短雙歧桿菌c11及其用圖
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)C11及其用途。本發(fā)明短雙歧桿菌C11(CCFM683)能夠有效改善小鼠腹瀉、大便隱血、便血等結(jié)腸炎癥狀，并能夠抑制疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)的升高，改善小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度的變化，顯著減低髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性，可以制備用于預(yù)防和治療腸道炎癥的藥物或者用于生產(chǎn)益于腸道健康的食品。CGMCC No. 1182820151204
【專(zhuān)利說(shuō)明】短雙歧桿菌C11及其用途 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及短雙歧桿菌 (Bifidobacterium breve)Cll的用途。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 炎癥性腸?。↖nflammatory Bowel Disease，IBD)是一組慢性、復(fù)發(fā)性腸道炎癥疾 病，分為潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis，UC)和克羅恩病(Crohn's Disease，⑶），發(fā)病 機(jī)理尚不明確。目前對(duì)IBD發(fā)病機(jī)理的研究普遍認(rèn)為IBD可能與易感基因、粘膜免疫、腸道微 生物和環(huán)境四個(gè)因素有關(guān)，且粘膜免疫在IBD發(fā)病過(guò)程中具有重要地位。近年來(lái)，隨著人們 生活水平的改變以及飲食結(jié)構(gòu)的變化，該病在我國(guó)的患病率正逐年上升。
[0003] IBD嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量和身體健康，耗費(fèi)衛(wèi)生資源。目前IBD的治療藥物包括 抗生素、氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑(6-MP，AZA，MTX)和生物制劑（infliximab) 等，但副作用大，難以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期治療，如生物制劑infliximab通常選用TNF-α單克隆抗體，盡 管能有效達(dá)到IBD治療目標(biāo)，但使用inf 1 iximab常見(jiàn)的不良反應(yīng)有感染、充血性心力衰竭、 自身免疫反應(yīng)、神經(jīng)系統(tǒng)病變、肝損害、惡性腫瘤等，所以需尋找新的IBD預(yù)防和治療新方 法。
[0004] 腸道微生物與人體健康息息相關(guān)，且被形象的稱(chēng)為"微生物器官"。利用腸道益生 菌來(lái)預(yù)防和治療腸道疾病越來(lái)越受到關(guān)注。例如中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)CN 102210717 A公開(kāi)了 含有與丹寧組合的一種或多種產(chǎn)生丹寧酶的乳桿菌菌株的組合物，所述菌株具有粘附到腸 粘膜上的能力，該組合物可以用于治療IBD。
[0005] 腸道益生菌可通過(guò)調(diào)節(jié)粘膜免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)腸上皮細(xì)胞間的緊密連接，降低腸道 通透性，抑制腸上皮細(xì)胞凋亡，改善腸道物理屏障功能，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡等作用來(lái)減輕腸 道炎癥。乳酸菌是存在于人體腸道內(nèi)的益生菌，近年來(lái)，乳酸菌對(duì)結(jié)腸炎治療的研究報(bào)道有 增無(wú)減，且產(chǎn)生著積極的影響。
[0006] 中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)CN 102711778A公開(kāi)了一株動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種DN-173010,并 通過(guò)TRUE小鼠實(shí)驗(yàn)和組織學(xué)研究驗(yàn)證了其發(fā)酵乳能減輕潰瘍性結(jié)腸炎。然而，該申請(qǐng)僅通 過(guò)組織學(xué)、通過(guò)小鼠結(jié)腸炎改善結(jié)果一個(gè)指標(biāo)進(jìn)行表征，這種檢驗(yàn)方式及指標(biāo)受人為認(rèn)知 的影響較大，存在主觀因素。此外，該申請(qǐng)?jiān)趯?shí)施時(shí)給小鼠灌胃含有培養(yǎng)基組分的乳雙歧桿 菌組合物，因此，培養(yǎng)基的復(fù)雜組分對(duì)其結(jié)果造成的影響也必須被考慮。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0007] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，獲得一株具備改善結(jié)腸炎特別是的短雙歧桿 菌C11，其具備降低結(jié)腸炎后小鼠結(jié)腸病理評(píng)分、降低結(jié)腸炎后小鼠結(jié)腸粘液層破壞、上調(diào) 抑炎性因子并下調(diào)促炎性因子轉(zhuǎn)錄并對(duì)免疫有調(diào)節(jié)作用。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明提供一株短雙歧桿菌(Bifidobacteriumbreve)Cll，該 菌株已于2015年12月04日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，其保藏 號(hào)為CGMCC No.11828。
