具有生物活性的角膜修復(fù)植片的制備方法和角膜修復(fù)植片的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有生物活性的角膜修復(fù)植片的制備方法和角膜修復(fù)植片，解決角膜供體缺乏的技術(shù)問題。包括：制備膠原溶脹液；基于所述膠原溶脹液，制備膠原膜；在無菌條件下，以3D打印或涂覆的方式在所述膠原膜表面增加表面功能化改性物質(zhì)，以形成具有生物活性的角膜修復(fù)植片。該表面功能化改性物質(zhì)為由病患自體的去除病變部分的含活性細(xì)胞的角膜基質(zhì)為材料制備而成細(xì)微顆粒，能夠改善高強(qiáng)度膠原膜的生物、生物穩(wěn)定性，改善了角膜的生理功能，使改性后的膠原膜植入病患眼鏡后具有良好的透明性和含水率，在臨床上可以更快的恢復(fù)透明性，具備良好的生物相容性能，為角膜移植受體的角膜細(xì)胞培養(yǎng)提供了良好的支架。
【專利說明】
具有生物活性的角膜修復(fù)植片的制備方法和角膜修復(fù)植片
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于組織工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是涉及一種具有生物活性的角膜修復(fù)植片的制備方法和使用所述制備方法制備的具有生物活性的角膜修復(fù)植片。
【背景技術(shù)】
[0002]角膜為與眼球前壁，是一種透明組織，主要行使屏障和屈光功能。
[0003]由于角膜直接與外界接觸，極易受到機(jī)械外傷、熱灼傷、酸堿侵蝕等，從而引起角膜疾病的發(fā)生，嚴(yán)重者甚至失明。現(xiàn)在角膜盲在全球已經(jīng)是第二位的致盲眼病，全球每年大約有上千萬人因角膜疾病而失明，這其中80%可以通過角膜移植手術(shù)脫盲。
[0004]但是，角膜盲卻因為缺乏角膜供體而無法通過角膜移植手術(shù)脫盲。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本申請?zhí)峁┝艘环N具有生物活性的角膜修復(fù)植片的制備方法和角膜修復(fù)植片，解決角膜供體缺乏的技術(shù)問題。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本申請采用以下技術(shù)方案予以實現(xiàn):
提出一種具有生物活性的角膜修復(fù)植片的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:制備膠原溶脹液;基于所述膠原溶脹液，制備膠原膜;在無菌條件下，以3D打印或涂覆的方式在所述膠原膜表面增加表面功能化改性物質(zhì)，以形成具有生物活性的角膜修復(fù)植片。
[0007]進(jìn)一步的，所述制備膠原溶脹液，具體為:在動物結(jié)蹄組織中用蛋白酶消化法提取膠原蛋白；將提取的膠原蛋白使用0.3%-0.5%的丙二酸溶液溶脹，并混勻離心除去雜質(zhì)，得到膠原溶脹液。
[0008]進(jìn)一步的，所述在動物結(jié)蹄組織中用蛋白酶消化法提取膠原蛋白，具體為:在所述動物結(jié)蹄組織中按重量加入蛋白酶溶液;攪拌后置于恒溫環(huán)境中進(jìn)行設(shè)定時間的蛋白酶解反應(yīng)，期間定時攪拌;在設(shè)定時間后終止酶解反應(yīng);將終止酶解反應(yīng)的動物結(jié)蹄組織使用蒸餾水沖洗并干燥得到膠原蛋白。
[0009]進(jìn)一步的，所述制備膠原膜，具體為:將所述膠原溶脹液通過飽和無機(jī)鹽溶液鹽析濃縮，得到膠原懸浮溶液;將所述膠原懸浮溶液進(jìn)行離心和分離沉淀，得到膠原凝膠;將所述膠原凝膠置入模具后，低溫冷凍進(jìn)行冷凍干燥;將凍干的所述膠原凝膠置于兩個聚四氟乙烯平板之間用平滑物體壓平整成為致密膠原層;將所述壓平整的致密膠原層進(jìn)行交聯(lián)處理得到膠原膜。
