疫苗與佐劑的組合物以及治療尿路感染的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明描述了新的佐劑組合物和制劑，在冷藏、室溫以及達(dá)到約37℃下具有極好的穩(wěn)定性，能以顯著低的成本生產(chǎn)。本發(fā)明描述了新的疫苗組合物和制劑，來(lái)治療和預(yù)防由革蘭氏陰性細(xì)菌包括大腸桿菌和多藥物抗性大腸桿菌(E.coli)所引起的尿路感染。本發(fā)明還描述了施用所述新的疫苗組合物和制劑的方法，以及預(yù)防和治療由革蘭氏陰性細(xì)菌包括E.coli和多藥物抗性大腸桿菌引起的尿路感染的處置方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】疫苗與佐劑的組合物從及治療尿路感染的方法
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求于2013年9月25日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)NO. 61/882498的權(quán)益，通過(guò)引 用將其全部?jī)?nèi)容合并在文本中。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 發(fā)明領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明提供了新的佐劑組合物和制劑，在被冷藏時(shí)和在室溫下，W及在達(dá)到約37 Γ時(shí)具有極好的穩(wěn)定性，其可顯著低的成本生產(chǎn)。運(yùn)些新的佐劑組合物和制劑被用于 疫苗，展現(xiàn)了增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫反應(yīng)的優(yōu)越性質(zhì)，同時(shí)引起更少的嚴(yán)重的注射位置和全身 性反應(yīng)。本發(fā)明還描述了新的疫苗組合物和制劑，來(lái)治療和預(yù)防由革蘭氏陰性細(xì)菌包括大 腸桿菌和多藥物抗性大腸桿菌化.coli)所引起的尿路感染。本發(fā)明還提供了施用所述新的 疫苗制劑的方法，W及預(yù)防和治療由革蘭氏陰性細(xì)菌包括大腸桿菌和多藥物抗性大腸桿菌 引起的尿路感染的處置方法。
【背景技術(shù)】
[0005] 在美國(guó)和其他國(guó)家，通過(guò)使用疫苗來(lái)保護(hù)大多數(shù)人群免于許多傳染性疾病。僅舉 幾個(gè)例子，疫苗保護(hù)人免于傳染性疾病，例如，白喉、破傷風(fēng)、百日咳、肝炎、流感和脊髓灰質(zhì) 炎。社會(huì)依賴(lài)于疫苗所提供的保護(hù)，運(yùn)使得大部分運(yùn)些傳染性疾病對(duì)于美國(guó)公民來(lái)說(shuō)僅是 歷史的一部分。實(shí)際上，在美國(guó)，疾病控制中屯、(CDC)實(shí)施了兒童疫苗計(jì)劃，其在2010年為接 近4千萬(wàn)兒童提供了免費(fèi)的接種。運(yùn)些兒童的大約70%加入了醫(yī)療補(bǔ)助計(jì)劃。為了防止疾病 的爆發(fā)和降低治療運(yùn)些傳染性疾病的成本，美國(guó)已經(jīng)使疫苗接種具有獨(dú)立于經(jīng)濟(jì)狀態(tài)的國(guó) 家優(yōu)先性。低成本的疫苗在現(xiàn)在和可預(yù)見(jiàn)的將來(lái)是急需的，運(yùn)些疫苗具有國(guó)家優(yōu)先性。
[0006] 考慮到疫苗的重要性，顯而易見(jiàn)，需要不斷開(kāi)發(fā)新的和改進(jìn)的疫苗，來(lái)改善我們的 人群的健康狀態(tài)。更關(guān)鍵的是需要提供更低成本的疫苗來(lái)幫助降低美國(guó)衛(wèi)生系統(tǒng)的扶搖直 上的成本。國(guó)家優(yōu)先性是要降低美國(guó)衛(wèi)生系統(tǒng)的成本。
[0007] 即使在美國(guó)，符合疫苗保存需求有助于解決運(yùn)些困難問(wèn)題。由衛(wèi)生和公共事業(yè)部 的監(jiān)察長(zhǎng)辦公室所進(jìn)行的并于2012年報(bào)道的一項(xiàng)研究（0EI-04-10-00430)發(fā)現(xiàn)，參與疾病 預(yù)防控制中屯、(CDC)的兒童疫苗計(jì)劃的供應(yīng)商：1.)將疫苗暴露于運(yùn)些疫苗被批準(zhǔn)的溫度范 圍W外的溫度下；2.)將疫苗在它們被批準(zhǔn)的溫度范圍之外的溫度下保存在冷柜和冷凍庫(kù) 中；W及3.)將到期的疫苗與未到期疫苗保存在一起。
[000引疫苗的其他問(wèn)題在于，疫苗可能具有短的保質(zhì)期，容易在使用之前到期。
[0009] 此外，監(jiān)察長(zhǎng)辦公室進(jìn)行的上述研究發(fā)現(xiàn)，兒童疫苗計(jì)劃的46個(gè)美國(guó)衛(wèi)生供應(yīng)商 中的16個(gè)將到期的疫苗與未到期的疫苗保存在一起。平均起來(lái)，運(yùn)些到期的疫苗已經(jīng)過(guò)期 約6個(gè)月。例如，據(jù)報(bào)道，截止2010年7月1日，耗費(fèi)了約2億6千萬(wàn)美元生產(chǎn)的4千萬(wàn)份家豬流 感疫苗到期并被銷(xiāo)毀。在美國(guó)每年疫苗到期產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0010] 佐劑增強(qiáng)了對(duì)疫苗的抗原的免疫反應(yīng)。在美國(guó)由CDC實(shí)施的兒童疫苗計(jì)劃中提供 的34種疫苗中，20種含有佐劑。運(yùn)20種具有佐劑的疫苗中，19種疫苗含有白抓佐劑a種疫苗 含有吸附到白抓的單憐酷基脂質(zhì)A(GSK的MPL)作為佐劑。
[0011]盡管全行業(yè)嘗試開(kāi)發(fā)新的佐劑，目前在美國(guó)只有白抓和葛蘭素史克公司（GSK)的 MI^L用于批準(zhǔn)的疫苗。在美國(guó)許多佐劑開(kāi)發(fā)遭遇失敗，但對(duì)新的和有效的佐劑的需求仍然很 局。
[0012] 含有吸附到白抓的3'-0-去酷基-4'-單憐酷基脂質(zhì)A的GlaxoSmithKline(GSK)的 Cervarix疫苗在美國(guó)被批準(zhǔn)用于預(yù)防由人類(lèi)乳頭狀瘤病毒引起的子宮頸癌。由于生產(chǎn)MPL 的起始材料分離自Salmonella minnessota，最終產(chǎn)品是六酷基、五酷基和四酷基類(lèi)似物的 動(dòng)態(tài)的復(fù)雜混合物;運(yùn)些類(lèi)似物的每一種在生物學(xué)活性方面都不同。結(jié)果，3'-0-去酷基- 4'-單憐酷基脂質(zhì)A呈現(xiàn)了制造、測(cè)試和使用上的挑戰(zhàn)，其大大提高了疫苗的成本和供應(yīng)問(wèn) 題。
[0013] 除了保存問(wèn)題之外，疫苗注射對(duì)接受者而言經(jīng)常是痛苦的。在疫苗的施用之后可 能發(fā)生注射部位的發(fā)紅、腫脹、癢和觸痛。含有Μ化和白抓佐劑的GSK的Cervarix疫苗處方信 息列出了局部有害事件，其可能包括疼痛、發(fā)紅和腫脹。在接受了 GSK的Cervarix疫苗或單 獨(dú)的佐劑白抓的受試者中約百分之對(duì)良告了妨礙日常生活的局部疼痛。在施用含有MI^L和白 抓佐劑的疫苗之后觀察到的全身性不良反應(yīng)包括頭痛、疲勞、發(fā)熱、皮疹、肌肉痛、關(guān)節(jié)痛、 等麻疹和消化系統(tǒng)癥狀，包括惡屯、、嘔吐、腹瀉和/或腹痛。
[0014] 此外，在"人類(lèi)乳頭狀瘤病毒二價(jià)（16和18型）疫苗的臨床回顧(Types 16 and 18) vaccine[GSK's Cervarix Vaccine],Recombinant,Biologies License Application Efficacy Supplement"中描述的，四項(xiàng)研究報(bào)告了局部有害事件，包括在大約百分之16的 受試者中妨礙運(yùn)動(dòng)的局部疼痛。據(jù)報(bào)道在大約百分之3的受試者中也產(chǎn)生了大于50mm的腫 脹。同樣的四項(xiàng)研究報(bào)道了有百分之2.4到7.8的受試者產(chǎn)生了關(guān)節(jié)痛、疲勞、胃腸、頭痛和 肌肉痛的全身性的嚴(yán)重有害事件。
[0015] 注射部位反應(yīng)和全身性反應(yīng)的嚴(yán)重度是明顯需要治療，設(shè)及麻醉劑使用、IV輸水 或其他醫(yī)師實(shí)施的處置，W及來(lái)自于防止由腹瀉、肌肉痛、疲勞、頭痛和嘔吐的日?；顒?dòng)帶 來(lái)的工作損失。
[0016] 免疫實(shí)踐顧問(wèn)委員會(huì)(Advisory Committee on Immunization Practices)建立 了大流行性感冒的國(guó)家策略的建議。運(yùn)種策略包括"在大流行宣告的6個(gè)月內(nèi)向所有美國(guó)居 民提供大流行病疫苗：大流行病疫苗(6億劑）[大流行性流感的國(guó)家策略（2005年11月）和 HHS大流行性感冒規(guī)劃(2005年11月r的需求，W及需要使用佐劑來(lái)試圖接近運(yùn)種看似難W 接近的免疫接種目標(biāo)。由于在美國(guó)沒(méi)有用于一般性流感疫苗的批準(zhǔn)的佐劑，美國(guó)國(guó)家疫苗 儲(chǔ)備沒(méi)有選擇，花費(fèi)約5億美元從Novadis購(gòu)買(mǎi)MF59佐劑。由于"在9到12歲兒童中觀察到的 高度疫苗反應(yīng)原性，研究V7P29的方案被修改為排除了小于9歲的兒童"，MF59佐劑在Fluad 兒科的臨床研究中被中斷。該證據(jù)支持了在國(guó)家大流行病宣告期間，由于使用MF59佐劑將 發(fā)生大量的嚴(yán)重反應(yīng)，并需要額外的醫(yī)學(xué)護(hù)理。
[0017] 單憐酷基脂質(zhì)A的合成類(lèi)似物在約2005年期間由Avanti Polar Lipids (Alabaster，Alabama，USA)引入。Avanti化lar Lipids將運(yùn)種合成類(lèi)似物命名為六酷基憐 酸化二糖（phospho;rylated hexaacyl disaccharide) "PHAD"，也被稱(chēng)為"GLA"ePHADW分子 量1763道爾頓、約98 %純度的單一化合物存在，在附圖1中示出。PHAD的純度與GSA的Μ化形 成顯著對(duì)比，如上所述，MPL分離自Salmonella minnesota，作為動(dòng)態(tài)的復(fù)雜化合物存在。不 同于GSA的MPUPHAD的生產(chǎn)過(guò)程、供應(yīng)、使用和穩(wěn)定性可W按照純化合物來(lái)緊密的監(jiān)視與控 制。
[0018] 特定的佐劑或佐劑的組合是否將增強(qiáng)針對(duì)每種特定抗原的免疫應(yīng)答是不可預(yù)見(jiàn) 的。例如，GSK的Cervarix疫苗含有單憐酷基脂質(zhì)A和白抓，因?yàn)檫\(yùn)種組合優(yōu)于單獨(dú)的白抓 (Giannini et al.化ccine，2006，24，P. 5937-5949)。使用了重組乙型肝炎表面抗原的疫苗 觀察的了類(lèi)似的效力提高(Vaccine,1998,16(7)，p.708-714)。在美國(guó)專(zhuān)利6,889,885的表6 中顯示了另一個(gè)實(shí)例，其展現(xiàn)了抗原-佐劑組合在針對(duì)特定抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答的差異性。運(yùn) 些發(fā)明人展現(xiàn)了，與單獨(dú)的白帆或單憐酷基脂質(zhì)A相比，QS-21佐劑，W及單獨(dú)的白抓加單憐 酷基脂質(zhì)A的佐劑組合產(chǎn)生了針對(duì)74kD蛋白質(zhì)的更大的抗體反應(yīng)。此外在2009年，Novadis Vaccines的Derek T.0'化gan和Ennio De Gregorio公開(kāi)了關(guān)于佐劑開(kāi)發(fā)的綜述。（Drug Discovery Today,14(11/12),June 2009,P.541-551)他們報(bào)告了，對(duì)于某些蛋白質(zhì)或抗 原，白抓是相對(duì)弱的佐劑，仍然需要新的佐劑。
[0019] 2004年，美國(guó)傳染病學(xué)會(huì)(IDSA)預(yù)先警告了世界范圍內(nèi)不斷增多的抗生素抗性細(xì) 菌的未決危機(jī)，沒(méi)有新的地平線抗生素能對(duì)抗危機(jī)的發(fā)生。2009年，IDSA鑒定出對(duì)當(dāng)前所有 抗生素有抗性的正在發(fā)生的細(xì)菌感染，最具警告性的抗生素抗性細(xì)菌是革蘭氏陰性細(xì)菌， 包括E. col i。2010年，IDSA聲稱(chēng)，盡管許多私營(yíng)的、公眾的和政府的實(shí)驗(yàn)室作出了努力，研究 沒(méi)有產(chǎn)生治療抗生素抗性細(xì)菌的新選擇，現(xiàn)在需要全球性的投入。IDSA的敦促得到了 GlaxoSmithKline的科學(xué)家的支持，他們預(yù)測(cè)的是，用于治療革蘭氏陰性細(xì)菌感染的任何新 抗生素啟用之前需要超過(guò)十到十五年（Payne et al.Nature Reviews Drug Discoveiy.2007,6,p.29-40)。
[0020] 他們的預(yù)測(cè)基于34家公司開(kāi)發(fā)新抗生素的嘗試失敗。在科學(xué)界中正在形成共識(shí)， 美國(guó)急需新的用于細(xì)菌感染的治療方法。Adam L.Hersh和同事在2012年在Clinical Infectious Disease的期刊化ersh等，CID.2012.54(11) ,1677-8)中報(bào)告了對(duì)整個(gè)美國(guó)的 562名傳染病醫(yī)生的調(diào)查，在過(guò)去的一年，63%的醫(yī)生治療過(guò)對(duì)所有已知抗生素有抗性的細(xì) 菌感染患者。運(yùn)些數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了對(duì)細(xì)菌感染的新的治療手段的需求。本領(lǐng)域中鑒定新的治療 替代品W預(yù)防和治療革蘭氏陰性細(xì)菌感染的失敗是有據(jù)可查的。
[0021] 此外，處于開(kāi)發(fā)中的至少五種用W預(yù)防或治療金黃葡萄球菌感染的疫苗近年來(lái)已 被停止了。運(yùn)些包括Staph VAX、Ve;ronate、Aurexis Aurograb和V710。鑒定新的疫苗W預(yù)防 和治療細(xì)菌感染的失敗是有據(jù)可查的。
[0022] 尿路感染化TIs)是世界范圍內(nèi)最普遍的傳染性疾病之一，在美國(guó)是女性遭遇的第 一位的傳染性疾病。UTI的癥狀包括排尿困難(排尿痛苦）、尿急和恥骨上疼痛。在美國(guó)每年 估計(jì)有7百萬(wàn)到1千1百萬(wàn)女性患上急性非復(fù)雜性尿路感染。超過(guò)半數(shù)的成年女性在她們的 一生中將遭遇一次或多次尿路感染化TI) ,25-44%的女性正經(jīng)歷復(fù)發(fā)性尿路感染化TI)。實(shí) 際上，在美國(guó)大約1，〇〇〇,〇〇〇名女性和男性每年經(jīng)歷Ξ次或更多次UTI急性發(fā)作。此外，盡管 有適當(dāng)?shù)目股刂委熀湍蛞褐谐跏几腥镜拿黠@清除，復(fù)發(fā)常常在感染的30到90天內(nèi)發(fā)生。
[0023] 盡管在UTI的流行病學(xué)和病理學(xué)方面有了新的進(jìn)展，在我們實(shí)際上預(yù)防或治療運(yùn) 些感染的能力方面還沒(méi)有新近的較大的進(jìn)步。經(jīng)歷復(fù)發(fā)性感染的患有UTI的25-44%的女性 需要額外的治療、額外的費(fèi)用，W及在某些情況下需要廣泛的泌尿?qū)W評(píng)估來(lái)防止發(fā)生更嚴(yán) 重的并發(fā)癥。因而，具有改善患者便利性和降低費(fèi)用的潛力的安全有效的疫苗對(duì)于患者、供 應(yīng)商和衛(wèi)生保健機(jī)構(gòu)是相當(dāng)有吸引力的。在復(fù)發(fā)的im群體中，由于治療選項(xiàng)不斷減少，抗 菌素耐藥性受到極大關(guān)注。因而，急需開(kāi)發(fā)新的方法用于UTI預(yù)防和治療，其更少地依賴(lài)于 抗微生物劑的使用。
[0024] 由尿路致病性大腸桿菌（UPEC)引起尿路感染(UTI)是最常見(jiàn)的，其可能對(duì)高達(dá) 85%的社區(qū)獲得性UTI負(fù)責(zé)。已經(jīng)掲露了關(guān)鍵的致病級(jí)聯(lián)，UPEC通過(guò)它逃避宿主防御并在尿 路中快速擴(kuò)大數(shù)量導(dǎo)致疾病。運(yùn)一工作支持了對(duì)UTI疫苗的臨床需求。
[0025] FimH在致病級(jí)聯(lián)的幾個(gè)階段中起到重要作用，運(yùn)使得它成為主要的疫苗祀點(diǎn)。缺 乏FimH粘附素的UPEC菌株不能有效地定殖膀脫。針對(duì)FimH的疫苗將激活宿主防御來(lái)在感染 的所有階段識(shí)別和清除UPEC，即使是在IBC或細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)庫(kù)中被保護(hù)時(shí)。
[0026] 使用含有角整締的MF59作為佐劑的FimCH疫苗由Medlmmune Inc.和Scott 化Itgren教授的實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家共同發(fā)明（美國(guó)專(zhuān)利6,500,434;完全合并在本文中）DFimH 蛋白和FimC蛋白W非共價(jià)的蛋白質(zhì)復(fù)合物FimCH的形式存在。FimC使FimH穩(wěn)定化，雖然產(chǎn)生 針對(duì)兩種蛋白質(zhì)抗體，然而僅針對(duì)FimH的抗體在動(dòng)物中表現(xiàn)出降低膀脫的E.coli定殖。因 而在疫苗中使用FimCH作為抗原受到了需要有效佐劑的限制。
[0027] 具有含角整締的Μ陽(yáng)9佐劑的FimCH疫苗(水包油的乳劑)在1期臨床試驗(yàn)中引發(fā)了 免疫應(yīng)答(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)20030138449,全部合并在本文中）。再次使用含有角整締的MF59在 兩個(gè)獨(dú)立的群體中進(jìn)行了 2期臨床試驗(yàn)，但是在運(yùn)些試驗(yàn)的任一個(gè)中女性都沒(méi)有產(chǎn)生針對(duì) Fi恤的相關(guān)的IgG滴度。由于運(yùn)些令人失望的結(jié)果，使用MF59佐劑的Medlmmune的FimCH疫苗 的開(kāi)發(fā)被停止。當(dāng)與某些抗原一起使用時(shí)，帶有角整締的MF59有引起嚴(yán)重的局部注射部位 和全身性反應(yīng)的歷史。在運(yùn)些2期臨床試驗(yàn)期間，女性經(jīng)歷了嚴(yán)重的注射部位反應(yīng)和嚴(yán)重的 全身性反應(yīng)。由于運(yùn)種失敗，在美國(guó)還沒(méi)有用于UTI的治療或預(yù)防的疫苗。
[00%]對(duì)于預(yù)防和治療UTI的疫苗存在著持續(xù)的需求。Medlmmune和其他人在開(kāi)發(fā)UTI疫 苗上的失敗表明了開(kāi)發(fā)用于細(xì)菌感染的新疫苗方面的困難性。Medlmmune證明了白抓不足 W增強(qiáng)對(duì)FimCH的免疫應(yīng)答。Medlmmune沒(méi)有明確的佐劑替代品選擇來(lái)匹配FimCH抗原。
[0029] 因而，對(duì)于疫苗W及在疫苗中用來(lái)增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的佐劑存在急迫的需 求。需要疫苗和用于疫苗的佐劑，其具有擴(kuò)展的穩(wěn)定性而不犧牲效力。特別地，對(duì)于在室溫 下穩(wěn)定的疫苗和佐劑存在著急迫的和公認(rèn)的需求。此外，希望的是擁有在高于室溫的溫度 下穩(wěn)定的疫苗、佐劑和組合物。
[0030] 此外，需要產(chǎn)生更少的嚴(yán)重的注射部位和全身性反應(yīng)的佐劑和藥物組合物。
[0031] 需要新的疫苗來(lái)預(yù)防和治療細(xì)菌感染，特別是用于UTI的預(yù)防和治療的疫苗。
[0032] 希望擁有具有增加保質(zhì)期疫苗和用于在疫苗中增強(qiáng)抗原的免疫應(yīng)答的佐劑，運(yùn)些 疫苗與佐劑可-種低成本的方式生產(chǎn)。運(yùn)樣的疫苗和佐劑將顯著地降低美國(guó)的醫(yī)療成 本，特別是如果它們可W在室溫或更高溫度下保存而不影響它們的穩(wěn)定性。
[0033] 希望擁有產(chǎn)生最小的注射部位反應(yīng)和全身性反應(yīng)的佐劑和疫苗。希望擁有具有盡 可能少的賦形劑的制劑。
