寡肽以及生產(chǎn)寡肽綴合物的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及寡肽及其綴合物。本發(fā)明還涉及這些寡肽綴合物用于治療或診斷由淀粉樣蛋白β沉積所介導(dǎo)的疾病的用途。最后，本發(fā)明還涉及用于獲得偶聯(lián)有興趣物質(zhì)的寡肽(功能性綴合物)的偶聯(lián)方法。CNCM I-481820131112CNCM I-481920131112
【專利說明】
寡肽以及生產(chǎn)寡肽綴合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及針對(duì)淀粉樣蛋白β的抗體及其綴合物。本發(fā)明還涉及這些抗體綴合物 治療或者診斷由淀粉樣蛋白β沉積所介導(dǎo)的疾病的用途。最后，本發(fā)明還涉及獲得偶聯(lián)有感 興趣的物質(zhì)的VHH(功能綴合物)的偶聯(lián)方法，以及更通常地，涉及偶聯(lián)有感興趣的物質(zhì)的寡 肽。
[0002] 所有癡呆癥病例的約70%是由于阿爾茨海默氏病(AD)，它與對(duì)認(rèn)知重要的腦區(qū)和 神經(jīng)回路的選擇性損傷相關(guān)。阿爾茨海默氏病的特征是神經(jīng)纖維纏結(jié)，尤其是在海馬的錐 體神經(jīng)元中，以及大量的主要含有淀粉樣蛋白沉積的致密核心和漫射暈的淀粉樣蛋白斑 塊。
[0003] 細(xì)胞外神經(jīng)炎性斑塊含有大量占主要地位的纖維狀肽稱為"淀粉樣蛋白β"、"Α-β"、"淀粉樣蛋白 Ρ"、"ΑΡ4"、"Αβ"、"M4"、"Ρ-Α4" 或者 "ΑΡ" ；參見 Selk〇e( 1994)， Ann.Rev.Cell Bi〇1.10,373-403;K〇〇(1999)，PNAS 96卷，pp.9989-9990;US 4,666,829或 者Glenner(1984)，BBRC 12，1131。這種β淀粉樣蛋白源自"阿爾茨海默前體蛋白/β-淀粉樣 蛋白前體蛋白YAPPhAPP是完整的膜糖蛋白（參見Sisodia(1992)PNAS卷89，ρρ·6075)并且 通過質(zhì)膜蛋白酶α分泌酶在Αβ序列內(nèi)被內(nèi)蛋白水解(endoproteolytically)切割。其它分泌 酶活性，特別是β分泌酶和γ分泌酶活性導(dǎo)致淀粉樣蛋白β的胞外釋放，其中包含不同大小 的蛋白，比如39個(gè)氨基酸(Αβ39)、40個(gè)氨基酸(ΑΜ0)、42個(gè)氨基酸(ΑΜ2)或43個(gè)氨基酸(Αβ 43);參見Sinha( 1999)，PNAS 96,11094-1053;Price( 1998)，Science 282,1078-1083;TO 00/72880或者Hardy(1997)，TINS 20，154。注意到Αβ具有若干天然存在的形式，由此人的形 式被稱為上述的如39)04〇^041)042和邠43。形式如42具有氨基酸序列（從~端開始） ： DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQ ID Ν0.12)。在Αβ41、Αβ40、Αβ39中， 分別缺失C端氨基酸Α、ΙΑ和VIA。在ΑΜ3的形成中，額外的蘇氨酸殘基被包含在上述序列的C 端(SEQ ID N0.12KAPP基因的突變可導(dǎo)致Αβ序列的修飾和聚集的Αβ積累增加。
[0004] 這些細(xì)胞外神經(jīng)炎斑塊的主要成分是水溶形式的Αβ40或者AM2。然而，最初的焦 點(diǎn)在于將水不溶的纖維狀淀粉樣蛋白作為AD病理學(xué)的中心結(jié)構(gòu)，這在過去15年中得以發(fā) 展。這是由于幾個(gè)突出的發(fā)現(xiàn)，比如，在人類大腦中發(fā)現(xiàn)寡聚Αβ的水溶性級(jí)分(Kuo Υ.Μ.等 人，1996,J Biol Chem，271,4077-81)。這些分離的可溶性寡聚物對(duì)培養(yǎng)的神經(jīng)元是有毒 的。然后，確認(rèn)了寡聚仙的存在和毒性，并提出了這些結(jié)構(gòu)的名稱ADDL(Ai3衍生的擴(kuò)散配體） (Lambert M.P.等人，1998，Proc Natl Acad Sci U.S.A. ,95,6448-53)。根據(jù)條件，ADDL組 合物可以主要包含三聚體-六聚體，較大的結(jié)構(gòu)高達(dá)24聚體。ADDL顯示重要的區(qū)域選擇性神 經(jīng)毒性，幸免了小腦中的神經(jīng)元，而選擇性殺死海馬CA1區(qū)和內(nèi)嗅皮質(zhì)的神經(jīng)元（Klein W. L.等人，2001，Trends in Neurosciences，24，219-224)。此外，寡聚物能夠在大鼠體內(nèi) (Walsh D.M.等人，2002，Nature,416,535-9)以及在海馬切片中（Wang H.W.等人，2002， Brain Res.，924，133-40;Wang Q.等人，2004，J Neurosci. ,24,3370-8)抑制海馬的長時(shí)程 增強(qiáng)(LTP)。已經(jīng)表明，認(rèn)知缺陷直接歸因于少量可溶寡聚形式的淀粉樣蛋白β;三聚體，以 及在更小的程度上，二聚體和四聚體尤其活躍(Cleary J.P.等人，2005，Nat Neurosc.，8， 79-84;Townsend Μ·等人，2006，J Physiol,572,477-92)。