[0009]這株短雙歧桿菌Cl 1也被命名為CCFM683,留存于江南大學(xué)食品生物技術(shù)菌種保藏 中心。
[0010]本發(fā)明的菌株經(jīng)分離、篩選后，采用了包括細(xì)菌基因組DNA提取、16S rDNA特異引 物PCR擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物純化、DNA測(cè)序、序列比對(duì)等步驟進(jìn)行種屬鑒定，鑒定為短雙歧桿菌，并 命名為短雙歧桿菌C11 (或CCFM683)。
[0011]短雙歧桿菌C11具有下述生物學(xué)特性：
[0012] 菌體特征:呈乳白色。
[0013] 菌落特征：在mMRS固體平板上菌落突起，光滑、圓形、乳白色、半透明、直徑為1~ 2mm
[0014] 生長(zhǎng)特性:在37°C恒溫厭氧的條件下，在mMRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)約24h達(dá)到對(duì)數(shù)末期。
[0015] 短雙歧桿菌是雙歧桿菌屬中的一種。雙歧桿菌屬共包含35個(gè)種，包括青春雙歧桿 菌、動(dòng)物雙歧桿菌動(dòng)物亞種、動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種（即乳雙歧桿菌）、兩歧雙歧桿菌、熊峰 雙歧桿菌、布姆雙歧桿菌、短雙歧桿菌、鏈雙歧桿菌、豚雙歧桿菌、棒狀雙歧桿菌、家兔雙歧 桿菌、齒雙歧桿菌、沒(méi)食子雙歧桿菌、雞雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種、長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞 種、大雙歧桿菌、最小雙歧桿菌、假小鏈雙歧桿菌、假長(zhǎng)雙歧桿菌假長(zhǎng)亞種、假長(zhǎng)雙歧桿菌球 旋蟲(chóng)亞種、小雞雙歧桿菌、細(xì)長(zhǎng)雙歧桿菌、嗜熱雙歧桿菌等。
[0016] 由于雙歧桿菌屬種類(lèi)繁多，同屬不同種的雙歧桿菌在形態(tài)、生理、代謝及生理功能 等多方面存在顯著差異，目前為止，尚未有研究發(fā)現(xiàn)短雙歧桿菌能夠改善炎癥性腸病特別 是潰瘍性結(jié)腸炎或克羅思病，僅少數(shù)同屬不同種的菌株具備相似用途。目前也尚未有研究 確定導(dǎo)致差異的原因或機(jī)理。
[0017] 本發(fā)明還提供短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)Cll在制備用于治療或預(yù)防 炎癥性腸病的藥物中的用途。
[0018] 特別地，所述的炎癥性腸病是潰瘍性結(jié)腸炎或克羅思病。
[0019] 潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種病因尚不十分清楚的結(jié)腸和直腸慢性非特異性炎癥性 疾病，病變局限于大腸黏膜及黏膜下層，病變多位于乙狀結(jié)腸和直腸，也可延伸至降結(jié)腸， 甚至整個(gè)結(jié)腸。病程漫長(zhǎng)，常反復(fù)發(fā)作。克羅恩病(CD)是一種原因不明的腸道炎癥性疾病， 在胃腸道的任何部位均可發(fā)生?？肆_恩病臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、腸梗阻，伴有發(fā)熱、營(yíng)養(yǎng)障 礙等腸外表現(xiàn)?？肆_恩病尚無(wú)根本的治愈方法，還會(huì)出現(xiàn)并發(fā)癥，需手術(shù)治療，而術(shù)后復(fù)發(fā) 率很高。
[0020] 優(yōu)選地，所述藥物還包括在藥學(xué)上可接受的載體和/或輔料。
[0021] 本發(fā)明的藥物含有短雙歧桿菌C11菌劑，所述菌劑是將含有所述短雙歧桿菌C11的 菌液通過(guò)冷凍干燥制備所得到的粉劑，所述粉劑含有l(wèi)〇 1()CFU/g以上短雙歧桿菌Cl 1。
[0022] 在本發(fā)明中，在藥學(xué)上可接受的載體是一種或多種選自在藥學(xué)上通常使用的填充 劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑或矯味劑的載體。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明，所述的填充劑應(yīng)該理解是一種用來(lái)增加藥物與載體重量和體積，以 利于將它們壓制成片劑的稀釋劑;或者應(yīng)該理解是用以吸收藥物與載體中多余液體成分的 輔料吸收劑。凡是具有這種性能而又不會(huì)影響本發(fā)明菌劑效果的物質(zhì)都可以用于本發(fā)明， 也都在本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)。具體地，本發(fā)明使用的填充劑選自淀粉、蔗糖、乳糖、硫酸鈣或 微晶纖維素，優(yōu)選地選自淀粉、蔗糖或微晶纖維素，更優(yōu)選地選自淀粉或微晶纖維素。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明，所述的潤(rùn)濕劑應(yīng)該理解是一種在藥物本身無(wú)粘性時(shí)能夠使其藥物潤(rùn) 濕并誘發(fā)其具有粘性，故能夠制成顆粒的液體。