天然本草提取物的制備方法及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種天然本草提取物，其中樟子松多酚的質(zhì)量百分比為10％?80％。本發(fā)明還提供了一種天然本草提取物的制備方法以及在化妝品中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的天然本草提取物為粉末狀，可以直接向化妝品和/或護(hù)膚品中添加，而不需要研磨等其他預(yù)處理。且提取工藝產(chǎn)生的廢渣用于合成木板，溶媒經(jīng)過處理后返回至溶媒槽，可以繼續(xù)使用，整個(gè)提取工藝無廢液、廢渣產(chǎn)生，綠色無污染。本發(fā)明提供的天然本草提取物具有優(yōu)異的抗衰老、保濕和美白功效，可以作為復(fù)合型化妝品和/或護(hù)膚品添加劑。
【專利說明】
天然本草提取物的制備方法及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種提取物及其制備方法和包含該提取物的化妝 品，尤其涉及一種樟子松樹皮提取物及其制備方法和在化妝品中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 棒子松(Pinus sylvestris L.var.mongolica Litvin)是松科松屬裸子植物，又 名海拉爾松。常綠喬木，高達(dá)25m，胸徑達(dá)80cm，樹干下部灰褐色或黑褐色。主要分布于大興 安嶺北部海拔400-1000m的山地。
[0003 ]樟子松花紋美觀、紋理較直，且具有耐寒、抗旱、耐貧瘠及抗風(fēng)等特性，目前在家具 及三北地區(qū)防護(hù)林和固沙造林方面應(yīng)用較多。顧劍、張宇(樟子松樹皮有效成分的初步研 究，黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2009年6月第32卷第3期第4頁)采用水提和醇提的方法對樟子松樹皮 的有效成分進(jìn)行提取、檢測，發(fā)現(xiàn)樟子松樹皮中含有多糖、苷類、黃酮、有機(jī)酸、鞣質(zhì)等有效 成分，具有藥用開發(fā)價(jià)值。
[0004] 研究表明，樟子松樹皮用乙醇提取的醇溶性物質(zhì)中含有的黃酮類物質(zhì)，為具有多 種保健功效的天然提取物，但是由于樟子松中的油脂含量僅為樹皮干重的1%_3%，因此， 樟子松樹皮的應(yīng)用價(jià)值并未引起人們的重視。申請?zhí)?01410820123.X，發(fā)明創(chuàng)造名稱為:一 種從樟子松樹皮中提取醇溶性物質(zhì)的方法的中國專利，公開了一種分段提取樟子松樹皮活 性物質(zhì)的方法，但是其并未公開樟子松樹皮在化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用與介紹，目前也未見到將 樟子松樹皮用于化妝品領(lǐng)域的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種樟子松樹皮提取物及其制備方法，并研究了該提取物在化妝品領(lǐng) 域中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的第一個(gè)方面在于提供一種樟子松樹皮提取物，所述樟子松樹皮包括樟子 松多酚、多糖及苷類化合物中的任意一種或幾種組合物。
[0007] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述樟子松樹皮提取物中所述樟子松多酚的質(zhì)量 百分比為10%-80%，如15%、70%等，優(yōu)選為20%-50%，如25%、35%等。
[0008] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述樟子松多酚中包括黃酮類化合物和原花青素 中的任意一種或幾種組合。
[0009] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述黃酮類化合物包括黃杉素、橙皮素、異鼠李 素、落葉松內(nèi)酯(Larixinol)中的任意一種或幾種組合。
[0010] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述黃酮類化合物的質(zhì)量含量為6-15%，優(yōu)選為 8-10% 〇
[0011] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述原花青素的質(zhì)量含量為10%_40%，優(yōu)選為 20%-30%。
[0012] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述多糖和/苷類的質(zhì)量含量為5-20 %，如6 %、 18%等，優(yōu)選為8%-15%，如10%、12%等。
[0013] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述樟子松樹皮提取物還包括芥子酸、開環(huán)異落 葉松脂醇、9'_對羥基(反式)桂皮酸、7-羥基-開環(huán)異落葉松脂醇酯中的任意一種或幾種組 合。