[0034] 希望擁有疫苗和用于增強(qiáng)治療細(xì)菌感染的免疫應(yīng)答疫苗的佐劑。希望擁有疫苗和 用于增強(qiáng)對(duì)患有尿路感染化TI)的患者的大腸桿菌的免疫應(yīng)答疫苗的佐劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0035] 本發(fā)明解決了在此描述的先有技術(shù)的佐劑、疫苗和藥物組合物的許多難題。本發(fā) 明提供了新的液體佐劑組合物和制劑，其提供了許多意想不到的和有益的性質(zhì)，運(yùn)些性質(zhì) 在佐劑和藥物組合物的領(lǐng)域中是未知的。
[0036] 在一個(gè)方面，提供的液體佐劑組合物和制劑展現(xiàn)出在室溫下維持穩(wěn)定性超過(guò)約6 個(gè)月，W及達(dá)到約37°C時(shí)維持穩(wěn)定性約60天或更久。所述新的液體佐劑組合物和制劑可W 保存在冷藏溫度或室溫條件下，有利于儲(chǔ)運(yùn)期間的保質(zhì)期和降低運(yùn)輸成本。
[0037] 通過(guò)使用一種低成本和出乎意料顯著穩(wěn)定的佐劑制劑，W更少的嚴(yán)重注射部位反 應(yīng)和全身性反應(yīng)增強(qiáng)了對(duì)大腸桿菌巧.coli)抗原的免疫應(yīng)答。本發(fā)明所述的佐劑制劑解決 了在疫苗施用中許多當(dāng)前的障礙。
[0038] 本文描述的數(shù)據(jù)展現(xiàn)了，本發(fā)明的佐劑制劑增強(qiáng)了對(duì)包括細(xì)菌和病毒抗原的其他 抗原的免疫應(yīng)答。
[0039] 本發(fā)明通過(guò)治療由包括大腸桿菌化.coli)的革蘭氏陰性細(xì)菌引起的尿路感染為 降低運(yùn)種困難作出了貢獻(xiàn)。
[0040] 在一個(gè)方面，公開(kāi)了一種新的佐劑組合物，在2°C到8°C和達(dá)到約37°C的室溫下具 有顯著的穩(wěn)定性。
[0041] 在本發(fā)明的一個(gè)方面中，一種組合物，其包含一種合成的佐劑PHAD和選自由巧樣 酸鹽、班巧酸鹽和憐酸鹽組成的組的緩沖劑，其濃度為約25mM到約50mM，優(yōu)選為28mM到約 50mMW及最優(yōu)選為30mM到約50mM。運(yùn)些新的PHAD組合物優(yōu)選地是水懸浮緩沖液。所述組合 物可各種方式用于疫苗和醫(yī)藥方面。優(yōu)選沒(méi)有其他成分的所述組合物顯著改善了在懸 浮液中PHAD的穩(wěn)定性，并在室溫下及達(dá)到約37Γ下獲得了顯著穩(wěn)定性。所述組合物在冷藏 溫度下也展現(xiàn)了極好的穩(wěn)定性。提供一種高效和經(jīng)濟(jì)的PHAD組合物，其不需要為了長(zhǎng)期穩(wěn) 定性而冷藏，運(yùn)代表了在佐劑和制藥技術(shù)方面的顯著進(jìn)步。
[0042] 在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了作為水懸浮緩沖液的新的佐劑制劑。在一個(gè)實(shí)施 方式中，所述佐劑制劑包括一種合成的佐劑PHAD，選自由巧樣酸鹽、班巧酸鹽和憐酸鹽組成 的組的緩沖劑，其濃度為約1 OmM到約50mM，優(yōu)選的約25mM到約50mM，更優(yōu)選的28mM到約 50mM，最優(yōu)選的30mM到約50mM的，W及優(yōu)選的加入一種合成的憐脂酷膽堿。當(dāng)添加憐脂酷膽 堿時(shí)，優(yōu)選的緩沖劑濃度可W擴(kuò)展到約lOmM到約50mM，同時(shí)得到本文描述的顯著穩(wěn)定性。運(yùn) 些新的佐劑制劑優(yōu)選為水懸浮緩沖液。所述佐劑制劑保存在冷藏和室溫下時(shí)具有極好的長(zhǎng) 期穩(wěn)定性，W及在達(dá)到約37Γ時(shí)具有極好的穩(wěn)定性。運(yùn)些制劑可極低的成本生產(chǎn)。
[0043] 本文所述新的佐劑制劑不需要為了室溫穩(wěn)定性或在達(dá)到約37Γ時(shí)的穩(wěn)定性而凍 干或等效的加工。所述佐劑制劑包括一種特定的緩沖劑，W及任選地和優(yōu)選地合成一種或 多種憐脂酷膽堿，其選自由DMPC、DPPC、DSPC、D0PC和P0PC組成的組、優(yōu)選為DPPC，W及一種 人工合成的佐劑PHAD，其摩爾比約1:1到40:1 (憐脂酷膽堿:PHAD)，優(yōu)選為約1:1到20:1 (憐 脂酷膽堿:PHAD)，更優(yōu)選為約2:巧化：1(憐脂酷膽堿：PHAD)，W及最優(yōu)選為約2:巧化：1 (DPPC:PHAD)。。
[0044] 本發(fā)明的最有價(jià)值的方面之一是，所述佐劑制劑僅包括在本文所述指定濃度的巧 樣酸鹽、班巧酸鹽或憐酸鹽緩沖劑中的單一佐劑PHAD，W及優(yōu)選單一的憐脂酷膽堿。不需要 其他的成分來(lái)產(chǎn)生在室溫下出乎意料的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。此外，所述佐劑制劑可ww低成本生 產(chǎn)。就此來(lái)說(shuō)，運(yùn)些佐劑制劑在室溫下的長(zhǎng)期穩(wěn)定性是顯著的，而且不需使用膽固醇、憐脂 酷甘油、憐脂酷乙醇胺、單酷基甘油、凍干保護(hù)劑和可代謝的油即可實(shí)現(xiàn)上述穩(wěn)定性。在不 使用一種或多種運(yùn)些成分的情況下，常規(guī)先有技術(shù)的佐劑不能獲得該穩(wěn)定性。
[0045] 本發(fā)明的另一個(gè)方面是佐劑制劑不需要兩種或兩種W上的憐脂酷膽堿或添加憐 脂酷甘油。如實(shí)施例中顯示的，兩種或兩種W上種憐脂酷膽堿或一種或多種憐脂酷甘油可 W添加到運(yùn)些制劑中，但優(yōu)選地，不需要它來(lái)實(shí)現(xiàn)本文展現(xiàn)的顯著的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。
[0046] 然而不受理論的限制，巧樣酸鹽、班巧酸鹽或憐酸鹽緩沖劑的優(yōu)選的緩沖劑濃度 擴(kuò)展到約lOmM到約50mM來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所述顯著穩(wěn)定性，被認(rèn)為是由于添加優(yōu)選的賦形劑， 優(yōu)選W本文所述本發(fā)明優(yōu)選方面限定的憐脂酷膽堿與PHAD的摩爾比添加憐脂酷膽堿。更優(yōu) 選地，優(yōu)選的緩沖劑濃度為約25mM到約50mM，再更優(yōu)選為28mM到約50mM，最優(yōu)選為30mM到約 50mM。優(yōu)選地，pH值范圍在約4.0到約7.5，優(yōu)選為約4.巧喲6.5，更優(yōu)選為約5.0至化.0。
[0047] 如實(shí)施例中所示，當(dāng)配制在水、等于或大于lOOmM的乙酸鹽緩沖劑、憐酸緩沖液 (PBS)、或巧樣酸鹽或憐酸鹽緩沖劑時(shí)，沒(méi)有呈現(xiàn)出運(yùn)種優(yōu)越的室溫穩(wěn)定性。相反，W巧樣酸 鹽、班巧酸鹽或憐酸鹽配制約lOmM到約50mM，但優(yōu)選為約25mM到約50mM，更優(yōu)選為28mM到約 50mM，最優(yōu)選為30mM到約50mM濃度時(shí)產(chǎn)生了穩(wěn)定性。
[0048] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式包括非離子表面活性劑，優(yōu)選的聚山梨醋80,來(lái)降低本 發(fā)明的顆粒聚集。
[0049] 不需要凍干是顯著的優(yōu)點(diǎn)和意想不到的突破，因?yàn)橄嗽S多高成本的步驟和風(fēng) 險(xiǎn)。本發(fā)明的另一個(gè)方面，與先有技術(shù)相比，運(yùn)些佐劑制劑在增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答，同時(shí) 在施用期間顯著更少的引起嚴(yán)重注射部位反應(yīng)和全身性反應(yīng)方面是優(yōu)越的。本發(fā)明的另一 個(gè)方面，佐劑制劑實(shí)質(zhì)上沒(méi)有膽固醇和可代謝的油包括角整締。在本領(lǐng)域中，廣泛地認(rèn)為膽 固醇是佐劑制劑或脂質(zhì)體實(shí)現(xiàn)功能所必需的。本文所述本發(fā)明產(chǎn)生的所有益處不需要膽固 醇。
[0050] 因此，本文所述佐劑制劑和藥物組合物的優(yōu)點(diǎn)包括:作為水懸浮緩沖液至少維持6 個(gè)月的室溫穩(wěn)定性，和/或達(dá)到約37Γ下維持約60天或更久的穩(wěn)定性;每次施用時(shí)更少地引 起嚴(yán)重注射部位反應(yīng)和全身性反應(yīng)，同時(shí)增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫反應(yīng)；W及使用更少的材料或 成分，更低濃度的材料或成分生產(chǎn)或制造的更低成本。本發(fā)明的佐劑制劑提供的運(yùn)Ξ種組 合的主要益處，是通過(guò)合成MLA或MI^L的類(lèi)似物作為基于白抓的佐劑替代物的佐劑早先未能 實(shí)現(xiàn)的。
[0051] 本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了含有所述新的佐劑制劑的新的疫苗組合物用于治療 或預(yù)防由革蘭氏陰性細(xì)菌包括大腸桿菌和多重抗藥性的E.coli引起的尿路感染。還提供了 施用所述新的疫苗組合物的方法，W及預(yù)防和治療由革蘭氏陰性細(xì)菌包括E.coli和多重抗 藥性的E.coli引起的尿路感染的方法。
[0052] 本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了在患有復(fù)發(fā)性尿路感染的人群體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì) FimH的抗體的方法。本發(fā)明的另一個(gè)方面是疫苗組合物，其在患有復(fù)發(fā)性尿路感染的人類(lèi) 中誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)FimH的抗體。
[00對(duì)在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了疫苗試劑盒，該試劑盒包含PHAD組合物或制劑或 疫苗組合物，W及施用指導(dǎo)和儲(chǔ)藏說(shuō)明。所述說(shuō)明用于PHAD組合物或制劑暴露在室溫下和 達(dá)到約37°C。運(yùn)些描述了保存、運(yùn)輸和暴露溫度的說(shuō)明可W由政府管理部口包括美國(guó)食品 和藥品管理局化S抑A)和歐洲藥品管理局化uropean Medicines Agency)批準(zhǔn)。優(yōu)選地，一 種或多種試劑盒成分是注射器中的PHAD組合物或制劑。
[0054] 本發(fā)明的另一個(gè)方面，PHAD組合物和制劑W及疫苗組合物是無(wú)菌的組合物和無(wú)菌 的藥物組合物，優(yōu)選的，所述無(wú)菌的PHAD組合物和制劑容納于無(wú)菌注射器中。
[0055] 附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0化6]附圖1顯示了 PHAD的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0化7]附圖2顯示了 DPPC的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0化引附圖3是說(shuō)明利用IgG抗FimH對(duì)FimCH和Q133K間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定化LISA)圖。
[0059] 附圖4是說(shuō)明分析FimCH和Q13：3K的效價(jià)測(cè)定圖。
[0060] 附圖5是說(shuō)明在效價(jià)測(cè)定中評(píng)估小分子抑制物的圖。兩種小分子，4-甲基傘形酬酷 基-a-D-甘露化喃糖巧(UFMP)和甲基-a-D-甘露化喃糖巧(MDMP)抑制結(jié)合于FimH的甘露糖。 [0061 ]附圖6是FimCH藥物物質(zhì)樣品的代表性的CEX-HPLC層析譜。
[0062 ]附圖7是說(shuō)明在小鼠的FimCH/PHAD免疫之后對(duì)大腸桿菌化.CO1 i)感染保護(hù)的圖。 [006引附圖8是一個(gè)實(shí)施例的DPPC和PHAD的高效液相色譜化PLC)層析譜。
[0064]發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明
[00化]室義
[0066] 提及PHAD數(shù)量或緩沖劑濃度(除非限定了）時(shí)"約"是指所列數(shù)量的加和減10%。
[0067] 。約25 XT'是指20 °C到30 °C的溫度。
[006引。約37 XT'是指34°C到40 °C的溫度。
[00例提及本文描述的緩沖劑濃度"約50mM"是指在50mM和小于lOOmM之間。如實(shí)施例中 顯示的aOOmM或更高的指定緩沖劑在允許長(zhǎng)期室溫穩(wěn)定性方面是無(wú)效的。緩沖劑濃度的上 限一般被評(píng)估為兩倍增加。當(dāng)提及約50mM時(shí)，本發(fā)明的指定的緩沖劑濃度優(yōu)選地小于90mM， 優(yōu)選地小于80mM，更優(yōu)選地小于70mM，最優(yōu)選地小于60mM。
[0070] 提及本文描述的緩沖劑濃度"約lOmT是指6mM到lOmM之間。
[0071] "可接受的載體"是指一種載體，其對(duì)于組合物的其他成分是無(wú)害的，W及對(duì)于要 與之應(yīng)用的材料是無(wú)害的。
[0072] "佐劑"是指提高抗原應(yīng)答的試劑;增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的物質(zhì)；或刺激針對(duì)抗 原的抗體生產(chǎn)的試劑。本領(lǐng)域中存在多種命名規(guī)則或術(shù)語(yǔ)。不參考特定的命名規(guī)則，本文描 述的佐劑組合物可W簡(jiǎn)單地稱(chēng)為佐劑制劑或佐劑制品。"施用"是指向受試者提供化合物或 組合物的任何方式。
[0073] "膠體"是指在整個(gè)水性緩沖的溶液或其他物質(zhì)中顯微地分散的一種或更多種化 學(xué)物質(zhì)、化合物或物質(zhì)。本文描述的佐劑制劑也可W描述為膠體。膠態(tài)分散體的一個(gè)實(shí)例是 化ngizone，其由用于胃腸外施用的兩性霉素 B-去氧膽酸鋼組成。
[0074] "臨界膠粒團(tuán)濃度"是指表面活性劑的濃度，高于該濃度形成膠粒團(tuán)，添加到系統(tǒng) 的所有額外的表面活性劑進(jìn)入膠粒團(tuán)。
[0075] 可LPC'是指1,2-二月桂酷基-sn-甘油基-3-憐酸膽堿/'DMPC'是指
[0076] 1,2-二肉豆違酷基-sn-甘油基-3-憐酸膽堿。
[0077] 可0PC'是指1,2-二油酷基-sn-甘油基-3-憐酸膽堿。
[007引 "DPPC"是指1,2-二棟桐酷基-sn-甘油基-3-憐酸膽堿（分子式C4地80N08P(fflf = 73站a)(化學(xué)結(jié)構(gòu)在附圖2中示出）。
[00巧]"DPPG"是指1,2-二棟桐酷基-sn-甘油基-3-憐酸-(r-rac-甘油）。
[0080] "DSPC'是指1,2-二硬脂酷基-sn-甘油基-3-憐酸膽堿。
[0081] "有效量"是指施用給人類(lèi)的疫苗組合物中足夠數(shù)量的FimCH或截短的FimH或其他 抗原，W引發(fā)針對(duì)FimH或其他抗原的免疫應(yīng)答，或足夠數(shù)量的佐劑，優(yōu)選的PHAD，W引發(fā)針 對(duì)抗原的增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。
[0082] "基本上沒(méi)有"材料、添加劑、化學(xué)物質(zhì)或賦形劑是指所述材料、添加劑、化學(xué)物質(zhì) 或賦形劑不被添加到本發(fā)明的組合物或制劑中，然而可W存在一定的混雜水平數(shù)量。
[0083] "基本上沒(méi)有嚴(yán)重的注射部位和全身性反應(yīng)"是指百分之二或更少的人經(jīng)歷運(yùn)些 可歸因于佐劑組合物或制劑的嚴(yán)重的注射部位和全身性反應(yīng)。
[0084] "注射部位反應(yīng)"是指在施用的部位或注射部位的疼痛、觸痛、發(fā)紅和/或腫脹。
[0085] "發(fā)明"是指本發(fā)明的至少某些實(shí)施方式;在本文中提及"發(fā)明"或"本發(fā)明"的各種 特征不意味著所有要求權(quán)利的實(shí)施方式或方法包括所提及的特征。
[0086] "標(biāo)記"或"標(biāo)簽"是指在任何物品或其任何容器或包裝物上，或伴隨運(yùn)樣的物品的 所有的標(biāo)簽和其他手寫(xiě)、印刷或圖形的物質(zhì)，因而，包括了伴隨本發(fā)明的疫苗或佐劑組合物 或制劑的任何包裝說(shuō)明書(shū)或信息頁(yè)。
[0087] "更少的嚴(yán)重的注射部位和全身性反應(yīng)"是指與在本文中和在其產(chǎn)品信息文件中 詳述的商業(yè)疫苗Cervarix，^及本文和Treanor et al.(Vaccine2013)中描述的 111￥631:1旨曰1:;[0]1曰1疫苗佐劑61^\-56相比，更少的嚴(yán)重的或6腳(10 3的注射部位反應(yīng)和/或全 身性反應(yīng)。
[0088] "脂質(zhì)體"一般是指泡囊，其由圍繞親水性核屯、的脂質(zhì)雙分子層膜組成。
[0089] "低成本"是指W組合物，其具有足W實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的新特性的最低濃度下的成分或 材料。
[0090] ""凍干保護(hù)劑"是指主要用于保護(hù)材料免于制造、保存和使用期間的凍傷或其他 損傷，或改善重構(gòu)，包括在使用前使之適當(dāng)溶解的材料、化學(xué)物質(zhì)或賦形劑，還包括用于修 改滲透壓或調(diào)節(jié)張力的運(yùn)些材料、化學(xué)物質(zhì)或賦形劑，包括但不限于山梨醇、甘露醇、甘露 糖、赤薛醇、木糖醇、甘油、薦糖、葡萄糖、海藻糖、麥芽糖、乳糖和纖維二糖。
[0091] "可代謝的油"主要是指在疫苗制劑或佐劑制劑中用作佐劑的角整締，或緊密相關(guān) 的角整締類(lèi)似物，但是還指在疫苗或佐劑制劑中作為賦形劑使用、或用來(lái)產(chǎn)生佐劑效果、或 產(chǎn)生乳劑的中鏈的甘油Ξ醋，包括Miglyol 810和來(lái)自植物、動(dòng)物或魚(yú)類(lèi)的油。實(shí)施例包括 葡萄巧油、大豆油、挪子油、橄攬油、葵花油、玉米油和整魚(yú)肝油。
[0092] "膠粒團(tuán)"是指分散在水性緩沖的溶液中的表面活性劑分子的聚集物，親水性的頭 部區(qū)域與周?chē)乃跃彌_的溶液接觸，將處于膠粒團(tuán)中屯、的疏水性的單獨(dú)的尾部區(qū)域隔 離。
[0093] "MLA"是指單憐酷基脂質(zhì)A。
[0094] "MPL"是指3 ' -0-去酷基-4 ' -單憐酷基脂質(zhì)A。
[0095] "藥學(xué)上可接受的載體"是指一種載體，其對(duì)于組合物的其他成分是無(wú)害的，W及 對(duì)于它的人類(lèi)或其他動(dòng)物受試者是無(wú)害的。在組合物的其他成分的情境下，"無(wú)害的"是指 所述載體將不會(huì)與其他成分反應(yīng)或降解其他成分，或干擾它們的效力。然而，干擾成分的效 力不是指純粹的成分稀釋。
[0096] "PHAD"是指合成的六酷基憐酸化二糖（結(jié)構(gòu)在附圖1中示出KPHAD可從Avanti 化lar Lipids獲得。PHAD是Toll樣受體4激動(dòng)劑。
[0097] "藥物組合物"是指一種組合物，其被給與哺乳動(dòng)物W圖治療或預(yù)防疾病，或?qū)τ?疫苗組合物來(lái)說(shuō)，產(chǎn)生治療或預(yù)防疾病的免疫原性應(yīng)答，降低癥狀，或提供某些類(lèi)型的治療 益處，或?qū)τ谧魟┙M合物來(lái)說(shuō)，增強(qiáng)對(duì)一種或更多種抗原的免疫應(yīng)答。
[0098] "憐酸鹽緩沖劑"或"憐酸鹽"是指選自W下的組的憐酸鹽緩沖劑:憐酸氨二鋼、憐 酸二氨鋼、憐酸二氨鐘和憐酸氨二鐘，或其一定的組合。優(yōu)選的，"憐酸鹽"由憐酸氨二鋼、憐 酸二氨鋼和憐酸二氨鐘組成。除非另有說(shuō)明，提及憐酸鹽緩沖劑特別地排除憐酸錠。
[0099] "PBS"是指憐酸緩沖劑(化抽Κ)4和/或K此Κ)4)、氯化鐘和氯化鋼的一般組成的憐酸 鹽緩沖鹽水。典型的PBS組合物包含約lOmM憐酸緩沖劑(化抽Κ)4和/或Κ出Ρ〇4)，2.7mM氯化鐘 和0.14M氯化鋼，pH7.4，25 °C。
[0100] "憐酸鹽巧樣酸鹽緩沖劑"是指含有巧樣酸和憐酸鋼的憐酸緩沖劑，其中pH值通過(guò) 巧樣酸鹽/巧樣酸和憐酸鹽/憐酸氨鹽的平衡來(lái)維持。憐酸鹽可W包括，例如化抽P化和/或 KH2FO4，可W使用巧樣酸鋼。