凡是具有這種性能而又不會(huì)影響本發(fā)明菌 劑效果的物質(zhì)都可以用于本發(fā)明，也都在本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)。具體地，本發(fā)明使用的潤(rùn)濕 劑選自水、乙醇、淀粉或糖漿，優(yōu)選地選自水、乙醇或淀粉，更優(yōu)選地選自水或淀粉。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明，所述的崩解劑應(yīng)該理解是一種能夠促進(jìn)片劑在胃腸液中快速崩解成 細(xì)小粒子的輔料。凡是具有所述這種性能而又不會(huì)影響本發(fā)明菌劑效果的物質(zhì)都可以用于 本發(fā)明，也都在本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)。具體地，本發(fā)明使用的崩解劑選自羧甲基淀粉鈉、羥 丙纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素、瓊脂、碳酸鈣或碳酸氫鈉，優(yōu)選地選自羧甲基淀粉鈉、羥丙纖 維素、交聯(lián)羧甲基纖維素、瓊脂或碳酸氫鈉，更優(yōu)選地選自羧甲基淀粉鈉、羥丙纖維素、交聯(lián) 羧甲基纖維素或碳酸氫鈉。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明，所述的粘合劑應(yīng)該理解是當(dāng)藥物本身無(wú)粘性或粘性不足時(shí)需要加入 一種粘性物質(zhì)以便將其藥物制成顆粒劑，這種粘性物質(zhì)稱(chēng)為粘合劑。凡是具有所述這種性 能而又不會(huì)影響本發(fā)明菌劑效果的物質(zhì)都可以用于本發(fā)明，也都在本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)。 具體地，本發(fā)明使用的粘合劑選自纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠或聚乙烯吡咯烷酮，優(yōu)選地 選自纖維素衍生物、明膠或聚乙烯吡咯烷酮，更優(yōu)選地選自明膠或聚乙烯吡咯烷酮。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明，所述的潤(rùn)滑劑應(yīng)該理解是一種在制粒過(guò)程中能夠提高片劑流動(dòng)性， 防止片劑粘附在制片機(jī)上，有利于片劑脫模的物質(zhì)。凡是具有所述這種性能而又不會(huì)影響 本發(fā)明菌劑效果的物質(zhì)都可以用于本發(fā)明，也都在本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)。具體地，本發(fā)明使 用的潤(rùn)滑劑選自滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、微粉硅膠或聚乙二醇，優(yōu)選地選自滑石粉、硬 脂酸鈣、硬脂酸鎂或聚乙二醇，更優(yōu)選地選自滑石粉或硬脂酸鈣。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明，所述的矯味劑應(yīng)該理解是一種在藥品中用以改善或屏蔽藥物不良?xì)?味和味道(例如強(qiáng)烈苦味或其它異味等)的輔料。凡是具有這種性能而又不會(huì)影響本發(fā)明菌 劑效果的物質(zhì)都可以用于本發(fā)明，也都在本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)。具體地，本發(fā)明使用的矯味 劑選自單糖漿、蔗糖、卵磷脂、橙皮糖漿、枸櫞糖漿、櫻桃糖漿甜味劑;檸檬、茴香、薄荷油芳 香劑;海藻酸鈉、阿拉伯膠、明膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉膠漿劑;枸櫞酸、酒石酸與碳 酸氫鈉混合物泡騰劑，優(yōu)選地選自單糖漿、蔗糖、橙皮糖漿、櫻桃糖漿甜味劑;檸檬、薄荷油 芳香劑;海藻酸鈉、阿拉伯膠、明膠、羧甲基纖維素鈉膠漿劑;酒石酸與碳酸氫鈉混合物泡騰 劑，更優(yōu)選地選自蔗糖、橙皮糖漿、櫻桃糖漿甜味劑;檸檬芳香劑;海藻酸鈉、阿拉伯膠膠漿 劑;酒石酸與碳酸氫鈉混合物泡騰劑。
[0029] 在本發(fā)明中，填充劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑或矯味劑的用量應(yīng)該根據(jù)實(shí) 際使用的需要進(jìn)行確定，這些對(duì)于制藥技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是不存在任何技術(shù)困難 的。
[0030] 在本發(fā)明中，所述的藥物的劑型是顆粒劑、膠囊劑、片劑、丸劑或口服液。
[0031] 本發(fā)明的短雙歧桿菌C11菌劑可以與在藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑組合制成各 種劑型，例如顆粒劑、膠囊劑、片劑、丸劑或口服液，其中在藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑可 以根據(jù)不同劑型進(jìn)行選擇，所使用的這些載體或賦形劑及其用量對(duì)于制藥技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù) 人員都是容易確定的，也是顯而易見(jiàn)的。
[0032] 所述的劑型一般應(yīng)該理解是適用于人的單劑量藥物形式，單個(gè)劑型含有為達(dá)到所 需藥物量的預(yù)定活性物質(zhì)，例如本發(fā)明的短雙歧桿菌C11菌劑。
