草本水楊梅在制備黃嘌呤氧化酶抑制劑中的應(yīng)用【專利摘要】本發(fā)明涉及一種草本水楊梅在制備黃嘌呤氧化酶抑制劑中的應(yīng)用，屬于中藥領(lǐng)域。草本水楊梅及其提取物作為活性組分在制備黃嘌呤氧化酶抑制劑中的用途，其中所述草本水楊梅及其提取物包含所述草本水楊梅原植物、及其溶劑提取物，其中所述溶劑提取物為水、乙醇、甲醇提取物。本發(fā)明的有益效果是：解決了高尿酸血癥、痛風(fēng)等相關(guān)疾病的血尿酸異常升高的問(wèn)題，并間接的解決、緩解了高尿酸血癥、痛風(fēng)等疾病所導(dǎo)致的關(guān)節(jié)疼痛、腫脹變形及高血壓、糖尿病、心血管疾病、腎臟疾病、代謝綜合征等疾病的相關(guān)癥狀?！緦＠f(shuō)明】草本水楊梅在制備黃嘌昤氧化酶抑制劑中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001]本發(fā)明涉及中藥領(lǐng)域，特別涉及中藥源黃嘌呤氧化酶抑制劑?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]體內(nèi)尿酸水平持續(xù)偏高達(dá)過(guò)飽和會(huì)使尿酸鈉晶體沉積在關(guān)節(jié)及周圍組織中，造成一種嘌呤類代謝性疾病--痛風(fēng)。高尿酸血癥是痛風(fēng)的重要標(biāo)志，大約有5%~12%的高尿酸血癥最終會(huì)發(fā)展成痛風(fēng)，80%~90%的痛風(fēng)患者伴隨有高尿酸血癥。此外，高尿酸血癥還與高血壓、糖尿病、心血管疾病、腎臟疾病、代謝綜合征等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。痛風(fēng)的發(fā)病率地區(qū)間差異較大，尼日利亞其發(fā)病率只有0.03%，而臺(tái)灣的土著居民中其發(fā)病率高達(dá)15.2%。流行病學(xué)調(diào)查顯示，由于人們生活水平的提高，飲食的日益改善尤其是啤酒、動(dòng)物內(nèi)臟等高嘌呤性食物的攝入過(guò)多，導(dǎo)致痛風(fēng)的發(fā)病率呈日漸上升的趨勢(shì)。[0003]傳統(tǒng)的抗痛風(fēng)藥物主要包括促尿酸排泄藥(如丙磺舒、苯溴馬隆等)和尿酸生成抑制劑(如別嘌呤醇等)兩大類，而尿酸生成抑制劑主要為黃嘌呤氧化酶抑制劑。黃嘌呤氧化酶(XanthineOxidase，簡(jiǎn)稱X0D)是一種復(fù)合黃素蛋白酶，是人體內(nèi)產(chǎn)生尿酸過(guò)程中的一種極其重要的酶，它能夠催化體內(nèi)的黃嘌呤和次黃嘌呤生成尿酸和過(guò)氧化物自由基，因此通過(guò)抑制其活性可達(dá)到防止或減少尿酸產(chǎn)生的作用。近年來(lái)，黃嘌呤氧化酶抑制劑作為一種極有效的抗痛風(fēng)藥物而受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，由于傳統(tǒng)的黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌呤醇的副作用如藥物超敏反應(yīng)綜合征、史蒂文生氏-強(qiáng)生癥候群等，從天然藥物中發(fā)掘黃嘌呤氧化酶抑制劑將成為研究熱點(diǎn)?，F(xiàn)有的文獻(xiàn)記載了對(duì)17種中藥的黃嘌呤氧化酶抑制劑的篩選，以及花生四烯酸可以作為黃嘌呤氧化酶抑制劑(CN102133214)，節(jié)桿菌可以生產(chǎn)黃嘌呤氧化酶抑制劑（CN101402922)，中藥組方提取物作為黃嘌呤氧化酶抑制劑(CN102205083)，通過(guò)烘干、粉碎、超聲提取、過(guò)濾、濃縮、干燥得到蔬菜提取物也可以用作黃嘌呤氧化酶抑制劑（CN102106516)，以及以海參為原料制備黃嘌呤氧化酶抑制劑(CN102138938，CN102580063)。