[0005] 在阿爾茨海默氏病發(fā)作之前很長一段時(shí)間（最長30年)就已出現(xiàn)淀粉樣蛋白斑塊 (Sperling R.A.,2011,Alzheimer's and Dementia,7:280-92；Villemagne V.L.,2013, Lancet Neurol. ,12:357-67)并且根據(jù)淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說，淀粉樣蛋白負(fù)責(zé)導(dǎo)致AD所有 損害的事件的級(jí)聯(lián)(Hardy J.A.，1992,Science,256:184-5)。因而，淀粉樣蛋白的早期檢測(cè) 對(duì)于阿爾茨海默氏病的隨訪及其治療是重要的。淀粉樣蛋白斑塊的成像對(duì)在動(dòng)物模型中篩 選新藥也是重要的。
[0006] 淀粉樣蛋白沉積也和血管病變(淀粉樣蛋白血管病)有關(guān)。在其它疾病例如唐氏綜 合征的過程中，淀粉樣蛋白以類似的形式積累。
[0007] 已開發(fā)幾種方法用以檢測(cè)淀粉樣蛋白疾病的病變，特別是阿爾茨海默氏病。迄今 為止，在人體中，應(yīng)用最廣泛的方法是基于正電子發(fā)射斷層掃描(PET)成像。例如，可以在患 者體內(nèi)評(píng)價(jià)淀粉樣蛋白的負(fù)荷，但在動(dòng)物中使用PET放射性配體如 nC-PIB(Klunk W.E.， 2004，Ann Neurol·,55:306-19)或 18F-AV_45(Doraiswamy P.M.，2012，Neurology，79:1636-44)則更加困難。對(duì)化合物進(jìn)行放射性標(biāo)記的需要是基于PET的方法的主要缺點(diǎn)。在人類中， 這會(huì)導(dǎo)致暴露于電離輻射。在臨床前研究中，因?yàn)橹挥杏邢迶?shù)量的中心允許操縱放射性化 合物，PET檢查不能用于新藥大規(guī)模的評(píng)估和用于常規(guī)診斷。此外，同位素如 nC(20分鐘）的 半衰期短，當(dāng)使用基于nC的配體比如PIB時(shí)，需要在現(xiàn)場(chǎng)有一個(gè)回旋加速器?；?18F的配體 具有更長的半衰期（110分鐘），但這種半衰期仍然相對(duì)較短。這需要強(qiáng)大的有關(guān)放射性示蹤 物的供應(yīng)、處理和管理后勤，放射性示蹤物的保質(zhì)期有限，需要謹(jǐn)慎的部署。此外，PET成像 分辨率低，妨礙其在小的腦尺寸AD動(dòng)物模型中用于常規(guī)臨床前研究中的應(yīng)用。綜上所述，可 以說，應(yīng)找到在患者和在疾病的動(dòng)物模型中在體內(nèi)AD和唐氏綜合征腦部病變中沒有延遲成 像的新替代物。
[0008] 除了 PET成像，核磁共振(匪R)成像或者磁共振成像(MRI)也可用于檢測(cè)AD腦病變。 在過去十年中，已經(jīng)做了很多努力來開發(fā)能夠通過MRI進(jìn)行斑塊檢測(cè)的新方法。無造影劑的 規(guī)程允許觀察淀粉樣蛋白斑塊內(nèi)由于循環(huán)鐵自然發(fā)生的沉積而導(dǎo)致的一些Αβ沉積。然而， 在淀粉樣蛋白沉積中的鐵積累在人體中較低(Dhenain Μ. ,2002,匪R Biomed. ,15:197-203)，并且只發(fā)生在疾病晚期階段或者小鼠局灶性腦區(qū)（Dhenain M.，2009，Neur〇bi〇l Aging 30:41-53)。有幾個(gè)規(guī)程都是基于采用特定的造影劑。比如，一些小組開發(fā)了使用Αβ 衍生肽的造影劑，其磁性標(biāo)記有IL(Gd)或單晶娃鐵氧化物納米顆粒(ΜΙ0Ν) (Wadghiri， Y.Z.,2003,Magn Reson Med.,50:293-302；Poduslo,J.F.,2002,Neurobiol Dis.,11:315-329)。