[0033]此外，本發(fā)明還提供短雙歧桿菌C11在食品添加劑中的用途，特別地作為食品發(fā)酵 劑。
[0034]本發(fā)明證實(shí)短雙歧桿菌Cl 1 (CCFM683)能夠有效改善小鼠腹瀉、大便隱血、便血等 結(jié)腸炎癥狀，并能夠抑制疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)的升高，改善小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度的變化，與現(xiàn)有技 術(shù)相比還具有顯著減低髓過(guò)氧化物酶(ΜΡ0)活性，還可調(diào)節(jié)結(jié)腸免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)，包括上調(diào)抑 炎性細(xì)胞因子IL-10及核轉(zhuǎn)錄因子PPARy的mRNA轉(zhuǎn)錄量，并顯著下調(diào)促炎性細(xì)胞因子IL-1 f3、IL-6及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κΒ p65和TNF-α的mRNA水平，表現(xiàn)出對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病更 好的治療或預(yù)防效果，因此可以制備用于預(yù)防和治療腸道炎癥的藥物。
[0035] 短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)Cll，該菌株于2015年12月04日在中國(guó)微生 物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó) 科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)為CGMCC No. 11828。 【【附圖說(shuō)明】】
[0036] 圖1表示各組造模期間疾病活動(dòng)指數(shù)的變化，表明短雙歧桿菌C11顯著降低小鼠的 疾病活動(dòng)指數(shù)；
[0037] 圖中：*:Ρ〈0·05，**:Ρ〈0·01，***:Ρ〈0·001。
[0038] 圖2表示各組結(jié)腸長(zhǎng)度的變化，表明短雙歧桿菌C11改善DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎后小鼠結(jié) 腸長(zhǎng)度變化；
[0039] 圖中：*:Ρ〈0·05，**:Ρ〈0·01，***:Ρ〈0·001。
[0040] 圖3表示各組髓過(guò)氧化物酶(ΜΡ0)活力的變化，表明短雙歧桿菌Cl 1顯著降低ΜΡ0活 力；
[0041] 圖中：ns:P>0.05，*:P〈0.05，**:P〈0.01，***:P〈0.001。
[0042] 圖4表示各組結(jié)腸組織HE染色（圖4-A，圖4-B，圖4-C)及組織損傷評(píng)分（圖4-D)， [0043] 圖4-A:正常組；
[0044] 圖4-B:造模組；
[0045] 圖4-C:短雙歧桿菌C11處理組；
[0046]圖4-D:短雙歧桿菌C11顯著降低DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎后小鼠結(jié)腸病理評(píng)分；
[0047] 圖中：*:Ρ〈0·05，**:Ρ〈0·01，***:Ρ〈0·001。
[0048] 圖5表示各組結(jié)腸組織阿利新藍(lán)染色（圖5-Α，圖5-Β，圖5-C)
[0049] 圖5-Α:正常組；
[0050] 圖5-Β:造模組；
[0051 ] 圖5-C:短雙歧桿菌C11處理組；
[0052]圖6表示短雙歧桿菌C11改善腸道組織的緊密連接蛋白的合成；
[0053] 圖7表示短雙歧桿菌C11調(diào)節(jié)腸道免疫應(yīng)答；
[0054] 圖中：ns:P>0.05，*:P〈0.05，**:P〈0.01，***:P〈0.001。 【【具體實(shí)施方式】】
[0055] 通過(guò)下述實(shí)施例將能夠更好地理解本發(fā)明。
[0056]在本發(fā)明中，如無(wú)特殊說(shuō)明，用于說(shuō)明濃度或比例的"％"或百分比均為重量百分 比。
[0057]本發(fā)明涉及以下培養(yǎng)基：
[0058] mMRS液體培養(yǎng)基:胰蛋白胨10g、牛肉浸膏10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、檸檬酸氫二 銨2g、醋酸鈉5g、磷酸氫二鉀2g、七水硫酸鎂0.5g、一水合硫酸錳0.25g，吐溫801mL與0.5g半 胱氨酸，加水至l〇〇〇mL。
[0059] mMRS固體培養(yǎng)基是在以上基礎(chǔ)添加以液體培養(yǎng)基總重計(jì)1.5%瓊脂得到的。
[0060] 實(shí)施例1:短雙歧桿菌C11(CCFM683)采集、分離和鑒定
[0061] 于無(wú)錫市第九人民醫(yī)院采集新生兒糞便樣品。取lg新生兒糞便樣品，梯度稀釋后 涂布于mMRS固體培養(yǎng)基，置于厭氧環(huán)境下在37 °C下培養(yǎng)72h，觀察記錄菌落形態(tài)，挑去菌落 劃線純化，然后在mMRS液體培養(yǎng)基中在37°C下培養(yǎng)48h，所得菌落進(jìn)行革蘭氏染色并記錄菌 株形態(tài)，棄除菌落中的革蘭氏陰性菌株和革蘭氏陽(yáng)性球菌，挑選得到革蘭氏陽(yáng)性桿菌，經(jīng)過(guò) 過(guò)氧化氫酶分析后棄除過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性菌株，保留過(guò)氧化氫酶陰性菌株，以果糖-6-磷酸激 酶檢測(cè)以棄除陰性菌株，所得均經(jīng)過(guò)16S rDNA測(cè)序鑒定為短雙歧桿菌。所得短雙歧桿菌進(jìn) 行傳代培養(yǎng)，收集菌體置于離心管中3000rpm離心10min洗滌，重復(fù)3次，所得菌體加入基體 保護(hù)劑中進(jìn)行冷凍保存，并保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏， 保藏號(hào)為CGMCC No.11828
