一種克羅諾桿菌的物理化學聯合殺菌方法與應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種克羅諾桿菌的物理化學聯合殺菌方法與應用，屬于殺菌方法技術領域。本發(fā)明所提供的方法是向待滅菌對象上噴淋消毒劑，消毒劑作用20?40s后，利用紫外線進行輻照處理，輻照劑量達到0.2?0.3J/cm2后，停止紫外線輻照處理并利用中和劑噴淋待滅菌對象；所述消毒劑是過氧乙酸、二氧化氯或過氧化氫。本發(fā)明所提供的方法可以在使用較低消毒劑和較低紫外線輻照劑量的情況下獲得較好的殺滅克羅諾桿菌的效果。既可以降低生產成本，還可以在保證加工產品安全性的情況下降低食品安全風險。
【專利說明】
一種克羅諾桿菌的物理化學聯合殺菌方法與應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種克羅諾桿菌的物理化學聯合殺菌方法與應用，屬于殺菌方法技術 領域。
【背景技術】
[0002] 克羅諾桿菌(Cronobacter)原名阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)，是嬰兒 配方乳粉(powdered infant formula，PIF)中的A類致病菌，能夠通過污染PIF造成新生兒 感染，致死率高達40 % -80 %。
[0003] 阪崎克羅諾桿菌是具有極大危害的食源性病原菌，能引發(fā)嚴重的敗血癥、壞死性 小腸結腸膜炎、腦膜炎以及膿毒癥。此外，在一定條件下，該菌也可導致免疫力低下的成年 人菌血癥、局部感染及骨髓炎等。感染該菌的高危人群是體重偏輕的新生兒(低于2.5kg)和 剛出生的嬰兒（出生28天內）。
[0004] 目前關于感染阪崎克羅諾桿菌的嬰幼兒案例，集中于西方國家。剛出生一周左右 的嬰兒易被阪崎克羅諾桿菌所感染，使其患有腦膜炎。當被感染的新生兒表現出瞳孔散大、 眼外肌麻痹以及上臉下垂等癥狀后，嚴重者會在幾小時就死亡。致死率在40%以上，并且剩 余存活者也會留下嚴重的神經后遺癥，承受神經系統(tǒng)疾病的折磨。
[0005] 世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯合國糧食及農業(yè)組織(FA0)已確定克羅諾桿菌屬中有六 種菌具有毒性，毒性強弱存在差異。到目前為止，阪崎克羅諾桿菌的致病機制尚無定論，很 多研究學者都從不同角度對其致病機制進行了探討。致病機制可能是:外膜蛋白A黏附細胞 的作用、脂多糖非特異致病作用、細菌間相互作用等。但是至今還沒有系統(tǒng)解釋該菌致病機 理的報道，阪崎克羅諾桿菌的致病機制仍有待進一步闡明。
[0006] 我國關于阪崎克羅諾桿菌的傳播、感染的研究，主要在嬰幼兒食品等方面。全國疾 控中心在2010-2011年發(fā)布的報告稱，廣西省梧州市在175份食品樣品中對阪崎克羅諾桿菌 進行檢測，檢出率達到5.26 %。在江蘇省某市在891份樣品的監(jiān)測中，檢測出該菌的概率是 2.6%。由此可見，在我國食品中阪崎克羅諾桿菌污染的程度及其范圍的廣泛。
[0007]嬰幼兒配方粉是克羅諾桿菌的主要污染源和污染渠道，而生產加工環(huán)節(jié)是克羅諾 桿菌的主要污染環(huán)節(jié)。因此，對食品加工設備進行有效殺毒對殺滅克羅諾桿菌具有重要意 義。在食品行業(yè)，目前的殺菌方法主要都集中在單一的化學或物理殺菌，來確保食品安全， 很少使用聯合殺菌方法。雖然目前對物理-化學聯合殺菌方法的研究有所報道，但都處于就 出研究階段。由于加工場地的限制，很多研究中的方法并不具備可操作性。

【發(fā)明內容】

[0008] 為解決上述技術問題，本發(fā)明提供了一種克羅諾桿菌的物理化學聯合殺菌方法， 所采取的技術方案如下：
[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種克羅諾桿菌的物理化學聯合殺菌方法，該方法是向待 滅菌對象上噴淋消毒劑，消毒劑作用20-40S后，利用紫外線進行輻照處理，輻照劑量達到 0.2-0.3J/cm2后，停止紫外線輻照處理并利用無菌清水噴淋待滅菌對象;所述消毒劑是過 氧乙酸、二氧化氯或過氧化氫。
[0010]所述殺菌方法的步驟如下：