[0101] "憐脂酷膽堿"（做為選擇，稱(chēng)為"PC")是指含有膽堿的脂質(zhì)。實(shí)例包括但不限于 DMPC( 1，2-二肉豆違酷基-sn-甘油基-3-憐酸膽堿）、DPPC( 1，2-二棟桐酷基-sn-甘油基-3- 憐酸膽堿）、DSPC( 1，2-二硬脂酷基-sn-甘油基-3-憐酸膽堿）、D0PC( 1，2-二油酷基--sn-甘 油基-3-憐酸膽堿)和POPCa-棟桐酷基-2-油酷基-sn-甘油基-3-憐酸膽堿）。憐脂酷膽堿可 從Avanti Polar Lipids獲得。
[0102] "憐脂酷乙醇胺"是指含有附著于乙醇胺的憐酸基團(tuán)的脂質(zhì)，例如，1，2-二油酷基- sn-甘油基-3-憐酸乙醇胺。
[010引"憐脂酷甘油"是指含有甘油脂質(zhì)。實(shí)施例包括但不限于1,2-二肉豆違酷基-sn-甘 油基-3-憐酸-(r-rac-甘油）（DMPG)，1,2-二棟桐酷-sn-甘油基-3-憐酸（1 ' -rac-甘油 (DPPG)和1,2-二硬脂酷基-sn-甘油基-3-憐酸-(r-rac-甘油(DSPG)。
[0104] "P0PC'是指1-棟桐酷基-2-油酷基-sn-甘油基-3-憐酸膽堿。
[0105] "復(fù)發(fā)性尿路感染"是指人在約一年內(nèi)患有3到4次尿路感染。
[0106] "7令藏"是指2°C到8°C的溫度范圍。
[0107] 。室溫"是指19°C(66°F)到25°C(77°F)的溫度范圍。
[0108] "鹽水"是指在緩沖的水性溶液中約125mM到約155mM的化C1。例如，PBS-般含有 137mM NaCl，Tris緩沖鹽水可W含有150mM。
[0109] "嚴(yán)重的注射部位反應(yīng)"是指一種或更多種W下的：需要麻醉性止痛藥的、或妨礙 日?；顒?dòng)的疼痛;靜止時(shí)引起顯著不適的觸痛;超過(guò)10cm的發(fā)紅；W及超過(guò)10cm或妨礙日常 活動(dòng)的腫脹。
[0110] "嚴(yán)重的全身性反應(yīng)"是指一種或更多種W下的：惡屯、/嘔吐，其妨礙日?；顒?dòng)或需 要外部IV輸液;24小時(shí)內(nèi)有6次或更多次水狀便和/或>800克的腹瀉，或需要外部IV輸液;重 度使用麻醉止痛藥或妨礙日?；顒?dòng)的頭痛;顯著的或妨礙日常活動(dòng)的疲勞；W及顯著的或 妨礙日?；顒?dòng)的肌肉痛。
[0111] 提及膽固醇"基本上沒(méi)有"是指，如果存在的話，膽固醇是0.3mM或更少。
[0112] 提及單酷基甘油"基本上沒(méi)有"是指，如果存在的話，單酷基甘油是0.5mM或更少。 單酷基甘油的實(shí)例是單棟桐酷基甘油。
[0113] 提及憐脂酷甘油或憐脂酷乙醇胺"基本上沒(méi)有"是指如果存在的話，運(yùn)些物質(zhì)是 O.lmM或更少。
[0114] 提及凍干保護(hù)劑"基本上沒(méi)有"是指如果存在的話，運(yùn)些物質(zhì)是0.5%或更少的組 合物或制劑濃度。
[0115] "基本上沒(méi)有鹽水"是指在本發(fā)明的組合物或制劑中低于30mM NaCl。
[0116] "全身性反應(yīng)"是指惡屯、/嘔吐、腹瀉、頭痛、疲勞和/或肌肉痛。
[0117] "班巧酸鹽緩沖劑"或""班巧酸鹽"是指班巧酸二鋼或下二酸鋼二堿。可W使用下 二酸鐘，但是是較低優(yōu)選的。
[0118] 提及佐劑、活性、蛋白質(zhì)、抗原或藥物時(shí)"穩(wěn)定性"或"穩(wěn)定的"是指物質(zhì)或產(chǎn)品從它 的制造日期開(kāi)始的一段時(shí)間中、在一些變量如溫度和/或濕度的影響下為其預(yù)定用途保持 可接受的質(zhì)量。物質(zhì)的穩(wěn)定性常常通過(guò)分析數(shù)據(jù)(或其他相當(dāng)?shù)淖C據(jù))來(lái)證明。
[0119] "巧樣酸Ξ鋼"是指巧樣酸鹽緩沖劑(也稱(chēng)為"巧樣酸鹽"），例如，巧樣酸Ξ鋼二水 合物、巧樣酸鋼、巧樣酸鋼Ξ堿水化物或巧樣酸Ξ鋼鹽二水合物，如供應(yīng)商包括Sigma- A1化ich和抓Η化emicals所稱(chēng)的?？蒞使用巧樣酸鐘、巧樣酸鋼單堿和巧樣酸鋼二堿，但是 它們是較低優(yōu)選的。例如，用于注射的產(chǎn)品伊米巧酶（imiglucerase)使用了巧樣酸Ξ鋼和 巧樣酸氨二鋼的組合。運(yùn)些類(lèi)型的組合是可接受的。巧樣酸，CAS 77-92-9可W用于調(diào)節(jié)緩 沖劑的pH值，但是它不能代替在此列出的緩沖劑。
[0120] "截短的FimH"是指被截短的、包括來(lái)自Fi^l的前175個(gè)氨基酸的至少約25個(gè)到約 175個(gè)氨基酸殘基的截短的FimH蛋白。對(duì)于截短的FimH，截短的FimH蛋白優(yōu)選地包括FimH蛋 白的至少9%，更優(yōu)選的Fi恤蛋白的至少30%，最優(yōu)選的Fi恤蛋白的至少60%。
[0121] "尿路感染"是指一種醫(yī)學(xué)診斷，其特征在于W下一種或多種體征和癥狀:刺激性 的排尿，例如尿頻、尿急和排尿困難；肉眼血尿;或在檢查時(shí)引發(fā)的恥骨上觸痛;和/或一種 或多種W下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果:來(lái)自?xún)舨杉驅(qū)Ч苣蛞簶颖镜哪蛞涸嚰垯z查呈陽(yáng)性;來(lái)自?xún)舨杉?或?qū)Ч苣蛞簶颖镜娘@微鏡尿分析(可能存在白細(xì)胞、細(xì)菌和管狀物）；或凈采集或?qū)Ч苣蛞?樣品的尿液培養(yǎng)中E. coli > 103C即/ml。"疫苗"或"疫苗組合物"是指改善對(duì)疾病的免疫性 的組合物。疫苗組合物是引發(fā)針對(duì)所述組合物的抗原的免疫反應(yīng)和抗體生產(chǎn)的免疫原性組 合物。
【具體實(shí)施方式】
[0122] 在一個(gè)實(shí)施方式中，提供了藥物組合物或藥學(xué)上可接受的載體。所述藥物組合物 或藥學(xué)上可接受的載體包含PHAD和緩沖劑（稱(chēng)為"PHAD組合物"或"含有PHAD的組合物"或 "含有PHAD的組合物和載體"）。本發(fā)明的PHAD組合物優(yōu)選地是含水的緩沖懸浮液。所述緩沖 劑選自由約25mM到約50mM，更優(yōu)選的約28mM到約50mM，最優(yōu)選的30mM到約50mM的由巧樣酸 鹽、班巧酸鹽和憐酸鹽組成的組。優(yōu)選地，pH值在約4.0到約7.5,優(yōu)選的約4.巧喲6.5,更優(yōu) 選的約5.0到約6.0的范圍內(nèi)。具有運(yùn)種組合(PHAD和所述緩沖劑)的藥物組合物或載體展現(xiàn) 了作為藥物組合物的基礎(chǔ)的極好的穩(wěn)定性，并改善了 PHAD組合物的總體穩(wěn)定性。具體地，運(yùn) 些含有PHAD的組合物和載體實(shí)現(xiàn)了在室溫下和達(dá)到約37°C下的穩(wěn)定性。本發(fā)明的運(yùn)些含有 PHAD的組合物和載體還展現(xiàn)了在冷藏溫度到室溫下的極好的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。
[0123] 含有PHAD的藥物組合物和藥物載體(如早先描述的其包括PHAD和特定的緩沖劑） 可W任選地包括對(duì)于疫苗、佐劑制劑和其他藥物組合物典型的其他成分，例如賦形劑、修飾 劑、表面活性劑和添加劑。例如，憐脂酷膽堿(如W下更詳細(xì)描述的）可W任選地被添加，單 獨(dú)或與其他脂質(zhì)載體組合地。在一個(gè)實(shí)施方式中，可W添加來(lái)自大豆或蛋的天然發(fā)生的憐 脂酷膽堿，或來(lái)自大豆或蛋的氨化的憐脂酷膽堿，或合成的或天然混合的酷基憐脂酷膽堿。
[0124] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，一種或更多種疫苗抗原被添加到含有PHAD的組合物中來(lái)形 成疫苗。疫苗抗原可W是疫苗中使用的任何抗原，包括但不限于白喉、破傷風(fēng)、百日咳、脊髓 灰質(zhì)炎、肝炎和/或流感病毒的抗原制品。優(yōu)選地，疫苗抗原是如下文詳細(xì)描述的FimCH蛋白 質(zhì)復(fù)合物。
[0125] 含有PHAD的組合物和載體可任何濃度制備，一般地W約0.005到約l.Omg/ml 的PHAD，優(yōu)選的約0.05到1. Omg/ml的PHAD來(lái)制備，但通常不超過(guò)約2.5mg/ml的PHAD。含有 PHAD的組合物可W作為疫苗的佐劑來(lái)施用給動(dòng)物或人類(lèi)，優(yōu)選地遞送約10微克PHAD每劑到 約50微克PHAD每劑。
[0126] 確切的劑量可W根據(jù)使用的抗原來(lái)修改。更優(yōu)選的，施用約20微克PHAD每劑到約 50微克PHAD每劑。再更優(yōu)選的，施用約40微克PHAD每劑到約50微克PHAD每劑。
[0127] 如本文顯示的，當(dāng)在水、乙酸鹽緩沖劑、PBS、或巧樣酸鹽或憐酸鹽緩沖劑中配制濃 度等于或大于lOOmM時(shí)，在室溫和達(dá)到約37°C下含有PHAD的組合物是不存在出乎意料的穩(wěn) 定性的。PHAD組合物含有巧樣酸鹽、班巧酸鹽或憐酸鹽緩沖劑W產(chǎn)生出乎意料的穩(wěn)定性，其 濃度優(yōu)選為約25mM到約50mM，更優(yōu)選為28mM到約50mM，最優(yōu)選為30mM到約50mM。
[01 %]更特別地，PHAD組合物的優(yōu)選的緩沖劑、緩沖劑的濃度選自W下構(gòu)成的組:約25mM 到約 50mM; 25mM 到約 50mM;約 30mM 到約 50mM; 28mM 到約 50mM; 30mM 到約 50mM，約 30mM;約 40mM 到約50mM; 40mM到約50mM;約40mM; W及約50mM。
[0129] 此外，如下文的實(shí)施例中所顯示的，在含有PHAD的組合物和制劑中使用PBS不展現(xiàn) 本發(fā)明的新的特征，特別是本發(fā)明的穩(wěn)定性特征。相比之下，使用在此特別指定的巧樣酸 鹽、班巧酸鹽和憐酸鹽緩沖劑能夠獲得本發(fā)明的新的穩(wěn)定性特征。
[0130] 本發(fā)明的PHAD組合物優(yōu)選地基本上沒(méi)有角整締。
[0131] 本發(fā)明的PHAD組合物優(yōu)選地基本上沒(méi)有用作佐劑的可代謝的油。本發(fā)明的PHAD組 合物優(yōu)選地基本上沒(méi)有可代謝的油。
[0132] 本發(fā)明的PHAD組合物優(yōu)選地是含水的緩沖懸浮液，優(yōu)選地運(yùn)些含水的緩沖懸浮液 具有小于15化m，再更優(yōu)選的小于130皿的顆粒大小，優(yōu)選的，運(yùn)些PHAD組合物不是水包油乳 劑。
[0133] 本發(fā)明的PHAD組合物優(yōu)選地基本上沒(méi)有第二佐劑，包括白抓、角整締、QS2UMF59、 ToU-樣受體9激動(dòng)劑，W及其他佐劑，包括基于角整締的佐劑。第二佐劑具有在人類(lèi)中產(chǎn)生 更多嚴(yán)重的局部和全身性反應(yīng)的可能性，而沒(méi)有進(jìn)一步提高免疫應(yīng)答來(lái)改善治療結(jié)果的益 處。
[0134] PHAD組合物優(yōu)選地含有低于5mM的膽固醇，更優(yōu)選的低于ImM的膽固醇，再更優(yōu)選 的大體上沒(méi)有膽固醇，最優(yōu)選的基本上沒(méi)有膽固醇。
[0135] 優(yōu)選地，PHAD組合物大體上沒(méi)有憐脂酷甘油，更優(yōu)選的基本上沒(méi)有憐脂酷甘油。優(yōu) 選地，PHAD組合物大體上沒(méi)有憐脂酷乙醇胺，更優(yōu)選的基本上沒(méi)有憐脂酷乙醇胺。
[0136] 優(yōu)選地，PHAD組合物大體上沒(méi)有單酷基甘油，更優(yōu)選的基本上沒(méi)有單酷基甘油。
[0137] PHAD組合物優(yōu)選地大體上沒(méi)有鹽水，優(yōu)選的含有低于20mM的化C1，更優(yōu)選的含有 低于lOmM的NaCl，再更優(yōu)選的基本上沒(méi)有NaCl。
[0138] PHAD組合物優(yōu)選地大體上沒(méi)有凍干保護(hù)劑，再更優(yōu)選的基本上沒(méi)有凍干保護(hù)劑。
[0139] 所述PHAD組合物不需要凍干或等效的加工來(lái)為了保質(zhì)期或穩(wěn)定性保持PHAD的濃 度。因此，所述PHAD組合物優(yōu)選地不被凍干或不發(fā)生凍干;所述PHAD組合物優(yōu)選地在制備之 后不被干燥;所述PHAD組合物優(yōu)選地不需要在制備之后用液體或緩沖劑從干燥的材料中重 構(gòu);所述PHAD組合物優(yōu)選地在制造之后施用之前保持為含水的緩沖懸浮液。
[0140] 優(yōu)選地，PHAD組合物大體上沒(méi)有膽固醇、憐脂酷甘油和憐脂酷乙醇胺，W及基本上 沒(méi)有可代謝的油和第二佐劑。更更優(yōu)選的，PHAD組合物基本上沒(méi)有膽固醇、憐脂酷甘油和憐 脂酷乙醇胺，W及基本上沒(méi)有可代謝的油和第二佐劑。
[0141] 優(yōu)選地，本發(fā)明的PHAD組合物大體上沒(méi)有本文描述的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的新特征所不需 要的材料或賦形劑，而再更優(yōu)選的本發(fā)明的PHAD組合物基本上沒(méi)有本文描述的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明 的新特征所不需要的材料或賦形劑。優(yōu)選地，本發(fā)明的PHAD組合物大體上沒(méi)有一種、兩種、 Ξ種或更多種材料或賦形劑每種本文描述的組合物，運(yùn)種限制不排除僅一種材料或賦形劑 每組合物。
[0142] 優(yōu)選地，本發(fā)明的PHAD組合物基本上沒(méi)有一種、兩種、Ξ種或更多種材料或賦形劑 每種本文描述的組合物，運(yùn)種限制不排除僅一種材料或賦形劑每組合物。
[0143] 優(yōu)選地，當(dāng)本發(fā)明的含有PHAD的組合物或制劑在室溫下或達(dá)到約37°C下被保存、 運(yùn)輸、保持或施用時(shí)，最優(yōu)選的是已經(jīng)無(wú)菌過(guò)濾或使用無(wú)菌技術(shù)制備，更優(yōu)選的，所述無(wú)菌 的PHAD組合物和制劑容納在無(wú)菌的注射器中。
[0144] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了新的佐劑制劑。所述佐劑制劑包括一種合成生產(chǎn)的 PHAD、選自由約lOmM到約50mM的由巧樣酸鹽、班巧酸鹽和憐酸鹽組成的組的緩沖劑，W及優(yōu) 選的一種合成生產(chǎn)的憐脂酷膽堿(稱(chēng)為"PHAD制劑"或"含有PHAD的佐劑制劑"或"含有PHAD 的制劑"）。所述憐脂酷膽堿和PHAD W約1 (PC)比1 (PHAD)到約40 (PC)比1 (PHAD )，優(yōu)選的約 2.5(PC)比l(PHAD)的摩爾比存在。除非另有說(shuō)明，對(duì)PHAD制劑的引述適用于佐劑制劑。運(yùn)些 新的PHAD制劑優(yōu)選地是含水的緩沖懸浮液。所述佐劑制劑在保存在冷藏溫度到室溫下，W 及達(dá)到約37Γ時(shí)具有極好的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。另外，所述佐劑制劑可低成本生產(chǎn)。
[0145] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述佐劑制劑優(yōu)選地包括按照約1:1到40:1的摩爾比 (DPPC: PHAD)的一種合成生產(chǎn)的憐脂酷膽堿，優(yōu)選的DPPC，和一種合成生產(chǎn)的佐劑PHAD，W 及約1 OmM到50mM，但優(yōu)選的約25mM到約50mM，更優(yōu)選的28mM到約50mM，最優(yōu)選的30mM到約 50mM的巧樣酸鹽、班巧酸鹽或憐酸鹽緩沖劑。優(yōu)選地，pH值在約4.0到約7.5,優(yōu)選的約4.5到 約6.5,更優(yōu)選的約5.0到約6.0的范圍內(nèi)。重要地，所述PHAD佐劑制劑可W用僅一種佐劑 PHAD和優(yōu)選地一種憐脂酷膽堿來(lái)生產(chǎn)，從而允許它們W低成本生產(chǎn)。優(yōu)選地，所述佐劑制劑 含有PHAD作為唯一佐劑，然而可W使用其他的佐劑。本發(fā)明的長(zhǎng)期穩(wěn)定性特征進(jìn)一步降低 了使用運(yùn)些含有PHAD的佐劑制劑的成本。
[0146] 然而不受理論的限制，在所述PHAD制劑中巧樣酸鹽、班巧酸鹽或憐酸鹽緩沖劑的 優(yōu)選的緩沖劑濃度擴(kuò)展到約lOmM到約50mM來(lái)實(shí)現(xiàn)本文描述的本發(fā)明的顯著穩(wěn)定性，被認(rèn)為 是由于是W本文描述的憐脂酷膽堿與PHAD的本發(fā)明優(yōu)選方面的限定摩爾比來(lái)添加優(yōu)選的 賦形劑，優(yōu)選的為憐脂酷膽堿。
[0147] 本發(fā)明的含有PHAD的佐劑制劑優(yōu)選地基本上沒(méi)有角整締。
[0148] 本發(fā)明含有PHAD的佐劑制劑優(yōu)選地基本上沒(méi)有用作佐劑的可代謝的油。
[0149] 本發(fā)明的含有PHAD的佐劑制劑優(yōu)選地基本上沒(méi)有可代謝的油。
[0150] 本發(fā)明的含有PHAD的佐劑制劑優(yōu)選地是含水的緩沖懸浮液，優(yōu)選地運(yùn)些含水的緩 沖懸浮液具有小于150皿，再更優(yōu)選的小于130皿的顆粒大小，優(yōu)選的，運(yùn)些含有PHAD的佐劑 制劑不是水包油乳劑。
[0151] 本發(fā)明的含有PHAD的佐劑制劑優(yōu)選地基本上沒(méi)有第二佐劑，包括白抓、角整締、 QS21、MF59、To 1 ^樣受體9激動(dòng)劑，W及其他佐劑，包括基于角整締的佐劑。所述PHAD制劑優(yōu) 選地基本上沒(méi)有其他或額外的佐劑，因?yàn)樗鼈冇性谌祟?lèi)中產(chǎn)生更多的嚴(yán)重局部和全身性反 應(yīng)的可能性，而沒(méi)有進(jìn)一步提高免疫應(yīng)答或大體上改善治療結(jié)局的益處。
[0152] 所述含有PHAD的佐劑制劑優(yōu)選地含有低于5mM的膽固醇，更優(yōu)選的低于ImM的膽固 醇，再更優(yōu)選的大體上沒(méi)有膽固醇，最優(yōu)選的基本上沒(méi)有膽固醇。
[0153] 優(yōu)選地，所述含有PHAD的佐劑制劑大體上沒(méi)有憐脂酷甘油，更優(yōu)選的基本上沒(méi)有 憐脂酷甘油。
[0154] 優(yōu)選地，所述含有PHAD的佐劑制劑大體上沒(méi)有憐脂酷乙醇胺，更優(yōu)選的基本上沒(méi) 有憐脂酷乙醇胺。優(yōu)選地，所述含有PHAD的佐劑制劑大體上沒(méi)有單酷基甘油，更優(yōu)選的基本 上沒(méi)有單酷基甘油。
[01W]本發(fā)明的含有PHAD的佐劑制劑優(yōu)選地大體上沒(méi)有鹽水，優(yōu)選的含有低于20mM的 NaCl，更優(yōu)選的，所述PHAD制劑含有低于lOmM的NaCl，再更優(yōu)選的基本上沒(méi)有NaCl。
[0156] 優(yōu)選地，所述含有PHAD的佐劑制劑大體上沒(méi)有凍干保護(hù)劑，更優(yōu)選的基本上沒(méi)有 凍干保護(hù)劑。
[0157] 優(yōu)選地，所述含有PHAD的佐劑制劑大體上沒(méi)有膽固醇、憐脂酷甘油和憐脂酷乙醇 胺，W及基本上沒(méi)有可代謝的油和第二佐劑。
[0158] 更優(yōu)選的，所述含有PHAD的佐劑制劑基本上沒(méi)有膽固醇、憐脂酷甘油和憐脂酷乙 醇胺，W及基本上沒(méi)有可代謝的油和第二佐劑。
[0159] 優(yōu)選地，本發(fā)明的含有PHAD的制劑大體上沒(méi)有本文描述的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的新特征所 不需要的材料或賦形劑，而再更優(yōu)選的本發(fā)明含有PHAD的制劑基本上沒(méi)有本文描述的實(shí)現(xiàn) 本發(fā)明的新特征所不需要的材料或賦形劑。
[0160] 優(yōu)選地，本發(fā)明的含有PHAD的制劑大體上沒(méi)有一種、兩種、Ξ種或更多種材料或賦 形劑每種本文描述的含有PHAD的制劑，運(yùn)種限制不排除僅一種材料或賦形劑每種含有PHAD 的制劑。
[0161] 優(yōu)選地，本發(fā)明的含有PHAD的制劑基本上沒(méi)有一種、兩種、Ξ種或更多種材料或賦 形劑每種本文描述的含有PHAD的制劑，運(yùn)種限制不排除僅一種材料或賦形劑每種含有PHAD 的制劑。在另一個(gè)方面，提供了疫苗W及用疫苗治療和預(yù)防疾病的方法。
[0162] 為了制備疫苗，添加一種或更多種疫苗抗原到如上所述的含有PHAD的佐劑制劑 中。所述抗原可W是本文描述的FimCH蛋白質(zhì)復(fù)合物，或其他抗原，包括但不限于與白喉、破 傷風(fēng)、百日咳、脊髓灰質(zhì)炎、肝炎相關(guān)的抗原或流感病毒的抗原制品。
