冰晶模板法制備規(guī)則片層結(jié)構(gòu)三維生物支架的方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種冰晶模板法制備規(guī)則片層結(jié)構(gòu)三維生物支架的方法和應(yīng)用。將蠶繭脫膠后得到的絲素纖維依次經(jīng)過溶解、過濾、透析和離心后，濃縮獲得絲素蛋白水溶液，采用冰晶模板法制備冰晶/絲素支架，以恒定的降溫速度調(diào)節(jié)進(jìn)行冷凍處理，通過冷凍干燥去除冰晶/絲素支架中的規(guī)則片層冰晶，獲得具有規(guī)則片層結(jié)構(gòu)的絲素支架，作為規(guī)則片層結(jié)構(gòu)三維生物支架。由此，本發(fā)明具有優(yōu)良的生物相容性和力學(xué)性能，顯著提高了人體細(xì)胞的增殖性能和干細(xì)胞的定向分化性能，從而提高生物支架的骨組織修復(fù)作用，在組織工程、藥物緩釋、止血材料、過濾膜領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說明】
冰晶模板法制備規(guī)則片層結(jié)構(gòu)三維生物支架的方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明公開了一種冰晶模板法制備規(guī)則片層結(jié)構(gòu)三維生物支架的方法和應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥材料領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]以家蠶絲素蛋白、柞蠶絲素蛋白和蜘蛛絲蛋白為代表的絲蛋白生物材料具有優(yōu)良的力學(xué)性能、生物相容性、無免疫排斥、可降解性以及本質(zhì)是天然蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，在生物材料領(lǐng)域受到高度的關(guān)注。絲蛋白生物材料可用作骨組織修復(fù)、創(chuàng)面覆蓋材料、藥物緩釋材料等不同形狀與功能的生物材料，以滿足人類對生物材料的不同需求。
[0003]多孔材料可用于組織工程領(lǐng)域創(chuàng)傷組織的再生，所以支架材料的制備除了需要生物相容性之外還需要具有一定的強(qiáng)度，便于成型等性能，是支架材料能否應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵。多孔支架的孔結(jié)構(gòu)能夠?yàn)榧?xì)胞的粘附和增殖提供一種類似體內(nèi)的微環(huán)境，使得細(xì)胞具有了類似在體內(nèi)時的形態(tài)，能夠影響細(xì)胞的生長、信號傳遞和分化，在重塑和修復(fù)組織的過程中起著至關(guān)重要的作用。成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等人體細(xì)胞都可以在絲蛋白生物材料上良好地生長，發(fā)揮其特有的生理功能。現(xiàn)有技術(shù)制備多孔三維支架方法包括冷凍干燥法、粒子致孔法、氣體發(fā)泡法等方法。目前，通過冷凍干燥法制備絲蛋白多孔支架的研究最多，可以通過改變絲蛋白溶液的濃度、時間來控制支架材料的孔的尺寸;粒子致孔法是在絲蛋白溶液中加入致孔劑粒子，將兩者混合均勾、固化，再利用致孔劑與絲蛋白材料溶解性不同，置換出致孔劑粒子，最后干燥得到絲蛋白多孔支架的方法;氣體發(fā)泡法一般采用碳酸鹽類化合物為化學(xué)發(fā)泡劑，調(diào)節(jié)PH產(chǎn)生氣體，最后經(jīng)冷凍干燥制得多孔支架。盡管組織工程絲蛋白多孔支架的制備方法眾多，不同方法制備的絲蛋白多孔支架的表面形貌、孔徑和孔隙率會有所差異。但是以上制孔方法存在需要加入制孔劑或者需要添加發(fā)泡劑的缺點(diǎn)，同時存在力學(xué)性能不足，得到的孔徑不可控，支架內(nèi)部表面孔與下部孔會出現(xiàn)重疊及堵塞的缺點(diǎn)。對于微米級的細(xì)胞來說，只能在表面孔粘附與增殖，而不能深入到下部孔，這種細(xì)胞粘附方式與二維材料一樣，使得三維多孔支架空有三維形貌的外殼。以上制孔方法嚴(yán)重阻礙了三維多孔支架在生物醫(yī)藥的應(yīng)用。