[0010]進(jìn)一步的，所述表面功能化改性物質(zhì)的制備步驟包括:將病患自體的去除病變部分的含活性細(xì)胞的角膜基質(zhì)在無菌條件下在培養(yǎng)皿內(nèi)切碎，轉(zhuǎn)移至消毒好的玻璃器皿中，增加膠原酶;將增加了膠原酶的所述切碎的角膜基質(zhì)充分剪碎后，在微?；b置內(nèi)制備成均勻的細(xì)微顆粒;將所述細(xì)微顆粒離心、收集后，加入生物蛋白膠，形成所述表面功能化改性物質(zhì)。
[0011]進(jìn)一步的，所述蛋白酶為濃度為0.01%-0.5%的無花果蛋白酶。
[0012]進(jìn)一步的，所述交聯(lián)處理中使用的交聯(lián)溶液為戊二醛溶液、EDC溶液、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶溶液或環(huán)氧烷基溶液;所述交聯(lián)溶液的質(zhì)量濃度為I.5%_25%。
[0013]進(jìn)一步的，所述細(xì)微顆粒直徑為100-300微米。
[0014]進(jìn)一步的，所述生物蛋白膠的主要成分為纖維蛋白、凝血酶和鈣離子溶液。
[0015]提出一種具有生物活性的角膜修復(fù)植片，按照所述的具有生物活性的角膜修復(fù)植片的制備方法制備而成。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本申請的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:本申請?zhí)岢龅木哂猩锘钚缘慕悄ば迯?fù)植片的制備方法和角膜修復(fù)植片，在提取了膠原溶脹液制備出膠原膜后，采用3D打印或涂覆的方式在膠原膜表面增加表面功能化改性物質(zhì)，該表面功能化改性物質(zhì)為由病患自體的去除病變部分的含活性細(xì)胞的角膜基質(zhì)為材料制備而成細(xì)微顆粒，其在膠原膜表面對膠原膜進(jìn)行表面功能改性，能夠改善高強(qiáng)度膠原膜的物理、生物穩(wěn)定性，具有更高的吸水性、復(fù)水和保水性，改善了角膜的生理功能，使改性后的膠原膜植入病患眼鏡后具有良好的透明性和含水率，在臨床上可以更快的恢復(fù)透明性，具備良好的生物相容性能，為角膜移植受體的角膜細(xì)胞培養(yǎng)提供了良好的支架。在膠原膜制備過程中，通過鹽析、干燥和交聯(lián)等步驟，制得的膠原膜強(qiáng)度高于傳統(tǒng)的膠原蛋白膜，吸水后可自由彎曲和折疊，使得角膜修復(fù)植片具有良好的力學(xué)和機(jī)械性能。由此，能夠為角膜受體提供角膜細(xì)胞生長基質(zhì)實現(xiàn)角膜重建，解決了角膜供體缺乏的技術(shù)問題，角膜盲患者能夠基于本案提供的角膜修復(fù)植片通過角膜移植手術(shù)脫盲。
[0017]結(jié)合附圖閱讀本申請實施方式的詳細(xì)描述后，本申請的其他特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將變得更加清楚。
【附圖說明】
[0018]圖1為本申請?zhí)岢龅木哂猩锘钚缘慕悄ば迯?fù)植片的方法流程圖。
【具體實施方式】
[0019]下面結(jié)合附圖對本申請的【具體實施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。
[0020]本發(fā)明旨在提供一種具有生物活性的角膜修復(fù)植片的制備方法，以及使用所述制備方法制備的具有生物活性的角膜修復(fù)植片，制備的角膜修復(fù)植片是針對角膜盲患者眼角膜細(xì)胞生存繁殖的支架材料，力學(xué)強(qiáng)度高于傳統(tǒng)的膠原蛋白膜，采用患者自體角膜基質(zhì)制備的細(xì)微顆粒對膠原蛋白膜進(jìn)行表面功能改性，能夠改善高強(qiáng)度膠原膜的物理、生物穩(wěn)定性，也改善了角膜的生理功能，使改性后的膠原膜在臨床上可以更快恢復(fù)透明性。