[0014] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述樟子松樹皮提取物為粉末狀固體，可以全部 通過80目篩孔。
[0015] 本發(fā)明的第二個(gè)方面在于提供一種樟子松樹皮提取物的制備方法，所述方法包括 如下步驟：
[0016] 步驟1、向樟子松樹皮中加入10-20倍體積倍率的溶媒，提取2-10次，每次1.5-3h， 得到提取液；
[0017]步驟2、混合每次提取的提取液，得混合提取液，所述混合提取液經(jīng)減壓濃縮、干燥 后得到所述樟子松樹皮提取物。
[0018] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，步驟1中所述樟子松樹皮為粉碎后過60目篩，得到 的通過篩網(wǎng)的樟子松樹皮粉末。
[0019] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，步驟1中所述溶媒為去離子水、甲醇水溶液、乙醇 水溶液中的任意一種或幾種組合。
[0020] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述甲醇水溶液的體積濃度為30-80%，如40%、 75%，優(yōu)選為50-70 %，優(yōu)選為55 %、65 %。
[0021] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，減壓濃縮過程中，溶媒中的輕質(zhì)組分自上部離開 提取罐，所述輕質(zhì)組分經(jīng)回收塔回收后，返回溶媒儲槽，作為溶媒原料重復(fù)利用。
[0022] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，步驟2中所述干燥為熱空氣干燥、噴霧干燥、旋蒸 干燥、分子篩吸附干燥等中的任意一種或幾種組合。
[0023] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述噴霧干燥的條件為:80_120MPa壓力下，將浸 膏制成60-300μπι的微粒，將微粒通過50-90°C的熱空氣干燥5-60s。
[0024] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，步驟2中干燥后還包括消毒、殺菌步驟，所述殺菌 過程采用熱空氣滅菌、水蒸氣滅菌、輻射滅菌、5 %石炭酸、70 %乙醇溶液、50 %甲醇水溶液 中的任意一種或幾種組合。
[0025] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述輻射滅菌的條件為鈷60-γ射線，所述浸膏的 吸收劑量為10_30kGy，如15kGy、20kGy、25kGy等，輻射滅菌后所述橄欖葉提取物的Sal值小 于等于10- 5,優(yōu)選為小于等于10-6,如2X 10」、5X10-7。
[0026] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，步驟2中提取后的樟子松樹皮的渣滓可以作為制 作木板的原料。
[0027] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述樟子松樹皮提取物可以是水提物、醇提物、油 提物、超臨界C〇2提取物中的任意一種或幾種的組合。
[0028]作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述醇提物優(yōu)選為乙醇提取物、甲醇提取物、乙醚 提取物和丙酮提取物中的任意一種或幾種組合。
[0029] 本發(fā)明的第三個(gè)方面在于提供上述任意一種樟子松樹皮提取物的應(yīng)用。
[0030] 所述樟子松樹皮提取物優(yōu)選為施用于皮膚外表面，更優(yōu)選為應(yīng)用于制備涂覆于皮 膚外表面的制品。
[0031] 其中，本發(fā)明所述樟子松樹皮提取物應(yīng)用于制備日化用品，優(yōu)選為應(yīng)用于制備化 妝品和/或護(hù)膚品。
[0032] 本發(fā)明的第四個(gè)方面在于提供一種包含上述任意一種樟子松樹皮提取物的日化 用品，優(yōu)選為包含上述任意一種樟子松樹皮提取物的化妝品和/或護(hù)膚品，更優(yōu)選為所述化 妝品和/或護(hù)膚品中，優(yōu)選為化妝品和/或護(hù)膚品中，還可以包括營養(yǎng)性添加劑。
[0033]作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述化妝品和/或護(hù)膚品中，所述樟子松樹皮提取 物的含量為0.001%-50%，如1%、40%，優(yōu)選為5%-30%，如10%、20%等。
[0034]本發(fā)明的第四個(gè)方面在于提供一種日化用品，所述護(hù)膚用品優(yōu)選為化妝品和/或 護(hù)膚品。
[0035]作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述化妝品和/或護(hù)膚品中包括樟子松樹皮提取 物。
[0036] 其中，所述樟子松樹皮提取物的含量為0.001 % -50 %，如1 %、40 %，優(yōu)選為5 % -30%，如 10%、20% 等。