[0163] 使用PHAD制劑制備的疫苗不需要凍干來(lái)保持為了保質(zhì)期或穩(wěn)定性的PHAD濃度。凍 干是一種主要用于保存材料的脫水過(guò)程或冷凍-干燥過(guò)程?，F(xiàn)在有等效的過(guò)程來(lái)實(shí)現(xiàn)保存 材料的同一目標(biāo)。在制備本文描述的疫苗和PHAD組合物時(shí)，不需要凍干的疫苗或佐劑制劑 是意想不到的和顯著的優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)消除凍干的必要性，可W除去許多昂貴的步驟。首先，凍 干步驟本身被去除，其不僅除去了必需在良好監(jiān)視的無(wú)菌條件下進(jìn)行的昂貴的制造步驟， 還消除了對(duì)運(yùn)種制造步驟的驗(yàn)證和審查。接下來(lái)，該步驟的去除代表了持續(xù)的的費(fèi)用節(jié)省。 例如，每制備一個(gè)批次時(shí)，凍干步驟被節(jié)省了。此外，當(dāng)制備更大的批次時(shí)，或生產(chǎn)工序被轉(zhuǎn) 移到另一個(gè)工廠時(shí)，除去運(yùn)個(gè)步驟節(jié)省了額外的審批步驟。第二，凍干需要制造或取得、運(yùn) 送和與凍干制品一起保存稀釋劑的無(wú)菌小瓶，用于重構(gòu)。除去重構(gòu)步驟消除了運(yùn)種稀釋劑 小瓶和它的供應(yīng)鏈管理的成本。第Ξ，佐劑制劑的重構(gòu)可能影響它的無(wú)菌性，需要即刻使 用，或者如果不再預(yù)定的時(shí)間內(nèi)使用需要拋棄產(chǎn)品。第四，重構(gòu)過(guò)程易于出錯(cuò)，因而廠家失 去了對(duì)最終被施用給患者的產(chǎn)品的確切濃度的控制。本文描述的佐劑組合物和制劑通過(guò)除 去凍干需求消除了運(yùn)四個(gè)缺點(diǎn)。因此，所述含有PHAD的制劑優(yōu)選地不被凍干或不發(fā)生凍干； 所述含有PHAD的制劑優(yōu)選地在制備之后無(wú)需干燥;所述含有PHAD的制劑優(yōu)選地不需要在制 備之后用液體或緩沖劑從干燥的材料中重構(gòu);所述含有PHAD的制劑優(yōu)選地在制造之后施用 之前保持為含水的緩沖懸浮液。
[0164] 現(xiàn)在實(shí)現(xiàn)了本文描述的本發(fā)明的進(jìn)一步的顯著優(yōu)點(diǎn)。不需要凍干或等效的過(guò)程， 本發(fā)明的PHAD組合物或含有PHAD的制劑可W在制造之后立即被高效地和低成本地包裝到 注射器中。優(yōu)選地，所述組合物和制劑是無(wú)菌的，優(yōu)選地所述注射器是無(wú)菌的。運(yùn)些預(yù)裝填 的注射器可W在冷藏溫度到室溫下W及在達(dá)到約37°C下被運(yùn)送、保存、遞送或轉(zhuǎn)移。運(yùn)一優(yōu) 點(diǎn)提供了最高效和低成本的方式來(lái)使PHAD組合物和含有PHAD的制劑到達(dá)施用的地點(diǎn)。
[0165] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，非離子表面活性劑被添加到所述佐劑制劑中。優(yōu)選地，所述 非離子表面活性劑是聚山梨醋80,然而也可W使用其他的。所述非離子表面活性劑一般W 約0.001 %到1.0%，優(yōu)選的0.01 %到0.1 %的濃度添加到所述佐劑組合物中。在保存在室溫 下和達(dá)到約37°C下是，運(yùn)種添加可W防止PHAD制劑的輕微的聚集或平均顆粒大小的輕微提 高。優(yōu)選地，非離子表面活性劑來(lái)源于聚氧乙締山梨糖醇酢，包括但不限于聚山梨醋20和聚 山梨醋80。
[0166] 優(yōu)選的佐劑制劑包含選自由巧樣酸鹽、班巧酸鹽和憐酸鹽構(gòu)成的組的特定緩沖 劑，其濃度為約25mM到約50mM，更優(yōu)選為28mM到約50mM，最優(yōu)選為30mM到約50mM的，W及優(yōu) 選地選自由DMPC、DPPC、DSPC、DOPC和P0PC構(gòu)成的組，更優(yōu)選地DPPC，W及一種合成生產(chǎn)的佐 劑PHAD，摩爾比為約1:巧Ij40 :1 (憐脂酷膽堿:PHAD)，優(yōu)選的約1:巧Ij20 :1 (憐脂酷膽堿： PHAD)，更優(yōu)選的約2:巧化：1 (憐脂酷膽堿:PHAD)和最優(yōu)選的約2:巧化：UDPPC: PHAD)。更優(yōu) 選地，巧樣酸鹽或班巧酸鹽緩沖劑按照約lOmM到約50mM，優(yōu)選的約25mM到約50mM，更優(yōu)選的 28mM到約50mM，最優(yōu)選的30mM到約50mM用于PHAD制劑中。
[0167] 如本文對(duì)于PHAD制劑的優(yōu)選的緩沖劑的濃度所描述的，緩沖劑的濃度選自W下構(gòu) 成的組：約 1 OmM 到約 50mM; 15mM 到約 50mM; 20mM 到約 50mM;約 25mM 到約 50mM; 25mM 到約 50mM; 約 30mM 到約 50mM; 28mM 到約 50mM; 30mM 到約 50mM;約 30mM;約 40mM 到約 50mM; 40mM 到約 50mM; 約40mM;W及約50mM。本文描述的含有PHAD的制劑優(yōu)選地大體上沒(méi)有鹽水，優(yōu)選地含有低于 20mM的化Cl，更優(yōu)選的，所述PHAD組合物含有低于lOmM的化Cl，再更優(yōu)選的基本上沒(méi)有 NaCl。
[0168] 此外，如下文的實(shí)施例中所顯示的，在含有PHAD的組合物和制劑中使用PBS不展現(xiàn) 本發(fā)明的新的特征，特別是本發(fā)明的穩(wěn)定性特征。相比之下，在此特別指定的憐酸鹽緩沖劑 允許本發(fā)明的新的穩(wěn)定性特征。
[0169] PHAD制劑優(yōu)選地通過(guò)選擇W高純度合成制備的單一憐脂酷膽堿來(lái)制備。然而，來(lái) 自大豆或蛋的天然發(fā)生的憐脂酷膽堿，或來(lái)自大豆或蛋的氨化的憐脂酷膽堿，或合成的或 天然混合的酷基憐脂酷膽堿也可W用于制備所述佐劑制劑。
[0170] 所述PHAD制劑可W W任何濃度制備，但一般地W約0.005到約1. Omg/ml的PHAD，優(yōu) 選的約0.05到約1. Omg/ml的PHAD來(lái)制備，但優(yōu)選地不超過(guò)約2.5mg/ml的PHAD。所述PHAD制 劑的憐脂酷膽堿可任何濃度制備，但是優(yōu)選地按照約0.005到約16mg/ml(0.007mM到 22mM)，更優(yōu)選的約0.05到約8mg/m 1 (0.07mM到1 ImM)，再更優(yōu)選的約0.05到約0.8mg/m 1 (0.07mM 至 IJlmM)來(lái)制備
[0171] 本發(fā)明的PHAD制劑如下制備來(lái)產(chǎn)生約40 :1到約1:1的憐脂酷膽堿比PHAD，優(yōu)選的 DPPC比PHAD，優(yōu)選的約2.5: 1DPPC比PHAD的摩爾比。將PHAD稱(chēng)出到適當(dāng)?shù)牟Ａ∑恐?，例如?Type IPlus Schott玻璃小瓶。添加處于乙醇中的適當(dāng)數(shù)量的憐脂酷膽堿，優(yōu)選的DPPC。將 運(yùn)種制品超聲約1分鐘，同時(shí)輕輕地縱滿制品，然后通過(guò)蒸發(fā)適當(dāng)?shù)爻ヒ掖?。用巧樣酸鹽、 班巧酸鹽或憐酸緩沖劑，優(yōu)選的lOmM到約50mM的巧樣酸鋼，pH 6.0來(lái)重構(gòu)薄膜，在約50°C到 65°C，優(yōu)選的55°C下超聲約30分鐘，優(yōu)選的可W進(jìn)行超過(guò)一輪的超聲處理。制備的PHAD制劑 一般具有約60nm到約500nm的顆粒大小。為了允許過(guò)濾除菌，優(yōu)選地進(jìn)一步加工PHAD制劑來(lái) 實(shí)現(xiàn)降低的和適當(dāng)均勻的顆粒大小，優(yōu)選的在約70nm到130nm之間。使用Avestin擠壓機(jī)或 等效物將PHAD制劑擠壓通過(guò)80皿孔徑的聚碳酸醋膜(Avestin，LFLM-80)，在約45°C到65°C， 優(yōu)選的55下約7次到約12次通過(guò)，來(lái)實(shí)現(xiàn)低于約130nm的均勻的顆粒大小。為了確保過(guò)濾除 菌之后可接受的回收率，優(yōu)選的，所述PHAD制劑的顆粒大小是150nm或更小，但再更優(yōu)選的 130nm或更小。
[0172] 然后所述PHAD制劑任選地可W用本文描述的濃度，優(yōu)選的約25mM到約50mM，更優(yōu) 選的28mM到約50mM，最優(yōu)選的30mM到約50mM，pH6.0的巧樣酸鹽、班巧酸鹽或憐酸緩沖劑進(jìn) 行稀釋?zhuān)鼍彌_劑含有合適數(shù)量的聚山梨醋80W實(shí)現(xiàn)優(yōu)選的0.02%的聚山梨醋80的終濃 度，但0.01 %到0.1 %的聚山梨醋80是可接受的。一般地，PHAD制劑被稀釋到接近0.05mg/ml 至化.5mg/ml的濃度。PHAD制劑然后通過(guò)0.2μηι過(guò)濾器，優(yōu)選的Sadorius進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾。本文 描述的本發(fā)明的PHAD和佐劑制劑展現(xiàn)了約-20mV到-80mV的ze化電位。
[0173] 本文描述的PHAD制劑在一個(gè)實(shí)施方式中被用于疫苗的制品中，作為疫苗的佐劑被 施用給動(dòng)物和人類(lèi)。優(yōu)選地，所述制劑被設(shè)計(jì)W遞送約10微克PHAD每劑到約50微克PHAD每 劑，優(yōu)選的約20微克PHAD每劑到約50微克PHAD每劑，再更優(yōu)選的，約40微克PHAD每劑到約50 微克PHAD每劑。
[0174] PHAD作為分子量1763道爾頓、約98 %純度的單一化合物存在。PHAD的一個(gè)來(lái)源是 Avanti Polar Lipids(Alabaster，Alabama，USA)。
[01巧]與PHAD的純度鮮明對(duì)比的是分離自Salmonella minnesota的GSK的單憐酷基脂質(zhì) A，其作為六酷基、五酷基和四酷基類(lèi)似物的動(dòng)態(tài)復(fù)雜混合物存在;運(yùn)些類(lèi)似物的每一種在 生物學(xué)活性方面都是不同的。藥物和疫苗開(kāi)發(fā)領(lǐng)域的技術(shù)人員知道PHAD優(yōu)于GSK的單憐酷 基脂質(zhì)A，因?yàn)镻HAD的制造過(guò)程、供應(yīng)、使用和穩(wěn)定性可W作為純的化合物來(lái)緊密地監(jiān)控。
[0176] 巧樣酸鹽、班巧酸鹽或憐酸緩沖劑的濃度被用于改善在室溫下和達(dá)到約37°C下 PHAD制劑的穩(wěn)定性。不受理論的限制，相信的是優(yōu)選的組合PC:PHAD的摩爾比，W及具有本 文描述的特定濃度范圍的巧樣酸鹽、班巧酸鹽或憐酸鹽緩沖劑的組合產(chǎn)生了協(xié)同作用。
[0177] 重要的是，PHAD制劑優(yōu)選地被配制為大體上沒(méi)有各種賦形劑或化學(xué)物質(zhì)。因而，添 加膽固醇或兩種或更多種憐脂酷膽堿或一種或更多種憐脂酷甘油不是必需的，優(yōu)選地不被 包括在本發(fā)明的制劑中?；旧蠜](méi)有可代謝的油，包括角整締，W及大體上沒(méi)有膽固醇的佐 劑制劑是優(yōu)選的。此外，雖然先有技術(shù)提示膽固醇是脂質(zhì)體或佐劑制劑所需的必需化學(xué)物 質(zhì)，本文描述的佐劑制劑不需要用于佐劑的膽固醇來(lái)提供相對(duì)于先有技術(shù)制劑的顯著優(yōu) 點(diǎn)，優(yōu)選地不向所述佐劑制劑添加膽固醇。如實(shí)施例中所示，兩種或更多種憐脂酷膽堿或一 種或更多種憐脂酷甘油（總共兩種或更多種憐脂酷膽堿或憐脂酷甘油)任選地可微小 的濃度添加到制劑中，但是對(duì)于本發(fā)明在室溫下或達(dá)到約37°C下實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定性，或預(yù)防、減少 或降低嚴(yán)重注射部位和全身性反應(yīng)、同時(shí)增強(qiáng)免疫應(yīng)答，運(yùn)些是不必要的。
[0178] 如本文詳述的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員已經(jīng)使用含有MLA、M化或運(yùn)些佐劑的合成類(lèi)似 物的脂質(zhì)體和其他各種制劑超過(guò)二十年，已經(jīng)無(wú)法生產(chǎn)處于水懸浮液中的容許本文描述的 穩(wěn)定性的制劑。疫苗佐劑的室溫和達(dá)到約37Γ下的穩(wěn)定性是本領(lǐng)域技術(shù)人員高度追求的目 標(biāo)。盡管有許多努力，還沒(méi)有開(kāi)發(fā)出能在本文描述的溫度和持續(xù)時(shí)間下將MLA、M化或合成類(lèi) 似物保持穩(wěn)定的制劑。在此描述的方面解決了運(yùn)個(gè)問(wèn)題。
[0179] 疫苗的制備
[0180] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式進(jìn)一步描述了包含佐劑或PHAD制劑W及FimCH或截短的 FimH的新的疫苗組合物。運(yùn)種疫苗被用于治療和預(yù)防由革蘭氏陰性細(xì)菌包括大腸桿菌和多 藥物抗性E. coli引起的尿路感染。FimCH是FimC和FimH重組蛋白質(zhì)的非共價(jià)的復(fù)合物。通過(guò) 向FimCH的小瓶中添加預(yù)定體積的PHAD制劑來(lái)制備FimCH和PHAD制劑的疫苗。
[0181] W下是根據(jù)本發(fā)明制備的疫苗的實(shí)例。一般地，為了制備用于施用的疫苗，有效量 的FimCH或截短的FimH的抗原與含有約0.005mg/ml到約0.5mg/ml PHAD的佐劑制劑組合，來(lái) 向人類(lèi)施用每次注射約1 Oyg到約50yg的PHAD。
[0182] 實(shí)際上，W下是可W由醫(yī)務(wù)人員用于根據(jù)本發(fā)明制備和施用疫苗的過(guò)程的實(shí)例。 所述的條件和過(guò)程是示范性的，不限制本發(fā)明的范圍。
[0183] FimCH的小瓶從約-2(TC的保藏所中取出，容許在室溫放置約二十分鐘達(dá)到近似的 室溫。在FimCH小瓶達(dá)到近似室溫之后，翻轉(zhuǎn)小瓶數(shù)次來(lái)混合內(nèi)容物。單獨(dú)地，含有PHAD制劑 的小瓶來(lái)自2°C到8°C的保藏所的膽藏容器中取出。翻轉(zhuǎn)PHAD制劑的小瓶數(shù)次來(lái)混合內(nèi)容 物，然后用無(wú)菌的l.OmL注射器抽出約0.2mL，穿過(guò)塞子注射到FimCH小瓶中。再次翻轉(zhuǎn)小瓶 數(shù)次來(lái)混合內(nèi)容物。無(wú)菌注射水(WFI)或更優(yōu)選的本發(fā)明的無(wú)菌緩沖劑使用無(wú)菌的l.OmL注 射器抽出〇.2mL，穿過(guò)塞子注射到FimCH/PHAD小瓶中。再次翻轉(zhuǎn)小瓶數(shù)次。最后，使用無(wú)菌的 1. OmL注射器抽出約0.3mL制備的FimCH/PHAD疫苗。制備的疫苗含有每0.3mL劑量的50yg FimCH和20yg的PHAD。在施用之前運(yùn)種制備的疫苗可W在冷藏溫度或室溫保存。
[0184] 一般地，F(xiàn)imCH被長(zhǎng)期保存在-70°C、-20°C或2°C到8°C，或甚至在室溫下短期保存 約4天到兩至Ξ周。一般地，僅無(wú)菌的產(chǎn)品可在室溫下保存，因?yàn)槿绻a(chǎn)品不是無(wú)菌的，微生 物生長(zhǎng)是可能的，但不能保證。疫苗優(yōu)選地通過(guò)肌內(nèi)注射來(lái)施用。一般地，約5微克的FimCH 到約200微克的FimCH被施用給人類(lèi)，優(yōu)選的約20微克到約110微克。一般地，約10微克PHAD 每劑到約50微克PHAD每劑與FimCH-起施用，更優(yōu)選的約20微克PHAD每劑到約50微克PHAD 每劑，再更優(yōu)選的約40微克PHAD每劑到約50微克每劑，然而可W使用更多或更少。一般地， 具有PHAD制劑的Ξ到四劑的FimCH被施用給需要的患者。運(yùn)些劑量一般在0天進(jìn)行，然后在 首次施用后約30到60天，然后約90到180天，然后如果需要，約180到360天。根據(jù)需要，額外 的注射可W在首次接種后12到36個(gè)月進(jìn)行。
[0185] 如上所述，本發(fā)明的更優(yōu)選的方面是，PHAD組合物和制劑與抗原或FimCH單獨(dú)地保 存，因?yàn)镻HAD組合物和制劑具有極好的穩(wěn)定性，在向患者或人類(lèi)施用之前一定時(shí)間與抗原 或FimCH適當(dāng)?shù)嘏渲苹蚧旌?。然而，混合、制備和施用疫苗的其他方法是可能的，并將有效?起作用。
[0186] W下的小節(jié)中的數(shù)據(jù)展現(xiàn)了，本發(fā)明的佐劑制劑增強(qiáng)了對(duì)包括細(xì)菌和病毒抗原的 其他抗原的免疫應(yīng)答。一種或更多種疫苗抗原可W添加到根據(jù)本發(fā)明制備的PHAD制劑中。 運(yùn)些抗原可W是本文描述的FimCH蛋白質(zhì)復(fù)合物，或其他抗原，包括但不限于白喉、破傷風(fēng)、 百日咳、脊髓灰質(zhì)炎、肝炎，和/或流感病毒的抗原制品。
[0187] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了施用包含佐劑或PHAD制劑W及FimCH或截短的FimH 的新的疫苗組合物的方法。特別地，提供了預(yù)防和治療由革蘭氏陰性細(xì)菌包括E.coli和多 藥物抗性E.coli引起的尿路感染的方法。一般地，約5微克的FimCH到約200微克的FimCH被 施用給人類(lèi)，優(yōu)選的約20微克到約110微克。一般地，施用約10微克PHAD每劑到約50微克 PHAD每劑，優(yōu)選的約20微克PHAD每劑到約50微克PHAD每劑，再更優(yōu)選的約40微克PHAD每劑 到約50微克每劑。取決于使用的抗原和治療的狀況，可W使用其他劑量數(shù)量和給藥方案。
[0188] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了在患有復(fù)發(fā)性尿路感染的人類(lèi)中誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)FimH 的抗體的方法。
[0189] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了在患有復(fù)發(fā)性尿路感染的人類(lèi)中誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)FimH 的抗體的疫苗組合物。
[0190] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了含有PHAD的無(wú)菌的組合物和無(wú)菌的藥物組合物;優(yōu) 選的，運(yùn)些含水的緩沖懸浮液的組合物具有小于150nm的顆粒大小，再更優(yōu)選的小于130nm。 所述無(wú)菌的PHAD組合物和制劑被保存在藥物容器中，所述藥物容器與所述PHAD組合物和制 劑直接接觸。運(yùn)些藥物容器的實(shí)例是小瓶或注射器，更優(yōu)選的，所述無(wú)菌的PHAD組合物和制 劑容納在無(wú)菌的注射器中。容納所述PHAD組合物或制劑的運(yùn)些藥物容器可W被保存在批準(zhǔn) 的溫度的容器中，例如，保溫箱中，在室溫下。容納所述無(wú)菌PHAD組合物制劑的運(yùn)些藥物容 器可W放入組裝的運(yùn)輸容器中，在室溫下或達(dá)到約37°C下轉(zhuǎn)移到其他地點(diǎn)。運(yùn)些運(yùn)輸容器 可W通過(guò)郵政服務(wù)或商業(yè)的運(yùn)輸服務(wù)來(lái)運(yùn)輸。由于本文描述的本發(fā)明的杰出的穩(wěn)定性，接 受所述PHAD組合物和制劑的地點(diǎn)可W是沒(méi)有冷藏或間斷冷藏的地點(diǎn)，或沒(méi)有電力或只有間 斷電力的地點(diǎn)。
[0191] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了包含PHAD或佐劑組合物或制劑或疫苗組合物的疫苗 試劑盒。所述試劑盒可W任選地包括制備和施用所述疫苗的方法，和/或在室溫下和達(dá)到約 37°C下所述PHAD組合物或制劑的保藏和暴露的說(shuō)明。描述了保存、運(yùn)輸和暴露溫度的運(yùn)些 說(shuō)明可W由政府管理部口包括US FDA和歐洲藥品管理局批準(zhǔn)。優(yōu)選地，一種或更多種試劑 盒成分是處于注射器中的PHAD組合物或制劑。優(yōu)選地，所述PHAD組合物或含有PHAD的制劑 是無(wú)菌的，W及是處于無(wú)菌的注射器中的。
[0192] 所述試劑盒可W包括本發(fā)明的PHAD或佐劑組合物或制劑的標(biāo)簽，其提供了在室溫 下和達(dá)到約37°C下所述PHAD組合物或制劑的保存和暴露的說(shuō)明或限制。描述了保存、運(yùn)輸 和暴露溫度的運(yùn)些標(biāo)簽或說(shuō)明可W由政府管理部口包括US抑A和歐洲藥品管理局批準(zhǔn)。
[0193] 如本文聲明的，本發(fā)明的新的特征允許PHAD組合物和制劑在冷藏溫度、室溫、達(dá)到 和約37°C、冷藏溫度和室溫之間的溫度下被制造、測(cè)試、分析、保存、運(yùn)輸、容納、移動(dòng)、轉(zhuǎn)移 或施用持續(xù)本文描述的時(shí)間。由于本文描述的本發(fā)明的杰出的穩(wěn)定性，接受所述PHAD組合 物和制劑的地點(diǎn)可W是沒(méi)有冷藏或間斷冷藏的地點(diǎn)，或沒(méi)有電力或只有間斷電力的地點(diǎn)。