用這些方法已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了離體和體內(nèi)檢測(cè)，但仍需要穿透血腦屏障(BBB)，不能以高效 且再現(xiàn)的形式進(jìn)行，并且可能是有害的（例如，使用甘露醇瞬時(shí)打開血腦屏障）。因此，這些 方法受到必須打開血腦屏障的困擾，因此未在非實(shí)驗(yàn)的情況下使用過。借助靶向淀粉樣蛋 白斑塊的抗體，其它小組開發(fā)的方法革巴向淀粉樣蛋白（Ramakrishnan，M.，2008，Pharm Res. ,25:1861-1872)。最近通過MRI檢測(cè)淀粉樣蛋白斑塊的方法基于使用小抗體片段，其中 的小抗體片段展示出增加的穿過BBB的潛能（多胺修飾的Fab片段)并且靶向淀粉樣蛋白斑 塊。這些抗體連接至造影團(tuán)（contrastophore)，從而允許通過MRI對(duì)其檢測(cè)(Ramakrishnan， Μ.，2008，Pharm Res .，25:1861-1872)。然而，抗體像其它大的血漿蛋白一樣，如白蛋白，不 容易穿過BBB，其通常保持只局限于循環(huán)的血漿部分中。增強(qiáng)抗體分子穿過BBB的遞送的一 個(gè)潛在機(jī)制是陽離子化，其中表面的羧基綴合有伯氨基，而抗體的等電點(diǎn)（Pi)被提高 (Bickel U等人，2001，Adv Drug Deliv Rev. ,46:247-279)。陽離子化的蛋白的正電荷結(jié)合 細(xì)胞表面上的負(fù)電荷，并且這種相互作用觸發(fā)陽離子化的蛋白通過吸收介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn) 入細(xì)胞。相對(duì)于免疫球蛋白的陽離子化，最近的研究已經(jīng)表明，在體外通過分離的腦毛細(xì)血 管，這種過程導(dǎo)致增強(qiáng)的吸收介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，以及在體內(nèi)，這種內(nèi)吞作用過程導(dǎo)致陽離子 化IgG進(jìn)入腦的凈轉(zhuǎn)胞吞作用。陽離子化抗體應(yīng)用的主要限制是其抗原結(jié)合性能的下降。實(shí) 際上，陽離子化的單克隆抗體的親和性受到影響，因?yàn)橥ǔ⑴c抗原結(jié)合的精氨酸和賴氨 酸由陽離子化處理而被修飾（Triguero D.等人，1991，J Pharmacol Exp Ther.258:186_ 192)〇
[0009] 常規(guī)的免疫球蛋白是異四聚體，由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，組合分子量約 150kDa。在胳胳盤科(Came 1 idae)成員中，相當(dāng)比例的血清抗體是同源二聚體IgG，分子量約 80kD(Hamers_Casterman C.等人，1993，Nature，363:446-448)。這些重鏈免疫球蛋白（Ig) 包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域，其可變區(qū)被稱為VHH。重組VHH(約12至14kD的尺寸）構(gòu)成完整的抗原結(jié)合 結(jié)構(gòu)域并顯示出廣闊的抗原結(jié)合譜。擴(kuò)大它們的高變區(qū)，并表現(xiàn)出獨(dú)特的特性，如三至四個(gè) (與常規(guī)抗體I相互作用的)疏水框架殘基被更多親水性氨基酸取代。為了穩(wěn)定擴(kuò)大的CDR， 除了常規(guī)的二硫鍵以外，在單峰駱駝⑶R1和⑶R3之間，在美洲駝的⑶R2和⑶R3之間，VHH可 具有額外的二硫鍵（（Harmsen，M.M和De Haard H.J.，2007，Appl Microbiol Biotechnol·， 77:13-22;Muyldermans S.，2001，J Biotechnol. ,74:277-302)。擴(kuò)展的CDR3環(huán)可以采取凸 面構(gòu)象，而常規(guī)的互補(bǔ)位被限制在凹的或者平面結(jié)構(gòu)（Muyldermans S. ,2001，J Biotechnol.，74: 277-302)。這些特征允許VHH識(shí)別對(duì)于常規(guī)抗體而言免疫原性較差的獨(dú)特 表位（Lafaye P.等人，2009，Mol Immuno. ,46 :695-704 ;Wernery U·，2001，J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health. ,48:561-568)。盡管VHH被定義為單價(jià)抗體，默認(rèn)排除任 何親合力效果，然而測(cè)量的其體外生物活性如IC5Q，可類似于常規(guī)的二價(jià)抗體分子(Thys B. 等人，2010，Anti viral Research. ,87:257-264) 〇