[0004]因此，需要克服現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題，模擬細(xì)胞外基質(zhì)形貌的結(jié)構(gòu)特征，保持三維多孔支架的具有規(guī)則形貌和力學(xué)強(qiáng)度，使得細(xì)胞能夠在三維多孔支架內(nèi)部粘附、增殖與分化，以滿足當(dāng)前組織工程材料的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決【背景技術(shù)】中的應(yīng)用，本發(fā)明公開了一種冰晶模板法制備規(guī)則片層結(jié)構(gòu)三維生物支架的方法和應(yīng)用，通過改善絲蛋白多孔支架的形貌特征與力學(xué)強(qiáng)度來滿足實(shí)際的需求。
[0006]本發(fā)明采用可控梯度降溫技術(shù)，通過在一定濃度的絲蛋白溶液中恒定降溫至冰點(diǎn)以下，獲得形貌規(guī)則的冰晶結(jié)構(gòu)，冷凍干燥去除冰晶/絲素支架中的冰晶，獲得具有規(guī)則片層結(jié)構(gòu)的絲蛋白支架。
[0007]為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0008]一、一種冰晶模板法制備規(guī)則片層結(jié)構(gòu)三維生物支架的方法:
[0009](I)將蠶繭脫膠后得到的絲素纖維依次經(jīng)過溶解、過濾、透析和離心后，濃縮至獲得質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為2 %?25 %的絲素蛋白水溶液；
[0010](2)采用冰晶模板法制備冰晶/絲素支架:
[0011](3)接著通過冷凍干燥去除冰晶/絲素支架中的規(guī)則片層冰晶，獲得具有規(guī)則片層結(jié)構(gòu)的絲素支架，作為規(guī)則片層結(jié)構(gòu)三維生物支架。
[0012]所述步驟(2)具體為:將步驟(I)獲得的絲素蛋白水溶液注入支架模具中，將支架模具放置降溫調(diào)節(jié)環(huán)境中，以恒定的降溫速度調(diào)節(jié)進(jìn)行冷凍處理，在常溫?-150°C低溫范圍內(nèi)經(jīng)過I?240分鐘完成降溫冷凍處理，使得絲素蛋白溶液中的冰晶以恒定速度由下往上生長，得到冰凍的冰晶/絲素支架。
[0013]所述恒定的降溫速率為0.10C/分鐘?100°C/分鐘。
[0014]將所述支架模具在梯度降溫裝置上面，梯度降溫裝置包括銅棒、加熱線圈、液氮容器和加熱器，銅棒上部纏繞加熱線圈，加熱線圈連接加熱器，通過加熱器給銅棒加熱，銅棒下部置于液氮容器中，所述支架模具放置于銅棒頂端。
[0015]所述步驟(2)中梯度降溫裝置為一種可控降溫的裝置，可將溫度將至-150°C的低溫，降溫速度可達(dá)到0.TC/分鐘?100°C/分鐘范圍，降溫裝置與支架模具之間具有很好的熱傳導(dǎo)。
[0016]所述步驟(I)中的絲素原料采用家蠶絲膠、絲腺蛋白、野蠶絲膠、蜘蛛絲蛋白或重組絲蛋白等絲蛋白，但不限于此。
[0017]所述絲素原料替換為其它生物大分子，其它生物大分子為殼聚糖、海藻酸鈉或者膠原等材料。
[0018]二、一種冰晶模板法制備規(guī)則片層結(jié)構(gòu)三維生物支架的應(yīng)用:采用所述規(guī)則片層結(jié)構(gòu)三維生物支架用于接種人體纖維細(xì)胞、人體充質(zhì)干細(xì)胞中的應(yīng)用。
[0019]所述的規(guī)則片層結(jié)構(gòu)絲蛋白支架用于與人體纖維細(xì)胞實(shí)驗(yàn):將人體纖維細(xì)胞接種到所述規(guī)則片層結(jié)構(gòu)絲蛋白支架中，細(xì)胞能夠在支架表面和支架內(nèi)部生長，表現(xiàn)出良好的細(xì)胞增殖能力。
[0020]所述的規(guī)則片層結(jié)構(gòu)絲蛋白支架用于與人間充質(zhì)干細(xì)胞實(shí)驗(yàn):將人間充質(zhì)干細(xì)胞接種在所述規(guī)則片層結(jié)構(gòu)絲蛋白支架中，一天培養(yǎng)后既表現(xiàn)出高的貼壁效果，兩周培養(yǎng)后，能夠促進(jìn)細(xì)胞大量分泌膠原蛋白和堿性磷酸酶，表現(xiàn)出良好的促進(jìn)干細(xì)胞定向分化能力。