[0037] 本發(fā)明提供的樟子松樹皮提取物為粉末狀，可以直接向化妝品和/或護(hù)膚品中添 加，而不需要研磨等其他預(yù)處理。且提取工藝產(chǎn)生的廢渣用于合成木板，溶媒經(jīng)過處理后返 回至溶媒槽，可以繼續(xù)使用，整個(gè)提取工藝無廢液、廢渣產(chǎn)生，綠色無污染。本發(fā)明提供的樟 子松樹皮提取物具有優(yōu)異的抗衰老、保濕和美白功效，可以作為復(fù)合型化妝品和/或護(hù)膚品 添加劑。
【附圖說明】
[0038] 圖1為過氧化氫對細(xì)胞存活率的影響；
[0039] 圖2為樟子松樹皮提取物對過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞存活率的影響；
[0040] 圖3為樟子松樹皮提取物對過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞MMP-1分泌的影響；
[0041 ]圖4為樟子松樹皮提取物對過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞HAS3含量的影響；
[0042]圖5為樟子松樹皮提取物對過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞HA含量的影響；
[0043] 圖6為樟子松樹皮提取物對酪氨酸酶的抑制作用。
【具體實(shí)施方式】
[0044] 樟子松樹皮提取物的制備
[0045] 實(shí)施例一
[0046] 位于乙醇儲罐中的濃乙醇和去離子水在乙醇配制罐中配制成60 %的乙醇水溶液， 作為溶媒備用。
[0047] 取樟子松樹皮10kg，去離子水洗滌2次，粉碎機(jī)粉碎至60目以下，得到樟子松樹皮 粉末，按樟子松樹皮粉末:60 %乙醇水溶液(體積比）=1:10向其中加入60 %乙醇水溶液，并 使用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至5,在常壓、70°C水浴條件下于多功能提取罐中提取5次，每次2h，混 合每次提取的提取液，得到混合提取液，提取結(jié)束后剩余的樟子松樹皮殘?jiān)糜谥苽淠景濉?混合提取液在35°C、5kPa壓力下濃縮至3kg，濃縮后的提取液經(jīng)噴霧干燥得到樟子松樹皮提 取物 0.86kg。
[0048] 其中，該噴霧干燥的條件為：100MPa壓力下，將浸膏制成150nm的微粒，將微粒通過 70°C的熱空氣干燥15s。
[0049] 該樟子松樹皮提取物為淺黃色，能夠全部通過80目篩網(wǎng)。采用紫外-可見光吸收光 譜法、紅外吸收光譜法、高效液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用法檢測該樟子松樹皮提取物中黃酮類 化合物的質(zhì)量含量為8%，原花青素的質(zhì)量含量為25%，其他多酚類物質(zhì)的質(zhì)量含量為 40%，多糖的質(zhì)量含量為5%，苷類的質(zhì)量含量為6%。
[0050] 真空濃縮過程得到的稀乙醇水溶液經(jīng)稀乙醇水溶液儲罐進(jìn)入乙醇回收塔，在乙醇 回收塔中濃縮，提濃后的乙醇自乙醇回收塔的頂部進(jìn)入乙醇儲罐，再次使用。
[0051 ] 實(shí)施例二
[0052] 位于乙醇儲罐中的濃乙醇和去離子水在乙醇配制罐中配制成30 %的乙醇水溶液， 作為溶媒備用。
[0053]取樟子松樹皮10kg，去離子水洗滌2次，粉碎機(jī)粉碎至80目以下，得到樟子松樹皮 粉末，按樟子松樹皮粉末:30 %乙醇水溶液:50%甲醇(體積比）=1:10:4向其中加入30 %乙 醇水溶液和50%甲醇水溶液，并使用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3,在常壓、80°C水浴條件下于多功 能提取罐中提取3次，每次2h，混合每次提取的提取液，得到混合提取液，提取結(jié)束后剩余的 樟子松樹皮殘?jiān)糜诤铣赡景濉；旌咸崛∫涸?5°C、5kPa壓力下濃縮至3kg，濃縮后的提取 液經(jīng)噴霧干燥得到樟子松樹皮提取物1.01kg。
[0054] 其中，該噴霧干燥的條件為:80MPa壓力下，將浸膏制成300nm的微粒，將微粒通過 70°C的熱空氣干燥30s。
[0055] 該樟子松樹皮提取物為淺黃色，能夠全部通過80目篩網(wǎng)。采用紫外-可見光吸收光 譜法、紅外吸收光譜法、高效液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用法檢測該樟子松樹皮提取物中黃酮類 化合物的質(zhì)量含量為15%，原花青素的質(zhì)量含量為10%，其他多酚類物質(zhì)的質(zhì)量含量為 20%，多糖的質(zhì)量含量為8%，苷類的質(zhì)量含量為10%。
[0056]真空濃縮過程得到的稀乙醇水溶液經(jīng)稀乙醇水溶液儲罐進(jìn)入乙醇回收塔，在乙醇 回收塔中濃縮，提濃后的乙醇自乙醇回收塔的頂部進(jìn)入乙醇儲罐，再次使用。
[0057] 實(shí)施例三
[0058] 位于甲醇儲罐中的濃甲醇和去離子水在甲醇配制罐中配制成70 %的甲醇水溶液， 作為溶媒備用。
