR A3巧5)為用含有編碼人膜高血糖素受體的 cDNA的表達(dá)質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞。
[0742] 使細(xì)胞在5%C02下在DMEM、10%胎牛血清、l%Pen/Strep(青霉素/鏈霉素）和 l.Omg/血選擇標(biāo)記G418中生長。為了進(jìn)行膜制備，使細(xì)胞生長至約80%匯合。將細(xì)胞在憐酸 鹽緩沖鹽水中洗涂兩次并收獲。使用短暫離屯、使細(xì)胞沉淀，并將細(xì)胞沉淀物保持在冰上。通 過添加約5mL HME緩沖液裂解細(xì)胞，通過吸液混合，并在液氮中驟凍。使細(xì)胞裂解物快速解 凍，并添加 HME緩沖液至10血。將細(xì)胞沉淀物用化TRA-T皿RRAX分散儀器勻漿化20-30秒。在4 °C下W20，OOOxG離屯、勻漿10分鐘。將沉淀物在l-2mL HME緩沖液中重懸（勻漿化）。測定蛋白 質(zhì)濃度。對膜進(jìn)行等分并在液氮中驟凍，并儲存在-80°C下。
[0743] 程序
[0744] 1.對于受體結(jié)合試驗，將50μ1測定緩沖液添加至測定板的每個孔中。
[0745] 2.連續(xù)稀釋測試化合物W得到W下濃度：8χ10ΕΕ-7Μ、8χ10ΕΕ-8Μ、8χ10ΕΕ-9Μ、 8x10邸-101、扣1066-1謹(jǐn)、扣10邸-121和扣1(^6-131。將2541添加至測定板的適當(dāng)?shù)目字小?br>[0746] 3.將細(xì)胞膜等份解凍并稀釋至其工作濃度。將50μ1添加至測定板的每個孔中。
[0747] 4.將WGA SPA珠 W20mg/mL懸浮于測定緩沖液中。在臨添加至測定板之前將懸浮液 在測定緩沖液中稀釋至lOmg/mL。將50μ1添加至測定板的每個孔中。
[0748] 5.通過將25μ1的48化Μ[125Ι]-膜高血糖素溶液添加至測定板的每個孔中開始溫 育。留下25μ1等份W用于測量總計數(shù)/孔。
[0749] 6.測定板在25°C下溫育化。
[0"7加]7.將測定板在1500巧m下離屯、lOmin。
[0巧1] 8.在化ckard TopCountNXT儀器中讀取測定板。
[0巧2] 計算
[0753] 將來自TopCount儀器的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移至GraphPad Prism軟件。該軟件對重復(fù)測量的值 取平均，并進(jìn)行非線性回歸。
[0754] 試驗（III):用于評估膚組合物的物理穩(wěn)定性的化T原纖維形成試驗
[0755] 本試驗的目的在于評估本發(fā)明的膜高血糖素衍生物在水溶液中的物理穩(wěn)定性。
[0756] 膚的低物理穩(wěn)定性可導(dǎo)致淀粉樣原纖維的形成，觀察到其在樣品中呈有序的絲狀 大分子結(jié)構(gòu)，運(yùn)最終可導(dǎo)致凝膠形成。運(yùn)在傳統(tǒng)上通過對樣品的目測來測量。然而，運(yùn)種測 量非常不方便，并且取決于觀察者。因此，小分子指示探針的應(yīng)用更為有利。硫代黃素 T (化T)是運(yùn)樣一種探針，并且當(dāng)與原纖維結(jié)合時具有不同的巧光特征[Naiki等人（1989) Anal.Biochem.177,244-249；LeVine(1999)Methods.Enzymol.309,274-284]〇
[0757]可采用W下表達(dá)式利用S形曲線描述原纖維形成的時程[Nielsen等人（2001) Biochemistry 40,6036-6046]：
[0巧引
[0759] 運(yùn)里，F(xiàn)為在時間t時的化T巧光。常數(shù)to為達(dá)到最大巧光的50%所需的時間。描述 原纖維形成的兩個重要參數(shù)是通過t〇-2T計算出的滯后時間和表觀速率常數(shù)kapp 1Λ。
[0760]
[0761] 提出膚的部分折疊中間體的形成是原纖維形成的一般啟動機(jī)制。運(yùn)些中間體中很 少成核形成模板(進(jìn)一步的中間體可W裝配到該模板上)并且原纖維形成繼續(xù)進(jìn)行。滯后時 間對應(yīng)于建立核的臨界質(zhì)量的時間間隔，而表觀速率常數(shù)是形成原纖維本身的速率。
[0762] 在每次測定之前新鮮制備樣品。每種樣品的組成在圖例中描述。使用適量的濃 化0H和肥1將樣品的抑調(diào)節(jié)至所需值。將硫代黃素 T從在出0中的儲備溶液添加至樣品中，至 ΙμΜ的最終濃度。
[0763] 將20化1的樣品等份(在lOmM pH 7.5的皿PES緩沖液中的25化Μ膜高血糖素衍生 物/類似物)放置在96孔微量滴定板(Packard 0ptiPlate?-96，白色聚苯乙締）中。通常，將 每種樣品（對應(yīng)于一個測試條件）的四個或八個重復(fù)物放置在一列孔中。該板用Scotch Pad (Qiagen)密封。
[0764] 在Fluoroskan Ascent化巧光讀板器(Thermo Labsystems)中完成在給定溫度下 的溫育、搖動和化T巧光發(fā)射的測量。采用調(diào)節(jié)至96化pm、振幅為1mm的定軌搖動（orbital shaking),將板在37°C下溫育。使用通過444nm濾光器的激發(fā)，W及通過485nm濾光器的發(fā)射 的測量，來完成巧光測量。