[0194] 實(shí)施例
[0195] 參考W下實(shí)施例更詳細(xì)地解釋本公開(kāi)內(nèi)容的某些特定的方面和實(shí)施方式，其完全 為了舉例的目的來(lái)提供，而不被看作是W任何方式限制公開(kāi)內(nèi)容的范圍。所使用的數(shù)量不 代表一種限制，所述過(guò)程可W擴(kuò)大來(lái)產(chǎn)生更大的批次。
[0196] 實(shí)施例1:如下制造 PHAD制劑來(lái)產(chǎn)生約2.5:1的DPPC與PHAD的摩爾比
[0197] PHAD、六酷基憐酸化二糖和DPPC可W從Avanti Polar Lipids(Alabaster， Alabama，USA)作為非GMP或GMP材料(分析證明書(shū)在表1中提供)獲得。PHAD是單憐酷基脂質(zhì)A 的合成的版本。PHAD與DPPC-起配制來(lái)制備本發(fā)明的佐劑制劑。DPPC的發(fā)布規(guī)范在表2中提 供。DPPC的轉(zhuǎn)變溫度是41°C。
[0198] 將PHAD稱(chēng)出到適當(dāng)?shù)牟Ａ∑恐校瑑?yōu)選的Type IPlus Schott玻璃小瓶。添加處于 乙醇中的適當(dāng)數(shù)量的大約2.3mg/ml的DPPC溶液，或等效物。將運(yùn)種制品超聲約1分鐘，同時(shí) 輕輕地縱滿制品，然后通過(guò)蒸發(fā)適當(dāng)?shù)匦⊥汀⒊ヒ掖?。薄膜用PH6.0的lOmM巧樣酸鋼重構(gòu)， 在大約50°C到65°C，優(yōu)選的55°C下超聲約30分鐘。PHAD制劑一般W約0.5到1. Omg/ml，但是 不超過(guò)約2.5mg/ml來(lái)制備。（如本文描述的，例如約13:1的DPPC: PHAD的摩爾比也可W通過(guò) 按需調(diào)整DPPC的數(shù)量使用相同的過(guò)程來(lái)制備。
[0199] 制備的PHAD制劑一般展現(xiàn)約60nm到約500nm的顆粒大小。為了允許過(guò)濾除菌，必須 一般地進(jìn)一步加工PHAD制劑來(lái)實(shí)現(xiàn)降低的和適當(dāng)均勻的顆粒大小，一般在約70nm到130nm 之間。雖然有許多的參考文獻(xiàn)，包括美國(guó)專(zhuān)利6,630,161，報(bào)道了高壓均質(zhì)化是降低脂質(zhì)體 的顆粒大小的優(yōu)選的方法，使用壓力達(dá)到25,000psi的Avestin均質(zhì)器的高壓勻質(zhì)化不會(huì)顯 著地或貼切地降低運(yùn)些PHAD制劑的顆粒大小。運(yùn)種困難是意想不到的。運(yùn)些PHAD制劑必需 使用Avestin擠壓機(jī)或等效物擠壓通過(guò)80nm孔徑的聚碳酸醋膜(Avestin，LFLM-80)在約45 °(：到65°(：，優(yōu)選的55°(：下約7到約12次穿過(guò)，來(lái)實(shí)現(xiàn)低于約130皿的均勻的顆粒大小。在451： 到65°C下擠壓是重要的參數(shù)。為了確保過(guò)濾除菌之后可接受的回收率，PHAD佐劑制劑的顆 粒大小優(yōu)選地是150nm或更低，但更優(yōu)選的130nm或更低。
[0200] PHAD制劑然后可W用抑6.0、含有適當(dāng)數(shù)量的聚山梨醋80的lOmM巧樣酸鋼稀釋來(lái) 達(dá)到最優(yōu)選的0.02 %的聚山梨醋80終濃度，但是0.01 %到0.1 %的聚山梨醋80是可接受的。 一般地，PHAD制劑被稀釋到約0.05mg/na到0.5mg/ml的濃度。運(yùn)些PHAD制劑然后通過(guò)0.2皿 濾器，優(yōu)選的Sadorius來(lái)無(wú)菌過(guò)濾。
[0201] 根據(jù)低溫透射電子顯微鏡的測(cè)定，本文描述的佐劑制劑是懸浮液。
[0202] 額外的或可選擇的步驟可W增加到上述過(guò)程中來(lái)制備PHAD制劑。舉一個(gè)實(shí)例，乙 醇可w通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)或等價(jià)方法，或通過(guò)氮?dú)饬骰虻葍r(jià)方法來(lái)蒸發(fā)。作為其他的實(shí)例，包括 本發(fā)明的緩沖劑的超聲處理步驟可W重復(fù)來(lái)兩次或更多次，在重復(fù)的超聲處理之間制劑可 W被冷卻到室溫或更低溫度，在所述超聲處理之前、期間或之后，制劑可W保持在類(lèi)似于超 聲處理步驟的溫度下一小時(shí)或更久。
[0203] 表1:來(lái)自Avanti化lar Lipids, Inc的PHAD的分析證明信息
[0204]
[0206] 表2:來(lái)自Avanti化lar ^91(13,1]1(3的0??〔的分析證明信息
[0207]
[020引 實(shí)施例2:
[0209]疫苗的抗原可W如下制備。
[0210] FimCH是FimC和FimH重組蛋白質(zhì)的非共價(jià)的復(fù)合物。所述重組蛋白質(zhì)來(lái)自轉(zhuǎn)基因 的E. coli培養(yǎng)物。FimC和FimH蛋白在E. col i中單獨(dú)地表達(dá)，它們自發(fā)地形成非共價(jià)的復(fù)合 物。FimCH復(fù)合物的分子量大約51，700道爾頓。
[0211]復(fù)合物的FimH蛋白具有29,065道爾頓的分子量，它由W下序列表示的279個(gè)氨基 酸殘基組成：Phe Ala 切S Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala lie Pro lie Gly Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gin Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gin He Phe Cys His Asn Asp Tyr Pro Glu Thr He Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gin Arg Gly Ser Ala Tyr Gly Gly Val Leu Ser Asn Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala lie Lys Ala Gly Ser Leu lie Ala Val Leu He Leu Arg Gin Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gin Phe Val Trp Asn He Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr Leu Pro Asp Tyr Arg Gly Ser Val Pro He Pro Leu Thr Val Tyr Cys Ala Lys Ser Gin Asn Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr His Ala Asp Ala Gly Asn Ser lie Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gin Gly Val Gly Val Gin Leu Thr Arg Asn Gly Thr He lie Pro Ala Asn Asn Thr Val Ser Leu Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly Leu Thr Ala Asn Tyr Ala Arg Thr Gly Gly Gin Val Thr Ala Gly Asn Val Gin Ser lie lie Gly Val Thr Phe Val Tyr Gin〇 [0212]復(fù)合物的FimC蛋白具有22,700道爾頓的分子量，它由W下序列表示的205個(gè)氨基 酸殘基組成：Gly Val Ala Leu Gly Ala ???Γ Arg Val lie Tyr Pro Ala Gly Gin Lys Gin Val Gin Leu Ala Val Thr Asn Asn Asp Glu Asn Ser Thr Tyr Leu lie Gin Ser Trp Val Glu Asn Ala Asp Gly Val Lys Asp Gly Arg Phe He Val Thr Pro Pro Leu Phe Ala Met Lys Gly Lys Lys Glu Asn Thr Leu Arg lie Leu Asp Ala Thr Asn Asn Gin Leu Pro Gin Asp Arg Glu Ser Leu Phe Trp Met Asn Val Lys Ala lie Pro Ser Met Asp Lys Ser Lys Leu Thr Glu Asn Thr Leu Gin Leu Ala lie He Ser Arg He Lys Leu Tyr Tyr Arg Pro Ala Lys Leu Ala Leu Pro Pro Asp Gin Ala Ala Glu Lys Leu Arg Phe Arg Arg Ser Ala Asn Ser Leu Thr Leu He Asn Pro Thr Pro Tyr Tyr Leu Thr Val Thr Glu Leu Asn Ala Gly Thr Arg Val Leu Glu Asn Ala Leu Val Pro Pro Met Gly Glu Ser Ala Val Lys Leu Pro Ser Asp Ala Gly Ser Asn He Thr Tyr Arg Thr lie Asn Asp Tyr Gly Ala Leu Thr Pro Lys Met Thr Gly Val Met Glu。
[0213] 為了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，來(lái)自E.coli菌株J96的FimC基因用引物SLC4-28-fimC5和 SLC4-28-FimC3從純化的J96基因組DNA中擴(kuò)增得到771堿基對(duì)的產(chǎn)物。用BamHI和EcoRr消 化，純化，連接到用相同的酶（BamH巧此coRI)切割的pTRC99a中。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. CO1 i C600細(xì)胞中，在氨節(jié)西林上選擇，產(chǎn)生質(zhì)粒pSJH-32。
[0214]氨節(jié)西林抗生素抗性使用W下過(guò)程切換為卡那霉素 :Primers P邸4-prl和地D4- pr2用于從地D4擴(kuò)增卡那霉素抗性基因。運(yùn)一PCR產(chǎn)物用T4多核巧酸激酶憐酸化，進(jìn)行凝膠 純化。pSJH-32用Sea巧郵gll切割，用T4DNA聚合酶純化，用小牛腸堿性憐酸酶脫去憐酸，然 后與憐酸化的卡那霉素抗性基因 PCR產(chǎn)物連接。連接產(chǎn)物然后轉(zhuǎn)化到E.coli C600細(xì)胞中， 在卡那霉素上選擇，產(chǎn)生質(zhì)粒pSJH-319。
[0215] 來(lái)自菌株J96的Fi恤基因用引物Fi恤5和Fi恤3從純化的J96基因組DM中擴(kuò)增得到 97姉咸基對(duì)的產(chǎn)物。用SacI和化ndin消化，純化，連接到用SacI和化ndin消化的PBAD33中。 此后，構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到C600細(xì)胞中，在氯霉素上選擇。 腳引實(shí)施例3
[0217] 生物加工(獲得疫苗的抗原的過(guò)程）
[0218] 啟動(dòng)生物加工步驟，將主細(xì)胞庫(kù)(MCB)接種到含有帶卡那霉素(5化g/ml)和氯霉素 (20μg/ml)的APBS LB培養(yǎng)基的搖瓶中。當(dāng)0D達(dá)到2.0-3.0單位(約生長(zhǎng)15小時(shí)后)時(shí)，細(xì)胞培 養(yǎng)物無(wú)菌轉(zhuǎn)移到反應(yīng)器中用于進(jìn)料-分批發(fā)酵。在接種之前將含有APS S叫er化oth、約 0.8%甘油和抗生素的培養(yǎng)基消毒。FimH蛋白表達(dá)在0D〉10時(shí)用IPTG誘導(dǎo)。添加 IPTG后五分 鐘，用阿拉伯糖誘導(dǎo)FimC蛋白表達(dá)。大約一小時(shí)后收獲細(xì)胞。在收獲之后，通過(guò)連續(xù)的或分 批的離屯、從培養(yǎng)基成分中分離細(xì)胞。
[0219] 蛋白質(zhì)回收
[0220] 重組FimCH被表達(dá)在E.coli周質(zhì)中。作為革蘭氏陰性細(xì)菌，E.coli擁有內(nèi)和外脂質(zhì) 雙分子層膜。脂質(zhì)雙分子層之間的空間是周質(zhì)。在離屯、之后立即地，使用周質(zhì)制備物從細(xì)胞 中回收FimCH。在存在薦糖、Tris和邸TA的情況下在2-8°C將細(xì)胞與重組溶菌酶反應(yīng)。然后離 屯、混合物，收集產(chǎn)生的周質(zhì)蛋白質(zhì)溶液。蛋白質(zhì)然后用硫酸錠沉淀，離屯、，重懸浮在20mM MES pH 5.9中，然后使用SpechaPor 2透析膜（Spectrum Labs 132680)通過(guò)透析過(guò)濾到 20mM MES pH 5.9中。當(dāng)溶液電導(dǎo)率降低到大約<1.51115八111時(shí)，收集溶液并轉(zhuǎn)移去純化。
[0221] 蛋白質(zhì)純化
[0222] 純化由Ξ個(gè)柱層析步驟（1 .CEX，2.HIC，3.CEX)，使用SpectraPor 2滲析膜 (Spectr皿Labs 132680)滲濾隨后過(guò)濾的一個(gè)緩沖劑交換步驟，W及一個(gè)最終的無(wú)菌過(guò)濾 步驟組成。滲濾步驟用于將蛋白質(zhì)交換到抑5.9的20mM MES緩沖劑中，從而它將結(jié)合第二個(gè) CEX 柱。
[0223] 兩個(gè)CEX步驟使用XK26柱中的Source 15S(GE Healthcare 17-1273-02)。對(duì)兩個(gè) CEX柱，使用W下的條件：緩沖液A:20mMMES，pH5.9;緩沖液B:20mMMES/500mM氯化鋼， 抑5.9;除了XK26/10柱的裝載之外，所有步驟8mL/分鐘，用5CV的緩沖液B預(yù)平衡，用4CV的緩 沖液A平衡柱子，對(duì)XK26 10使用樣品累并特別地不通過(guò)層析累W5mL/分鐘加載透析的 FimCH樣品，用4CV的緩沖液A洗涂柱子，用0-25%緩沖液B的線性的5CV梯度洗脫柱子，收集 饋分。
[0224] 對(duì)于HIC柱，在XK26柱中使用Butyl Sepharose 4FF(GE Healthcare 17-0980- 01)。緩沖液C: 20mM MES/550mM硫酸錠，p冊(cè).9;除了加載之外對(duì)XK26/10為8mL/分鐘，用3CV 的緩沖液A(如上述)預(yù)平衡柱子，用6CV的緩沖液C平衡柱子，W5mL/分鐘XK26/10柱加載集 中的FimCH樣品，用6CV的緩沖液C洗涂柱子，用0-100 %緩沖液A的線性的4CV梯度洗脫柱子， 收集饋分。在20mM MES pH 5.9或20mM巧樣酸鋼抑5.4中配制0.3111旨/血的濃度的。山邸。然后 通過(guò)0.2μπι無(wú)菌濾器無(wú)菌過(guò)濾。FimCH是穩(wěn)定的，可W在-20°C保存約至少2年。
[0225] 實(shí)施例4:體外甘露糖結(jié)合的效價(jià)(證明FimCT的生物學(xué)活性)
[0226] FimCH藥物物質(zhì)(例如，來(lái)自實(shí)施例3)的生物學(xué)活性通過(guò)體外的甘露糖結(jié)合分析來(lái) 測(cè)定。FimH蛋白是E.coli用W結(jié)合糖基化蛋白質(zhì)上的甘露糖殘基的細(xì)菌粘附素。在尿路感 染期間，F(xiàn)imH粘附素結(jié)合膀脫上皮細(xì)胞上的甘露糖基化的尿溶蛋白（uroplakin)蛋白，其促 進(jìn)結(jié)合的E.coli的內(nèi)化。FimCH與甘露糖基化的尿溶蛋白的結(jié)合是E.coli導(dǎo)致尿路感染必 不可少的。為了在體外監(jiān)視FimH的甘露糖結(jié)合活性，觀察FimH與酶辣根過(guò)氧化酶化RP)的結(jié) 合。皿P是含有甘露糖殘基的糖基化蛋白，早先被用于研究哺乳動(dòng)物甘露糖結(jié)合受體。也已 經(jīng)產(chǎn)生并研究了HRP和凝集素 ConA的復(fù)合物，其結(jié)合a-D-甘露糖基和a-D葡萄糖基基團(tuán)。運(yùn) 些結(jié)果表明皿P作為其他已知的甘露糖結(jié)合蛋白的配體起作用。利用下文描述的運(yùn)種效價(jià) 測(cè)定，與FimH的HRP結(jié)合顯示了是濃度依賴(lài)性的，并且被阻斷甘露糖與FimH結(jié)合的小分子抑 制。
[0227] 在體外的FimCH效價(jià)分析中，通過(guò)結(jié)合在化ISA平板上的、純化的和有作用的抗- FimH抗血清來(lái)"捕獲"FimCH。運(yùn)項(xiàng)分析中使用的抗-Fi恤抗血清已經(jīng)展現(xiàn)了在間接化ISA (作 為檢測(cè)抗血清)和Western印跡中結(jié)合FimH的能力。
[0228] 然后添加 HRP，清洗掉過(guò)量的HRP，檢測(cè)結(jié)合的HRP的活性。測(cè)得的皿巧舌性與添加的 FimCH的濃度成比例（附圖4)。運(yùn)些結(jié)果表明，HRPW劑量依賴(lài)性的方式結(jié)合FimH。
[0229] 為了證明皿P與FimH的結(jié)合需要FimH甘露糖結(jié)合活性，對(duì)也處于與FimC的復(fù)合物 中、稱(chēng)為Q13：3K的甘露糖結(jié)合缺陷性FimH進(jìn)行分析并與Fim(M比較。Q133K與FimH共有相同的 氨基酸序列，只是位置133處的關(guān)鍵的谷氨酷胺被賴(lài)氨酸替換。運(yùn)一突變處于FimH甘露糖結(jié) 合口袋中，使得Q133K在結(jié)合甘露糖和甘露糖基化蛋白方面有功能上的缺陷。如附圖4中所 示，Q133K FimCH不結(jié)合HRP。在間接化ISA(附圖3)中，Q133K突變復(fù)合物被純化的抗FimH抗 血清識(shí)別。運(yùn)表明，使用Q13：3K的皿P信號(hào)缺乏不是由于純化的抗血清不能結(jié)合Q133K;而是 有感于Q13：3K不能結(jié)合HRP上的甘露糖殘基。運(yùn)些結(jié)果也表明，HRP不結(jié)合FimC，因?yàn)镼13：3K也 處于與FimC的復(fù)合物中。
[0230] 如化ng et al.2002中證明的，F(xiàn)imH在位置54、133、135和140處的單點(diǎn)突變完全地 消除甘露糖結(jié)合。按照化ng et al.所報(bào)道的"……在不直接結(jié)合甘露糖的原子上，在甘露 糖結(jié)合口袋中即使最輕微的改變，顯著地降低結(jié)合"，表明可在體外發(fā)生的突變可W嚴(yán)重地 限制或消除FimH甘露糖結(jié)合活性。HRP缺乏對(duì)Q133K突變體的結(jié)合支持了運(yùn)種分析用來(lái)評(píng)估 FimH與甘露糖基化蛋白結(jié)合的生物學(xué)活性的能力。
[0231] 已經(jīng)描述了甘露糖結(jié)合FimH的幾種小分子抑制物。運(yùn)些抑制物中的兩種，4-甲基 傘形酬酷基-a-D甘露化喃糖巧(UFMP)和甲基-a-D-甘露化喃糖巧(MDMP)已經(jīng)被用于進(jìn)一步 增強(qiáng)運(yùn)種效價(jià)測(cè)定。UFMP結(jié)合FimH的報(bào)告的解離常數(shù)化d)是20nM，它比MDMP的的Kd更 強(qiáng)大約100倍。如所預(yù)料的，在皿P結(jié)合步驟中添加運(yùn)些FimH甘露糖結(jié)合抑制物的任一個(gè)W 劑量依賴(lài)性方式阻斷了HRP與FimH的結(jié)合(參見(jiàn)附圖5)。對(duì)于UFMP，在1 Ong/ml (30nM)下觀察 到50%抑制。對(duì)于MDMP，在大約化g/ml(5.1yM)下觀察到50%抑制，其比UFMP的濃度高大約 100 倍。
[0232] 運(yùn)些結(jié)果證明了運(yùn)種測(cè)定用來(lái)評(píng)估FimH的生物學(xué)活性和驗(yàn)證制造過(guò)程的批次之 間的一致性的能力。此外，運(yùn)種效價(jià)測(cè)定確認(rèn)了 Fi^l表位的正確折疊，對(duì)于通過(guò)施用FimCH/ PHAD疫苗來(lái)產(chǎn)生顯示了降低小鼠膀脫中E. coli C即的IgG抗-FimH是預(yù)示性的。 腳引 實(shí)施例5:使用CEX-HPLC測(cè)定FimCH藥物物質(zhì)的雜質(zhì)