[0004]我們?cè)趯?duì)長(zhǎng)白山地區(qū)的近百種藥用植物活性篩選過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)了幾種具有較強(qiáng)黃嘌呤氧化酶抑制活性的植物，其中就包括草本水楊梅。[0005]草本水楊梅（GeumaleppicumJacq.)別名追風(fēng)七、老五葉、海棠菜，為薔薇科(Rosaceae)水楊梅屬(Geum)植物，主要分布于我國(guó)東北、華北、西北等地區(qū)，長(zhǎng)白山海拔400~1500m山區(qū)分布尤為豐富。民間以其全草或根入藥，具有清熱解毒、消腫止痛、利尿功效，臨床主要用于治療腸炎、腰腿疼痛、跌打損傷、小兒驚風(fēng)、疥瘡、癰腫等癥?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0006]本發(fā)明提供一種草本水楊梅在制備黃嘌呤氧化酶抑制劑中的應(yīng)用，以解決高尿酸血癥、痛風(fēng)等相關(guān)疾病的血尿酸異常升高的問(wèn)題。[0007]本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:草本水楊梅及其提取物作為活性組分在制備黃嘌呤氧化酶抑制劑中的用途，其中所述草本水楊梅及其提取物包含所述草本水楊梅原植物、及其溶劑提取物，其中所述溶劑提取物為水、乙醇、甲醇提取物。[0008]本發(fā)明還提供草本水楊梅及其提取物的另一種應(yīng)用，該應(yīng)用為治療高尿酸血癥、痛風(fēng)等相關(guān)疾病提供一種新的食品、食品添加劑、保健食品、藥品。[0009]所述的草本水楊梅及其提取物用于制備治療尚尿酸血癥、痛風(fēng)相關(guān)疾病的食品、食品添加劑、保健食品、藥品的應(yīng)用，通過(guò)下述方法制備：[0010]1.取草本水楊梅，干燥，粉碎，附加藥學(xué)可以接受的輔料，制成片劑、膠囊劑、散劑、丸劑等藥學(xué)上可以接受的劑型。[0011]2.取草本水楊梅，以水、乙醇或甲醇等溶劑提取，濃縮至干，得到草本水楊梅提取物，以該提取物為原料，附加藥學(xué)可以接受的輔料，制成片劑、膠囊劑、散劑、丸劑、軟膠囊等藥學(xué)上可以接受的劑型。[0012]3.取草本水楊梅，以水、乙醇或甲醇等溶劑提取，濃縮至干，得到草本水楊梅提取物，以該提取物為原料制成液體飲料、固體飲料、壓片糖果等食品、保健食品可以接受的形式。[0013]本發(fā)明的有益效果是:解決了高尿酸血癥、痛風(fēng)等相關(guān)疾病的血尿酸異常升高的問(wèn)題，并間接的解決、緩解了高尿酸血癥、痛風(fēng)等疾病所導(dǎo)致的關(guān)節(jié)疼痛、腫脹變形及高血壓、糖尿病、心血管疾病、腎臟疾病、代謝綜合征等疾病的相關(guān)癥狀?！靖綀D說(shuō)明】[0014]圖1是GAC對(duì)黃嘌呤氧化酶動(dòng)力學(xué)考察Linewaver-Burk雙倒數(shù)曲線圖；[0015]圖2是GAT對(duì)黃嘌呤氧化酶動(dòng)力學(xué)考察Linewaver-Burk雙倒數(shù)曲線圖；[0016]圖3是GAOL對(duì)黃嘌呤氧化酶動(dòng)力學(xué)考察Linewaver-Burk雙倒數(shù)曲線圖。【具體實(shí)施方式】[0017]實(shí)施例1:草本水楊梅制備降尿酸產(chǎn)品的應(yīng)用[0018]1·草本水楊梅降尿酸膠囊(Geumaleppicumcapsule，GAC):收取草本水楊梅，陰干，粉碎，制成硬膠囊制劑。[0019]2.草本水楊梅降尿酸片(Geumaleppicumtablet，GAT):收取草本水楊梅，陰干，粉碎，以10倍量75%乙醇超聲提取三次，每次30分鐘，過(guò)濾，合并濾液，蒸干，粉碎，加淀粉適量，壓片。[0020]3.草本水楊梅降尿酸口服液(Geumaleppicumoralliquid,GAOL):取草本水楊梅，1〇倍量水煎煮40分鐘，過(guò)濾，濾液濃縮得流浸膏，加輔料，制成口服液。