天麻提取物的應(yīng)用及含有天麻提取物的免疫佐劑和疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及天麻提取物的應(yīng)用及含有天麻提取物的免疫佐劑和疫苗，天麻提取物在制備免疫佐劑中的應(yīng)用。本發(fā)明用天麻提取物作為流感疫苗佐劑，具有良好的有效性，能提高抗原的免疫原性，增強免疫效果，其安全性高、副作用?。唤鉀Q了目前免疫佐劑單一，副作用難以避免，疫苗生產(chǎn)供應(yīng)量有限，難以滿足疫情爆發(fā)時急需提供大量疫苗的要求，以及疫苗起效時間慢等諸多問題。天麻提取物制備方法簡便，疫苗質(zhì)量容易控制。
【專利說明】
天麻提取物的應(yīng)用及含有天麻提取物的免疫佐劑和疫苗
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及天麻提取物的應(yīng)用及含有天麻提取物的免疫佐劑和疫苗，屬于生物技 術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 天麻，又名赤箭、定風草、水洋芋等，為蘭科天麻屬多年生草本植物天麻，其干燥塊 莖入藥，產(chǎn)于我國四川、河北、云南、貴州、陜西等地，于立冬后至清明前采摘。味甘，性平，歸 肝經(jīng)。具有息風止痙，平抑肝陽，祛風通絡(luò)之功效。臨床用于小兒驚風，癲癇抽搐，頭痛眩暈， 肢體麻木，風濕痹痛等癥?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》把天麻列為上品，《本草綱目》記載天麻能"主諸風 痹，久服益氣，輕身長年"，在我國的藥用歷史已有2000多年，是我國傳統(tǒng)名貴中藥材之一。
[0003] 天麻的化學成分研究已經(jīng)達到一定深度，天麻含有天麻素、天麻苷元(對羥基苯甲 醇）、天麻多糖、對羥基苯甲醛、檸檬酸、檸檬酸單甲酯、谷留醇等多種化學成分;酚類成分是 天麻的主要活性成分。天麻具有鎮(zhèn)靜催眠、抗驚厥、鎮(zhèn)痛、拮抗興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性、保 護缺血腦損傷、抑制神經(jīng)元凋亡、抗氧化、增加動脈血管順應(yīng)性、降低外周血管阻力、保護心 肌細胞、改善血液粘度、抗血栓形成、抑制炎性滲出和炎癥因子的表達、增強免疫作用、提高 學習記憶能力等多種功效。
[0004] 天麻多糖具有良好的降血壓的作用。天麻素能提高血管性癡呆大鼠的學習能力， 其作用機制可能與提高腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)，改善細胞能量代謝，清除腦內(nèi)自由基相關(guān)。目前天 麻的開發(fā)利用主要集中在藥用方面，臨床研究表明天麻素注射液對椎-基底動脈供血不足 病人有較好的治療效果，對治療中老年眩暈其療效也較為顯著，且安全可靠。天麻的主要有 效成分天麻素在臨床上應(yīng)用廣泛，但天麻含有多種化學成分，需要在進行藥理學研究的基 礎(chǔ)上，闡明其他化學成分的作用機制。