[0021]本發(fā)明提出的具有生物活性的角膜修復(fù)植片的制備方法，如圖1所示，包括以下步驟:
步驟Sll:制備膠原溶脹液。
[0022]具體的，在動物結(jié)蹄組織中用蛋白酶消化法提取出膠原蛋白；然后將提取的膠原蛋白使用0.3%-0.5%的丙二酸溶液溶脹，并混勻離心除去雜質(zhì)，得到膠原溶脹液，放入4°C環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?br>[0023]步驟S12:基于膠原溶脹液，制備膠原膜。
[0024]具體的，將膠原溶脹液通過飽和無機(jī)鹽溶液鹽析濃縮，得到膠原懸浮溶液;將膠原懸浮溶液進(jìn)行離心和分離沉淀，得到含水率小于10%的膠原凝膠;將膠原凝膠置入模具中，低溫冷凍后進(jìn)行冷凍干燥;將凍干的就按凝膠置于兩個聚四氟乙烯平板之間用錕子等平滑物體壓平整成為致密膠原層;最后將致密膠原層進(jìn)行交聯(lián)處理得到膠原膜。
[0025]其中，飽和無機(jī)鹽溶液中的無機(jī)鹽可以為鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽或鎂鹽。
[0026]在交聯(lián)處理中使用的交聯(lián)溶液為戊二醛溶液、EDC溶液、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶溶液或環(huán)氧烷基溶液;交聯(lián)溶液的質(zhì)量濃度為I.5%-25%。
[0027]步驟S13:在無菌條件下，以3D打印或涂覆的方式在所述膠原膜表面增加表面功能化改性物質(zhì)，以形成具有生物活性的角膜修復(fù)植片。
[0028]該表面功能化改性物質(zhì)的制備步驟如下:將病患自體的去除病變部分的含活性細(xì)胞的角膜基質(zhì)在無菌條件下在培養(yǎng)皿內(nèi)切碎，轉(zhuǎn)移至消毒好的玻璃器皿中，增加膠原酶;將增加了膠原酶的所述切碎的角膜基質(zhì)充分剪碎后，在微粒化裝置內(nèi)制備成均勻的細(xì)微顆粒;將所述細(xì)微顆粒離心、收集后，加入生物蛋白膠，形成所述表面功能化改性物質(zhì)。
[0029]這其中，細(xì)微顆粒直徑需要在100微米至300微米之間；生物蛋白膠的主要成分為纖維蛋白、凝血酶和鈣離子溶液等。
[0030]上述，本發(fā)明提出的具有生物活性的角膜修復(fù)植片的制備方法中，在提取了膠原溶脹液制備出膠原膜后，采用3D打印或涂覆的方式在膠原膜表面增加表面功能化改性物質(zhì)，該表面功能化改性物質(zhì)為由病患自體的去除病變部分的含活性細(xì)胞的角膜基質(zhì)為材料制備而成細(xì)微顆粒，其在膠原膜表面對膠原膜進(jìn)行表面功能改性，能夠改善高強(qiáng)度膠原膜的物理、生物穩(wěn)定性，具有更高的吸水性、復(fù)水和保水性，改善了角膜的生理功能，使改性后的膠原膜植入病患眼鏡后具有良好的透明性和含水率，在臨床上可以更快的恢復(fù)透明性，具備良好的生物相容性能為角膜移植受體的角膜細(xì)胞培養(yǎng)提供良好的支架。在膠原膜制備過程中，通過鹽析、干燥和交聯(lián)等步驟，制得的膠原膜強(qiáng)度高于傳統(tǒng)的膠原蛋白膜，吸水后可自由彎曲和折疊，使得角膜修復(fù)植片具有良好的力學(xué)和機(jī)械性能。由此，能夠為角膜受體提供角膜細(xì)胞生長基質(zhì)實現(xiàn)角膜重建，解決了角膜供體缺乏的技術(shù)問題，角膜盲患者能夠基于本案提供的角膜修復(fù)植片通過角膜移植手術(shù)脫盲。
[0031]基于提出的具有生物活性的角膜修復(fù)植片的制備方法，本發(fā)明還提出一種使用所述制備方法制備的具有生物活性的角膜修復(fù)植片。
[0032]下面以一個具體的實施例詳細(xì)說明使用上述的制備方法制備具有生物活性的角膜修復(fù)植片的過程:
1、采用新鮮牛腱為原材料，于去離子水中充分清洗，并去除周圍組織以及筋膜，暴露牛腱，進(jìn)一步洗滌后在冷柜中充分冷凍。
[0033]去除牛腱用切片機(jī)橫向切片，厚度約I毫米，稱重后移入合適容器，按重量加入濃度為0.1%的無花果蛋白酶溶液進(jìn)行酶處理，充分?jǐn)嚢韬笾糜?7±1°的恒溫箱內(nèi)進(jìn)行設(shè)定時間的蛋白酶解反應(yīng)，反應(yīng)期間定時攪拌。
[0034]在設(shè)定時間結(jié)束后加入過量的過氧化氫終止酶解反應(yīng)，并將終止酶解反應(yīng)的牛腱組織使用蒸餾水沖洗3-4次后干燥得到膠原蛋白。
[0035]將得到的膠原蛋白使用0.3%-0.5%的丙二酸溶液溶脹，混勻離心除去雜質(zhì)，得到5g/L的膠原溶脹液。
[0036]2、將濃度為5g/L的膠原溶脹液與飽和氯化鉀溶液混合，不斷攪拌，使得膠原逐漸從膠原溶脹液中沉淀出來。并將該溶液以12000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心分離，清去上清液，收集沉淀的膠原，再擠壓脫水，最終得到固含量約為50mg/L的膠原凝膠。
[0037]將膠原凝膠傾入模具中，低溫冷凍后進(jìn)行冷凍干燥。
[0038]將凍干的膠原凝膠置于兩個聚四氟乙烯平板之間用錕子等平滑物體壓平整使之成為致密膠原層。
[0039]將致密膠原層放入5%EDC溶液中交聯(lián)12小時之后，漂洗去除交聯(lián)劑，晾干得到膠原膜。
[0040]得到的膠原膜強(qiáng)度高于傳統(tǒng)的膠原蛋白膜，吸收后可自由彎曲和折疊，具有良好的力學(xué)和機(jī)械性能。
[0041]3、將患者自體的去除病變部分的含活性細(xì)胞的角膜基質(zhì)在無菌條件下在培養(yǎng)皿中切碎，轉(zhuǎn)移至消毒好的玻璃瓶內(nèi)，加入膠原酶，充分剪碎，在微?；b置中將其制備成均勻的細(xì)微顆粒，顆粒直徑在100-300微米，離心，收集，加入生物蛋白膠，在無菌條件下將微組織化的角膜材料使用3D打印技術(shù)附在膠原膜表面，實現(xiàn)對膠原膜的功能改性;能夠改善高強(qiáng)度膠原膜的物理、生物穩(wěn)定性，具有更高的吸水性、復(fù)水和保水性，改善了角膜的生理功能，使改性后的膠原膜植入病患眼鏡后具有良好的透明性和含水率，在臨床上可以更快的恢復(fù)透明性，具備良好的生物相容性能，為角膜移植受體的角膜細(xì)胞培養(yǎng)提供了良好的支架。
[0042]上述本發(fā)明提出的制備方法采用的工藝步驟不影響膠原本身的分子結(jié)構(gòu)和特性，保持了膠原特有的結(jié)構(gòu)特性，提高了膠原膜的力學(xué)性能，吸水后可自由彎曲和折疊。利用自體角膜基質(zhì)制備的細(xì)微顆粒改性后使膠原膜具有良好的物理、生物穩(wěn)定性，以及具有更高的吸水性、復(fù)水和保水性，植入后具有很好的透明性和含水率，可快速恢復(fù)透明性，為角膜受體提供角膜細(xì)胞生長基質(zhì)來實現(xiàn)角膜重建。
[0043]應(yīng)該指出的是，上述說明并非是對本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不僅限于上述舉例，本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的實質(zhì)范圍內(nèi)所做出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項】