[0059]取干燥樟子松樹皮10kg，去離子水洗滌2次，粉碎機(jī)粉碎至60目以下，得到樟子松 樹皮粉末，按樟子松樹皮粉末:70%甲醇水溶液(體積比）= 1:15向其中加入70%甲醇水溶 液，并使用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4,在1.2MPa、60°C水浴條件下于多功能提取罐中提取3次，每 次2.5h，混合每次提取的提取液，得到混合提取液，提取結(jié)束后剩余的樟子松樹皮殘?jiān)?jīng)干 燥后用于合成木板?；旌咸崛∫涸?5°C、8kpa壓力下濃縮至3kg，濃縮后的提取液經(jīng)噴霧干 燥得到樟子松樹皮提取物1.20kg。
[0060]其中，該噴霧干燥的條件為：120MPa壓力下，將浸膏制成100nm的微粒，將微粒通過 70°C的熱空氣干燥50s。
[0061 ]該樟子松樹皮提取物為淺黃色，能夠全部通過100目篩網(wǎng)。采用紫外-可見光吸收 光譜法、紅外吸收光譜法、高效液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用法檢測該樟子松樹皮提取物中黃酮 類化合物的質(zhì)量含量為10%，原花青素的質(zhì)量含量為35%，其他多酚類物質(zhì)的質(zhì)量含量為 30%，多糖的質(zhì)量含量為5%，苷類的質(zhì)量含量為15%。
[0062]真空濃縮過程得到的稀甲醇水溶液經(jīng)稀甲醇水溶液儲罐進(jìn)入甲醇回收塔，在甲醇 回收塔中濃縮，提濃后的甲醇自甲醇回收塔的頂部進(jìn)入甲醇儲罐，再次使用。
[0063] 對比實(shí)施例
[0064]取干燥樟子松樹皮10kg，在粉碎機(jī)中粉碎成粉末，過40目篩，得到樟子松樹皮粉備 用。
[0065] 按體積比1:20加入60 %乙醇溶液，在50 °C溫度下提取2h，提取結(jié)束后進(jìn)行抽濾，得 濾液，將濾液的上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到濃縮液3kg，將濃縮液經(jīng)80°C熱空氣干燥2h，得到樟子 松樹皮提取物〇.73kg，該樟子松樹皮提取物為淺黃色，為小塊狀。采用紫外-可見光吸收光 譜法、紅外吸收光譜法、高效液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用法檢測該樟子松樹皮提取物中黃酮類 化合物的質(zhì)量含量為5%，原花青素的質(zhì)量含量為25%，其他多酚類物質(zhì)的質(zhì)量含量為 35%，多糖的質(zhì)量含量為8%、苷類的質(zhì)量含量為10%。
[0066] 樟子松樹皮提取物對HDF細(xì)胞和Hacat細(xì)胞存活率的影響
[0067]取對數(shù)生長期、濃度為105個(gè)/mL的人HDF細(xì)胞，將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 每孔細(xì)胞液l〇〇yL。最終所鋪的細(xì)胞孔數(shù)取決于樣品數(shù)，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔。
[0068]將96孔板置于37 °C的細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)6h。
[0069] 將終濃度為lmg/mL、0. lmg/mL和0.01mg/mL的樟子松樹皮提取物加入到96孔細(xì)胞 培養(yǎng)板中，向?qū)φ战M加入等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液。于37 °C、包含5 % C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育 48h〇
[0070] 然后向每孔中加入0.5mg/mL的MTTlOOyL，于37°C、包含5%⑶2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中黑 暗條件下孵育4h。去除上清液，加入150yL DMS0，震蕩以570nm為實(shí)驗(yàn)波長，630nm為參照波 長，檢測吸光度。
[0071] 計(jì)算細(xì)胞存活率，結(jié)果如表1所示：
[0072] 表1，樟子松樹皮提取物對人HDF細(xì)胞和Hacat細(xì)胞存活率的影響
[0073]
[0074]^以細(xì)胞存活率高于80%為對人HDF細(xì)胞和Hacat細(xì)胞無毒的標(biāo)準(zhǔn)，由表1可知，本發(fā) 明提供的樟子松樹皮提取物對人HDF細(xì)胞無毒的最高濃度為0.01mg/mL，對人Hacat細(xì)胞無 毒的最高濃度為〇. 〇lmg/mL，因此，確定樟子松樹皮提取物的濃度0.01 mg/mL為后續(xù)的試驗(yàn) 濃度。
[0075] 樟子松樹皮提取物的抗衰老性能
[0076]自然狀態(tài)下樟子松樹皮提取物對HDF膠原蛋白分泌的影響
[0077]為了考察本發(fā)明提供的樟子松樹皮提取物對HDF膠原蛋白分泌的影響，本實(shí)施例 分為空白組、實(shí)驗(yàn)組、對照實(shí)驗(yàn)組和標(biāo)準(zhǔn)組。