[0062] 16S rDNA 擴(kuò)增條件：95°C5min;35 個(gè)循環(huán)（95Γ3〇8,55Γ3〇8,72Γ2π?η);72Γ 10min
[0063] 擴(kuò)增引物：
[0064] 27F:(5 '-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '）
[0065] 1492R:(5'-TACGGCTACCTTGTTACGACT T-3'
[0066] 擴(kuò)增產(chǎn)物純化和序列比對(duì)過(guò)程按文獻(xiàn)（Turroni F et al .Exploring the Diversity ofthe Bifidobacterial Population in the Human Intestinal Tract[J] .Appl Environ Microb. 2009;75(6) :1534-45)記載的方法進(jìn)行。
[0067] 該短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve Cl 1(CCFM683))的基本特性見(jiàn)表l〇
[0068] 表1短雙歧桿菌C11(CCFM683)的基本特性
[0069]
[0070]
[0071]實(shí)施例2:短雙歧桿菌C11(CCFM683)改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的動(dòng)物實(shí)驗(yàn) [0072] 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0073] 6-8周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠24只（購(gòu)自蘇州蘇普思生物科技有限公司），在22 ±2°C、自由取食、自由飲水和12h晝夜交替的條件下飼養(yǎng)，所用飼料為蘇州雙獅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼 料科技有限公司生產(chǎn)的小鼠繁殖配合飼料，普通飲食飼養(yǎng)適應(yīng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0074] 2、短雙歧桿菌CCFM683培養(yǎng)
[0075] (1)活化培養(yǎng)：
[0076] 采用mMRS液體培養(yǎng)基，37°C厭氧工作站中靜置培養(yǎng)。
[0077] 培養(yǎng)目標(biāo):取冷凍保存的菌體，挑單菌落于液體mMRS液體培養(yǎng)基中，在37°C厭氧工 作站中靜置培養(yǎng)約24h，活化短雙歧桿菌C11。
[0078] (2)-級(jí)培養(yǎng)：
[0079] 采用mMRS液體培養(yǎng)基，37°C厭氧工作站中靜置培養(yǎng)。
[0080] 培養(yǎng)目標(biāo):將活化培養(yǎng)的短雙歧桿菌Cl 1以培養(yǎng)基體積計(jì)1 %接種量轉(zhuǎn)接至mMRS液 體培養(yǎng)基，傳兩代。
[0081] (3)二級(jí)培養(yǎng)：
[0082]培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件同一級(jí)培養(yǎng)。
[0083]將經(jīng)過(guò)一級(jí)培養(yǎng)的短雙歧桿菌Cl 1以培養(yǎng)基體積計(jì)1 %接種量轉(zhuǎn)接至1L mMRS液體 培養(yǎng)基中，37 °C厭氧工作站中靜置培養(yǎng)約24h，收集菌體。用pH 7.4的PBS洗滌兩遍，接著重 懸于濃度以重量計(jì)13%脫脂乳溶液中，活菌數(shù)為1 X 101()CFU/mL，用于后續(xù)試驗(yàn)。
[0084] 3、實(shí)驗(yàn)方法
[0085] (1)結(jié)腸炎小鼠模型的建立
[0086] C57BL/6J小鼠自由飲用2%DSS(葡聚糖硫酸鈉，Mff:36000-50000,購(gòu)自MP公司）溶 液，連續(xù)7天。
[0087] (2)實(shí)驗(yàn)分組及給藥
[0088] 將24只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為3組，即正常組，模型組和短雙歧桿菌C11(CCFM683) 處理組，每組8只。短雙歧桿菌Cl 1處理組給藥方式為灌胃，灌胃劑量為2 X 109CFU/200yL/ 只/天。C11處理組在造模前7天開(kāi)始每天灌胃短雙歧桿菌C11，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束(含造模過(guò)程）， 連續(xù)14天，正常組和模型組均灌胃重懸后的13%脫脂乳粉作為對(duì)照，連續(xù)14天，至實(shí)驗(yàn)結(jié) 束。
[0089] (3)指標(biāo)測(cè)定