[0005] 佐劑與疫苗聯(lián)合使用能增強特異性免疫反應(yīng)或改變免疫應(yīng)答類型的物質(zhì)。將其應(yīng) 用于流感疫苗，能顯著增強疫苗的免疫效果，減少抗原的用量，從而有利于流感疫苗的生產(chǎn) 效率的提高與生產(chǎn)成本的降低，擴大接種人群數(shù)量，更好的保護易感人群，降低疫苗生產(chǎn)企 業(yè)因產(chǎn)量不足而帶來的巨大壓力。以應(yīng)對突然爆發(fā)的流感疫情，佐劑在新型流感疫苗的研 究與開發(fā)中具有極為重要的作用。目前應(yīng)用較為廣泛的佐劑主要有:鋁佐劑(氧化鋁、氫氧 化鋁、磷酸鋁）、MF59(是一種包含1%的鯊烯）、0.5%的Tween80和0.5%的三油酸聚山梨脂的水 包油乳液）、LTK63和新型佐劑。
[0006] 目前上市流感疫苗使用的佐劑主要是鋁佐劑和MF59。但事實上鋁佐劑對蛋白亞單 位疫苗誘導抗體產(chǎn)生的能力較弱，不能有效地誘導免疫應(yīng)答，其不能誘導產(chǎn)生Thl型反應(yīng)， 干擾細胞免疫，并阻斷CD8 + CTL的激活，使得疫苗的免疫保護作用不全面，不持久，在某些 情況下還會產(chǎn)生與過敏反應(yīng)有關(guān)的IgE，其副作用難以避免;MF59作為佐劑使用時，在增加 免疫原性的同時也增強了反應(yīng)原性在成年人中出現(xiàn)了局部疼痛、發(fā)熱、紅斑、硬結(jié)、肌痛等 癥狀的增加。另外，一些新型佐劑正處于研發(fā)中，像多聚脫氧核苷酸類、抗菌肽類、細胞因子 類、多糖類佐劑，但進展都比較緩慢。因此，隨著各種新發(fā)流感在全世界的爆發(fā)和對人感染 性的增強，加快了新型流感疫苗的研究，尋求更高安全性和免疫原性的佐劑仍然是流感疫 苗發(fā)展的一個需要。
[0007] 佐劑發(fā)揮作用是由于能增強抗原的免疫原性、提高疫苗效果，因此佐劑一般可在 多種疫苗中進行使用，如目前的鋁佐劑。所以佐劑的研究不僅對流感，而且對其它感染性疾 病的防治也有很高的價值。
[0008] 流感是由流感病毒引起的一種可造成大規(guī)模流行的急性呼吸道傳染病，它的特點 是短期內(nèi)爆發(fā)，然后迅速蔓延，造成不同程度的流行，包括世界大流行、局部暴發(fā)流行及散 發(fā)，發(fā)病率高并伴有一定的死亡率，一旦流感疫情爆發(fā)，將會對人類的生命健康帶來巨大的 威脅。預(yù)防流感疫情爆發(fā)的最主要也是最有效的手段就是接種流感疫苗。由于流感病毒變 異很快，通常每年的流行類型都有所不同，生產(chǎn)企業(yè)一般都在世界衛(wèi)生組織(WHO)指導下選 擇流感病毒毒株進行疫苗生產(chǎn)，每年接種最新的流感疫苗才能達到預(yù)防的效果。一旦流感 病毒變異造成大規(guī)模流行或者是世界性流行，疫苗需求量必將猛增，但目前由于受流感疫 苗生產(chǎn)工藝的限制，短時間內(nèi)難于提供大規(guī)模流行所需的足量疫苗，因此，應(yīng)用免疫佐劑， 減少疫苗用量并提高免疫效果，是應(yīng)對大規(guī)模流行期間疫苗量不足的途徑之一。隨著禽流 感疫情在世界各地的爆發(fā)，并產(chǎn)生了較高的死亡率，研究出一種新型的疫苗佐劑，從而有效 的提高疫苗的安全性和免疫原性，提高疫苗的生產(chǎn)效率，已成為更好的保護人類生命健康 的一種需要。
[0009] 經(jīng)查閱文獻，目前未發(fā)現(xiàn)關(guān)于天麻提取物應(yīng)用于免疫佐劑研究的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 為解決目前免疫佐劑單一，副作用難以避免，疫苗生產(chǎn)供應(yīng)量有限，難以滿足疫情 爆發(fā)時急需提供大量疫苗的要求，以及疫苗起效時間慢等諸多問題，本發(fā)明提供天麻提取 物的應(yīng)用及含有天麻提取物的免疫佐劑和疫苗，能有效提高疫苗免疫效果，降低疫苗抗原 用量。