[0078]取對數(shù)生長期、濃度為105個(gè)/mL細(xì)胞，每孔100yL，于37°C、含有C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)24h，之后取出上清液，以3000rpm的速度離心10min，取上清液。
[0079]向標(biāo)準(zhǔn)組中加入50yL標(biāo)準(zhǔn)液，向?qū)嶒?yàn)組中加入10yL上清液和40yL本發(fā)明提供的樟 子松樹皮提取物的稀釋液，向?qū)φ諏?shí)驗(yàn)組中加入l〇yL上清液和40yL采用對比實(shí)施例所述方 法制備的樟子松樹皮提取物的稀釋液，空白組中不加樣品，分別于37°C孵育lh，并洗板5次， 每組樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔。
[0080]向四組樣品中分別加入生物素標(biāo)記的抗-lgG抗體50yL，于37°C溫育30min，洗滌5 次。
[0081 ]向四組樣品中分別加入50μL的鏈霉素和素-HRP，輕輕震蕩混勻，于3 7 °C溫育 30min，洗滌5次。
[0082] 向四組樣品中分別加入顯色劑A和顯色劑B各50yL，輕輕震蕩混勻，于37°C避光孵 育30min，向四組樣品中加入終止液50yL。
[0083] 以空白組調(diào)零，在終止反應(yīng)后15min內(nèi)，在450nm波長測量各組的吸光度，結(jié)果如表 2所示。
[0084] 表2，樟子松樹皮提取物對HDF細(xì)胞I型膠原蛋白分泌的影響
[0085]
L〇〇86」膠原蛋白主要包括I型膠原和III型膠原，外界誘導(dǎo)促使真皮細(xì)胞中氧化水平提高 是細(xì)胞損傷的主要因素，氧化水平提高的直接結(jié)果是降低了 I型膠原蛋白的表達(dá)及I型膠原 蛋白被基質(zhì)金屬蛋白酶MPP-1降解，兩種情況造成的結(jié)果均為I型膠原蛋白在皮膚中的含量 減少，而I型膠原蛋白含量減少是皮膚形成皺紋的主要原因。
[0087]由表2可知，向HDF細(xì)胞中添加本發(fā)明提供的濃度為0.01mg/mL樟子松樹皮提取物 后，皮膚中的I型膠原蛋白含量相對于不加樟子松樹皮提取物時(shí)提高了6.6 %。向HDF細(xì)胞中 添加本發(fā)明提供的濃度為〇.〇lmg/mL樟子松樹皮提取物后，皮膚中的I型膠原蛋白含量相對 于不加樟子松樹皮提取物時(shí)提高了 2.2%。說明樟子松樹皮提取物能夠促進(jìn)I型膠原蛋白的 表達(dá)，并進(jìn)而起到抗老化的效果，且本發(fā)明提供的樟子松樹皮提取物比現(xiàn)有技術(shù)更能促進(jìn)I 型膠原蛋白的表達(dá)，可以作為潛在的抗老化添加劑添加到化妝品中。
[0088] 過氧化氫對HDF細(xì)胞存活率的影響
[0089] 選取不同濃度的過氧化氫，如 50μΜ、100μΜ、200μΜ、400μΜ、600μΜ、800μ]\^Ρ1000μΜ， 與HDF細(xì)胞共同孵育不同時(shí)間，如3h、6h和9h等，采用ΜΤΤ法檢測不同濃度的過氧化氫對HDF 細(xì)胞存活率的影響。
[0090] 取培養(yǎng)至濃度為1〇5個(gè)/mL的HDF細(xì)胞，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100yL。于37 °C、含有C〇2的培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)6h，每孔做復(fù)孔3個(gè)。
[0091]使用不同濃度的過氧化氫分別孵育造模3h、6h和9h;向每個(gè)樣品孔中加入濃度為 0.5mg/mL的MTT 100yL，于37°C、含有C02的培養(yǎng)箱中，黑暗條件下孵育4h。
[0092] 去除上清液，向樣品中加入150yL DMS0,震蕩，以570nm為實(shí)驗(yàn)波長，630nm為參照 波長，檢測每個(gè)樣品的吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。
[0093] 測試結(jié)果如圖1所示，人HDF細(xì)胞于濃度為50-800μΜ的過氧化氫共孵育3-9h后，人 HDF細(xì)胞的存活率明顯下降，當(dāng)孵育濃度超過400μΜ時(shí)，細(xì)胞存活率低于50%，200μΜ過氧化 氫作用6h后，細(xì)胞存活率降到70 %。
[0094] 樟子松樹皮提取物對過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞存活率的影響 [0095] 取培養(yǎng)至密度為105個(gè)/mL的HDF細(xì)胞接種于96孔板，每孔100yL。于37°C，含有C02的 培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)6h，加入本發(fā)明提供的樟子松樹皮提取物，利用過氧化氫損傷建模，并向 每孔加入〇.5mg/mL的MTT 100yL，于37°C、5%⑶2的黑暗條件下孵育4h。去除上清液，加入 DMS0 150yL，震蕩檢測吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。