1.具有生物活性的角膜修復(fù)植片的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 制備膠原溶脹液； 基于所述膠原溶脹液，制備膠原膜； 在無菌條件下，以3D打印或涂覆的方式在所述膠原膜表面增加表面功能化改性物質(zhì)，以形成具有生物活性的角膜修復(fù)植片。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有生物活性的角膜修復(fù)植片的制備方法，其特征在于，所述制備膠原溶脹液，具體為: 在動物結(jié)蹄組織中用蛋白酶消化法提取膠原蛋白； 將提取的膠原蛋白使用0.3%-0.5%的丙二酸溶液溶脹，并混勻離心除去雜質(zhì)，得到膠原溶脹液。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有生物活性的角膜修復(fù)植片的制備方法，其特征在于，所述在動物結(jié)蹄組織中用蛋白酶消化法提取膠原蛋白，具體為: 在所述動物結(jié)蹄組織中按重量加入蛋白酶溶液； 攪拌后置于恒溫環(huán)境中進(jìn)行設(shè)定時間的蛋白酶解反應(yīng)，期間定時攪拌； 在設(shè)定時間后終止酶解反應(yīng)； 將終止酶解反應(yīng)的動物結(jié)蹄組織使用蒸餾水沖洗并干燥得到膠原蛋白。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有生物活性的角膜修復(fù)植片的制備方法，其特征在于，所述制備膠原膜，具體為: 將所述膠原溶脹液通過飽和無機(jī)鹽溶液鹽析濃縮，得到膠原懸浮溶液； 將所述膠原懸浮溶液進(jìn)行離心和分離沉淀，得到膠原凝膠； 將所述膠原凝膠置入模具后，低溫冷凍進(jìn)行冷凍干燥； 將凍干的所述膠原凝膠置于兩個聚四氟乙烯平板之間用平滑物體壓平整成為致密膠原層； 將所述壓平整的致密膠原層進(jìn)行交聯(lián)處理得到膠原膜。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有生物活性的角膜修復(fù)植片的制備方法，其特征在于，所述表面功能化改性物質(zhì)的制備步驟包括: 將病患自體的去除病變部分的含活性細(xì)胞的角膜基質(zhì)在無菌條件下在培養(yǎng)皿內(nèi)切碎，轉(zhuǎn)移至消毒好的玻璃器皿中，增加膠原酶； 將增加了膠原酶的所述切碎的角膜基質(zhì)充分剪碎后，在微?；b置內(nèi)制備成均勻的細(xì)微顆粒； 將所述細(xì)微顆粒離心、收集后，加入生物蛋白膠，形成所述表面功能化改性物質(zhì)。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有生物活性的角膜修復(fù)植片的制備方法，其特征在于，所述蛋白酶為濃度為0.01%-0.5%的無花果蛋白酶。7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的具有生物活性的角膜修復(fù)植片的制備方法，其特征在于，所述交聯(lián)處理中使用的交聯(lián)溶液為戊二醛溶液、EDC溶液、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶溶液或環(huán)氧烷基溶液;所述交聯(lián)溶液的質(zhì)量濃度為1.5%-25%。8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的具有生物活性的角膜修復(fù)植片的制備方法，其特征在于，所述細(xì)微顆粒直徑為100-300微米。9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的具有生物活性的角膜修復(fù)植片的制備方法，其特征在于，所述生物蛋白膠的主要成分為纖維蛋白、凝血酶和鈣離子溶液。10.一種具有生物活性的角膜修復(fù)植片，其特征在于，按照如權(quán)利要求1-9任一項所述的具有生物活性的角膜修復(fù)植片的制備方法制備而成。
【文檔編號】A61L27/24GK106039403SQ201610557778
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月15日
【發(fā)明人】王紅, 張楠, 陳靜
【申請人】青島三帝生物科技有限公司