[0010] 有人提議，同源二聚體VHH提供了體內(nèi)免疫診斷的新前景。已經(jīng)描述了如噬菌體展 示的方法從免疫的駱駝或者美洲駝的VHH庫中選擇抗原特異性VffiLVHH基因克隆至噬菌體 展示載體中，通過篩選獲得抗原結(jié)合物，選擇的VHH在細(xì)菌中表達(dá)。與常規(guī)抗體片段(Fab或 者scFv)相比，重組VHH具有許多優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)橹豢寺×艘粋€(gè)結(jié)構(gòu)域，且因?yàn)檫@些VHH表達(dá)良好， 高度溶于水性環(huán)境并且在高溫下是穩(wěn)定的。由于VHH的尺寸小，約12-14kDa，它們迅速通過 腎臟過濾，腎臟過濾的截?cái)嘀导s60kDa，導(dǎo)致在血液中快速清除。此外，小尺寸導(dǎo)致快速的組 織穿透。VHH血清半衰期短，約2小時(shí)，相較于scFv的4h和IgG的50h而言，這對(duì)于使用成像的 體內(nèi)診斷而言是有利的，并且有利于偶聯(lián)至感興趣物質(zhì)的VHH進(jìn)行靶向從而用于治療疾病， 因?yàn)槿藗兛梢灶A(yù)期非特異結(jié)合的VHH將從組織中迅速消除。
[0011] Li T.等人（2012，F(xiàn)aseb J. ,26:3969-3979)獲得針對(duì)GFAP(-種特異于星形細(xì)胞 的中間絲蛋白）的VHH。在活的小鼠中采用頸動(dòng)脈內(nèi)注射，作者證實(shí)這些天然VHH發(fā)揮"轉(zhuǎn)換 體(transbody)"的作用，因?yàn)樗鼈兲烊坏啬軌虼┻^BBB而在腦組織中的擴(kuò)散，滲透到星形細(xì) 胞中，并特異性結(jié)合GFAP表位(又參見國際申請(qǐng)W0 2010/004432)。
[00?2] 更一般地，具有至少8.5等電點(diǎn)的VHH能夠通過微胞飲作用(micropinocytosis)和 吸收介導(dǎo)的內(nèi)吞作用而迀移穿過BBB。這樣的VHH可用于肽載體的制備將感興趣的物質(zhì)遞送 穿過哺乳動(dòng)物血腦屏障（國際申請(qǐng)WO 2009/004495和WO 2010/004432)。
[0013] 國際申請(qǐng)W0 2004/044204公開了能夠在體外特異性結(jié)合淀粉樣蛋白β肽42(AM2) 的駱駱駝科單鏈抗體(VHH)可變片段的文庫制備。已經(jīng)通過用AM2免疫羊駝Lama pacos而 獲得這些VHH。這些VHH當(dāng)中，已經(jīng)描述了一個(gè)特定的VHH，稱為VHH V31-1，通過ELI SA特異性 識(shí)別纖維狀形式的AM2肽(AM2)的羧基端，以及通過免疫組織化學(xué)識(shí)別神經(jīng)元內(nèi)AM2沉 積。然而，在國際申請(qǐng)W0 2009/004494中，W0 2004/044204的發(fā)明人已清楚地通過免疫組織 化學(xué)顯示，不同于W0 2004/044204中描述的，VHH V31-1不識(shí)別水溶纖維狀形式的AM2,但 特異性識(shí)別AM2的水溶性低分子量寡聚物（即，單_、二_、四-和十二聚體）（還參見Lafaye Ρ·等人，2009，M〇1 Immunol. ,46:695-704)。在國際申請(qǐng) W0 2009/004494 中，W0 2004/ 044204的發(fā)明人進(jìn)一步研究W0 2004/044204中公開的兩種VHH，即VHH 61-3和VHH L1-3。他 們通過免疫組織化學(xué)顯示，染色的AD腦組織切片顯示非常微弱的神經(jīng)元內(nèi)對(duì)VHH 61-3的免 疫反應(yīng)，對(duì)VHH L1-3無法檢測(cè)到神經(jīng)元內(nèi)的免疫反應(yīng)。
[0014] Rutgers K.S.等人（2011，Neurobio 1 .Aging，32:1774-83)報(bào)道，通過菌體展不 從未免疫的和免疫的庫中篩選特異于淀粉樣蛋白β的8個(gè)美洲駝來源的重鏈抗體片段 (VHH)，通過噬菌體ELISA、免疫組織化學(xué)和表面等離子體共振確定其對(duì)淀粉樣蛋白β的親和 性和特異性。作者表明在體外8個(gè)VHH識(shí)別不同的淀粉樣蛋白β表位，這與不同的免疫原相一 致。作者還表明，這些VHH中的三個(gè)識(shí)別血管的和實(shí)質(zhì)的（parenchymal)淀粉樣蛋白β沉積， 而剩下的5個(gè)VHH特異性識(shí)別血管的淀粉樣蛋白β(未結(jié)合到實(shí)質(zhì)的淀粉樣蛋白β)。作者認(rèn) 為，血管的和實(shí)質(zhì)的淀粉樣蛋白β沉積在表位的存在/可用性方面是異質(zhì)的 (heterogeneous)，并且特異于淀粉樣蛋白β的VHH可以用作體內(nèi)成像的試劑來區(qū)分血管的 及實(shí)質(zhì)的淀粉樣蛋白β沉積。