[0090] I.小鼠造模期間，觀察小鼠進(jìn)食、活動(dòng)狀態(tài)、毛發(fā)整齊程度，每日稱(chēng)量體重，觀察糞 便性狀及檢測(cè)糞便隱血情況按照文獻(xiàn)(Murthy SNS，DigDis Sci，1993)進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù) (DiseaseActivity Index，DAI)評(píng)分，DAI =體重下降分?jǐn)?shù)+大便性狀+便血分?jǐn)?shù)，具體評(píng)分 標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。
[0091] 表1:DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)
[0092]
[0093] 表中：
[0094] *正常大便:成形大便;松散大便:不粘附于肛門(mén)的糊狀、半成形大便;稀便:可粘附 于肛門(mén)的稀水樣便；
[0095] #便血情況：鼠糞便正常者為便血陽(yáng)性，糞便呈紅色或褐色者為肉眼血便，對(duì)肉眼 血便不明顯又可疑隱血者，用四甲基聯(lián)苯胺檢測(cè)隱血情況。
[0096] Π ·處死小鼠，取結(jié)腸，測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度;取遠(yuǎn)端結(jié)腸 lcm于Carnoy's Solution固定、 常規(guī)組織脫水、石蠟包埋、切片、H&E染色;根據(jù)組織學(xué)損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(Murthy SNS，Dig Dis Sci，1993)對(duì)結(jié)腸進(jìn)行組織學(xué)損傷評(píng)分，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2Xarnoy's Solution固定后的 結(jié)腸組織采用改良Steedman法(Steedman HF，Q J Microsc Sci，1950)進(jìn)行阿利新藍(lán)和核 固紅染色，對(duì)結(jié)腸的粘液層進(jìn)行分析，最終粘液層染成藍(lán)色，而細(xì)胞核則染為紅色，如圖4、5 所示。
[0097]表2:組織學(xué)損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) [0098]
[00"] m ·結(jié)腸樣品髓過(guò)氧化物酶(Myeloperoxidase，ΜΡ0)測(cè)定
[0100] 按照由南京建成生物工程研究所有限公司銷(xiāo)售的ΜΡ0試劑盒使用說(shuō)明書(shū)描述的方 法進(jìn)行測(cè)定。
[0101] IV.處死小鼠后取lcm結(jié)腸樣品放入液氮，再轉(zhuǎn)入-80°C下保存，待用；用TRIzol (購(gòu) 自美國(guó)Invitrogen公司）提取結(jié)腸樣品總RNA，取lyg RNA按照PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，參照iTaq? Universal_SYB.R?Green Supermix的說(shuō)明書(shū)準(zhǔn)備實(shí)時(shí)焚光定量體系，用Bio-Rad CFX Connect? Real-time System 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，同時(shí)通過(guò)溶解曲線和擴(kuò)增曲線評(píng)估RT-qPCR數(shù)據(jù)的質(zhì)量。
[0102] qPCR程序如下：50°C2min;95°C10min;40個(gè)循環(huán)（95°C15s，60°C30s);95°C15s，所 檢測(cè)基因引物序列見(jiàn)表3,數(shù)據(jù)用2- AA5i(Li-Xuan 3&即，111^1〇1.5(^，2014)分析。
[0103] 表3: RT-qPCR引物序列表
[0104]
[0105] 4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0106] (1)短雙歧桿菌CCFM683顯著降低小鼠的疾病活動(dòng)指數(shù)
[0107] 通過(guò)日常稱(chēng)量小鼠體重，觀察小鼠糞便性狀、檢測(cè)糞便隱血及肉眼血便情況，根據(jù) 疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)得到的結(jié)果列于圖1。
[0108] 造模期間，正常組小鼠活潑好動(dòng)，毛發(fā)光亮，體重持續(xù)增長(zhǎng)，大便正常;模型組小鼠 第三天開(kāi)始大便開(kāi)始松散，大便開(kāi)始出現(xiàn)褐紅色血跡，體重下降，并隨著造模時(shí)間的推移， 模型組小鼠體重持續(xù)下降，大便不成形，且粘附于肛門(mén)，肉眼血便，且肛門(mén)出現(xiàn)紅色的血跡； 短雙歧桿菌C11(CCFM683)處理組與模型組相比，上述臨床癥狀顯著改善，顯著降低了DAI評(píng) 分，具體結(jié)果參見(jiàn)附圖1。
[0109] (2)短雙歧桿菌Cl 1 (CCFM683)改善DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸組織病變
[0110] -方面，DSS結(jié)腸炎模型有結(jié)腸縮短、水腫等特征，結(jié)腸長(zhǎng)度的縮短在一定程度上 可以作為反映炎癥嚴(yán)重程度的一個(gè)指標(biāo)。觀察各組結(jié)腸長(zhǎng)度的變化，短雙歧桿菌CCFM683改 善DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎后小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度變化結(jié)果列于附圖2中。