[0021]本發(fā)明所使用到的絲蛋白物質(zhì)為天然活性物質(zhì)，已普遍用于生物醫(yī)藥行業(yè)，對細(xì)胞或組織無毒性反應(yīng)。以冰晶為模板能夠快速、準(zhǔn)確地構(gòu)建具有平行排列的片層拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的絲蛋白多孔材料。片層結(jié)構(gòu)能夠?yàn)榧?xì)胞提供單獨(dú)的儲存空間；同時，與普通的網(wǎng)絡(luò)狀多孔支架相比，同方向的片層結(jié)構(gòu)能夠在z軸方向提供很好的支撐作用(如骨骼的著力點(diǎn)方向)，從而提高支架材料的力學(xué)性能。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表面:具有片層結(jié)構(gòu)的絲蛋白多孔支架表現(xiàn)出較高的細(xì)胞粘附率和增殖率;細(xì)胞能夠在支架內(nèi)部正常粘附與生長，具有良好的生物相容性，生物安全性高，能滿足生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。
[0022]因此，本發(fā)明充分發(fā)揮了多孔結(jié)構(gòu)特點(diǎn)對細(xì)胞相容性和力學(xué)性能的改善，綜合了生物多孔支架材料的優(yōu)勢，屬于最為理想的一種三維多孔支架材料，而該發(fā)明也為研究生物大分子多孔材料的設(shè)計(jì)和制備工藝提供參考信息。
[0023]由于上述技術(shù)方案的運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下突出特點(diǎn):
[0024](I)優(yōu)良的生物相容性:絲蛋白成分，天然安全，能被生物體吸收再利用，是一種對機(jī)體組織無毒副作用；
[0025](2)對環(huán)境沒有污染:制備過程不使用有機(jī)或有毒試劑，制備條件溫和，不產(chǎn)生有對人體和環(huán)境有毒害的產(chǎn)物；
[0026](3)工藝簡單，快速:以冰晶為模板，通過恒速降溫能夠快速、準(zhǔn)確地在絲蛋白支架內(nèi)部構(gòu)建具有平行排列的片層拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)；
[0027](4)提高細(xì)胞在支架內(nèi)部的生長:均一形貌的片層支架，能夠很好地為細(xì)胞粘附提供著力點(diǎn)和生存空間，解決了細(xì)胞在三維支架內(nèi)部中的細(xì)胞缺氧氣及缺養(yǎng)分的問題，克服現(xiàn)有技術(shù)制備的三維多孔支架內(nèi)部無法使得細(xì)胞生存的缺點(diǎn)。
[0028](5)提高支架的力學(xué)性能:與普通的網(wǎng)絡(luò)狀多孔支架相比，同方向的片層結(jié)構(gòu)能夠在z軸方向提供很好的支撐作用，從而提高支架材料的力學(xué)性能。
[0029]由此，本發(fā)明不另加制孔劑，并具有優(yōu)良的生物相容性和力學(xué)性能，顯著提高了人體細(xì)胞的增殖性能和干細(xì)胞的定向分化性能，從而提高生物支架的骨組織修復(fù)作用，在組織工程、藥物緩釋、止血材料、過濾膜領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0030]圖1為實(shí)施例1中所獲得的規(guī)則片層結(jié)構(gòu)的絲素支架的掃描電鏡圖(圖1A)和傳統(tǒng)冷凍干燥法制備的絲素支架的掃描電鏡圖(圖1B)。
[0031]圖2為人纖維細(xì)胞在實(shí)施例1中所獲得的規(guī)則片層結(jié)構(gòu)的絲素支架上的細(xì)胞形貌圖(圖2A)和人纖維細(xì)胞在傳統(tǒng)冷凍干燥法制備的絲素支架上的細(xì)胞形貌圖(圖2B)。
【具體實(shí)施方式】
[0032]下面通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以下實(shí)施例是對本發(fā)明的解釋而本發(fā)明并不局限于以下實(shí)施例。
[0033]本發(fā)明的實(shí)施例如下:
[0034]實(shí)施例1:
[0035](I)將蠶繭脫膠后得到的絲蛋白纖維依次經(jīng)過溶解、過濾、透析和離心后，濃縮至質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為2 %的絲素蛋白水溶液；
[0036](2)冰晶模板法制備冰晶/絲素支架，將絲素蛋白水溶液注入模具中，將模具放置在梯度降溫裝置上面，通過恒定速度調(diào)節(jié)降溫速率為0.TC/分鐘，經(jīng)過240分鐘，使得模具內(nèi)的支架降至_24°C，得到冰凍的冰晶/絲素支架；
[0037](3)通過冷凍干燥去除冰晶/絲素支架中的規(guī)則片層冰晶，獲得具有規(guī)則片層結(jié)構(gòu)的絲素支架，而對照組組支架(冷凍干燥法制備)的形貌則是無規(guī)則的多孔狀；