[0765] 通過將板在測定溫度下溫育lOmin來啟動每個運(yùn)行。在期望的時間段內(nèi)每20分鐘 對板進(jìn)行測量。在各次測量之間，如描述的那樣將板搖動并加熱。
[0766] 完成化T試驗之后，合并每種樣品的四個或八個重復(fù)物，并在18°C下W200(K)巧m離 屯、30分鐘。通過0.22μπι過濾器過濾上清液，并將等份轉(zhuǎn)移至HPLC小瓶中。
[0767] 使用合適的標(biāo)準(zhǔn)作為參考，通過反相HPLC測定在初始樣品中和在過濾的上清液中 的膚的濃度。將過濾樣品的濃度占初始樣品濃度的百分比分?jǐn)?shù)報告為回收率。
[0768] 將測量點^Microsoft Excel格式保存W供進(jìn)一步處理，并使用Gra地Pad Prism 進(jìn)行曲線繪制和擬合。在不存在原纖維時來自ThT的背景發(fā)射可忽略不計。數(shù)據(jù)點通常是四 個或八個樣品的平均值，并示出標(biāo)準(zhǔn)差誤差條。僅將在同一實驗（即在同一板上的樣品）中 獲得的數(shù)據(jù)呈現(xiàn)在同一曲線圖中，W確保實驗之間原纖維形成的相對量度。
[0769] 可將數(shù)據(jù)集擬合至方程（1)。然而，通過目測曲線來確定本文報告的原纖維形成之 前的滯后時間，W確定化T巧光增加至顯著高于背景水平的時間點。
[0770] 試驗(IV):化學(xué)穩(wěn)定性評估
[0771 ]本試驗的目的在于評估本發(fā)明的膜高血糖素衍生物在水溶液中的化學(xué)穩(wěn)定性。
[0772] 通過RP-U化C測定膜高血糖素類似物的化學(xué)穩(wěn)定性。將凍干樣品溶解在8mM pH 8.6的憐酸鹽緩沖液中，接著用肥1調(diào)節(jié)至抑7.3，至最終濃度為33341。將樣品在5°(：和371： 下溫育14天，然后進(jìn)行RP-UPLC分析。將純度定義為每個色譜圖中的主峰相對于所有完整峰 的總面積的面積百分比?；瘜W(xué)穩(wěn)定性被確定為在37Γ下14天之后的純度損失(本文中也稱 為化學(xué)降解），其如下確定:在5°C下溫育的樣品或起始樣品（沒有溫育）與37°C之間的純度 差除W起始樣品或在5°C下溫育14天之后的純度。
[0773] 使用Waters Acquity C甜 Fluoro-phenyl 150x 2.1mm, 1.7μηι柱進(jìn)行RP-UF*LC分 析，該柱使用由A : 0 . 0 9 Μ憐酸鹽緩沖液p Η 3 . 6 (憐酸氨二錠（d i - ammoniumhy化oge噸hosphat))、10%MeCN(v/v% )，和B:60%MeCN(v/v% )、20%異丙醇（v/ V%)組成的流動相系統(tǒng)在50°C和0.3mL/min的流速下操作。
[0774] 在215nm下進(jìn)行UV檢測。W下示出了用于大多數(shù)樣品的典型梯度圖形。為了使類似 物在與大多數(shù)類似物相比基本不同的保留時間下洗脫，對梯度圖形作了一些調(diào)整，W便更 好地實現(xiàn)樣品間的純度評估比較。數(shù)據(jù)證實了本發(fā)明的膜高血糖素衍生物的改善的化學(xué)穩(wěn) 定性。
[0775] 通過大小排阻高效液相色譜法（SE-HPLC)測定高分子量蛋白質(zhì)化MWP)含量。使用 Waters Insulin HMWP 7.8x 300mm柱進(jìn)行分析，該柱使用由500mM 化CUlOmM NaH2P〇4、5mM 出P〇4和50%(v/v)2-丙醇組成的解離流動相在50°C和0.5mL/min的流速下操作。在215nm下 進(jìn)行UV檢測。
[0776] 用于RP-UPLC分析的典型梯度圖形：
[0777]
[0778] 實施例23:本發(fā)明的衍生物的性質(zhì)
[0779] 分別使用如本文所述的試驗（I)(b)、試驗（II)(b)、試驗（III)和試驗（IV)測試本 發(fā)明的衍生物對人膜高血糖素受體的效力化巧化GlucagonR)、對人膜高血糖素受體的親和 力（I巧OhGlucagonR)、物理穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性。結(jié)果不于表1中。
[0780] 表 1
[0781]
[0782]
[0783] 結(jié)果顯示本發(fā)明的衍生物具有良好的對膜高血糖素受體的效力、良好的對膜高血 糖素受體的親和力W及良好或適度的物理穩(wěn)定性和良好的化學(xué)穩(wěn)定性。
[0784] 雖然本文已說明并描述了本發(fā)明的某些特征，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員現(xiàn)將想到許 多修改、替換、變化和等同項。因此，應(yīng)當(dāng)理解，所附權(quán)利要求旨在涵蓋落入本發(fā)明的真正范 圍之內(nèi)的所有運(yùn)樣的修改和變化。
【主權(quán)項】