[0015] Nabuurs R.J.A.等人（2012年，PLoS 0ne，7:e38284)進(jìn)一步在體內(nèi)表征了Rutgers 等人公開的兩種VHH，即VHH ni3A和pa2H。作者發(fā)現(xiàn)，和Rutgers等人報(bào)道相反的是兩種VHH 對(duì)實(shí)質(zhì)的和血管淀粉樣蛋白β沉積均顯示親和性。事實(shí)上，Rutgers K.S等人報(bào)道在人體組 織上進(jìn)行的免疫組織化學(xué)中ni3A特異性地僅僅靶向血管淀粉樣蛋白^Nabuurs R.J.A.等 人進(jìn)一步報(bào)道，對(duì)于用于體內(nèi)成像而言，VHH ni 3A和pa2H的腦攝取太低。
[0016] 因此，需要提供通過體內(nèi)神經(jīng)成像來診斷淀粉樣蛋白β沉積介導(dǎo)的疾病特別是阿 爾茨海默氏病和唐氏綜合征、以及監(jiān)測(cè)這類疾病的疾病進(jìn)展的手段和方法。也有必要提供 用于治療這些疾病的手段和方法。
[0017] 在產(chǎn)生本發(fā)明的研究框架內(nèi)，本發(fā)明人用AM2免疫羊駝。他們已獲得稱為R3VQ和 R3VE的兩種VHH。R3VQ和R3VE分別具有氨基酸序列SEQIDN0.4和SEQIDN0.5，兩種均包含 氨基酸序列SEQ ID Ν0.1所示的CDR1 (互補(bǔ)決定區(qū)1)、氨基酸序列SEQ ID勵(lì).2所示的0?2 和氨基酸序列SEQ ID N0.3所示的CDR3。R3VQ和R3VE相差僅一個(gè)第7位的氨基酸序列:R3VQ 和R3VE的殘基7分別是谷氨酰胺(Q)和谷氨酸(EhVHH R3VQ和R3VE氨基酸序列的前三個(gè)氨 基酸殘基(M-A-E)和最后兩個(gè)氨基酸殘基(S-S)可以被刪除，而不改變這些VHH的性質(zhì)。缺乏 這些氨基酸殘基的VHH R3VQ和R3VE被無差別分別稱為R3VQ和R3VEA3VQ和R3VE具有類似的 性質(zhì)。
[0018] 當(dāng)體外通過ELISA和免疫組織化學(xué)評(píng)估時(shí)，R3VQ和R3VE對(duì)Αβ有相似的結(jié)合特性。 VHH R3VQ能夠特異性識(shí)別淀粉樣蛋白邱勺纖維狀形式，但不識(shí)別寡聚（即，非-纖維)形式。采 用免疫組織化學(xué)技術(shù)，發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)這種VHH(以及VHH R3VE)特異性地標(biāo)記存在于人AD腦 組織樣本以及來自攜帶淀粉樣蛋白沉積的專用小鼠模型的腦切片中的淀粉樣蛋白斑塊。 [0019] VHH R3VQ也能在體內(nèi)穿過哺乳動(dòng)物未被破壞(non-compromised)的血腦屏障。 [0020] 此外，按照以下兩種策略，將VHH R3VQ綴合至感興趣的物質(zhì)，如MRI造影劑和螯合 劑：
[0021] -第一個(gè)策略是利用非位點(diǎn)特異性的方法，并且包括螯合劑和根據(jù)本發(fā)明的VHH或 者VHH衍生物的賴氨酸殘基的綴合步驟，其中螯合劑如1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7， 10-四乙酸(D0TA)，隨后是將獲得的配體和感興趣的物質(zhì)進(jìn)行螯合的步驟，其中感興趣的物 質(zhì)如MRI造影劑、如順磁劑釓(Gd)。當(dāng)通過IHC和MRI體內(nèi)評(píng)估時(shí)，R3VQ-N-(DOTA/Gd)η '綴合 物(圖9，化合物2)能夠識(shí)別腦室內(nèi)注射后小鼠中的淀粉樣蛋白斑塊。
[0022] -第二個(gè)策略是使用位點(diǎn)特異性的方法，其涉及通過硫代加成，用攜帶感興趣的物 質(zhì)的巰基反應(yīng)性化合物對(duì)VHH R3VQ進(jìn)行綴合(綴合步驟），更一般地是對(duì)在C-或Ν端包含半 胱氨酸殘基的任何VHH進(jìn)行標(biāo)記，其中攜帶感興趣的物質(zhì)的巰基反應(yīng)性化合物優(yōu)選為攜帶 感興趣的物質(zhì)的馬來酰亞胺化合物。