[0111] 附圖2表明，模型組小鼠與正常組相比對(duì)腸長(zhǎng)度明顯縮短，短雙歧桿菌CCFM683可 良好地抑制這種結(jié)腸縮短的趨勢(shì)。
[0112] 另一方面，髓過(guò)氧化物酶活性反映了中性粒細(xì)胞侵潤(rùn)數(shù)目和活性，已被公認(rèn)為評(píng) 價(jià)炎癥嚴(yán)重程度的一個(gè)指標(biāo)。各組髓過(guò)氧化物酶(ΜΡ0)活力的變化，短雙歧桿菌CCFM683顯 著降低髓過(guò)氧化物酶活力結(jié)果列于附圖3。
[0113] 附圖3表明模型組髓過(guò)氧化物酶活力較正常組明顯增加，而短雙歧桿菌CCFM683處 理組較造模組顯著下降，說(shuō)明短雙歧桿菌CCFM683能有效減輕結(jié)腸組織的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。
[0114] 在處死小鼠后取各組每只小鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸樣本，H&E染色考察各組小鼠病變病理情 況，其結(jié)果列于附圖4A。如圖4A所示，正常組小鼠粘膜上皮排列整齊，隱窩腺體明顯完整，無(wú) 炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；圖4B顯示，DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎組織病變主要表現(xiàn)為潰瘍形成，粘膜上皮細(xì)胞 變性壞死脫落、缺損最嚴(yán)重者可達(dá)肌層，并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，隱窩腺體變形或消失， 粘膜下層和肌層有不同程度的血管擴(kuò)張充血和細(xì)胞浸潤(rùn)；圖4C顯示，通過(guò)病理切片和組織 損傷評(píng)分可以看出，短雙歧桿菌CCFM683可顯著抑制上述癥狀，保護(hù)了上皮結(jié)構(gòu)，減輕了炎 癥細(xì)胞浸潤(rùn)和水腫程度。
[0115] 以上結(jié)果清楚表明，短雙歧桿菌C11(CCFM683)顯著降低DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎后小鼠結(jié) 腸病理評(píng)分。
[0116] 各組結(jié)腸組織的粘液層通過(guò)阿利新藍(lán)染色進(jìn)行考察，結(jié)果列于圖5。如圖5-A所示， 正常組小鼠的粘液層幾乎布滿于所有粘膜上皮細(xì)胞的間隙，圖5-B顯示DSS處理后，粘膜上 皮席間間隙的粘液層幾乎完全消失，而圖5-C顯示短雙歧桿菌CCFM683可極大程度保留粘液 層，這些結(jié)果清楚表明，短雙歧桿菌CCFM683顯著降低DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎后小鼠結(jié)腸粘液層破 壞。
[0117] (3)短雙歧桿菌CCFM683改善DSS引起的腸道組織的緊密連接蛋白破壞
[0118] 短雙歧桿菌CCFM683調(diào)節(jié)腸道緊密連接蛋白結(jié)果列于附圖6中。
[0119] 根據(jù)前述指標(biāo)測(cè)定IV，與正常組相比，模型組的緊密連接蛋白Claudin 3、Z01、 CDH1的轉(zhuǎn)錄水平顯著下降，表明結(jié)腸組織的致密程度受到破壞，而短雙歧桿菌CCFM683抑制 了緊密連接蛋白轉(zhuǎn)錄水平下降的趨勢(shì)，甚至在一定程度上增加緊密連接蛋白的表達(dá)水平 (表現(xiàn)在處理組的Claudin 3、Z01表達(dá)量顯著高于正常組），表明短雙歧桿菌CCFM683除治療 用途以外、能夠提高正常腸道的緊密程度，更好地維護(hù)宿主的腸道屏障。
[0120] (4)短雙歧桿菌CCFM683改善DSS引起的腸道免疫應(yīng)答紊亂
[0121] 根據(jù)前述步驟IV，短雙歧桿菌CCFM683調(diào)節(jié)腸道免疫應(yīng)答結(jié)果列于附圖7中。
[0122] 與正常組相比，模型組的核轉(zhuǎn)錄因子NF-κΒ p65及促炎性細(xì)胞因子IL-6、IL_li3、 TNF-α顯著升高，而短雙歧桿菌CCFM683有效地抑制了這種上升趨勢(shì)、其表達(dá)量與正常組基 本一致，并顯著降低了核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB p65及促炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-lf3、TNF-c^mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平，且短雙歧桿菌CCFM683促進(jìn)核轉(zhuǎn)錄因子PPAR γ及抗炎細(xì)胞因子IL-10的上調(diào)。
[0123] 總體表明，短雙歧桿菌CCFM683能通過(guò)顯著上調(diào)抑炎性因子并下調(diào)促炎性因子轉(zhuǎn) 錄實(shí)現(xiàn)改善炎癥反應(yīng)，并對(duì)免疫有一定的調(diào)節(jié)作用，最終體現(xiàn)為對(duì)結(jié)腸炎具有較顯著的緩 解效果。