[0011] 本發(fā)明通過下列技術(shù)方案實現(xiàn):天麻提取物在制備免疫佐劑中的應(yīng)用。
[0012] 進一步地，天麻提取物在制備流感疫苗中的應(yīng)用。
[0013] 所述天麻提取物為天麻乙醇提取物或者天麻水提取物，或者以常規(guī)溶劑提取的提 取物，常規(guī)溶劑如甲醇、丙酮、乙酸乙酯等。
[0014] 天麻乙醇提取物經(jīng)以下操作提?。?將天麻粉碎成天麻粉，用乙醇經(jīng)常規(guī)冷浸、溫浸或者加熱回流提取，再經(jīng)過濾后取濾 液，對濾液進行減壓回收乙醇，剩余物經(jīng)真空冷凍干燥或噴霧干燥，即得天麻乙醇提取物； 其中，乙醇的質(zhì)量濃度為75~99.7%，乙醇加入量是天麻粉質(zhì)量的5~50倍;冷浸是在室溫 下浸泡1~10天，溫浸是在40~60°C下浸泡1~3小時，提取次數(shù)為1~3次；加熱回流提取是 在30~75°C下，回流提取1~3次，每次30~180分鐘；真空冷凍干燥的冷凝溫度在-20~-50 °C下預(yù)凍3~16小時，真空度5~20KPa;噴霧干燥進風溫度100~300°C，出風溫度30~140 Γ。
[0015]天麻水提取物經(jīng)以下操作提?。?將天麻粉碎成天麻粉，用蒸餾水經(jīng)常規(guī)冷浸、溫浸或超聲波輔助提取，再經(jīng)過濾后取濾 液，進行噴霧干燥或冷凍干燥，得天麻水提取物;其中，蒸餾水的加入量是天麻粉質(zhì)量的5~ 100倍，冷浸是在室溫下浸泡1~10天，溫浸是在40~60 °C下浸泡1~3小時，提取次數(shù)為1~3 次;超聲波輔助提取是在溫度20~60°C、超聲功率100~650W、超聲頻率19~23KHz、超聲波 輸出功率70~100%的條件下進行，提取次數(shù)1~3次，每次20~120分鐘；真空冷凍干燥的冷 凝溫度在-20~-50 °C下預(yù)凍3~16小時，真空度5~20KPa;噴霧干燥進風溫度100~300 °C， 出風溫度30~140 °C。
[0016] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種含有天麻提取物的免疫佐劑的流感疫苗，其特征 在于:含有天麻提取物的免疫佐劑與流感疫苗血凝素的質(zhì)量比為50:1~150000:1。
[0017] 本發(fā)明提供的含有天麻免疫佐劑與傳統(tǒng)氫氧化鋁佐劑相比，具有以下優(yōu)點： 1)天麻是一種天然中草藥，常作為保健品使用。在以往的研究中展現(xiàn)出了多種保健功 效，將其作為流感疫苗佐劑應(yīng)用，安全性高、副作用低。在研究中發(fā)現(xiàn)，用含天麻提取物的流 感疫苗注射小鼠，小鼠未見全身不良反應(yīng)，活動及飲水進食未見明顯影響，而用含氫氧化鋁 佐劑的流感疫苗注射小鼠，則偶見注射局部出現(xiàn)紅斑、腫脹結(jié)節(jié)的現(xiàn)象。
[0018] 2)用天麻提取物制備的佐劑用在流感疫苗上，不僅佐劑效果明顯，而且疫苗質(zhì)量 容易控制；而以氫氧化鋁為佐劑制備的流感疫苗，在制備和存儲過程中，影響因素較多，對 疫苗的質(zhì)量較難控制。
[0019] 3)用天麻提取物作為流感疫苗佐劑，展現(xiàn)出了良好的有效性，能夠更好的提高抗 原的免疫原性，增強免疫效果。