[0023]非位點(diǎn)特異性綴合需要初始緩沖液的交換，而R3VQ-SH 3與馬來酰亞氨基(D0TA/ Gd)3 4之間的位點(diǎn)特異性綴合可以直接在PBS/氯化鈉/咪唑緩沖中實(shí)施。在溫和的條件可 以有效控制半胱氨酸上的特異性硫代加成，所述策略允許減少反應(yīng)的步驟數(shù)并改進(jìn)工藝的 總產(chǎn)率，而沒有A.Papini等人Int.J.Pept.Protein Res. ,1992,39,348-355;B.Rudolf等 人，J.Organomet · Chem，1996，522,313-315 ;J.Paulech 等人，Biochim.Biophys .Acta, 2013， 1834,372-379中先前提到的任何潛在副反應(yīng)。因而，令人驚訝地，以如此顯著的方式改善了 總產(chǎn)率，而在VHH賴氨酸或組氨酸上沒有任何副反應(yīng)，并且整體保持了 VHH的功能和三維結(jié) 構(gòu)。
[0024] 重組蛋白經(jīng)常和His-標(biāo)簽一起表達(dá)，His-標(biāo)簽允許通過固定化金屬親和性色譜 (IMAC)將其純化。當(dāng)使用Ni2+次氮基三乙酸樹脂時(shí)，它們通常在含有500mM咪唑的PBS緩沖液 中被洗脫。在非位點(diǎn)特異性的方法中（圖9A)，咪唑的氮可以促進(jìn)NHS酯的水解（即降解反應(yīng) 物），并由此干擾綴合（G.T.Hermanson, Biocon jugate Techniques，Academic Press ,2013; P.Cuatrecasas等人，Biochemistry，1972，11,2291-2299)。因此，緩沖液交換步驟必須包括 在上游親和性純化和綴合之間的過程中從而除去咪唑?？偖a(chǎn)率范圍從60至67 %。還在緩沖 液交換（圖9B，方法1)之后進(jìn)行第一位點(diǎn)特異性實(shí)驗(yàn)（圖9B)，以70%的產(chǎn)率產(chǎn)生綴合物 R3VQ-S-(D0TA/Gd)3 5。如以前幾個(gè)小組所報(bào)道的，其中顯示了組氨酸側(cè)鏈烷基化，預(yù)期咪 P坐和馬來酰亞胺基團(tuán)之間副反應(yīng)(A.Papini等人;B.Rudolf等人;J.Paulech等人）。盡管如 此，在親和柱洗脫緩沖液中馬來酰亞胺(D0TA/Gd) 3 4可直接綴合至R3VQ-SH VHH 3(圖9B， 方法2)，馬來酰亞胺試劑的過量有限，盡管咪唑過量很多摩爾。這第二個(gè)策略給出83%的總 產(chǎn)率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0025]因此，本發(fā)明提供一種針對(duì)淀粉樣蛋白辟千維狀形式的分離的駱駱駝科重鏈抗體 的可變結(jié)構(gòu)域(稱為VHH)，特征在于其氨基酸序列從N端到C端包含氨基酸序列SEQ ID NO. 1 (對(duì)應(yīng)著CDR1)、氨基酸序列SEQIDN0.2(對(duì)應(yīng)著CDR2)以及氨基酸序列SEQIDN0.3(對(duì)應(yīng) 著CDR3)〇
[0026] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述VHH包含選自以下的氨基酸序列或者由選自以下 的氨基酸序列組成：
[0027] -SEQ ID從).4，對(duì)應(yīng)1?3￥〇的全長形式，
[0028] -SEQ ID N0·5，對(duì)應(yīng)R3VE的全長形式，
[0029] -SEQ ID從).6，對(duì)應(yīng)1?3￥〇的短形式，以及
[0030] -SEQ ID N0·7，對(duì)應(yīng)R3VE的短形式，
[0031] 優(yōu)選地，選自SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6。
[0032] 如此處所用，術(shù)語"分離的"涉及VHH，其已經(jīng)從它的天然環(huán)境中分離出來。在一些 實(shí)施方式中，例如通過電泳(如，SDS-PAGE、等電聚焦（IEF)、毛細(xì)管電泳)或色譜(如，凝膠過 濾、離子交換或者反相HPLC)所確定的，VHH被純化至高于95%或者99%的純度。針對(duì)綜述抗 體純度評(píng)價(jià)的方法，參見例如Flatman等人，2007，J · Chromatogr · B 848:79-87。
[0033] 如此處所用，術(shù)語"VHH"涉及來自駱駝科(駱駝、單峰駱駝、美洲駝、羊駝等)重鏈抗 體的可變抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(參見Nguyen V.K.等人，2000，The EMBO Journal，19,921-930; ]\11171(161'1]1&118 3.，2001，了13;[(^6(3111101.，74,277-302以及綜述￥&111&11(18(3110(^?.等人， 2011，Antiviral Research 92，389-407) dVHH也可稱為納米抗體(Nanobody) (Nb) 0