[0021]實(shí)施例2:草本水楊梅降尿酸產(chǎn)品活性研究[0022]1材料[0023]1.1藥材與試劑[0024]草本水楊梅Rudbeckialaciniata采自長(zhǎng)白山脈臨江地區(qū)。黃噪呤（xanthine，XA)、黃嘌呤氧化酶(xanthineoxidase，X0D)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；別嘌醇，購(gòu)自上海阿拉丁試劑公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。[0025]1.2儀器[0026]ThermoMultiskanG0型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技）；ABS320-4N型分析天平（上海島韓實(shí)業(yè)有限公司）；KQ-250B型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠）；DZF6020真空干燥器(上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。[0027]2方法[0028]對(duì)文獻(xiàn)[李英，陳君，李萍.金銀花中酚酸類和黃酮類成分的黃嘌呤氧化酶抑制活性.中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，42(5):407]中的黃嘌呤氧化酶抑制劑篩選方法進(jìn)行了改良。[0029]2.1溶液配制[0030]磷酸鹽緩沖液配制(0.2mol·:A液(0.2mol·L-1磷酸二氫鉀）：取磷酸二氫鉀(1?2?04，麗136.09)1.3618，加雙蒸水使溶解并定容至1001111。財(cái)夜(0.2111〇1.1/1磷酸氫二鈉）：取磷酸氫二鈉(Na2HP〇4·2H20，MW177.99)1.78g，加雙蒸水溶解并定容至100ml。使用時(shí)分別取等量A液和B液混合即可得到pH為7.5的磷酸鹽緩沖溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。[0031]底物配制:取黃嘌呤適量，精密稱定，加磷酸鹽緩沖溶液配成1.5mmol·I/1的黃嘌呤底物溶液。底物溶液需新鮮配制，現(xiàn)用現(xiàn)配。[0032]酶液配制:精密稱取黃嘌呤氧化酶lmg，加磷酸鹽緩沖溶液配成0.05U·ml/1的黃嘌呤氧化酶溶液。[0033]2.2草本水楊梅降尿酸產(chǎn)品的樣品溶液的配制[0034]草本水楊梅降尿酸產(chǎn)品見(jiàn)"實(shí)施例1"。取相應(yīng)產(chǎn)品，膠囊取內(nèi)容物、片劑研為細(xì)粉、口服液直接吸取，分別加磷酸鹽緩沖溶液配成相應(yīng)濃度的樣品溶液。[0035]2.3產(chǎn)品對(duì)黃嘌呤氧化酶活性的影響[0036]按表1順序分別將相應(yīng)溶液加入96孔板中加入完畢后震蕩2min，于37°C條件下反應(yīng)lOmin，用酶標(biāo)儀測(cè)定290nm處的吸光度值，每個(gè)樣品均作3次重復(fù)，取平均值。同時(shí)測(cè)定相應(yīng)濃度樣品自身的吸光度以扣除干擾，并測(cè)無(wú)樣品時(shí)酶與底物反應(yīng)的吸光度作為空白對(duì)照。按照公式計(jì)算抑制率。[0037][0038]式中：Αι為反應(yīng)體系中加入樣品后的吸光度值，A2為樣品溶液自身的吸光度值，Ao為空白對(duì)照的吸光度值。[0039]本實(shí)驗(yàn)以別嘌醇為陽(yáng)性對(duì)照，將高活性(抑制率大于60%)的樣品稀釋成6個(gè)濃度，進(jìn)行梯度復(fù)篩。