1. 一種包含式I的胰高血糖素類似物的衍生物，或所述衍生物的藥學(xué)上可接受的鹽、酰 胺或酯： Imp-X2-His-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xi〇-Ser-Xi2-Tyr-Leu-Xi5-Xi6-Arg-Arg-Ala-X2〇 -X2i_Phe-Val-X24_Trp-Leu-X27_X28 _X29_X3〇 [ I ] 其中 X2 為 Ser 或 Aib; Xio為Tyr、Leu、Ile或Val; Xi2 為 Lys 或 Arg; Xi5 為 Asp 或 Glu; Xi6 為Ser、Ala、Leu、Thr、Aib、lie、Val或Lys; X2〇 為 Gln、Glu、Aib 或 Lys; X2i 為 Asp、Glu 或 Lys; X24 為 Gln、Ala、Glu、Ait^Lys; X27為Met、Leu或Val; X28*Asn、Ser、Thr、Gln、Ala、Gly、Gli^Lys; 父29為!111'、617、361'、6111、厶1&、6111或1^8;并且 X3〇不存在或為Lys; 并且其中所述衍生物包含與在式1的位置乂12、乂16、乂20、乂21、乂24、乂28、乂29或乂3()處的賴氨酸的 側(cè)鏈的氮原子共價連接的取代基， 其中所述取代基具有式II: Y1-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Y7-Y8-Y9-Y10-Y11-Y12- [II] 其中Yl為氫或表示C2-6?；鶊F(tuán)或琥珀?；糠?，并且 其中Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Yl()、Yll或Yl2單獨地不存在或單獨地表示選自Ser殘基、 Ala殘某、CM V殘某、式i、式i i、式i i i、式i V和式V的氣某酸殘某， 其中式i、i i、i i i和i V單獨地具有立體化學(xué)L或D， 并且條件是所述取代基具有三至十個帶負(fù)電荷的部分。2. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的衍生物，其中所述胰高血糖素類似物與胰高血糖 素 (SEQ ID NO: 1)相比在所述胰高血糖素類似物中包含3-15個氨基酸殘基修飾，如置換或 添加。3. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的衍生物，其中Y12與在所述衍生物的位置X12、X16、 Χ20、Χ2Ι、Χ24、Χ28、Χ29或X3Q處的賴氨酸的側(cè)鏈的所述氮原子連接。4. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的衍生物，其中所述取代基與賴氨酸的側(cè)鏈的ε_氮 原子共價連接。5. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的衍生物，其中所述取代基與在位置X24處的賴氨酸 連接。6. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的衍生物，其中所述取代基具有3、4、5、6、7、8、9或 10個帶負(fù)電荷的部分。7. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的衍生物，其中所述取代基包含3-10個如3-5個或4 個式i的殘基。8. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的衍生物，其中所述取代基的心為乙酰基基團(tuán)。9. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的衍生物，其中所述取代基選自以下部分：10. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的衍生物，其中所述衍生物選自 Ne24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁?；鵠氨基]-4-羧基 丁?；鵠氨基]-4-羧基丁?；鵠氨基]-4-羧基丁酰基]-[Impl，Aib2，His3，Leul6，Lys24, Leu27，Ser28 ]-胰高血糖素 化學(xué)式I:Ne24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁?；鵠氨基]-4-羧基 丁?；鵠氨基]_4_駿基丁?；鵠氨基]_4_駿基丁酰基]-[Impl，Aib2，His3，Glul5，Lys24, Leu27，Ser28 ]-胰高血糖素 化學(xué)式2:Ne24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁?；鵠氨基]-4-羧基 丁?；鵠氨基]_4_駿基丁酰基]氨基]_4_駿基丁?；鵠-[Impl，Aib2，His3 ,LeulO，Glul5， Lys24，Leu27，Ser28]_ 胰高血糖素 化學(xué)式3:Ne28-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁?；鵠氨基]-4-羧基 丁?；鵠氨基]_4_駿基丁?