[0034] 有利的是，根據(jù)本發(fā)明的VHH具有堿性的等電點(diǎn)，優(yōu)選8.5至9.5。
[0035] 本發(fā)明包括如上述所限定的天然、重組或合成的VHH。
[0036] 如此處所用，術(shù)語"重組"涉及采用遺傳工程的方法(克隆、擴(kuò)增)來生產(chǎn)所述VHH。
[0037] 如此處所用，術(shù)語"合成"涉及通過體外化學(xué)的或者酶促的合成來生產(chǎn)所述VHH。 [0038]根據(jù)本發(fā)明的VHH能夠是單體的形式或者同源多聚體的形式，如同源二聚體或同 源三聚體。
[0039] 本發(fā)明還提供一種分離的駱駱駝科血清，優(yōu)選羊駝血清，其包含根據(jù)本發(fā)明的 VHH〇
[0040] 本發(fā)明還提供式P-C-Z或者Z-C-P所示的寡肽，優(yōu)選P-C-Z，其中：
[0041 ] -P是8至800個(gè)氨基酸的肽，所述P不含有還原的半胱氨酸殘基，
[0042] -C是半胱氨酸殘基，
[0043] -Z代表1至10個(gè)氨基酸的間隔序列，優(yōu)選1至10個(gè)中性的或帶負(fù)電的氨基酸的間隔 序列，其中Z的氨基酸殘基是相同的或不同的，并且其中Z不含半胱氨酸殘基，
[0044] 所述半胱氨酸殘基C通過式（I)所示的帶有所述感興趣物質(zhì)的馬來酰亞胺化合物 連接至感興趣的物質(zhì)：
[0045]
[0046] 其中：
[0047] 3、8'1、8'2和礦是相同的或不同的，其各自獨(dú)立地是選自以下的單鍵或間隔序列 ： 多元醇，比如聚乙二醇(PEG)，其優(yōu)選具有2至12個(gè)氧乙烯(0E)單元;聚烯烴，其優(yōu)選具有2至 12個(gè)芳香環(huán);聚烷基，其優(yōu)選具有2至12個(gè)碳原子；乙烯基聚合物，比如聚（甲基丙烯酸烷基 酯），其優(yōu)選具有2至12個(gè)甲基丙烯酸基團(tuán)；聚醛，其優(yōu)選具有2至12個(gè)羰基;聚酸酯，其優(yōu)選 具有2至12個(gè)酯基，
[0048] _D、D'和D"是相同的或不同的，其各自獨(dú)立地是選自胺、酰胺、氨基醇、尿素、硫脲、 氨基甲酸酯、碳酸酯、酯、醚、硫醚、芳基、雜芳基、肟基，
[0049] -A是單鍵或者螯合劑，
[0050] -SI是感興趣的物質(zhì)，
[0051] -X'是酸、胺、酰胺、酯、醚、烷基、烯基、炔基、芳基或者雜芳基，以及
[0052] -]1 = 1至100，優(yōu)選地11 = 1、2或者3。
[0053]在本發(fā)明的意義之內(nèi)：
[0054]-烷基選自（Ci-Cu)烷基，并且優(yōu)選(Q-C6)烷基，比如甲基、乙基、η-丙基、異丙基、 η-丁基、仲丁基、叔丁基和異丁基自由基；
[0055]-烯基選自2至12個(gè)優(yōu)選2至6個(gè)碳原子的烴鏈，有至少一個(gè)碳碳雙鍵。烯基的示例 包括乙烯、丙烯、異丙烯、2,4_戊二烯；
[0056]-炔基選自2至12個(gè)優(yōu)選2至6個(gè)碳原子的烴鏈，有至少一個(gè)碳碳三鍵；
[0057]-芳基表示衍生自至少一個(gè)簡(jiǎn)單芳香環(huán)的任何官能團(tuán)或者取代基;芳香環(huán)對(duì)應(yīng)著 具有離域η系統(tǒng)的任何平面環(huán)形化合物，在所述離域η系統(tǒng)中環(huán)的每一個(gè)原子包括Ρ軌道，所 述Ρ軌道彼此重疊。更具體地說，術(shù)語芳基包括但不限于苯、聯(lián)苯、1-萘、2-萘、蒽基、芘基、及 其取代的形式。本發(fā)明的芳基優(yōu)選地包括4至12個(gè)碳原子，更優(yōu)選地5或者6個(gè)碳原子；
[0058]-雜芳基表示衍生自至少一個(gè)如上限定的芳香環(huán)的任何官能團(tuán)或者取代基，并且 含有選自P、s、0和Ν的至少一個(gè)雜原子。術(shù)語雜芳基包括但不限于呋喃、吡啶、吡咯、噻吩、咪 唑、吡唑、噁唑、異噁唑、三唑、噻唑、異噻唑、四唑、吡噠唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、噠嗪、苯并呋 喃、異苯并呋喃、吲哚、異吲哚、苯并噻吩、苯并[c ]噻吩、苯并咪唑、吲唑、苯并噁唑、苯并異 噁唑、苯并噻唑、喹啉、異喹啉、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、嘌呤和吖啶。本發(fā)明的芳基和雜芳基 包括優(yōu)選地4至12個(gè)碳原子，更優(yōu)選5或者6個(gè)碳原子；