[0096] 如圖2所示，經(jīng)過200μΜ過氧化氫作用6h后，HDF細(xì)胞的存活率降低至70 %以下，而 向經(jīng)過過氧化氫損傷過的HDF細(xì)胞中加入本發(fā)明提供的樟子松樹皮提取物后，人HDF細(xì)胞的 存活率達(dá)到82.44%，向經(jīng)過氧化氫損傷過的HDF細(xì)胞中加入現(xiàn)有技術(shù)制備的樟子松樹皮提 取物后，人HDF細(xì)胞的存活率為72%，即本發(fā)明提供的樟子松樹皮提取物相對于現(xiàn)有技術(shù)制 備的樟子松樹皮提取物更利于過氧化氫損傷細(xì)胞的修復(fù)。
[0097] 樟子松樹皮提取物對過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶的影響 [0098] 材料與試劑
[0099]細(xì)胞培養(yǎng)液 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板
[0100]細(xì)胞培養(yǎng)箱 過氧化氫
[0101] 離心機(jī) ELISA試劑盒
[0102] 測試步驟
[0103 ] 本測試分為標(biāo)準(zhǔn)組、空白組、實(shí)驗(yàn)組和對照實(shí)驗(yàn)組。
[0104]取對數(shù)生長期的濃度為1〇5個(gè)/mL的HDF細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔lmL，于37 °C，含有C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h。
[0105] 向?qū)嶒?yàn)組加入本發(fā)明提供的樟子松樹皮提取物，向?qū)嶒?yàn)對照組加入采用對比實(shí)施 例所述方法制備的樟子松樹皮提取物，向標(biāo)準(zhǔn)組加入標(biāo)準(zhǔn)液，空白組不添加樣品。
[0106] 誘導(dǎo)建立過氧化氫損傷模型。小心吸取上清液培養(yǎng)基，離心，按照試劑盒說明書， 取10yL細(xì)胞懸液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以空白孔調(diào)零，在反應(yīng)終止后15min內(nèi)，用450nm波長測量各孔的 吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-1)的濃度及對應(yīng)的吸光度值，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn) 曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣本的吸光度值，在回歸方程上計(jì)算出實(shí)驗(yàn)組中MMP-1的濃度 結(jié)果如表3和圖3所示。
[0107] 表3，樟子松樹皮提取物對過氧化氫損傷HDF細(xì)胞MMP-1濃度的影響
[0108]
由表3和圖3所示，經(jīng)過過氧化氫刺激后，人HDF細(xì)胞中的MMP-1水平顯著上升，由100升 高至167.21，如表3中陰性對照組所示；向經(jīng)過過氧化氫刺激的人HDF細(xì)胞中加入本發(fā)明提 供的樟子松樹皮提取物后，MMP-1的含量降低至151.48，MMP-1的濃度降低了近12%，而加入 采用現(xiàn)有技術(shù)制備的樟子松樹皮提取物后，MMP-1的含量為160。這說明，本發(fā)明提供的樟子 松樹皮提取物與現(xiàn)有技術(shù)制備的樟子松樹皮提取物相比，具有更優(yōu)異的抑制MMP-1表達(dá)的 性能。
[0109] 樟子松樹皮提取物的保濕性能
[0110] 皮膚內(nèi)水分的含量的多少，直接影響皮膚的彈性、光澤度等，皮膚的表皮、真皮、皮 下組織均對皮膚維持水分起著不同的作用。在皮膚保濕過程中，主要有兩種機(jī)制影響皮膚 對水的維持作用：
[0111] 1)皮膚作為天然屏障，避免水分流失；
[0112] 皮膚表皮是人的天然屏障，其中透明層、顆粒層和角質(zhì)層對皮膚鎖水能力起到重 要作用。透明層含有磷脂類物質(zhì)和角質(zhì)蛋白，能夠防止水分及電解質(zhì)等透過皮膚。顆粒層的 細(xì)胞排列致密，對貯存水分、防止水分滲透具有重要的作用。角質(zhì)層是由角質(zhì)形成細(xì)的堅(jiān) 韌、有彈性的板層結(jié)構(gòu)，細(xì)胞內(nèi)充滿了角蛋白。
[0113] 2)皮膚中存在許多保濕因子，吸收和鎖住水分。
[0114] 樟子松樹皮提取物對HDF細(xì)胞透明質(zhì)酸合成酶(HAS3)表達(dá)量的影響
[0115] 正常皮膚中，HA主要由HAs合成，HAs主要包括三種，分別為說31、說82、說33，其中 HAS3的催化活性最大，且催化生成小分子量的HA(200-300ku)，而HA是已知的保濕能力最強(qiáng) 的物質(zhì)，因此，皮膚中HAS3的含量提高能夠間接促進(jìn)皮膚的保濕能力。
[0116] 本測試分為空白組、實(shí)驗(yàn)組、對照實(shí)驗(yàn)組和標(biāo)準(zhǔn)組。