[0234] CEX-HPLC被用于測(cè)定最終的FimCH藥物物質(zhì)中的FimCH復(fù)合物、未結(jié)合的FimC和雜 質(zhì)。使用20mM MES緩沖液抑6.2(緩沖液B)(緩沖液A是20mM MES緩沖液，P冊(cè).2)中0.3M NaCl 的梯度從GE化althcare Mono S 5/50化柱上洗脫蛋白質(zhì)。在Τ = 0時(shí)，流動(dòng)相是100%緩沖 液A，在Τ = 22分鐘時(shí)，流動(dòng)相是100 %緩沖液Β。根據(jù)峰面積測(cè)定未結(jié)合的FimC和雜質(zhì)的相對(duì) 含量。在附圖6中提供了代表性的層析譜。 腳引實(shí)施例6:FimCH和PHAD制劑:在家兔中85天肌肉內(nèi)毒性/免疫原性研究，21天的恢 復(fù)期(GLP)
[0236] 在雌兔中進(jìn)行關(guān)鍵的化P毒性研究，來(lái)評(píng)估含有本發(fā)明的PHAD制劑(DPPC:PHAD-約 2.4:1摩爾比）的FimCH疫苗的毒性和免疫原性。該研究檢查眼科發(fā)現(xiàn)、抗體評(píng)估和病理解 剖。雌兔通過(guò)每3周的IM注射(第1、22、43、64和85天)持續(xù)13周施用總共5劑的鹽水對(duì)照(N = 6)，40到50μg的單獨(dú)的PHAD(N=12)，100μgFimCH加20μ評(píng)HAD的（N = 6;低劑量），或12扣g FimCH加40到50yg PHAD(N=12;高劑量）。在第五劑之后的Ξ天(第88天），每組的6只家兔進(jìn) 行安樂(lè)死，單獨(dú)的PHAD組和FimCH高劑量組中的其余6只家兔在3周恢復(fù)期之后(第106天)安 樂(lè)死。
[0237] 根據(jù)臨床觀察、眼科學(xué)、體溫、體重、采食量、臨床病理學(xué)、肉眼尸檢、器官重量和病 理解剖學(xué)數(shù)據(jù)來(lái)評(píng)估毒性。在每次注射之前和之后2、4、6、24、48和72小時(shí)獲得體溫。除了標(biāo) 準(zhǔn)的臨床病理學(xué)參數(shù)(給藥前，第22和88天)之外，給藥后2天和7天評(píng)估C-反應(yīng)性蛋白（CRP) 和纖維蛋白原。每一劑后24、48和72小時(shí)，可能的注射部位反應(yīng)使用化aize量表對(duì)水腫和紅 斑進(jìn)行計(jì)分，評(píng)估局部毒性的其他表現(xiàn)（即，焦挪、水泡、潰瘍和血腫）。對(duì)第1、22、43、64和85 天給藥前，在第88和106天的尸檢之前采集的血清樣品，在第64天給藥之前、第88和106天尸 檢之前采集的尿液樣品，第1天給藥之前、第88和106天尸檢之前采集的陰道洗出物進(jìn)行抗 FimH抗體評(píng)估。尿液和陰道洗涂樣品的抗體評(píng)估是使用有資格的MSD-E化分析定性的。使用 經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的MSD-E化分析測(cè)定血清中的抗體水平。在用FimCH和PHAD免疫的18只家兔中，在 大約第88天，17只展現(xiàn)了約1:3，200，000的抗FimH IgG滴度。
[0238] 所有的家兔存活到計(jì)劃的尸檢之時(shí)。初步數(shù)據(jù)表明FimCH加 PHADW及單獨(dú)的PHAD 被良好地耐受。運(yùn)些發(fā)現(xiàn)證明了，對(duì)于臨床觀察、體重、采食量、體溫、臨床病理學(xué)或器官重 量，沒(méi)有明顯的PHAD單獨(dú)的影響或疫苗相關(guān)的影響。根據(jù)活體觀察，局部反應(yīng)是有限的。
[0239] 使用按照DPPC: PHAD大約1: 3.9摩爾比制備的FimCH和PHAD進(jìn)行了類(lèi)似的家兔研 究。在運(yùn)項(xiàng)研究中，在大約第43天，16只家兔的僅5只展現(xiàn)了 1:400,000到1:800,000的抗 Fi恤IgG滴度。相比之下，WDPPC: PHAD大約2.4:1的摩爾比制備的FimCH和PHAD (上文列出 的）免疫接種的18只家兔中的16只在大約第43天展現(xiàn)了 1:400,000到3,200,000的抗FimH IgG滴度。運(yùn)些免疫原性差異與本文描述的在小鼠中進(jìn)行的研究一致，表明約2.4:1的DPPC: PHAD摩爾比優(yōu)于約1:3.9的DPPC: PHAD摩爾比。
[0240] 實(shí)施例7
[0241] 為了測(cè)試小鼠 UTI感染模型中PHAD作為佐劑用于全身性疫苗接種的效力，在IM免 疫后通過(guò)經(jīng)尿道導(dǎo)管插入術(shù)W大約lX10化即的臨床膀脫炎E.coli分離物UTI89感染C3H/ HeN小鼠。雌性C3H/HeN小鼠（大約9周齡）購(gòu)自Charles River實(shí)驗(yàn)室(WiImington，MA)。小鼠 在光異氣燒麻醉化en巧5證6111，161乂1116，^)下在右腿通過(guò)肌肉內(nèi)途徑（這)使用30規(guī)格 針頭Κ50μ1體積進(jìn)行注射。在運(yùn)些效力研究中，小鼠用12.5yg PHAD/1扣g FimCH進(jìn)行免疫。 與用單獨(dú)的佐劑免疫的小鼠和天然小鼠相比，用PHAD作為佐劑和FimCH作為抗原免疫的小 鼠顯示了在感染后一天或兩天膀脫中的E.coli CRJ的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的降低(使用PHAD的實(shí) 驗(yàn)在附圖7中顯示）。運(yùn)些數(shù)據(jù)表明，用PHAD作為佐劑的FimCH疫苗在小鼠中產(chǎn)生了抗體，其 降低了膀脫的E.coli定殖。運(yùn)些數(shù)據(jù)提供了證據(jù)，即，使用根據(jù)本文描述的組合物制備的、 W及根據(jù)本文描述的方法使用的PHAD作為佐劑的FimCH疫苗施用給有需要的人類(lèi)患者也將 降低人類(lèi)膀脫中的E.coli定殖。
[02創(chuàng)實(shí)施例8:用PHAD制劑或弗氏佐劑作為佐劑的截短的FimH(FimHt):家兔中的免疫 原性研究
[0243] 通過(guò)IM注射雌性家兔在第0、21和42天施用總共3劑的10化g FimHt加約50yg本發(fā) 明的PHAD制劑(N = 2)，或總共5劑的l(K)yg FimHt加弗氏佐劑（首次接種是完全的，在約第 14、21、49和70天的每次強(qiáng)化是不完全的）（N=2)。在運(yùn)項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，截短的Fi^l具有一系列組 氨酸或組氨酸標(biāo)簽，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的是也可W使用其他截短版本的FimH,最優(yōu)選的 需要甘露糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域。運(yùn)個(gè)實(shí)施例中的截短的FimH由具有C-末端6-組氨酸標(biāo)簽的FimH殘 基1到175組成(SEQ ID N0:3)DFimH的序列在實(shí)施例2中描述。對(duì)約第20天或約第35和56天 采集的血清樣品進(jìn)行抗Fi^l抗體評(píng)估。血清中的抗體水平使用本文描述的化ISA來(lái)測(cè)定。運(yùn) 個(gè)實(shí)驗(yàn)的捕獲抗原是沒(méi)有組氨酸標(biāo)簽的相當(dāng)?shù)亟囟痰腇imH。用兩種制劑接種的家兔展現(xiàn)了 大于1:1，600,000(免疫前的血清<1:10，000)的抗FimH IgG。早先的截短的FimH版本已經(jīng)公 開(kāi)，一個(gè)實(shí)例是美國(guó)專(zhuān)利6,737,063中的，特別地將該專(zhuān)利全文引入本文作為參考。
[0244] 實(shí)施例9:施用給家兔的PHAD制劑的FimCH疫苗
[0245] 使用50yg FimCH與有和沒(méi)有0.1%聚山梨醋80的54yg PHAD(本發(fā)明的PHAD制劑， lOmM巧樣酸鋼，pH 6.0)通過(guò)IM注射對(duì)兩組家兔(N = 3)在第0天進(jìn)行免疫、在第21、42天進(jìn)行 強(qiáng)化。使用本文所述的化ISA測(cè)定血清中的抗體水平。包括在約第30天從兩個(gè)組中采集血 清。在兩個(gè)組中，IgG抗FimH滴度約等于或大于1:1，600,000(免疫前的血清<1:10,000)。在 此描述的數(shù)據(jù)表明，有或者沒(méi)有聚山梨醋80的本發(fā)明的PHAD制劑的FimCH疫苗產(chǎn)生了相等 的免疫原性應(yīng)答。
[0246] 實(shí)施例10:組合物中PHAD和DPPC的HPLC分析
[0247] PHAD 制劑中的 PHAD 和 DPPC 濃度使用 Agilent Eclipse X 抓 C18，l.祉m，4.6mmX 50mm柱進(jìn)行HPLC-ELSD分析。流動(dòng)相如下:MP A:含有20mM乙酸錠/1%乙酸的水;MP B:含有 2〇1111乙酸錠/1%乙酸的甲醇；^及1口。含有2〇1111乙酸錠/1%乙酸的甲醇/氯仿(50/50)。方 法1:W5%MP A和95%MP B梯度開(kāi)始，在2分鐘時(shí)是100%MP B，在8分鐘時(shí)是100%MP C。方 法2:W5%MP A和95%MP B梯度開(kāi)始，在2分鐘時(shí)是100%MP B，在15分鐘時(shí)是100%MP C。樣 品稀釋劑1:85:15(有20mM乙酸錠/1 %乙酸的甲醇:氯仿:水是75:15:10):(有20mM乙酸錠/ 1%乙酸的甲醇:氯仿是1:1的）。樣品和標(biāo)準(zhǔn)物用樣品稀釋劑1按1:4稀釋。樣品稀釋劑2:有 20mM乙酸錠/1%乙酸的甲醇：氯仿：水(70:25:5)。如果使用樣品稀釋劑2,樣品和標(biāo)準(zhǔn)物用 樣品稀釋劑2按1:10稀釋?；疭D增益是8,溫度60°C，氮?dú)饬髟O(shè)置在大約3.7bars。使用方法2 和樣品稀釋劑2的實(shí)例層析譜在附圖8中示出。
[024引 實(shí)施例η :PHAD組合物和制劑的穩(wěn)定性研究
[0249] 使用實(shí)施例10中所述的HPLC方法，作為懸浮液的不同的PHAD制品，或作為含有憐 脂酷膽堿的懸浮液的PHAD制劑的穩(wěn)定性通過(guò)分析運(yùn)些制品的PHAD濃度并將其與其初始結(jié) 果比較來(lái)監(jiān)測(cè)。PASS結(jié)果意味著PHAD濃度處于釋放樣品的初始測(cè)試結(jié)果的加/減20%之內(nèi)， 運(yùn)處于使用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器巧LSD)的HPLC方法的界限之內(nèi)。比較運(yùn)些保存在2Γ到8?；?25Γ或到37Γ時(shí)的制品的PHAD濃度W映射(估計(jì))運(yùn)些樣品在數(shù)月到數(shù)年間的穩(wěn)定性。對(duì)于 本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，25Γ的數(shù)據(jù)是中度的/加速的條件，37Γ的數(shù)據(jù)是加速的條件，用于 映射2Γ到8Γ的長(zhǎng)期保存條件下的保質(zhì)期。首先測(cè)定了使PHAD擁有超強(qiáng)的穩(wěn)定性的緩沖 劑;然后用包括憐脂酷膽堿的PHAD制劑評(píng)估運(yùn)些優(yōu)選的緩沖劑。
[0250] 表3.在選定的緩沖劑中25°C下7天的PHAD穩(wěn)定性
[0251]
[025引表格中的數(shù)據(jù)表明，約lOmM到50mM的巧樣酸鹽、班巧酸鹽和憐酸鹽緩沖劑優(yōu)于所 檢查的某些其他緩沖劑，在列出的溫度和列出的時(shí)間期下提供了穩(wěn)定性。
[0254]表4.在選定的緩沖劑中在25°C下持續(xù)30或60天，W及在37°C下持續(xù)7天、60天或4 個(gè)月的PHAD的穩(wěn)定性
[ο 巧5] [Ο 巧 6]
[0257] 表4中的數(shù)據(jù)表明，約30mM到約50mM的巧樣酸鹽和憐酸鹽緩沖劑優(yōu)于所檢查的其 他緩沖劑。巧樣酸鹽和憐酸鹽緩沖劑在列出的溫度和列出的時(shí)間周期下提供了穩(wěn)定性。數(shù) 據(jù)表明了將巧樣酸鹽和憐酸鹽濃度提高到約25mM到約50mM，更優(yōu)選的28mM到約50mM，最優(yōu) 選的30mM到約50mM的顯著的穩(wěn)定性效益。根據(jù)在此描述的所有數(shù)據(jù)，顯示了班巧酸鹽作為 緩沖劑的優(yōu)選的運(yùn)用。在30mM到50mM巧樣酸鹽和憐酸鹽緩沖劑中PHAD在37°C下持續(xù)60天或 更久的穩(wěn)定性是先有技術(shù)中未知的，是本發(fā)明的重要的方面。
[0258] 表5.在25°C下60天，沒(méi)有聚山梨醋80和沒(méi)有擠壓，在選定的緩沖劑和選定的憐脂 酷膽堿中本發(fā)明的0.5mg/ml PHAD制劑的穩(wěn)定性，按照與PHAD的摩爾比為2.5:1制備憐脂酷 膽堿。
[0 巧9]
[0260]
[0%1]表5中的數(shù)據(jù)表明了本發(fā)明組合約lOmM到50mM的巧樣酸鹽、班巧酸鹽和憐酸鹽緩 沖劑與憐脂酷膽堿的顯著的和意想不到的效果。本發(fā)明的優(yōu)選的緩沖劑與憐脂酷膽堿的組 合產(chǎn)生了與單獨(dú)的緩沖劑相比制劑中PHAD的優(yōu)越的穩(wěn)定性。
[0%2]表6.
[0%3]
[0264]
[0265] 如表6所示，約lOmM的巧樣酸鹽與DPPC比PHAD的特定摩爾比的組合提供了約25°C 下的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。
[0266] 如上表中顯示的，在水中制備的制劑在2°C到8°C保存時(shí)是短期穩(wěn)定的，然而，長(zhǎng)久 W來(lái)追求的目標(biāo)是降低冷鏈保存和管理。本文公開(kāi)的發(fā)明性的佐劑制劑通過(guò)提供具有在室 溫到約37°C下延長(zhǎng)的穩(wěn)定性的佐劑制劑實(shí)現(xiàn)了運(yùn)一目標(biāo)。表6中的數(shù)據(jù)清楚地顯示了，在巧 樣酸鹽緩沖劑中制備的運(yùn)些制劑的PHAD濃度將保持穩(wěn)定，在大約25°C下持續(xù)至少約6個(gè)月 或更久，在2°C到8°C下可能持續(xù)2到3年。
[0267] 向憐脂酷膽堿:PHAD制劑添加巧樣酸鹽、班巧酸鹽或憐酸鹽緩沖劑顯著地和意想 不到地允許在室溫下的保存和達(dá)到約37°C下的暴露。在水中制備的憐脂酷膽堿:PHAD制劑 可W在小鼠和家兔中產(chǎn)生相當(dāng)?shù)拿庖咴苑磻?yīng)，但是在約25°C下是不穩(wěn)定的。
[026引實(shí)施例12
[0269] 用MalvernZetasizer彩ZS90或化ooldiaven Inshuments Co;rp .，使用ZetaPlus Particle Sizing軟件，使用動(dòng)力學(xué)光散射對(duì)PHAD制劑測(cè)定顆粒大小和ze化電位。遵循廠家 的指導(dǎo)和建議。表7提供了代表性的數(shù)據(jù)。zeta電位值被用作估計(jì)雙分子層的電荷的定性數(shù) 據(jù)的一塊，W及如本文描述的來(lái)使用。根據(jù)制劑的顆粒大小和PHAD的濃度來(lái)通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定 PHAD制劑的穩(wěn)定性。
[0270] 表7.
[0271]
[0272] 如上所示，與本發(fā)明的含有PHAD的制劑相比，單獨(dú)的DPPC具有顯著更低的zeta電 位，更大得多的平均顆粒大小。DPPC的臨界膠粒團(tuán)濃度是約0.46納摩爾。運(yùn)些數(shù)據(jù)提供了證 據(jù)，即，單獨(dú)的DPPC是一種與DPPC和PHAD組合物顯著不同的組合物。 腳引實(shí)施例13
[0274]比較了保存在2°C到8°C或約25°C的有或者沒(méi)有聚山梨醋80或甘油制備實(shí)施例1的 PHAD制劑的顆粒大小，來(lái)映射(估計(jì))PHAD制劑在12到36個(gè)月期間的顆粒大小的穩(wěn)定性。審U 備多個(gè)批次的PHAD制劑，擠壓之后即時(shí)的顆粒大小一般展現(xiàn)為70到lOOnm之間。運(yùn)些PHADfIjU 劑的目標(biāo)是確保它們的平均有效直徑在其保質(zhì)期間優(yōu)選地保持在小于150nm，再更優(yōu)選為 小于130nm，基于在此描述的數(shù)據(jù)其保質(zhì)期預(yù)計(jì)為2到3年或更久。重要的是在中間/加速條 件，例如25°C下，歸納一定時(shí)間周期內(nèi)平均有效直徑的趨勢(shì)，來(lái)幫助預(yù)測(cè)在2°C到8°C下大約 2年或更久時(shí)的顆粒大小。
[02巧]用MalvernZetasizer嚴(yán)'ZS90或化ooldiaven Inshuments Co;rp .，使用ZetaPlus Particle Sizing軟件，使用動(dòng)力學(xué)光散射測(cè)定顆粒大小和ze化電位。遵循儀器廠家的指導(dǎo) 和建議。
[0276]表8.
[0277]
[027引
[0279] 運(yùn)個(gè)實(shí)施例中表8中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)映射了，沒(méi)有聚山梨醋80、在2°C到8°C保存的PHAD 制劑的顆粒大小將保持在低于150nm大約最少2年，如下文描述的暗示了可能的3年。在運(yùn)個(gè) 具體的實(shí)施例中，僅為了運(yùn)一測(cè)試的目的，穩(wěn)定的是指平均有效直徑保持在儀器的限制之 內(nèi)的低于150nm。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，25°C的數(shù)據(jù)是中間的/加速的條件，用于映射2 °C到8Γ的長(zhǎng)期保存條件下的保質(zhì)期。運(yùn)些數(shù)據(jù)清楚地映射了，運(yùn)些PHAD制劑的顆粒大小將 在約25°C下保持穩(wěn)定至少6個(gè)月或更久，在2°C到8°C下可能3年。如本文描述的，運(yùn)些PHAD制 劑在25Γ下的運(yùn)種穩(wěn)定性是先有技術(shù)未知的和意想不到的。
[0280] 實(shí)施例14:本發(fā)明的制劑與其他佐劑制劑在誘導(dǎo)小鼠的抗FimH抗體方面的比較
[0281] 如實(shí)施例1中描述的制備本發(fā)明的PHAD制劑或水性制劑(運(yùn)個(gè)實(shí)施例中的水性制 劑是指美國(guó)專(zhuān)利6,491，919和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)20080131466中描述的脂質(zhì)與佐劑的摩爾比）， 有W下的例外。使用指定的脂質(zhì)和/或摩爾比(在括號(hào)中顯示），根據(jù)實(shí)現(xiàn)勻質(zhì)懸浮液的需要 在約45 °C進(jìn)行超聲約30分鐘到2小時(shí)。如早先描述的，所有的脂質(zhì)購(gòu)自Avanti Polar Lipids。
[0282] 雌性C3H/HeN小鼠（大約9周齡）購(gòu)自化arles River實(shí)驗(yàn)室(Wilmington, ΜΑ)。小鼠 在光異氣燒麻醉化en巧5證6111，161乂1116，^)下在右腿通過(guò)肌肉內(nèi)途徑（這)使用30規(guī)格 針頭Κ50μ1體積進(jìn)行注射。在第1天和第29天，用12.5yg PHAD或弗氏佐劑(皮下施用）和15μ g FimCH免疫接種小鼠。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，在使用時(shí)，在第1天給與完全弗氏佐劑， 在第29天給與不完全弗氏佐劑。
[0283] 用于血清抗體檢測(cè)的化ISA:在處死時(shí)從小鼠采集血清，通過(guò)化ISA分析抗FimH抗 體。在PBS中Fi恤截短的T3附著于化g/ml的Immulon 4皿X平板（ThermoFisher)，在4°C過(guò) 夜。在用PBS+0.05%Tween 20洗涂之后，在PBS中的用1.5%BSA(Sigma A1化ich)阻斷開(kāi)放 的結(jié)合位點(diǎn)1小時(shí)。在洗涂之后，樣品血清的稀釋物(PBS中含有0.05 % Tween 20、0.1 % BSA、 0.5%甲基-a-D-甘露化喃糖巧的)解育2小時(shí)。在洗涂之后，樣品稀釋緩沖液中1:500稀釋的 生物素化山羊抗小鼠 IgG檢測(cè)抗血清(Sigma A1化ich)在反應(yīng)孔中4°C解育過(guò)夜。在洗涂之 后，樣品稀釋緩沖液中1:25,000稀釋的抗生物素蛋白-辣根過(guò)氧化物酶（HRP，Sigma Aldrich)在反應(yīng)孔中解育20分鐘。在洗涂之后，使用Phosphocitrate緩沖液中的TMB底物 (Sigma A1化ich)檢測(cè)皿P活性。使用VersaMax化US微量培養(yǎng)板讀取器在630nm處讀取光密 度，使用SoftMax Pro軟件(Molecular Devices,Sunnyvale,California)進(jìn)行分析?？贵w滴 度被定義為具有高于背景的信號(hào)的最高稀釋度。
[0284] 表9.