[0020] 4)天麻提取物制備方法簡便，較為經(jīng)濟、環(huán)保。
[0021] 本發(fā)明用天麻提取物作為流感疫苗佐劑，具有良好的有效性，能提高抗原的免疫 原性，增強免疫效果，其安全性高、副作用小;解決了目前免疫佐劑單一，副作用難以避免， 疫苗生產(chǎn)供應(yīng)量有限，難以滿足疫情爆發(fā)時急需提供大量疫苗的要求，以及疫苗起效時間 慢等諸多問題。天麻提取物制備方法簡便，疫苗質(zhì)量容易控制。
【附圖說明】
[0022] 圖1為不同接種組在56天內(nèi)的血凝抑制抗體效價變化圖； 圖2為不同接種組在接種后7天內(nèi)的體重增長情況。
【具體實施方式】
[0023] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明，但并不以此來限定本發(fā)明。
[0024] 本發(fā)明實施例所用的流感病毒疫苗原液為本所自制，并且是按照《中國藥典》三部 2010版中所述流感病毒裂解疫苗制造方法制備的，按照《中國藥典》三部2010版所述項檢 定標準檢驗合格的流感病毒疫苗原液。
[0025] 本發(fā)明實施例中未特別指明的組分均為市購產(chǎn)品，所用設(shè)備或儀器均是常規(guī)的。
[0026] 實施例1 天麻提取物在制備免疫佐劑中的應(yīng)用;其中，天麻提取物為天麻乙醇提取物，經(jīng)以下操 作提取： 將天麻粉碎成天麻粉l〇〇g，用質(zhì)量濃度為95%乙醇1000ml經(jīng)常規(guī)加熱回流提取，再經(jīng)過 濾后取濾液，對濾液進行減壓回收乙醇，剩余物經(jīng)真空冷凍干燥，即得天麻乙醇提取物;其 中，加熱回流提取是在50°C下，回流提取3次，每次60分鐘;真空冷凍干燥的冷凝溫度在-20 °C下預(yù)凍15小時，真空度6KPa。
[0027]天麻提取物在制備流感疫苗中的應(yīng)用，是將天麻提取物直接作為佐劑（即天麻提 取物占100%)，制備含有天麻提取物的免疫佐劑的流感疫苗，其中，含有天麻提取物的免疫 佐劑與流感疫苗血凝素(H3N2流感病毒抗原）的質(zhì)量比為15984:1。
[0028] 實施例2 天麻提取物在制備免疫佐劑中的應(yīng)用;其中，天麻提取物為天麻水提取物，經(jīng)以下操作 提取： 將天麻粉碎成天麻粉l〇〇g，用lOOOrnl蒸餾水經(jīng)常規(guī)超聲波輔助提取，再經(jīng)過濾后取濾 液，進行噴霧干燥，得天麻水提取物;其中，超聲波輔助提取是在溫度60°C、超聲功率130W、 超聲頻率20KHz、超聲波輸出功率100%的條件下進行，提取次數(shù)3次，每次35分鐘;噴霧干燥 進風溫度180°C，出風溫度120°C。
[0029] 天麻提取物在制備流感疫苗中的應(yīng)用，是將天麻提取物直接作為佐劑（即天麻提 取物占100%)，制備含有天麻提取物的免疫佐劑的流感疫苗，其中，含有天麻提取物的免疫 佐劑與流感疫苗血凝素(H3N2流感病毒抗原）的質(zhì)量比為150000:1。
[0030] 實施例3 天麻提取物在制備免疫佐劑中的應(yīng)用;其中，天麻提取物為常規(guī)溶劑提取的提取物。
[0031] 天麻提取物在制備流感疫苗中的應(yīng)用，具體是制成含有天麻提取物的免疫佐劑的 流感疫苗，其中，含有天麻提取物的免疫佐劑與流感疫苗血凝素的質(zhì)量比為2000:1，即 天麻提取物5mg/ml 流感疫苗血凝素2.5μg/ml。