[0011] 1)向待滅菌對象中噴淋過氧乙酸、二氧化氯或過氧化氫溶液，作用20-40S;
[0012] 2)對步驟1)經過消毒處理的待滅菌對象進行輻照劑量為0.2-0.3J/cm2的紫外線 輻照處理；
[0013] 3)利用無菌清水對噴淋清洗待滅菌對象。
[0014] 優(yōu)選地，步驟1)所述待滅菌對象為工廠生產設備或包裝材料。
[0015]更優(yōu)選地，所述待滅菌對象的材料是不銹鋼、馬口鐵、鋁塑復合膜、玻璃或水泥。
[0016] 優(yōu)選地，步驟1)所述過氧乙酸溶液的質量分數為0.1-0.15% ;所述二氧化氯添加 量為500-1 OOOppm;所述過氧化氫的質量分數為1.5-2.0%。
[0017] 更優(yōu)選地，所述方法的具體步驟如下：
[0018] 1)向工廠生產設備或包裝材料上噴淋質量分數為1.5-2.0 %的過氧化氫，作用 30s ；
[0019] 2)利用紫外線消毒燈對步驟1)經過過氧化氫處理的生產設備或包裝材料進行紫 外線輻照處理，處理劑量達到0.2-0.3J/cm 2后結束；
[0020] 3)在利用無菌清水對步驟2)經過紫外輻照處理的生產設備或包裝材料進行清洗。
[0021] 以上所述任一方法可在食品生產設備和包裝材料的滅菌消毒過程中應用。
[0022]本發(fā)明獲得的有益效果：
[0023]本發(fā)明所提供的方法具有殺菌徹底，可操作性強的特點，能夠有效殺滅污染到食 品加工設備和包裝材料上的克羅諾桿菌，保證加工產品的安全性。本發(fā)明所提供的方法可 以在使用較低消毒劑和較低紫外線輻照劑量的情況下獲得較好的殺滅克羅諾桿菌的效果。 既可以降低生產成本，可以降低食品安全風險。
【具體實施方式】
[0024]下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明不受實施例的限制。
[0025]以下實施例所用材料、試劑、方法和儀器，未經特殊說明，均為本領域常規(guī)材料、試 劑、方法和儀器，本領域技術人員均可通過商業(yè)渠道獲得。
[0026]發(fā)明人所用菌株見表1，均分離自2007年至2015年期間，嬰幼兒配方粉生產企業(yè)的 加工環(huán)境和成品，共計4株阪崎克羅諾桿菌分離株。
[0027] 所用菌株的選取主要是依據兩個原則:第一，選取主要ST型的菌株作為試驗的代 表菌株。第二，根據發(fā)明人近9年采樣結果，分析發(fā)現在噴霧干燥后、流化床出口、傳送帶等 生產環(huán)節(jié)以及嬰兒配方粉易被阪崎克羅諾桿菌污染。故選取這幾株分離株作為實驗菌株。
[0028] 表1本發(fā)明所用克羅諾桿菌菌株及其來源
[0029]
[0030] 上述菌種的活化培養(yǎng)方法是:取出保存在-80°C，用甘油作保護劑的含有阪崎克羅 諾桿菌的凍存管。將其恢復到室溫，以2%的接種量接種于TSB液體培養(yǎng)基中，37°C條件下在 搖床上培養(yǎng)12h進行活化。再用接種環(huán)取活化后的菌液在胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)固 體培養(yǎng)基三區(qū)劃線，在37°C下培養(yǎng)24h。挑取典型大小為1~1.5mm的黃色單菌落，將其接種 至iJlOmL胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)中進行純培養(yǎng)，連續(xù)傳代2次，方可進行后續(xù)試驗。 [0031 ]將上述4株阪崎克羅諾桿菌的待用菌液用渦旋器震蕩混勻，用移液槍分別從待測 溶液取菌懸液滴分別滴加到不銹鋼片、馬口鐵、鋁塑復合膜表面上，在生物安全柜中室溫 下，干燥2h之后馬上進行實驗處理。
[0032]紫外劑量的換算
[0033]紫外劑量等于紫外強度與紫外輻射時間的乘積，具體公式如下：
[0034]紫外劑量(J/cm2) =紫外強度(W/cm2)X輻照時間（s)
[0035]實施例1過氧乙酸處理對不同材料上克羅諾桿菌的殺滅效果 [0036]將經過滅菌處理并污染克羅諾桿菌并干燥2小時后的不銹鋼片、馬口鐵片和鋁塑 復合膜上滴加濃度為0.1%，0.15%，0.2%，0.25%和0.3%的過氧乙酸溶液，作用lOmin后 利用中止劑終止反應。在利用直徑為〇.5_的玻璃珠將材料商的菌進行洗脫，并進行培養(yǎng)計 數。以無菌硬質水代替過氧乙酸進行同樣操作作為空白對照。試驗結果以過氧乙酸處理前 后材料表面菌數減少量的Log值表示。具體結果如表1所述。