[0038](4)實(shí)施例1中所獲得的規(guī)則片層結(jié)構(gòu)的絲素支架的掃描電鏡如圖1A所示，人纖維細(xì)胞在實(shí)施例1中所獲得的規(guī)則片層結(jié)構(gòu)的絲素支架上的細(xì)胞形貌如圖2A所示。以傳統(tǒng)冷凍干燥法作為對照組，傳統(tǒng)冷凍干燥法制備的絲素支架的掃描電鏡如圖1B所示，人纖維細(xì)胞在傳統(tǒng)冷凍干燥法制備的絲素支架上的細(xì)胞形貌如圖2B所示。
[0039]圖中可見，人纖維細(xì)胞能夠在該本發(fā)明的絲素支架內(nèi)部粘附與增殖，具有良好的生物相容性，而傳統(tǒng)冷凍干燥法的對照組中的多孔支架(冷凍干燥法制備)上的細(xì)胞數(shù)量較少，細(xì)胞形貌較小。
[0040]實(shí)施例2:
[0041](I)將蠶繭脫膠后得到的絲蛋白纖維依次經(jīng)過溶解、過濾、透析和離心后，濃縮至質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為25 %的絲素蛋白水溶液；
[0042](2)冰晶模板法制備冰晶/絲素支架，將絲素蛋白水溶液注入模具中，將模具放置在梯度降溫裝置上面，通過恒定速度調(diào)節(jié)降溫速率為100°C/分鐘，經(jīng)過I分鐘，使得模具內(nèi)的支架以恒定降溫方式降至-100°C，得到冰凍的冰晶/絲素支架；
[0043](3)通過冷凍干燥去除冰晶/絲素支架中的規(guī)則片層冰晶，獲得具有規(guī)則片層結(jié)構(gòu)的絲素支架，75%酒精處理后使得片層結(jié)構(gòu)的絲素支架結(jié)構(gòu)β化；
[0044](5)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明該支架能夠誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。
[0045]實(shí)施例3:
[0046](I)將蠶繭脫膠后得到的絲蛋白纖維依次經(jīng)過溶解、過濾、透析和離心后，濃縮至質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為12%的絲素蛋白水溶液；
[0047](2)冰晶模板法制備冰晶/絲素支架，將絲素蛋白水溶液注入模具中，將模具放置在梯度降溫裝置上面，通過恒定速度調(diào)節(jié)降溫速率為5°C/分鐘，經(jīng)過20分鐘，使得模具內(nèi)的支架以恒定降溫方式降至-100°C，得到冰凍的冰晶/絲素支架；
[0048](3)通過冷凍干燥去除冰晶/絲素支架中的規(guī)則片層冰晶，獲得具有規(guī)則片層結(jié)構(gòu)的絲素支架，100%甲醇處理后使得片層結(jié)構(gòu)的絲素支架結(jié)構(gòu)β化；
[0049](5)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明該規(guī)則片層結(jié)構(gòu)支架能夠誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。
[0050]實(shí)施例4:
[0051 ] (I)將明膠溶液溶于水溶液中得到質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為10%的明膠溶液；
[0052](2)冰晶模板法制備冰晶/明膠支架，將明膠水溶液注入模具中，將模具放置在梯度降溫裝置上面，通過恒定速度調(diào)節(jié)降溫速率為5°C/分鐘，經(jīng)過30分鐘，使得模具內(nèi)的支架以恒定降溫方式降至-150°C，得到冰凍的冰晶/明膠支架；
[0053](3)通過冷凍干燥去除冰晶/明膠支架中的規(guī)則片層冰晶，獲得具有規(guī)則片層結(jié)構(gòu)的明膠支架；
[0054](5)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明該該規(guī)則片層結(jié)構(gòu)的明膠支架能夠誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。