[0032] 實施例4 天麻提取物在制備免疫佐劑中的應(yīng)用;其中，天麻提取物為天麻乙醇提取物。
[0033] 天麻提取物在制備流感疫苗中的應(yīng)用，是將天麻提取物直接作為佐劑（即天麻提 取物占100%)，制備含有天麻提取物的免疫佐劑的流感疫苗，其中，含有天麻提取物的免疫 佐劑與流感疫苗血凝素(H3N2流感病毒抗原）的質(zhì)量比為1000:1，即： 天麻提取物 5mg/ml 流感疫苗血凝素 5μg/ml。
[0034] 實施例5 天麻提取物在制備免疫佐劑中的應(yīng)用;其中，天麻提取物為天麻水提取物。
[0035] 天麻提取物在制備流感疫苗中的應(yīng)用，是將天麻提取物直接作為佐劑（即天麻提 取物占100%)，制備含有天麻提取物的免疫佐劑的流感疫苗，其中，含有天麻提取物的免疫 佐劑與流感疫苗血凝素(H3N2流感病毒抗原）的質(zhì)量比為333:1，即： 天麻提取物 2mg/ml 流感疫苗血凝素 6μg/ml。
[0036] 實施例6 天麻提取物在制備免疫佐劑中的應(yīng)用;其中，天麻提取物為以甲醇提取的提取物。
[0037] 天麻提取物在制備流感疫苗中的應(yīng)用，是將天麻提取物直接作為佐劑（即天麻提 取物占100%)，制備含有天麻提取物的免疫佐劑的流感疫苗，其中，含有天麻提取物的免疫 佐劑與流感疫苗血凝素(H3N2流感病毒抗原）的質(zhì)量比為111: 1，即： 天麻提取物lmg/ml 流感疫苗血凝素9μg/ml。
[0038] 實施例7 天麻提取物在制備免疫佐劑中的應(yīng)用;其中，天麻提取物是以丙酮提取的提取物。
[0039] 天麻提取物在制備流感疫苗中的應(yīng)用，是將天麻提取物直接作為佐劑（即天麻提 取物占100%)，制備含有天麻提取物的免疫佐劑的流感疫苗，其中，含有天麻提取物的免疫 佐劑與流感疫苗血凝素(H3N2流感病毒抗原）的質(zhì)量比為50:1，即： 天麻提取物 0 · 5mg/ml 流感疫苗血凝素 10μg/ml。
[0040] 免疫接種及檢測： 1)含有天麻提取物免疫佐劑的流感疫苗的制備，用上述實施例6所得的流感疫苗進行 免疫接種，具體制備方法為： a) 稱天麻提取物lOOmg，溶于2ml生理鹽水中，得濃度為50mg/ml的天麻提取物溶液，備 用； b) 取1)的濃度為50mg/ml的天麻提取物溶液lml加入到4ml生理鹽水中，得濃度為10mg/ ml的天麻提取物溶液，備用； c) 取2)濃度為10mg/ml天麻提取物溶液lml加入到4ml生理鹽水中，得濃度為2mg/ml的 天麻提取物溶液，備用； d) 取lml血凝素含量為126ug/mlH3N2流感病毒抗原稀釋液加入到6ml生理鹽水中，得到 濃度為18ug/mlH3N2流感病毒抗原稀釋液，備用； e) 取3)濃度為2mg/ml的天麻提取物溶液2ml加入到2ml血凝素含量為18ug/ml的H3N2流 感病毒抗原稀釋液中，制得天麻提取物免疫佐劑的流感疫苗A。
[0041] 2)制備下列不同的佐劑或溶液： a) 取0.5ml血凝素含量為126ug/mlH3N2流感病毒抗原稀釋液加入到5.98ml生理鹽水 中，得到濃度為9.72ug/mlH3N2流感病毒抗原稀釋液，備用； b) 取lml血凝素含量為126ug/mlH3N2流感病毒抗原稀釋液加入到6ml生理鹽水中，得到 濃度為18ug/mlH3N2流感病毒抗原稀釋液，備用； c) 2ml生理鹽水，備用； d) 5ml生理鹽水，備用； 3)制備下列不同的疫苗： A) 取14mg/ml的氫氧化鋁佐劑0.25ml加入到3.25ml步驟a)所得濃度為9.72ug/mlH3N2 流感病毒抗原稀釋液中，混勻，得到含有氫氧化鋁佐劑的流感病毒疫苗樣品B; B) 取步驟b)所得濃度為18ug/mlH3N2流感病毒抗原稀釋液2ml與步驟c)生理鹽水混合， 得到無佐劑的流感疫苗樣品C; C) 步驟d)的生理鹽水為不加疫苗抗原的生理鹽水對照組D。