[0037]表1不同濃度過氧乙酸對不同材料上克羅諾桿菌的殺滅效果
[0038]
[0039] 注:每行中字母的不同表示存在顯著性差異(P<0.05)
[0040] "ND"表示未檢出
[0041 ]從表1可知，過氧乙酸濃度越高殺菌效果越好。當濃度達到0.3%時，克羅諾桿菌未 被檢測到。同時，可知不同的菌株在不同的材料上對過氧乙酸的耐受程度不同。
[0042]實施例2二氧化氯處理對不同材料上克羅諾桿菌的殺滅效果
[0043] 本實施例米用500ppm，lOOOppm，1500ppm，2000ppm，2500ppm，3000ppm的二氧化氯 代替過氧乙酸對污染有四種不同克羅諾桿菌的不銹鋼片、馬口鐵片和鋁塑復合膜進行處 理，處理條件與實施例1的條件相同。實驗結果如表2所示。
[0044] 表2不同濃度二氧化氯對不同材料上克羅諾桿菌的殺滅效果
[0045]
[0046]
[0u4/j 從衣加」知，隨二氧化氣濃度的増刀p，
4秌囷綸處埋;5的減少重均迻浙提咼，a二氧 化氯濃度為3000ppm時，處理后，經洗脫，未檢測出菌。4株菌在用500ppm較低濃度和2500ppm 較高二氧化氯處理時，經SPSS差異性分析，顯示在三種材料上4株菌之間都無顯著性差異(P >0.05)0
[0048] 實施例3過氧化氫處理對不同材料上克羅諾桿菌的殺滅效果
[0049] 本實施例采用1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%，3.5%的過氧化氫代替過氧乙酸 處理污染有四種不同克羅諾桿菌的不銹鋼片、馬口鐵片和鋁塑復合膜進行處理，處理條件 與實施例1的條件相同。實驗結果如表3所示。
[0050] 表3不同濃度過氧化氫對不同材料上克羅諾桿菌的殺滅效果
[0051]
[0052] 注:每行中字母的不同表示存在顯著性差異(P<0.05)
[0053] "ND"表示未檢出。
[0054]從表3可知，隨著過氧化氫濃度的增大，4株菌在三種材料上菌的減少量也隨之增 加。當過氧化氫的濃度達到3.5 %時，四株菌在三種材料上經處理后，均未檢測出。在過氧化 氫的濃度為3%時，四株菌無顯著性差異。
[0055]實施例4不同紫外線輻照劑量對不同材料上克羅諾桿菌的殺滅效果
[0056] 本實施例采用 了輻照劑量為0 · 1 J/cm2、0 · 2J/cm2、0 · 3J/cm2、0 · 4J/cm2、0 · 5J/cm2的 紫外線來代替過氧乙酸對對污染有四種不同克羅諾桿菌的不銹鋼片、馬口鐵片和鋁塑復合 膜進行處理，處理條件與實施例1的條件相同。實驗結果如表4所示。
[0057] 表4不同紫外線輻照強度對不同材料上克羅諾桿菌的沒殺效果
[0058]
[0059] 注:每行中字母的不同表示存在顯著性差異(P<0.05)
[0060] "ND"表示未檢出
[0061] 從表4可知，隨著紫外劑量的增加，各ST型的菌在材料上的減少量也隨之增加。當 紫外劑量達到〇. 5J/cm2時，在材料上未檢測出菌。當紫外劑量為0.1 J/cm2、0.5J/cm2時，在三 種材料上4株菌都無顯著性差異。當紫外劑量為0.2J/cm 2、0.3 J/cm2、0.4J/cm2時，CE63 (ST1) 與CE64(ST4)存在明顯差異（P<0.05)，且CE63(ST1)減少的菌數多，CE64(ST4)與CE26 (ST268)之間差異不明顯。
[0062] 實施例5紫外線-消毒劑聯合處理對克羅諾桿菌的滅殺效果
[0063] 根據實施例1-4的結果，本實施例對紫外線-消毒劑聯合處理對克羅諾桿菌的滅殺 效果進行研究。消毒劑的濃度選取為:過氧乙酸的濃度為0.1%、〇. 15%，二氧化氯濃度為 500ppm、lOOOppm，過氧化氫濃度為1 · 5 %、2 · 0 %。紫外線劑量選取0 · 2J/cm2、0 · 3J/cm2。在處 理過程中，先向經過克羅諾桿菌污染的三種材料上噴淋消毒劑，作用時間30s后，進行紫外 線輻照處理，處理后在使用無菌廢水進行噴淋處理，處理后再將獲得的菌體進行培養(yǎng)計數。
[0064] 協同效果通過以下公式進行判定：