[0055]綜上，本發(fā)明實(shí)施例采用冰晶模板法制備冰晶/絲素支架，以恒定的降溫速度調(diào)節(jié)進(jìn)行冷凍處理，經(jīng)冷凍干燥后得到規(guī)則片層結(jié)構(gòu)的絲素支架，克服了需要加入制孔劑或者需要添加發(fā)泡劑的缺點(diǎn)。細(xì)胞能夠在該規(guī)則片層結(jié)構(gòu)的絲素支架內(nèi)部粘附、增殖與分化。解決了細(xì)胞在三維支架內(nèi)部中的細(xì)胞缺氧氣及缺養(yǎng)分的問題，克服現(xiàn)有技術(shù)制備的三維多孔支架內(nèi)部無法使得細(xì)胞生存的缺點(diǎn)。同時片層結(jié)構(gòu)能夠誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞的定向分化。該發(fā)明不僅可以應(yīng)用到片層絲蛋白支架的制備，還可以應(yīng)用到其它生物大分子(如:殼聚糖、海藻酸鈉或者膠原等)片層結(jié)構(gòu)生物支架的制備。因此本發(fā)明是一種生物相容性好、細(xì)胞三維培養(yǎng)效果顯著，可以誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化的生物支架。
[0056]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例子。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種冰晶模板法制備規(guī)則片層結(jié)構(gòu)三維生物支架的方法，依次包括如下步驟: (1)將蠶繭脫膠后得到的絲素纖維依次經(jīng)過溶解、過濾、透析和離心后，濃縮至獲得質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為2 %?25 %的絲素蛋白水溶液； (2)采用冰晶模板法制備冰晶/絲素支架； (3)接著通過冷凍干燥去除冰晶/絲素支架中的規(guī)則片層冰晶，獲得具有規(guī)則片層結(jié)構(gòu)的絲素支架，作為規(guī)則片層結(jié)構(gòu)三維生物支架。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種冰晶模板法制備規(guī)則片層結(jié)構(gòu)三維生物支架的方法，其特征在于:所述步驟(2)具體為:將步驟(I)獲得的絲素蛋白水溶液注入支架模具中，將支架模具放置降溫調(diào)節(jié)環(huán)境中，以恒定的降溫速度調(diào)節(jié)進(jìn)行冷凍處理，在常溫?-150°C低溫范圍內(nèi)經(jīng)過I?240分鐘完成降溫冷凍處理，使得絲素蛋白溶液中的冰晶以恒定速度由下往上生長，得到冰凍的冰晶/絲素支架。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種冰晶模板法制備規(guī)則片層結(jié)構(gòu)三維生物支架的方法，其特征在于:所述恒定的降溫速率為0.10C /分鐘?100 °C /分鐘。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種冰晶模板法制備規(guī)則片層結(jié)構(gòu)三維生物支架的方法，其特征在于:將所述支架模具在梯度降溫裝置上面，梯度降溫裝置包括銅棒、加熱線圈、液氮容器和加熱器，銅棒上部纏繞加熱線圈，加熱線圈連接加熱器，通過加熱器給銅棒加熱，銅棒下部置于液氮容器中，所述支架模具放置于銅棒頂端。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種冰晶模板法制備規(guī)則片層結(jié)構(gòu)三維生物支架的方法，其特征在于:所述步驟(I)中的絲素原料采用家蠶絲膠、絲腺蛋白、野蠶絲膠、蜘蛛絲蛋白或重組絲蛋白等絲蛋白，但不限于此。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種冰晶模板法制備規(guī)則片層結(jié)構(gòu)三維生物支架的方法，其特征在于:所述絲素原料替換為其它生物大分子，其它生物大分子為殼聚糖、海藻酸鈉或者膠原等材料。7.—種冰晶模板法制備規(guī)則片層結(jié)構(gòu)三維生物支架的應(yīng)用，其特征在于:采用權(quán)利要求I?6任一所述方法獲得的規(guī)則片層結(jié)構(gòu)三維生物支架用于接種人體纖維細(xì)胞、人體充質(zhì)干細(xì)胞中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61L27/50GK106039400SQ201610370399
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月27日
【發(fā)明人】楊明英, 帥亞俊, 毛傳斌
【申請人】浙江大學(xué)