；鵠氨基]_4_駿基丁酰基]-[Impl，Aib2，His3，Glul5，Ala24, Leu27，Lys28]-胰高血糖素 化學(xué)式4:Ne24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基 丁?；鵠氨基]_4_駿基丁?；鵠氨基]_4_駿基丁酰基]-[Impl，His3，Glul5, Lys24，Leu27， Ser28]_胰高血糖素 化學(xué)式5:Ne24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁?；鵠氨基]-4-羧基 丁?；鵠氨基]_4_駿基丁?；鵠氨基]_4_駿基丁酰基]-[Impl，His3，Glul5，Glu21，Lys24, Leu27，Ser28 ]-胰高血糖素Ne24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁?；鵠氨基]-4-羧基 丁?；鵠氨基]_4_駿基丁酰基]氨基]_4_駿基丁?；鵠-[Impl，Aib2，His3，Glul5，Glu21, Lys24，Leu27，Ser28]_ 胰高血糖素 化學(xué)式7:7 Ne24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁?；鵠氨基]-4-羧基 丁?；鵠氨基]-4-羧基丁?；鵠氨基]-4-羧基丁酰基]-[Impl ,His3 ,Leul6,Glu21 ,Lys24, Leu27，Ser28 ]-胰高血糖素 化學(xué)式8:Ne24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁?；鵠氨基]-4-羧基 丁酰基]氨基]-4-羧基丁?；鵠氨基]-4-羧基丁?；鵠-[Impl，His3，Leul6，Lys24，Leu27， Ser28]_胰高血糖素 化學(xué)式9:Ne24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁?；鵠氨基]-4-羧基 丁酰基]氨基]-4-羧基丁?；鵠氨基]-4-羧基丁酰基]-[Impl，Aib2，His3，Vall6，Lys24, Leu27，Ser28 ]-胰高血糖素 化學(xué)式10:Nel6-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁?；鵠氨基]-4-羧基 丁?；鵠氨基]_4_駿基丁?；鵠氨基]_4_駿基丁?；鵠-[Impl，His3，Glul5，Lysl6，Glu21, Leu27，Ser28 ]-胰高血糖素 化學(xué)式11:Ne2°-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁?；鵠氨基]-4-羧基 丁?；鵠氨基]_4_駿基丁?；鵠氨基]_4_駿基丁?；鵠-[Impl，His3，Glul5，Lys20，Glu21, Leu27，Ser28 ]-胰高血糖素 化學(xué)式12:Ne21-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基 丁?；鵠氨基]_4_駿基丁?；鵠氨基]_4_駿基丁酰基]-[Impl，His3，Glul5，Lys21，Leu27， Ser28]_胰高血糖素 化學(xué)式13:Ne28-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁?；鵠氨基]-4-羧基 丁?；鵠氨基]_4_駿基丁?；鵠氨基]_4_駿基丁酰基]-[Impl，His3，Glul5，Glu21，Leu27， Lys28]_胰高血糖素 化學(xué)式14:Ne29-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁?；鵠氨基]-4-羧基 丁?；鵠氨基]_4_駿基丁?；鵠氨基]_4_駿基丁酰基]-[Impl，His3，Glul5，Glu21，Leu27， Ser28，Lys29]_胰高血糖素 化學(xué)式15:Na( [Impl,His3，Glul5，Glu21，Leu27，Ser28]_胰高血糖素基）-，[(45)-4-[[(45)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁?；鵠氨基]-4-羧基丁酰 基]氨基]-4-羧基丁酰基]Ly s 化學(xué)式16:Ne24-[2-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁?；鵠氨基]-4-駿基丁?；鵠氨基] _4_駿基丁?；鵠氨基]_4_駿基丁?；鵠氨基]乙?；鵠-[Impl，His3， Glul5，Glu21，Lys24，Leu27，Ser28]_ 胰高血糖素 化學(xué)式17:Ne2M(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁?；鵠氨基]-4-羧基丁酰基]氨 基]-4-羧基丁?；鵠-[Impl，His3，Glul5，Glu21，1^824，1^1127,36128]-胰高血糖素 化學(xué)式18:Νε24-[ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4-[ [ (4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁?；鵠氨 基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁?；鵠氨基]-4-羧基丁?；鵠_ [Impl，His3，Glul5，Glu21，Lys24，Leu27，Ser28]_胰高血糖素 化學(xué)式19:Ne24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁?；鵠氨基]-4-羧基 丁?；鵠氨基]-4-羧基丁?；鵠氨基]-4-羧基丁?；鵠-[Impl，His3，Alal6，Lys24，Leu27， Ser28]_胰高血糖素 化學(xué)式20:Ne24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁?；鵠氨基]-4-羧基 丁?；鵠氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁?；鵠-[Impl，His3，Aibl6，Lys24，Leu27， Ser28]_胰高血糖素 化學(xué)式21:以及 Ne24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基 丁?；鵠氨基]_4_駿基丁?；鵠氨基]_4_駿基丁?；鵠-[Impl，His3，Glul5，Glu21，Lys24, Leu27，Glu28]_胰高血糖素 化學(xué)式22:11. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的衍生物，其中所述衍生物具有如通過本文所述 的試驗(IV)所測定的小于5%的化學(xué)降解。12. -種胰高血糖素類似物形式的中間產(chǎn)物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、酰胺或酯，該中 間產(chǎn)物與胰高血糖素(SEQ ID NO: 1)相比包含以下修飾： (i) [Impl，Aib2，His3，Leul6，Lys24，Leu27，Ser28]_胰高血糖素； (ii) [Impl，Aib2，His3，Glul5，Lys24，Leu27，Ser28]_胰高血糖素； (iii) [Impl，Aib2，His3 ,LeulO，Glul5，Lys24，Leu27，Ser28]_胰高血糖素； (iv) [Impl，Aib2，His3，Glul5，Ala24，Leu27，Lys28]_胰高血糖素； (V) [Impl，His3，Glul5，Lys24，Leu27，Ser28]_膜高血糖素； (vi) [Impl，His3，Glul5，Glu21，Lys24，Leu27，Ser28]_ 胰高血糖素； (vii) [Impl，Aib2，His3，Glul5，Glu21，Lys24，Leu27，Ser28]_胰高血糖素； (viii) [Impl，His3，Leul6，Glu21，Lys24，Leu27，Ser28]_膜高血糖素； (ix) [Impl，His3，Leul6，Lys24，Leu27，Ser28]_膜高血糖素； (X) [Impl，Aib2，His3，Val 16，Lys24，Leu27，Ser28]_胰高血糖素； (xi) [Impl，His3，Glul5，Lysl6，Glu21，Leu27，Ser28]_胰高血糖素； (xii) [Impl，His3，Glul5，Lys20，Glu21，Leu27，Ser28]_胰高血糖素； (xiii) [Impl，His3，Glul5，Lys21，Leu27，Ser28]_膜高血糖素； (xiv) [Impl，His3，Glul5，Glu21，Leu27，Lys28]_膜高血糖素； (XV) [Impl，His3，Glul5，Glu21，Leu27，Ser28，Lys29]_胰高血糖素； (xvi) [Impl，His3，Glul5，Glu21，Leu27，Ser28，Lys30]_胰高血糖素； (xvii) [Impl，His3，Alal6，Lys24，Leu27，Ser28]_膜高血糖素； (xviii) [Impl，His3，Aibl6，Lys24，Leu27，Ser28]_膜高血糖素； (xix) [Impl，His3，Glul5，Glu21，Lys24，Leu27，Glu28]_ 胰高血糖素。13. -種組合物，其包含如前述權(quán)利要求中任一項所述的衍生物以及一種或多種藥學(xué) 上可接受的賦形劑。14. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的衍生物，其用于在醫(yī)學(xué)中使用。15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的衍生物，其用于治療和/或預(yù)防低血糖。
【文檔編號】C07K14/605GK106029088SQ201580008796
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2015年2月18日
【發(fā)明人】J.F.勞, T.克魯塞, P.K.尼伊森
【申請人】諾和諾德股份有限公司