[0042] 所配置的上述樣品A、B、C疫苗中血凝素含量均為9ug/ml，其中天麻提取物佐劑流感疫 苗樣品A中：天麻提取物的質(zhì)量比為100%，天麻提取物免疫佐劑與流感疫苗血凝素的質(zhì)量比 為 111:1〇
[0043] 用上述A、B、C、D四個不同的樣品分別免疫標準體重雄性BALB/c小鼠，每組10只，每只肌 肉注射200ul，第1天接種一針，第21天補種一針。于首次免疫后7天、14天、21天、28天、35天、 42天取尾血，分離血清測定血凝抑制效價，結(jié)果顯示不同時間點天麻提取物佐劑組與單獨 疫苗組相比差異有統(tǒng)計學意義，說明天麻提取物作為疫苗佐劑具有較好的佐劑效果;在抗 體最高時即35天時天麻提取物佐劑組與氫氧化鋁佐劑組相比差異無統(tǒng)計學意義，說明在抗 體產(chǎn)生的峰值時天麻提取物佐劑與氫氧化鋁佐劑效果相當，但在初免后的第一周即第7天 時以及二免后的第一周即第28天時，天麻提取物佐劑組與氫氧化鋁佐劑組相比有顯著差 異，可初步說明天麻提取物佐劑的免疫增強作用產(chǎn)生的時間先于氫氧化鋁佐劑組以及單獨 疫苗組。具體結(jié)果見表1、表2及附圖1。
[0044] 表1不同接種組在42天內(nèi)的血凝抑制抗體效價變化
表2不同接種組在42天內(nèi)的血凝抑制抗體效價變化的單因素方差分析多重比較
注均值差的顯著性水平為0.05; 1.00- 天麻提取物佐劑流感疫苗組； 2.00- 氫氧化鋁佐劑組； 3.00- 單獨疫苗組； 4.00- 生理鹽水組。
[0045] 于初免之日起7d內(nèi)對各組小鼠進行體重測量，并對7天內(nèi)各組平均增長的體重進 行計算，所測結(jié)果顯示天麻提取物免疫佐劑組小鼠體重增長正常，與其他組相比，體重增長 無顯著性差異，具體結(jié)果見表3、表4及附圖2。
[0046] 表3不同接種組在接種后7天內(nèi)的體重增長情況
表4不同接種組在接種后7天內(nèi)的體重增長情況的單因素方差分析結(jié)果
注:顯著性水平為0.05。
【主權(quán)項】
1. 天麻提取物在制備免疫佐劑中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述天麻提取物在制備流感疫苗中的應(yīng) 用。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述天麻提取物為天麻乙醇提取物或 者天麻水提取物，或者以常規(guī)溶劑提取的提取物。4. 一種含有天麻提取物的免疫佐劑的流感疫苗，其特征在于:含有天麻提取物的免疫 佐劑與流感疫苗血凝素的質(zhì)量比為50:1~150000:1。
【文檔編號】A61K39/145GK106039305SQ201610468708
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月25日
【發(fā)明人】李映波, 朱喆
【申請人】中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所