[0124] 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，短雙歧桿菌Cl 1 (CCFM683)能有效改善小鼠腹瀉、大便隱血、便 血等結(jié)腸炎癥狀，并能夠抑制疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)的升高，改善小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度的變化，顯著 減低髓過(guò)氧化物酶(ΜΡ0)活性，顯著優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)。結(jié)腸病理切片結(jié)果表明，短雙歧桿菌 CCFM683可顯著改善DSS引起的小鼠結(jié)腸的病理?yè)p傷，有效降低炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、上皮細(xì)胞紊 亂程度和隱窩破壞。RT-qPCR結(jié)果表明，短雙歧桿菌CCFM683還可調(diào)節(jié)結(jié)腸免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)，包 括上調(diào)抑炎性細(xì)胞因子IL-10及核轉(zhuǎn)錄因子PPARy的mRNA轉(zhuǎn)錄量，并顯著下調(diào)促炎性細(xì)胞 因子IL-10、IL-6及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κΒ p65和TNF-a的mRNA水平。
[0125] 綜上所述，短雙歧桿菌CCFM683可顯著改善DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎，它可以制備用 于預(yù)防和治療腸道炎癥的藥物或保健品，或者生產(chǎn)益于腸道健康的食品，例如作為益生菌 飲料、酸豆奶、發(fā)酵果凍、發(fā)酵茶飲料或乳制品（如酸奶、奶酪制品、乳酸菌、奶粉）的食品添 加劑等。
[0126] 應(yīng)用實(shí)施例1:制備含有短雙歧桿菌CCFM683菌劑的片劑
[0127] 具體制作工藝基本步驟如下:菌種活化-擴(kuò)大培養(yǎng)-收集菌體-菌懸液制備-冷 凍干燥-總混-壓片
[0128] 1、菌種活化:短雙歧桿菌CCFM683以培養(yǎng)基體積計(jì)1 %的接種量在mMRS液體培養(yǎng)基 中在37 °C厭氧工作站中靜置培養(yǎng)，連續(xù)活化兩代。
[0129] 2、擴(kuò)大培養(yǎng):將活化的短雙歧桿菌CCFM683以培養(yǎng)基體積計(jì)1 %的接種量轉(zhuǎn)接到1L mMRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，在37°C厭氧工作站中靜置培養(yǎng)24h。
[0130] 3、收集菌體、制備菌懸液：擴(kuò)大培養(yǎng)結(jié)束后，在4 °C低溫離心收集菌體，用PBS (pH7.4)洗滌兩次后，用以重量計(jì)13 %脫脂乳水溶液制成101()CFU/mL的菌懸液。
[0131 ] 4、冷凍干燥:根據(jù)常規(guī)冷凍干燥工藝制成菌粉。
[0132] 5、總混:加入以菌粉總重計(jì)2 %硬脂酸作潤(rùn)滑劑，3 % CMC-Na作粘合劑，混勻。
[0133] 6、壓片:根據(jù)常規(guī)壓片工藝通過(guò)壓片機(jī)壓片。
[0134] 應(yīng)用實(shí)施例2:制備含有短雙歧桿菌CCFM683菌劑的粉劑
[0135] 具體制作工藝基本步驟如下:菌種活化-擴(kuò)大培養(yǎng)-收集菌體-菌懸液制備-冷 凍干燥
[0136] 菌種活化、擴(kuò)大培養(yǎng)、收集菌體、制備菌懸液步驟如前所述。
[0137] 冷凍干燥:根據(jù)常規(guī)冷凍干燥工藝制成凍干菌體粉劑。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)Cl 1在制備用于治療或預(yù)防炎癥性腸病的藥 物中的用途。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的炎癥性腸病是潰瘍性結(jié)腸炎或克羅 思病。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述藥物還包括在藥學(xué)上可接受的載體和/ 或輔料。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于所述的藥物含有短雙歧桿菌C11菌劑，所述 菌劑是將含有所述短雙歧桿菌C11的菌液通過(guò)冷凍干燥制備所得到的粉劑，所述粉劑含有 10 1QCFU/g以上短雙歧桿菌C11。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于在藥學(xué)上可接受的載體是一種或多種選自 在藥學(xué)上通常使用的填充劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑或矯味劑的載體。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的藥物的劑型是顆粒劑、膠囊劑、片劑、 丸劑或口服液。7. 短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)C11在食品添加劑中的用途。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，所述食品添加劑是發(fā)酵劑。
【文檔編號(hào)】A61K35/745GK106038611SQ201610546786
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年7月12日
【發(fā)明人】陳衛(wèi), 陳海琴, 楊波, 王俊通, 趙建新, 張灝, 陳永泉
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)