[0285] _
[0286] 如表9中清楚顯示的，與沒(méi)有佐劑、弗氏佐劑、或1:3.9摩爾比的DPPC比PHAD的水性 制劑相比，約2:1到約13:1的DPPC比PHAD摩爾比在增強(qiáng)小鼠中對(duì)Fi恤的免疫應(yīng)答方面是優(yōu) 越的。弗氏佐劑被認(rèn)為是動(dòng)物試驗(yàn)中使用的標(biāo)準(zhǔn)佐劑。數(shù)據(jù)顯示了，本文描述的約2:1到13: 1的摩爾比優(yōu)于運(yùn)種常用的前臨床佐劑。運(yùn)是本發(fā)明展現(xiàn)了對(duì)先有技術(shù)制劑的優(yōu)越性的一 個(gè)方面。表9中的數(shù)據(jù)還表明，向運(yùn)些制劑添加 DPPC不減弱PHAD制劑的預(yù)期用途，即，增強(qiáng)對(duì) FimH的免疫應(yīng)答。
[0巧7] 實(shí)施例15:本發(fā)明的制劑在24小時(shí)內(nèi)保持勻質(zhì)混合物的測(cè)定 [028引實(shí)施例1的方法用于制備DPPC: PHAD摩爾比為約2.5比1的PHAD制劑，只是不添加聚 山梨醋80。含有PHAD制劑的小瓶輕輕地翻轉(zhuǎn)約Ξ到五次。然后，容許PHAD制劑保持在室溫約 24小時(shí)。在24小時(shí)之后，不翻轉(zhuǎn)、搖動(dòng)或攬動(dòng)PHAD制劑，小屯、地從PHAD懸浮液的頂部、中間和 底部取出小的等分量。通過(guò)本文早先描述的HPLC分析運(yùn)些等分量的PHAD濃度。結(jié)果表明，來(lái) 自頂部、中間和底部的等分量含有相等的PHAD濃度。運(yùn)些結(jié)果證明，本發(fā)明的PHAD制劑在24 小時(shí)內(nèi)不沉積。
[0289] 實(shí)施例16:在人類(lèi)臨床研究中使用的本發(fā)明的制劑
[0290] 實(shí)施例1的佐劑制劑和FimCH根據(jù)cGMP制備，用于包含約21到64歲女性的人類(lèi)臨床 研究。如本文早先描述的通過(guò)向FimCH的小瓶添加預(yù)定體積的PHAD制劑，W獲得每個(gè)小瓶?jī)?yōu) 選的FimCH和PHAD濃度，來(lái)制備FimCH和PHAD制劑的疫苗。IM(肌肉內(nèi)）注射適當(dāng)體積的制備 的疫苗，來(lái)向每個(gè)女性受試者施用50yg或約107yg的FimCH，W及10yg、20yg或約40yg的 PHAD。
[0291]根據(jù)人類(lèi)中的運(yùn)些IM注射，疫苗展現(xiàn)了，與在人類(lèi)中使用的某些其他已知的佐劑 制劑相比，本發(fā)明的佐劑制劑與FimCH在人類(lèi)中產(chǎn)生了較不嚴(yán)重的注射部位反應(yīng)和全身性 反應(yīng)。運(yùn)是本發(fā)明的顯著的方面。注射部位反應(yīng)和全身性反應(yīng)的中期數(shù)據(jù)顯示如下，注射次 數(shù)是到每位女性的中期分析時(shí)為止。人類(lèi)研究正在進(jìn)行，研究中的女性計(jì)劃接受4次注射。
[0 巧 2]表 10.
[0293]
[0294] 在中期分析時(shí)，已經(jīng)對(duì)37名女性進(jìn)行了超過(guò)60次IM注射，沒(méi)有觀察嚴(yán)重的注射部 位反應(yīng)和全身性反應(yīng)。在運(yùn)個(gè)中期分析之時(shí)，組2中的女性在兩次IM注射之后展現(xiàn)了對(duì)FimH 的比疫苗接種之前的初始值大10倍的抗體反應(yīng)。運(yùn)些數(shù)據(jù)表明，疫苗產(chǎn)生了針對(duì)FimH的期 望的抗體反應(yīng)。運(yùn)項(xiàng)研究中的女性將接受4次疫苗IM注射。組5和則尋對(duì)有復(fù)發(fā)性υΤ?病史的 女性開(kāi)放注冊(cè)。
[OWS ]相比較，施用含有佐劑1化和白抓的Cer var i X疫苗引起約8 %到超過(guò)10 %的受試者 表現(xiàn)出嚴(yán)重的注射部位反應(yīng)和全身性反應(yīng)。如Treanor等(Vaccine,2013,31 (48) ,5760-5) 的出版物中報(bào)告的，已經(jīng)在含有角整締的不同制劑中制備PHAD并施用給人類(lèi)。根據(jù)運(yùn)一報(bào) 告，運(yùn)種制劑中的扣g的PHAD引起嚴(yán)重的局部反應(yīng)、寒戰(zhàn)和僵直，因而限制了在將來(lái)的研究 中使用運(yùn)一制劑僅能含有2微克或更少的PHAD。在含有1微克的PHAD的運(yùn)一制劑中，仍然觀 察到嚴(yán)重的注射部位反應(yīng)和全身性反應(yīng)。在化eanor等的運(yùn)一制劑中含有2微克或更少的 PHAD，該佐劑PHAD產(chǎn)生免疫應(yīng)答的效益是有限的，因而由于較差的制劑剝奪了PHAD的潛力。 然而，本發(fā)明的佐劑制劑使用優(yōu)越的制劑克服了運(yùn)一限制，其允許施用高達(dá)50yg的PHAD，或 可能更多，伴有不太嚴(yán)重的注射部位反應(yīng)和全身性反應(yīng)。運(yùn)些人類(lèi)數(shù)據(jù)提供了證據(jù)，即， PHAD可W用本文描述的制劑W10化g或更多施用給人類(lèi)。本發(fā)明的佐劑制劑優(yōu)于早先嘗試 的那些制劑。
[0296]在一個(gè)方面，公開(kāi)了治療人類(lèi)中復(fù)發(fā)性尿路感染的方法。所述方法包括向人類(lèi)施 用疫苗組合物的步驟，所述疫苗組合物包含（i)有效量的FimCH或截短的FimH的抗原，和 (ii)含有約lOyg到約50yg PHAD的佐劑制劑。施用于人的PHAD的量?jī)?yōu)選為約20yg到約50yg， 更優(yōu)選為約4〇yg到約5〇yg。所述疫苗組合物優(yōu)選地基本上沒(méi)有角整締。所述疫苗組合物優(yōu) 選地基本上沒(méi)有可代謝的油。所述疫苗組合物優(yōu)選地基本上沒(méi)有第二佐劑。所述疫苗組合 物優(yōu)選地大體上沒(méi)有膽固醇。所述疫苗組合物優(yōu)選地大體上沒(méi)有憐脂酷甘油。所述疫苗組 合物優(yōu)選地大體上沒(méi)有憐脂酷乙醇胺。所述疫苗組合物優(yōu)選地大體上沒(méi)有單酷基甘油。所 述疫苗組合物優(yōu)選地基本上沒(méi)有膽固醇、憐脂酷甘油、可代謝的油和第二佐劑。所述抗原可 W優(yōu)選為FimCH。
[0297] 所述佐劑制劑可W包含摩爾比約1:巧Ij約1:40的PHAD和憐脂酷膽堿，其中憐脂酷 膽堿選自由DMPC、DPPC、DSPC、P0PC和D0PC構(gòu)成的組。PHAD和憐脂酷膽堿的摩爾比優(yōu)選為約 1:1到約1:20，更優(yōu)選為約1:2到約1:5。
[0298] 所述方法可W進(jìn)一步包括在施用所述疫苗組合物的步驟之前在室溫下暴露所述 佐劑制劑60天或更久步驟。所述方法可W進(jìn)一步包括在約1年內(nèi)向人類(lèi)施用所述疫苗組合 物Ξ次的重復(fù)步驟。所述方法可W進(jìn)一步包括在施用所述疫苗組合物的步驟之前在室溫到 37°C之間的溫度下暴露所述佐劑制劑30天或更久的步驟。在一個(gè)實(shí)施方式中，在暴露于所 述溫度期間所述佐劑制劑容納于無(wú)菌的注射器中。
[0299] 所述佐劑制劑可W包含摩爾比為約1:巧Ij約1:40的PHAD和憐脂酷膽堿，其中憐脂 酷膽堿選自由01口(：、0口口(：、05口(：、口0口巧郵0口(：構(gòu)成的組;和緩沖劑選自由約10111]\1到約50111]\1范 圍內(nèi)的巧樣酸鹽、班巧酸鹽或憐酸鹽構(gòu)成的組，其Η值為約抑值4.0到約7.5。施用的PHAD的 數(shù)量?jī)?yōu)選為約20yg到約50yg，更優(yōu)選為約40yg到約50yg。
[0300] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述緩沖劑是28mM到約50mM的巧樣酸鹽，更優(yōu)選為40mM到約 50mM。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述緩沖劑是選自由憐酸氨二鋼、憐酸二氨鋼、憐酸二氨鐘和 憐酸氨二鐘構(gòu)成的組的28mM到約50mM的憐酸鹽優(yōu)選為40mM到約50mM。在另一個(gè)實(shí)施方式 中，所述緩沖劑是28mM到約50mM的班巧酸鹽，優(yōu)選為40mM到約50mM。所述佐劑制劑可W進(jìn)一 步包括非離子表面活性劑，優(yōu)選為聚山梨醋80。所述佐劑制劑優(yōu)選為不凍干。
[0301] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述佐劑制劑基本上由（i )PHAD，（ii)憐脂酷膽堿，（iii)緩沖 劑組成，其中PHAD和憐脂酷膽堿W約1:巧喲1:40的摩爾比存化其中所述憐脂酷膽堿選自 由01口(：、0口口(：、05口(：、口0口巧郵0口(：構(gòu)成的組；^及其中所述緩沖劑選自由約10111]\1到約50111]\1范 圍內(nèi)的巧樣酸鹽、班巧酸鹽或憐酸鹽構(gòu)成的組，其pH值約pH值4.0到約7.5。
[0302] 在另一個(gè)方面，提供了疫苗組合物。所述疫苗組合物包括有效量的選自由FimCH或 截短的FimH構(gòu)成的組的抗原；W及，包含PHAD和緩沖劑的佐劑制劑，所述緩沖劑選自由約 lOmM到約50mM的巧樣酸鹽、班巧酸鹽和憐酸鹽構(gòu)成的組。所述佐劑制劑可W包括摩爾比為 約1:1到約1:40的PHAD和憐脂酷膽堿，可W進(jìn)一步包括選自由25mM到約50mM的巧樣酸鹽、班 巧酸鹽或憐酸鹽構(gòu)成的組的緩沖劑，其抑值為約pH值4.5到約6.4。所述憐脂酷膽堿優(yōu)選地 選自由DMPC、DPPC、DSPC、POPC和D0PC構(gòu)成的組。佐劑制劑可W進(jìn)一步包含非離子表面活性 劑。
[0303] 優(yōu)選地，所述疫苗組合物中的PHAD在其用于所述疫苗組合物中之前在室溫下維持 穩(wěn)定6個(gè)月或更久。更優(yōu)選地，所述疫苗組合物中的PHAD在其用于所述疫苗組合物中之前在 室溫和37°C之間的溫度下維持穩(wěn)定60天或更久。所述抗原優(yōu)選為FimCH。
[0304] 所述疫苗組合物優(yōu)選地基本上沒(méi)有角整締。所述疫苗組合物優(yōu)選地基本上沒(méi)有用 作佐劑的可代謝的油。所述疫苗組合物優(yōu)選地基本上沒(méi)有可代謝的油。所述疫苗組合物優(yōu) 選地大體上沒(méi)有第二佐劑。所述疫苗組合物優(yōu)選地大體上沒(méi)有膽固醇。所述疫苗組合物優(yōu) 選地大體上沒(méi)有憐脂酷甘油或憐脂酷乙醇胺，或兩者都沒(méi)有。所述疫苗組合物優(yōu)選地大體 上沒(méi)有單酷基甘油。
[0305] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述疫苗組合物優(yōu)選地基本上沒(méi)有膽固醇、憐脂酷甘油、可代 謝的油和第二佐劑。
[0306] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述PHAD和憐脂酷膽堿的摩爾比優(yōu)選為約1:1到約1:20,更優(yōu) 選為約1:2到約1:5。所述憐脂酷膽堿優(yōu)選地選自由DMPC、DPPC和DSPC構(gòu)成的組。在一個(gè)實(shí)施 方式中，所述緩沖劑是28mM到約50mM的巧樣酸鹽，更優(yōu)選為40mM到約50mM。在另一個(gè)實(shí)施方 式中，所述緩沖劑是選自由憐酸氨二鋼、憐酸二氨鋼、憐酸二氨鐘和憐酸氨二鐘構(gòu)成的組的 憐酸鹽，其濃度為28mM到約50mM、優(yōu)選為40mM到約50mM。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述緩沖劑 是28mM到約50mM的班巧酸鹽，優(yōu)選為40mM到約50mM。
[0307] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述佐劑制劑基本上由（i)PHAD，（ii)憐脂酷膽堿，和（iii) 緩沖劑組成，其中所述PHAD和憐脂酷膽堿W約1:1到約1:40的摩爾比存在，其中所述憐脂酷 膽堿選自由01口0、0口口(：、05口(：、口0口巧郵0口(：構(gòu)成的組；從及其中所述緩沖劑選自由巧樣酸鹽、 班巧酸鹽或憐酸鹽構(gòu)成的組，其pH值為約pH值4.5到約6.5、其濃度在約1 OmM到約50mM范圍 內(nèi)的。
[0308] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了疫苗試劑盒。所述試劑盒包括含F(xiàn)imCH的組合物的第 一容器;本文描述的佐劑制劑的第二容器;和使用說(shuō)明書(shū)，其中所述說(shuō)明書(shū)包括在佐劑制劑 用于所述疫苗組合物之前在室溫下保存所述佐劑制劑60天或更久的指導(dǎo)。所述使用說(shuō)明書(shū) 優(yōu)選地包括容許佐劑制劑在用于所述疫苗組合物之前在室溫下暴露6個(gè)月或更久的指導(dǎo)。 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述使用說(shuō)明書(shū)包括容許佐劑制劑在用于所述疫苗組合物之前在室溫 到約37Γ下暴露2個(gè)月或更久的指導(dǎo)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述使用說(shuō)明書(shū)包括容許佐劑 制劑在用于疫苗組合物之前在室溫和約37Γ之間暴露30天或更久的指導(dǎo)。在另一個(gè)實(shí)施方 式中，所述使用說(shuō)明書(shū)包括暴露在室溫到約37°C之間通過(guò)郵政或商業(yè)運(yùn)輸服務(wù)來(lái)運(yùn)輸或轉(zhuǎn) 移所述佐劑制劑到其他地點(diǎn)的指導(dǎo)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述第二容器是無(wú)菌的注射器。
[0309] 在另一個(gè)方面，提供了制備疫苗的方法。所述方法包括提供包含PHAD和緩沖劑的 佐劑制劑的步驟，所述緩沖劑選自由約lOmM到約50mM的巧樣酸鹽、班巧酸鹽和憐酸鹽構(gòu)成 的組；W及將所述佐劑制劑與有效量的選自由FimCH或截短的FimH構(gòu)成的組的抗原組合的 步驟;其中所述佐劑制劑在其用于所述疫苗組合物之前在室溫下維持穩(wěn)定60天或更久，在 室溫和37°C之間的溫度下維持穩(wěn)定30天或更久。優(yōu)選地，所述佐劑制劑不進(jìn)行凍干處理。優(yōu) 選地，所述佐劑制劑容納在無(wú)菌的注射器中。
[0310] 在另一個(gè)方面，提供了包含PHAD和緩沖劑的藥物組合物，所述緩沖劑選自由巧樣 酸鹽和班巧酸鹽構(gòu)成的組，其抑值約4.0到約7.5、其濃度為25mM到約50mM。
[0311 ]在另一個(gè)方面，提供了包含PHAD和緩沖劑的藥物組合物，所述緩沖劑選自由憐酸 氨二鋼、憐酸二氨鋼、憐酸二氨鐘和憐酸氨二鐘構(gòu)成的組，其pH值約4.5到約6.5、其濃度為 28mM到約50mM，其中所述組合物大體上沒(méi)有鹽水。
[0312] 在另一個(gè)方面，提供了向人類(lèi)施用疫苗組合物的方法。所述方法包括向人類(lèi)施用 包含佐劑制劑的疫苗組合物的步驟，所述佐劑制劑含有憐脂酷膽堿、約2〇yg到約5〇yg的 PHAD、和選自由25mM到約50mM的巧樣酸鹽和班巧酸鹽構(gòu)成的組的緩沖劑。
[0313] 在另一個(gè)方面，提供了用于治療人類(lèi)中復(fù)發(fā)性尿路感染的方法。所述方法包括向 人類(lèi)施用疫苗組合物的步驟，所述疫苗組合物包含（i)有效量的FimCH，（ ii)含有憐脂酷膽 堿、約20yg到約50yg的PHAD和緩沖劑的佐劑制劑，所述緩沖劑選自由1 OmM到約50mM的巧樣 酸鹽、班巧酸鹽和憐酸鹽構(gòu)成的組，其中所述組合物基本上沒(méi)有角整締。
[0314] 在另一個(gè)方面，提供了在患有復(fù)發(fā)性尿路感染的人體中誘導(dǎo)針對(duì)FimH的抗體產(chǎn)生 的方法。所述方法施用疫苗組合物，所述疫苗組合物包含（i)有效量的FimCH或截短的FimH 的抗原，和（ii)含有約lOyg到約50yg PHAD的佐劑制劑。
[0315] 在另一個(gè)方面，提供了包含PHAD、憐脂酷膽堿和緩沖劑的藥物組合物，所述緩沖劑 選自由約lOmM到約50mM的巧樣酸鹽和班巧酸鹽構(gòu)成的組。
[0316] 在另一個(gè)方面，提供了包含PHAD、憐脂酷膽堿和緩沖劑的藥物組合物，所述緩沖劑 選自由約lOmM到約50mM的憐酸氨二鋼、憐酸二氨鋼、憐酸二氨鐘和憐酸氨二鐘構(gòu)成的組，其 中所述組合物大體上沒(méi)有鹽水。
[0317] 在另一個(gè)方面，提供了包含PHAD緩沖劑的藥物組合物，所述緩沖劑選自由25mM到 約50mM的巧樣酸鹽和班巧酸鹽構(gòu)成的組。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述組合物包含與PHAD的摩 爾比在大約1:1到約20 :1的憐脂酷膽堿，其中憐脂酷膽堿選自由DMPC、DPPC、DSPC、P0PC和 D0PC構(gòu)成的組。優(yōu)選地，所述緩沖劑濃度是30mM到約50mM，更優(yōu)選的，所述緩沖劑濃度是 40mM到約50mM，pH值約4.0到約7.5。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述緩沖劑是巧樣酸鹽。在一個(gè)實(shí) 施方式中，所述緩沖劑是班巧酸鹽。所述組合物可W包括有效量的FimCH。
[0318] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述組合物在作為佐劑施用給人類(lèi)之前暴露于室溫60天或更 久。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述組合物當(dāng)在約室溫下保存6個(gè)月或更久，W及在室溫和約37 °C之間保存2個(gè)月或更久時(shí)是穩(wěn)定的。
[0319] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述組合物大體上沒(méi)有鹽水。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述組合 物含有小于lOmM的化C1，優(yōu)選地基本上沒(méi)有NaCl。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述組合物基本上 沒(méi)有膽固醇、憐脂酷甘油和角整締。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述組合物沒(méi)有進(jìn)行凍干處理。 在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述組合物包含有效量的FimCH。優(yōu)選地，所述組合物沒(méi)有進(jìn)行凍干 處理。
[0320] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了包含PHAD和緩沖劑的藥物組合物，所述緩沖劑選自 由約28mM到約50mM的憐酸氨二鋼、憐酸二氨鋼、憐酸二氨鐘和憐酸氨二鐘構(gòu)成的組，其中所 述組合物大體上沒(méi)有鹽水。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述組合物包括與PHAD的摩爾比在大約1:1 到約20:1的憐脂酷膽堿，其中憐脂酷膽堿選自由DMPC、DPPC、D SPC、P0PC和D0PC構(gòu)成的組。優(yōu) 選地，所述緩沖劑濃度是30mM到約50mM，更優(yōu)選的，所述緩沖劑濃度是40mM到約50mM，抑值 約4.0到約7.5。
[0321] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述組合物含有小于lOmM的化C1，更優(yōu)選的基本上沒(méi)有 NaCl。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述組合物基本上沒(méi)有膽固醇、憐脂酷甘油和角整締。
[0322] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述組合物在作為佐劑施用給人類(lèi)之前暴露于室溫60天或 更久。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述組合物當(dāng)暴露于室溫6個(gè)月或更久W及暴露于室溫和約37 °C之間2個(gè)月或更久時(shí)是穩(wěn)定的。
[0323] 在另一個(gè)方面，提供了向人類(lèi)施用疫苗組合物的方法。所述方法包括向人類(lèi)施用 包含佐劑制劑的疫苗組合物的步驟，所述佐劑制劑含有憐脂酷膽堿、約2〇yg到約5〇yg的 PHAD、和選自由25mM到約50mM的巧樣酸鹽和班巧酸鹽構(gòu)成的組的緩沖劑。優(yōu)選地，所述佐劑 制劑基本上沒(méi)有膽固醇和憐脂酷甘油。
[0324] 在另一個(gè)方面，提供了治療人類(lèi)中復(fù)發(fā)性尿路感染的方法。所述方法包括向人類(lèi) 施用疫苗組合物的步驟，所述疫苗組合物包含(i)有效量的FimCH，（ ii)含有憐脂酷膽堿、約 20yg到約50yg的PHAD和緩沖劑的佐劑制劑，所述緩沖劑選自由lOmM到約50mM的巧樣酸鹽、 班巧酸鹽和憐酸鹽構(gòu)成的組，其中所述組合物基本上沒(méi)有角整締。優(yōu)選地，所述組合物大體 上沒(méi)有鹽水。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述緩沖劑選自巧樣酸鹽和班巧酸鹽的組，其濃度為25mM 至喲50mM、其抑值約4.0到約7.5的。
[0325] 本說(shuō)明書(shū)中引用的所有參考文獻(xiàn)，無(wú)限制地包括所有報(bào)紙、出版物、演講、教科書(shū)、 報(bào)告、手稿、手冊(cè)、互聯(lián)網(wǎng)發(fā)帖、期刊論文、周刊等，通過(guò)引用合并在本文中作為參考。本文的 參考文獻(xiàn)的討論僅僅為了概括它們的作者的主張，不承認(rèn)任何參考文獻(xiàn)構(gòu)成先有技術(shù)。發(fā) 明人保留挑戰(zhàn)引證的參考文獻(xiàn)的準(zhǔn)確性和適當(dāng)性權(quán)利。
[0326] 希望本文公開(kāi)的所有可專(zhuān)利的主題被要求權(quán)利，運(yùn)些可專(zhuān)利的主題不被貢獻(xiàn)給公 眾。因此，希望權(quán)利要求根據(jù)該意圖被廣義地解讀。此外，除非根據(jù)上下文是明顯矛盾的，希 望對(duì)"一"、"一個(gè)"的所有引用，W及隨后回頭指代由"一""一個(gè)"所指示的前提基礎(chǔ)時(shí)對(duì)"所 述"的相應(yīng)的引用，按照"至少一種"的意思被廣義地解讀。類(lèi)似地，除非根據(jù)上下文是明顯 矛盾的，詞語(yǔ)"或"在對(duì)可選擇的指定元素使用時(shí)，意圖被廣義地解讀為，在可選項(xiàng)中，指定 元素的任意一個(gè)、指定元素的任何子集、或所有的指定元素。