根據(jù)抑制劑的濃度及其平均抑制率，經(jīng)非線性回歸方法計(jì)算得各樣品的IC50〇[0040]表1草本水楊梅降尿酸產(chǎn)品對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制作用反應(yīng)體系(yL)[0041][0042]2.4產(chǎn)品對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制類型的判斷分別吸取不同濃度的產(chǎn)品溶液，再加入不同濃度的底物黃嘌呤(濃度分別為0.012、0.024、0.036、0.048、0.060臟〇1*1/1)，在251€條件下反應(yīng)30min，測(cè)定反應(yīng)速度，通過(guò)Linewaver-Burk雙倒數(shù)作圖法判斷各產(chǎn)品的抑制作用類型。[0043]3結(jié)果與分析[0044]3.1產(chǎn)品對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用[0045]各產(chǎn)品在2mg·ml/1濃度時(shí)對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制率均大于60%，繼續(xù)稀釋成6個(gè)濃度，進(jìn)行梯度復(fù)篩，結(jié)果表明呈明顯的量-效關(guān)系。根據(jù)抑制劑濃度及其平均抑制率，經(jīng)SPSS計(jì)算得樣品RLC、RLT、RL0L的IC5Q分別為：0.93mg·mL-\0.09mg·mL-\0.22mg·mL-、別嘌呤醇的IC5Q為:3.8μΜ。[0046]3.2各產(chǎn)品對(duì)黃嘌呤氧化酶的動(dòng)力學(xué)特征[0047]根據(jù)Linewaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，得到圖1-圖3,從圖1-圖3可以得到草本水楊梅各產(chǎn)品均為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑(三條線交叉于X軸），說(shuō)明以上產(chǎn)品與黃嘌呤氧化酶活性中心以外的必須基團(tuán)結(jié)合，這種結(jié)合不會(huì)影響酶與底物的結(jié)合，而底物與酶的結(jié)合，也不會(huì)影響與抑制劑的結(jié)合。但酶-底物-抑制劑復(fù)合物(ESI)不能進(jìn)一步變成產(chǎn)物，此種抑制方式，只要抑制劑存在，ESI就不能解脫出來(lái)，即底物濃度增加不能降低抑制劑對(duì)酶的抑制程度。[0048]實(shí)施例3:草本水楊梅降尿酸食品的制備[0049]1.草本水楊梅袋泡茶:收取新鮮草本水楊梅，陰干，粉碎、過(guò)40目篩，24目篩篩選，紫外線燈殺菌，機(jī)械裝袋，包裝，噴印日期，塑封，入庫(kù)。[0050]2.草本水楊梅飲料:取草本水楊梅，10倍量超聲處理20分鐘，過(guò)濾，濾液加苯甲酸、苯甲酸鈉等防腐劑，加香味劑調(diào)味，滅菌，灌裝，噴印日期，包裝入庫(kù)?！局鳈?quán)項(xiàng)】1.草本水楊梅在制備黃嘌呤氧化酶抑制劑中的應(yīng)用。2.草本水楊梅提取物在制備黃嘌呤氧化酶抑制劑中的應(yīng)用。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的草本水楊梅提取物在制備黃嘌呤氧化酶抑制劑中的應(yīng)用，所述草本水楊梅提取物為草本水楊梅水提取物、草本水楊梅乙醇提取物或草本水楊梅甲醇提取物。4.如權(quán)利要求1所述的草本水楊梅在制備黃嘌呤氧化酶抑制劑中的應(yīng)用，所述的制備黃嘌呤氧化酶抑制劑的產(chǎn)品包括食品、食品添加劑、保健食品、藥品。5.如權(quán)利要求2所述的草本水楊梅提取物在制備黃嘌呤氧化酶抑制劑中的應(yīng)用，所述的制備黃嘌呤氧化酶抑制劑的產(chǎn)品包括食品、食品添加劑、保健食品、藥品?！疚臋n編號(hào)】A23L33/10GK106038742SQ201610620029【公開(kāi)日】2016年10月26日【申請(qǐng)日】2016年8月1日【發(fā)明人】李海軍,劉菲,涂正坤,翟乃翠,高永梅【申請(qǐng)人】吉林大學(xué)