[0065] 協同作用效果=聯合處理減少的菌數-(紫外減少的菌數+消毒劑減少的菌數)聯 合處理的后的協同效果分析結果，如表5所示。
[0066] 表5紫外線-消毒劑聯合處理對克羅諾桿菌的滅殺效果
[0067]
[0068]
[0069] 注："ND"表示未檢出
[0070] 協同作用效果=聯合處理減少的菌數-(紫外減少的菌數+消毒劑減少的菌數)為 正數時表示存在協同效應。為負數時，表示二者具有殺菌效力相消的現象。
[0071] 從表5可知，當三種消毒劑與紫外聯用時，都表現出正的協同效應，即聯用后比兩 者單獨應用后累加的殺菌效果好。紫外和消毒劑聯用存在明顯的協同效應，能夠在兩者劑 量較低時，就產生一個較好的殺菌影響。尤其是在過氧化氫濃度為2.0%，紫外線輻照強度 為0.2J/cm 2時，協同效應顯著高于其他組別的技術效果。
[0072] 實施例6
[0073] 根據實施例5的結果，發(fā)明人調低了紫外輻照的強度和消毒劑的用量，采用消毒劑 濃度為:過氧乙酸的濃度為〇. 05%，二氧化氯濃度為400ppm，過氧化氫濃度為1.0 %。紫外線 劑量選取〇. lj/cm2對克羅諾桿菌進行處理。結果表明，紫外線處理與三種消毒劑聯合處理 對四種克羅諾桿菌的平均協同作用效果分別為馬口鐵:過氧乙酸0.11，二氧化氯0.07,過氧 化氫0.26 ;不銹鋼：過氧乙酸0.12，二氧化氯0.05，過氧化氫0.18;鋁塑復合膜:過氧乙酸 0.08，二氧化氯0.09，過氧化氫0.34。協同作用效果明顯低于實施例5。
[0074] 實施例7
[0075] 根據實施例5的結果，發(fā)明人調高紫外線輻照劑量的水平為0.4J/cm2,消毒劑的用 量水平為:過氧乙酸的濃度為〇. 1%，二氧化氯濃度為500ppm，過氧化氫濃度為1.5%。利用 上述條件(其他條件與實施例5相同）對克羅諾桿菌進行處理。結果表明，過氧乙酸、二氧化 氯和過氧化氫三種消毒劑與紫外線聯合使用對四種克羅諾桿菌的平均協同效果依次為:馬 口鐵:過氧乙酸0.89，二氧化氯0.58，過氧化氫0.77;不銹鋼:過氧乙酸0.78，二氧化氯0.33， 過氧化氫1.11;鋁塑復合膜:過氧乙酸0.88，二氧化氯0.51，過氧化氫1.23。從上述結果可 知，協同作用的效果沒有提高，反而普遍低于實施例5協同效應的結果。
[0076] 雖然本發(fā)明已以較佳的實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此 技術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內，都可以做各種改動和修飾，因此本發(fā)明的保護 范圍應該以權利要求書所界定的為準。
【主權項】
1. 一種克羅諾桿菌的物理化學聯合殺菌方法，其特征在于，向待滅菌對象上噴淋消毒 劑，消毒劑作用20-40S后，利用紫外線進行輻照處理，輻照劑量達到0.2-0.3J/cm 2后，停止 紫外線輻照處理并利用無菌清水噴淋待滅菌對象;所述消毒劑是過氧乙酸、二氧化氯或過 氧化氫。2. 根據權利要求1所述的殺菌方法，其特征在于，步驟如下： 1) 向待滅菌對象中噴淋過氧乙酸、二氧化氯或過氧化氫溶液，作用20-40S; 2) 對步驟1)經過消毒處理的待滅菌對象進行輻照劑量為0.2-0.3J/cm2的紫外線輻照處 理； 3) 利用無菌清水對噴淋清洗待滅菌對象。3. 根據權利要求2所述的殺菌方法，其特征在于，步驟1)所述待滅菌對象為工廠生產設 備或包裝材料。4. 根據權利要求2所述的殺菌方法，其特征在于，所述待滅菌對象的材料是不銹鋼、馬 口鐵、鋁塑復合膜、玻璃或水泥。5. 根據權利要求2所述的殺菌方法，其特征在于，步驟1)所述過氧乙酸溶液的質量分數 為0.1-0.15% ;所述二氧化氯添加量為500-1000ppm;所述過氧化氫的質量分數為1.5-2.0%〇6. 權利要求1-5任一所述方法在食品生產設備和包裝材料的滅菌消毒過程中的應用。
【文檔編號】A61L2/18GK106039353SQ201610375333
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月31日
【發(fā)明人】姜毓君, 滿朝新, 牛婕婷, 曲艷艷, 孫露宏
【申請人】東北農業(yè)大學