[0117] 取對數(shù)生長期、濃度為105個(gè)/mL的HDF細(xì)胞，將培養(yǎng)的細(xì)胞接種于24孔板中，每孔 細(xì)胞液lmL，于37°C、含有C0 2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h。
[0118] 向?qū)嶒?yàn)組細(xì)胞液中加入一定量本發(fā)明提供的樟子松樹皮提取物，向?qū)φ諏?shí)驗(yàn)組細(xì) 胞液中加入等量采用對比實(shí)施例所述方法制備的樟子松樹皮提取物，空白組不加樣品，置 于37 °C、含有5 % C02及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h;
[0119] 棄除上清液，用預(yù)冷ros沖洗細(xì)胞兩次，在培養(yǎng)孔中加入100yL裂解液，冰上裂解細(xì) 胞lOmin，收集細(xì)胞裂解液，以13000rpm離心10min，取上清液備用。
[0120] 按照ELISA試劑盒說明書，取細(xì)胞裂解液進(jìn)行試驗(yàn)；
[0121]利用BCA試劑盒檢測不同組別蛋白質(zhì)含量，各組HAS3表達(dá)量采用蛋白量矯正，結(jié)果 如表4和圖4所示。
[0122] 表4，樟子松樹皮提取物對HAs3表達(dá)的影響
[0123]
[0124]
[0125] 由表4和圖4可知，相對于未加入樟子松樹皮提取物，向人HDF細(xì)胞中添加本發(fā)明提 供的樟子松樹皮提取物后，HAS3含量提高了 33%。相對于采用現(xiàn)有技術(shù)制備的樟子松樹皮 提取物，向人HDF細(xì)胞中添加本發(fā)明提供的樟子松樹皮提取物后，HAS3含量提高了近15 %， 說明本發(fā)明提供的樟子松提取物保濕性能顯著。
[0126] 樟子松樹皮提取物對透明質(zhì)酸分泌的影響
[0127] 在皮膚真皮層中，透明質(zhì)酸(HA)是含量較多的氨基多糖，HA粘稠度極高且能高比 例地結(jié)合水分子，HA的含量直接影響皮膚中水分的含量。作為皮膚內(nèi)重要的保濕成分，它對 皮膚細(xì)胞的增殖、分化有顯著作用，對維持皮膚細(xì)胞的正常新陳代謝至關(guān)重要。
[0128] 本測試分為空白組、實(shí)驗(yàn)組、對照實(shí)驗(yàn)組和標(biāo)準(zhǔn)組。
[0129] 取對數(shù)生長期的濃度為105個(gè)/mL的人HDF細(xì)胞，將培養(yǎng)的細(xì)胞接種于24孔板中，每 孔細(xì)胞液lmL，于37 °C、含有C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h，置于37 °C、含有5 %C02及飽和濕度的 細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h;小心收集上清培養(yǎng)基，離心后得到上清液，備用。
[0130] 向標(biāo)準(zhǔn)組中加入50yL標(biāo)準(zhǔn)液，向?qū)嶒?yàn)組中加入10yL上清液和40yL本發(fā)明提供的樟 子松樹皮提取物的稀釋液，向?qū)φ諏?shí)驗(yàn)組中加入l〇yL上清液和40yL采用對比實(shí)施例所述方 法制備的樟子松樹皮提取物的稀釋液，空白組中不加樣品，分別于37°C孵育lh，并洗板5次。
[0131] 向四組樣品中分別加入顯色劑A和顯色劑B各50yL，于37°C避光孵育30min，向四組 樣品中加入終止液50yL。
[0132] 以空白組調(diào)零，在終止反應(yīng)后15min內(nèi)，在450nm波長測量各組的吸光光度值，并根 據(jù)吸光度值計(jì)算細(xì)胞液中HA的含量，結(jié)果如表5所示。
[0133] 表5，樟子松樹皮提取物對HA分泌的影響
[0134]
[0135] 由表5和圖5可知，添加本發(fā)明提供的樟子松樹皮提取物后，人HDF細(xì)胞中HA含量比 未加入樟子松樹皮提取物時(shí)，提高了 17% ;比添加現(xiàn)有技術(shù)制備的樟子松樹皮提取物，提高 了 10.2%，說明本發(fā)明提供的樟子松樹皮提取物比現(xiàn)有技術(shù)制備的樟子松樹皮提取物更能 夠促進(jìn)HDF細(xì)胞分泌HA，有效保持細(xì)胞中水分，并進(jìn)而起到保濕的作用。
[0136] 樟子松樹皮提取物的美白作用
[0137] 酪氨酸酶是黑素合成的主要限速酶，通過抑制酪氨酸酶的活性，可以減少黑素的 生成，酪氨酸酶活性檢測方法有:放射性同位素法、免疫學(xué)法和生化酶學(xué)法，以生化酶學(xué)法 較為簡單成熟。生化酶學(xué)法測定酪氨酸酶活性抑制的原理是:酪氨酸或多巴酸在酪氨酸酶 的作用下轉(zhuǎn)化為多巴醌，通過比色法測定判斷酪氨酸酶活性的抑制率，該方法通過體外測 定酪氨酸酶的活性，簡單快捷。
[0138] 材料與試劑 蘑菇酪氨酸酶 PH值=6.8的磷酸鹽緩沖液 左旋多巴（L-DOPA) 200μΙ_吸頭
[0139] 96孔板 8通道加樣槍 酶標(biāo)儀
[0140] 操作步驟
[0141] 測定本發(fā)明提供的樟子松樹皮提取物的酪氨酸酶抑制作用
[0142] 本測試分為空白組、空白參照組、實(shí)驗(yàn)組和實(shí)驗(yàn)參照組。