[0327] 根據(jù)上文，可W看出實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，獲得了其他有益的結(jié)果。要理解的 是，前述的實(shí)施方式僅為了示范性的目的，僅是代表本發(fā)明的原理應(yīng)用的許多可能的具體 實(shí)施方式的舉例。因此，可W在上述方法和組合物中進(jìn)行各種變化而不背離本發(fā)明的范圍， 希望伴隨附圖所示的包含于上述說(shuō)明書(shū)的所有內(nèi)容應(yīng)被解釋為說(shuō)明性的，而不是限制性 的。
[0328] 此外，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可W對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種變化和修改來(lái)使它適應(yīng)各種 用途和條件，包括沒(méi)有在此具體展開(kāi)的那些，而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因而，那些變 化和修改適當(dāng)?shù)亍⒑侠淼叵Ｍ诒疚乃_(kāi)和描述的發(fā)明的等價(jià)物的完整范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于治療人類(lèi)復(fù)發(fā)性尿路感染的方法，包括步驟： 向所述人類(lèi)施用疫苗組合物，所述疫苗組合物包括（i )FimCH或截短的FimH的有效量的 抗原，和（i i)含有約1 〇yg到約50yg PHAD的佐劑制劑。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述佐劑制劑包括PHAD與磷脂酰膽堿的摩爾比約1: 1到約1:40，其中磷脂酰膽堿選自由DMPC、DPPC、DSPC、P0PC和D0PC組成的組。3. 如權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括在施用所述疫苗組合物的步驟之前在室溫下 暴露所述佐劑制劑60天或更久。4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述佐劑制劑包括PHAD與磷脂酰膽堿的摩爾比約1: 1到約1:40，其中磷脂酰膽堿選自由DMPC、DPPC、DSPC、P0PC和D0PC組成的組；以及1 OmM到約 50mM的選自由檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或磷酸鹽組成的組的緩沖劑，其pH值為約4.0到約7.5。5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中，PHAD的施用量為約20yg到約50yg。6. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中，PHAD的施用量為約40yg到約50yg。7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述抗原為FimCH。8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，施用于人類(lèi)的PHAD的量為約20yg到約50yg。9. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，PHAD的施用量為約40yg到約50yg。10. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述疫苗組合物基本上沒(méi)有角鯊烯。11. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述疫苗組合物基本上沒(méi)有用作佐劑的可代謝的 油。12. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述疫苗組合物基本上沒(méi)有可代謝的油。13. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述疫苗組合物基本上沒(méi)有第二佐劑。14. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述疫苗組合物大體上沒(méi)有膽固醇。15. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述疫苗組合物大體上沒(méi)有磷脂酰甘油。16. 如權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述疫苗組合物大體上沒(méi)有磷脂酰乙醇胺。17. 如權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述疫苗組合物大體上沒(méi)有單?；视?。18. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述疫苗組合物基本上沒(méi)有膽固醇、磷脂酰甘油、 可代謝的油和第二佐劑。19. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述PHAD與磷脂酰膽堿的摩爾比為約1:1到約1: 20 〇20. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述PHAD與磷脂酰膽堿的摩爾比為約1:2到約1:5。21. 如權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括在約1年內(nèi)重復(fù)向人類(lèi)施用所述疫苗組合物 三次的步驟。22. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述緩沖劑為28mM到約50mM的檸檬酸鹽。23. 如權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述緩沖劑為40mM到約50mM。24. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述緩沖劑為28mM到約50mM的選自由磷酸氫二鈉、 磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀組成的組的磷酸鹽。25. 如權(quán)利要求24所述的方法，其中，所述緩沖劑為40mM到約50mM。26. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述緩沖劑為28mM到約50mM的琥珀酸鹽。27. 如權(quán)利要求26所述的方法，其中，所述緩沖劑為40mM到約50mM。28. 如權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括在施用所述疫苗組合物的步驟之前將所述佐 劑制劑暴露于室溫和37 °C之間的溫度下30天或更久的步驟。29. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述佐劑制劑進(jìn)一步包含非離子表面活性劑。30. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述佐劑制劑基本上由（i)PHAD，（ii)磷脂酰膽堿， (iii)緩沖劑組成，其中，PHAD與磷脂酰膽堿的摩爾比為約1:1到約1:40,其中磷脂酰膽堿選 自由01^(：、0??(：、03?(：、？0?(：和00?(：組成的組 ；以及其中所述緩沖劑為10111]\1到約501111的選自 由檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或磷酸鹽組成的組，其pH值為約4.0到約7.5。31. 如權(quán)利要求29所述的方法，其中，所述非離子表面活性劑是聚山梨酯80。32. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述佐劑制劑沒(méi)有經(jīng)過(guò)凍干處理。33. 如權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述佐劑制劑在暴露于所述溫度期間容納于無(wú)菌 的注射器中。34. 一種疫苗組合物，包括： 有效量的抗原，所述抗原選自由FimCH或截短的FimH組成的組;和， 包含PHAD和緩沖劑的佐劑制劑，所述緩沖劑為約10mM到約50mM的選自由檸檬酸鹽、琥 珀酸鹽和磷酸鹽組成的組。35. 如權(quán)利要求34所述的疫苗組合物，其中，所述佐劑制劑包括PHAD與磷脂酰膽堿的摩 爾比為約1:1到約1:40。36. 如權(quán)利要求35所述的疫苗組合物，進(jìn)一步包括一種緩沖劑，所述緩沖劑為25mM到約 50mM的選自由檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或磷酸鹽組成的組，其pH值約4.0到約7.5。37. 如權(quán)利要求35所述的疫苗組合物，其中，磷脂酰膽堿選自由DMPC、DPPC、DSPC、POPC 和D0PC組成的組。38. 如權(quán)利要求34所述的疫苗組合物，其中，所述佐劑制劑包括有效濃度的PHAD，向人 類(lèi)施用的0. lmL到1. OmL注射液含有約1 Oyg到約50yg的PHAD。39. 如權(quán)利要求35所述的疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物中的PHAD在其用于所述疫 苗組合物中之前在室溫下維持穩(wěn)定6個(gè)月或更久。40. 如權(quán)利要求35所述的疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物中的PHAD在其用于所述疫 苗組合物中之前在室溫到37 °C之間的溫度下維持穩(wěn)定60天或更久。41. 如權(quán)利要求34所述的疫苗組合物，其中，所述抗原是FimCH。42. 如權(quán)利要求34所述的疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物基本上沒(méi)有角鯊烯。43. 如權(quán)利要求42所述的疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物基本上沒(méi)有用作佐劑的可 代謝的油。44. 如權(quán)利要求43所述的疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物基本上沒(méi)有可代謝的油。45. 如權(quán)利要求44所述的疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物大體上沒(méi)有第二佐劑。46. 如權(quán)利要求34所述的疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物大體上沒(méi)有膽固醇。47. 如權(quán)利要求46所述的疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物大體上沒(méi)有磷脂酰甘油。48. 如權(quán)利要求47所述的疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物大體上沒(méi)有磷脂酰乙醇 胺。49. 如權(quán)利要求48所述的疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物大體上沒(méi)有單酰基甘油。50. 如權(quán)利要求34所述的疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物基本上沒(méi)有膽固醇、磷脂 酰甘油、可代謝的油和第二佐劑。51. 如權(quán)利要求35所述的疫苗組合物，其中，PHAD與磷脂酰膽堿的摩爾比為約1:1到約 1：20〇52. 如權(quán)利要求35所述的疫苗組合物，其中，PHAD與磷脂酰膽堿的摩爾比為約1:2到約 1:5〇53. 如權(quán)利要求37所述的疫苗組合物，其中，磷脂酰膽堿選自由DMPC、DPPC和DSPC組成 的組。54. 如權(quán)利要求36所述的疫苗組合物，其中，所述緩沖劑為28mM到約50mM的檸檬酸鹽。55. 如權(quán)利要求54所述的組合物，其中，所述緩沖劑為40mM到約50mM。56. 如權(quán)利要求36所述的組合物，其中，所述緩沖劑為28mM到約50mM的選自由磷酸氫二 鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀組成的組的磷酸鹽。57. 如權(quán)利要求56所述的組合物，其中，所述緩沖劑為40mM到約50mM。58. 如權(quán)利要求36所述的疫苗組合物，其中，所述緩沖劑為28mM到約50mM的琥珀酸鹽。59. 如權(quán)利要求58所述的組合物，其中，所述緩沖劑為40mM到約50mM。60. 如權(quán)利要求34所述的組合物，其中，所述佐劑制劑進(jìn)一步包含非離子表面活性劑。61. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述佐劑制劑基本上由（i)PHAD，（ii)磷脂酰膽 堿，和（iii)緩沖劑組成，其中，PHAD與磷脂酰膽堿的摩爾比為約1:1到約1:40,其中磷脂酰 膽堿選自由DMPC、DPPC、DSPC、POPC和DOPC組成的組；以及其中所述緩沖劑為1 OmM到約50mM 的選自由檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或磷酸鹽組成的組，其pH為約4.5到約6.5。62. -種疫苗試劑盒，包括： 含有FimCH的組合物的第一容器： 權(quán)利要求4的佐劑制劑的第二容器;和， 使用說(shuō)明書(shū)，其中所述說(shuō)明書(shū)包括在所述佐劑制劑用于所述疫苗組合物中之前在室溫 下將所述佐劑制劑保存60天或更久的指導(dǎo)。63. 如權(quán)利要求62所述的疫苗試劑盒，其中，所述使用說(shuō)明書(shū)包括在用于所述疫苗組合 物中之前容許佐劑制劑在室溫下暴露6個(gè)月或更久的說(shuō)明。64. 如權(quán)利要求62所述的疫苗試劑盒，其中，所述使用說(shuō)明書(shū)包括在用于所述疫苗組合 物中之前容許將所述佐劑制劑暴露于室溫到約37°C之間2個(gè)月或更久的指導(dǎo)。65. 如權(quán)利要求62所述的疫苗試劑盒，其中，所述使用說(shuō)明書(shū)包括在用于所述疫苗組合 物中之前容許所述佐劑制劑暴露于室溫到約37 °C之間30天或更久的指導(dǎo)。66. 如權(quán)利要求62所述的疫苗試劑盒，其中，所述使用說(shuō)明書(shū)包括暴露在室溫到約37°C 之間通過(guò)政府郵政服務(wù)或商業(yè)運(yùn)輸服務(wù)來(lái)運(yùn)輸或轉(zhuǎn)移所述佐劑制劑到其他地點(diǎn)的指導(dǎo)。67. 如權(quán)利要求62所述的疫苗試劑盒，其中，所述第二容器是無(wú)菌的注射器。68. -種制備疫苗的方法，包括步驟： 提供包含PHAD和緩沖劑的佐劑制劑，所述緩沖劑為約1 OmM到約50mM的選自由檸檬酸 鹽、琥珀酸鹽和磷酸鹽組成的組;和 組合所述佐劑制劑與有效量的抗原，所述抗原選自由FimCH或截短的FimH組成的組;其 中所述佐劑制劑在其用于所述疫苗組合物中之前在室溫下維持穩(wěn)定60天或更久，以及在室 溫到37°C之間的溫度下維持穩(wěn)定30天或更久。69. 如權(quán)利要求68所述的方法，其中，所述佐劑制劑沒(méi)有經(jīng)過(guò)凍干處理。70. 如權(quán)利要求68所述的方法，其中，所述佐劑制劑容納于無(wú)菌的注射器中。71. -種藥物組合物，包括PHAD和緩沖劑，所述緩沖劑為25mM到約50mM的選自由檸檬酸 鹽和琥珀酸鹽組成的組，其pH值約4.0到約7.5。72. -種藥物組合物，包括PHAD和緩沖劑，所述緩沖劑為28mM到約50mM的選自由磷酸氫 二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀組成的組，其pH值約4.5到約6.5，其中所述組 合物大體上沒(méi)有鹽水。73. -種向人類(lèi)施用疫苗組合物的方法，包括步驟： 向所述人類(lèi)施用包含佐劑制劑的疫苗組合物，所述佐劑制劑含有磷脂酰膽堿、約20yg 到約50yg的PHAD、和25mM到約50mM的選自由檸檬酸鹽和琥珀酸鹽組成的組的緩沖劑。74. -種用于治療人類(lèi)復(fù)發(fā)性尿路感染的方法，包括步驟： 向所述人類(lèi)施用疫苗組合物，所述疫苗組合物包括（i)有效量的FimCH，（ii)含有磷脂 酰膽堿、約20yg到約50yg的PHAD和緩沖劑的佐劑制劑，所述緩沖劑為10mM到約50mM的選自 由檸檬酸鹽、琥珀酸鹽和磷酸鹽組成的組，其中所述組合物基本上沒(méi)有角鯊烯。75. -種在患有復(fù)發(fā)性尿路感染的人類(lèi)中誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)FimH的抗體的方法，所述方法 包括： 施用疫苗組合物，所述疫苗組合物包括（i)有效量的FimCH或截短的FimH的抗原，和 (i i)含有約1 Owg到約5〇yg PHAD的佐劑制劑。76. -種藥物組合物，包括PHAD、磷脂酰膽堿和緩沖劑，所述緩沖劑為約10mM到約50mM 的選自由檸檬酸鹽和琥珀酸鹽組成的組。77. -種藥物組合物，包括PHAD、磷脂酰膽堿和緩沖劑，所述緩沖劑為約10mM到約50mM 的選自由磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀組成的組，其中所述組合物大 體上沒(méi)有鹽水。78. -種藥物組合物，包括PHAD和緩沖劑，所述緩沖劑為25mM到約50mM的選自由檸檬酸 鹽和琥珀酸鹽組成的組。79. 如權(quán)利要求78所述的藥物組合物，其中，所述組合物包含磷脂酰膽堿與PHAD的摩爾 比為約1:1到約20:1，其中磷脂酰膽堿選自由DMPC、DPPC、DSPC、P0PC和D0PC組成的組。80. 如權(quán)利要求78所述的藥物組合物，其中，所述緩沖劑濃度為30mM到約50mM。81. 如權(quán)利要求78所述的藥物組合物，其中，所述緩沖劑濃度為40mM到約50mM，其pH值 為約4.0到約7.5。82. 如權(quán)利要求78所述的藥物組合物，其中，所述緩沖劑為檸檬酸鹽。83. 如權(quán)利要求78所述的藥物組合物，其中，所述緩沖劑為琥珀酸鹽。84. 如權(quán)利要求78所述的藥物組合物，其中，所述組合物在作為佐劑施用于人類(lèi)之前暴 露于室溫60天或更久。85. 如權(quán)利要求78所述的藥物組合物，其中，所述組合物當(dāng)被保存在室溫下時(shí)維持穩(wěn)定 6個(gè)月或更久，以及在室溫到約37°C之間時(shí)維持穩(wěn)定2個(gè)月或更久。86. 如權(quán)利要求78所述的疫苗組合物，其中，所述組合物大體上沒(méi)有鹽水。87. 如權(quán)利要求78所述的疫苗組合物，其中，所述組合物含有小于10mM的NaCl。88. 如權(quán)利要求78所述的疫苗組合物，其中，所述組合物基本上沒(méi)有NaCl。89. 如權(quán)利要求78所述的疫苗組合物，其中，所述組合物基本上沒(méi)有膽固醇、磷脂酰甘 油和角鯊烯。90. 如權(quán)利要求78所述的疫苗組合物，其中，所述組合物包含有效量的FimCH。91. 如權(quán)利要求78所述的疫苗組合物，其中，所述組合物沒(méi)有經(jīng)過(guò)凍干處理。92. -種藥物組合物，包括PHAD和緩沖劑，所述緩沖劑為28mM到約50mM的選自由磷酸氫 二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀組成的組，其中所述組合物大體上沒(méi)有鹽水。93. 如權(quán)利要求92所述的組合物，其中，所述組合物包含的磷脂酰膽堿與PHAD的摩爾比 為約1:1到約20:1，其中磷脂酰膽堿選自由DMPC、DPPC、DSPC、POPC和DOPC組成的組。94. 如權(quán)利要求92所述的組合物，其中，所述緩沖劑濃度為30mM到約50mM。95. 如權(quán)利要求92所述的組合物，其中，所述緩沖劑濃度為40mM到約50mM，其pH值為約 4.0 到約 7.5。96. 如權(quán)利要求92所述的組合物，其中，所述組合物含有小于10mM的NaCl。97. 如權(quán)利要求92所述的組合物，其中，所述組合物基本上沒(méi)有NaCl。98. 如權(quán)利要求92所述的組合物，其中，所述組合物基本上沒(méi)有膽固醇、磷脂酰甘油和 角鯊烯。99. 如權(quán)利要求92所述的組合物，其中，所述組合物包含有效量的FimCH。100. 如權(quán)利要求92所述的組合物，其中，所述組合物在作為佐劑施用于人類(lèi)之前暴露 于室溫60天或更久。101. 如權(quán)利要求92所述的組合物，其中，所述組合物當(dāng)暴露于室溫6個(gè)月或更久以及暴 露于室溫和約37°C之間2個(gè)月或更久時(shí)是穩(wěn)定的。102. 如權(quán)利要求92所述的組合物，其中，所述組合物沒(méi)有經(jīng)過(guò)凍干處理。103. -種向人類(lèi)施用疫苗組合物的方法，包括步驟： 向所述人類(lèi)施用包含佐劑制劑的疫苗組合物，所述佐劑制劑含有磷脂酰膽堿、約20yg 到約50yg的PHAD、和25mM到約50mM的選自由檸檬酸鹽和琥珀酸鹽組成的組的緩沖劑。104. 如權(quán)利要求103所述的方法，其中，所述佐劑制劑基本上沒(méi)有膽固醇和磷脂酰甘 油。105. -種用于治療人類(lèi)復(fù)發(fā)性尿路感染的方法，包括步驟： 向所述人類(lèi)施用疫苗組合物，所述疫苗組合物包括(i)有效量的FimCH，（ ii)佐劑制劑， 所述佐劑制劑含有磷脂酰膽堿、約20yg到約50yg的PHAD和緩沖劑，所述緩沖劑為1 OmM到約 50mM的選自由檸檬酸鹽、琥珀酸鹽和磷酸鹽組成的組，其中所述組合物基本上沒(méi)有角鯊烯。106. 如權(quán)利要求105所述的方法，其中，所述疫苗組合物大體上沒(méi)有鹽水。107. 如權(quán)利要求105所述的方法，其中，所述緩沖劑為25mM到約50mM的選自檸檬酸鹽和 琥珀酸鹽的組，其pH值約4.0到約7.5。
【文檔編號(hào)】A61K39/00GK106029090SQ201480063419
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2014年9月24日
【發(fā)明人】加里·愛(ài)爾德里奇, 斯蒂文·馬丁
【申請(qǐng)人】紅杉科學(xué)有限公司