[0143] 配制質(zhì)量濃度為0.1 %的L-D0PA水溶液，配制pH值=6.8的磷酸鹽緩沖溶液。
[0144] 向?qū)嶒?yàn)組中加入5yL濃度為0. lmg/mL的本發(fā)明提供的樟子松樹皮提取物，向?qū)嶒?yàn) 參照組中加入5以1^濃度為0. lmg/mL的本發(fā)明提供的樟子松樹皮提取物和45yL pH值=6.8的 磷酸鹽緩沖溶液，向空白參照組加入5yL蘑菇酪氨酸酶的磷酸鹽溶液，和45yL pH值=6.8的 磷酸鹽緩沖溶液，向空白組加入50yL pH值=6.8的磷酸鹽緩沖溶液。
[0145] 置于37 °C空氣浴中20min，向每孔加入50yL、質(zhì)量濃度為0.1 %的L-D0PA水溶液，于 37°C空氣浴中靜置20min，于475nm下測定每組的吸光度值，并計(jì)算本發(fā)明提供的樟子松樹 皮提取物對蘑菇酪氨酸酶的活性抑制率。
[0146]
[0147] 采用相同的測試方法計(jì)算采用對比實(shí)施例(現(xiàn)有技術(shù))制備的樟子松樹皮提取物 以及陽性對照組曲酸對酪氨酸酶的抑制率。
[0148] 結(jié)果如圖6所示，本發(fā)明提供的樟子松樹皮提取物對蘑菇酪氨酸酶的抑制率分別 為49.4%，采用現(xiàn)有技術(shù)制備的樟子松樹皮提取物對蘑菇酪氨酸酶的抑制率為36.5%，說 明本發(fā)明提供的樟子松樹皮提取物具有顯著抑制黑素的作用，能夠作為美白添加劑添加到 化妝品中。
[0149] 綜上所述，本發(fā)明提供的樟子松樹皮提取物在人體細(xì)胞可耐受的范圍內(nèi)，除了具 有優(yōu)良的保濕作用外，還能夠起到抗老化、美白及去除自由基的作用，可以作為化妝品添加 劑，同樣的，也可以制作成口服試劑或膏劑，而起到相應(yīng)的作用。
[0150] 以上對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限 制于以上描述的具體實(shí)施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和 替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和 修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種化妝品和/或護(hù)膚品，其特征在于，所述化妝品和/或護(hù)膚品包括樟子松樹皮提 取物，所述樟子松樹皮提取物的含量為0.001-50%。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化妝品和/或護(hù)膚品，其特征在于，所述樟子松樹皮包括樟子 松多酚、原花青素、多糖和苷類化合物中的任意一種或幾種組合物。3. -種樟子松樹皮提取物，其特征在于，所述樟子松樹皮包括樟子松多酚、多糖及苷類 化合物中的任意一種或幾種組合物。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的樟子松樹皮提取物，其特征在于，所述樟子松多酚的質(zhì)量含量 為 10%-80%〇5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的樟子松樹皮提取物，其特征在于，所述所述樟子松多酚包括黃 酮類化合物和原花青素中的任意一種或幾種組合。6. -種如權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述樟子松樹皮提取物的制備方法，其特征在于，所述方 法包括如下步驟： 步驟1、向樟子松樹皮中加入10-20倍體積倍率的溶媒，提取2-10次，每次1.5-3h，得到 提取液； 步驟2、混合每次提取的提取液，得混合提取液，所述混合提取液經(jīng)減壓濃縮得到濃縮 液，所述濃縮液即為所述樟子松樹皮提取物。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟2中減壓濃縮后還包括純化、干 燥、消毒、殺菌等中的任意一種或幾種，所述殺菌過程采用熱空氣滅菌、水蒸氣滅菌、輻射滅 菌、5%石炭酸、70%乙醇溶液、50%甲醇水溶液中的任意一種或幾種組合。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述干燥步驟為噴霧干燥，所述噴霧 干燥的條件為高壓栗在80_120MPa壓力下將所述濃縮液通過霧化器形成100-200nm的顆粒， 所述顆粒與60_100°C的熱空氣接觸5-50s。9. 一種如權(quán)利要求3-5所述樟子松樹皮提取物的應(yīng)用，其特征在于，將所述樟子松樹皮 提取物制備成施用于皮膚外表面的制品。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的樟子松樹皮提取物應(yīng)用，其特征在于，所述制品中所述樟子 松樹皮提取物的質(zhì)量含量為0.001-50%。
【文檔編號】A61Q19/00GK106038406SQ201610520518
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月5日
【發(fā)明人】洪民華, 劉丹, 張營, 洪奇, 呂智, 盧艷花, 何浩, 朱理
【申請人】上海相宜本草化妝品股份有限公司, 華東理工大學(xué)