[0059] 根據(jù)本發(fā)明的酸、胺、酰胺、酯、醚和硫醚基團(tuán)優(yōu)選具有1至12更優(yōu)選1至6個(gè)碳原 子。
[0060] 根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，A是螯合劑，以及感興趣的物質(zhì)SI是NMR或者M(jìn)RI造影劑。
[0061 ]有利的是，螯合劑A選自1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸(D0TA)、二 乙三胺五乙酸(0了?4)、1，4,7-三(羧甲基氮雜)環(huán)十二烷-10-氮雜乙酰胺(0034)、次氮基三 乙酸(NTA)、D-青霉胺(Pen)、2,3-二巰基丁二酸(DMSA)、2,3-二巰基-1-丙磺酸(DMPS)、2,3-二巰基丙醇(BAL)、三乙烯四胺(Trien)、四硫代鉬酸銨(TTM)陰離子、乙二胺四乙酸(EDTA)、 2-(p_異硫氰酰芐基)-6-甲基-二乙三胺五乙酸（IB4M)或羥基吡啶酮(Η0Ρ0)。
[0062]有利的是，感興趣的物質(zhì)SI是釓，以及螯合劑是D0TA。
[0063]根據(jù)一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明的馬來酰亞胺化合物可以是式0-)所示：
[0064]
[0065] 其中，8』'1』'2』"丄31以及11是上述所限定的。
[0066] 通過固相方法，優(yōu)選使用Fmoc化學(xué)，以及更優(yōu)選在Fmoc-Gly-Wang樹脂上合成式 (I)或（Γ)的馬來酰亞胺化合物。
[0067]式（Γ)的馬來酰亞胺化合物：
[0068]
[0069] 其中，8』'1』'2、8"丄31以及11如上述所限定的，也屬于本發(fā)明的一部分。
[0070] 有利的是，氨基酸間隔序列Z的氨基酸殘基選自：丙氨酸、纈氨酸、絲氨酸、亮氨酸、 異亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺，優(yōu)選地丙氨 酸、纈氨酸和絲氨酸。
[0071] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，寡肽具有式P-C-Z或者Z-C-P，優(yōu)選地P-C-Z，其中：
[0072] -p是8至800個(gè)氨基酸的肽，所述P不含有還原的半胱氨酸殘基，
[0073] -C是半胱氨酸殘基，
[0074] -Z 代表
[0075] a)2至10個(gè)氨基酸的間隔序列，優(yōu)選2個(gè)氨基酸的間隔序列，其中Z的氨基酸殘基選 自：絲氨酸(S)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)和甘氨酸(G)，更優(yōu)選絲氨酸(S)、丙氨酸(A)和纈氨酸 (V)，其中Z的至少兩個(gè)氨基酸殘基是不同的，或
[0076] b) 2至10個(gè)氨基酸的間隔序列，優(yōu)選2至10個(gè)中性的或帶負(fù)電的氨基酸的間隔序 列，其中Z包括二肽絲氨酸-丙氨酸(S-A)或絲氨酸-纈氨酸(S-V)，并且其中Z不包含半胱氨 酸殘基。
[0077] 有利的是，半胱氨酸殘基C是立體上可接觸的。
[0078] 有利的是，當(dāng)Z如a)中所限定的，則氨基酸間隔序列Z包含1個(gè)或者至少1個(gè)絲氨酸。
[0079] 有利的是，當(dāng)Z如a)中所限定的，則氨基酸間隔序列Z僅由絲氨酸和丙氨酸殘基組 成，或者僅由絲氨酸和纈氨酸殘基組成。
[0080] 在這種寡肽的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，氨基酸間隔序列z由2個(gè)氨基酸的序列組成， 如氨基酸序列S-A或者S-V。
[0081 ] 按照遞增的優(yōu)選順序，氨基酸肽P還可以是50至800、100至800、100至700、100至 500、100至400、100至300、或100至250個(gè)氨基酸的肽。
[0082]有利的是，氨基酸肽P包含肽P'或者由肽P'組成，其能夠選擇性地結(jié)合抗原。P'優(yōu) 選地選自：駱駱駝科重鏈抗體的可變結(jié)構(gòu)域（V Η Η )、常規(guī)抗體的F a b片段、常規(guī)抗體的F (ab)'2片段、常規(guī)抗體的Fv片段、常規(guī)抗體的scFv片段、免疫球蛋白新抗原受體（IgNAR)、 nanof it in、DARPin、anti calin、親合體、affilin、avimer、單體(monobody)和庫尼茨結(jié)構(gòu) 域。
[0083]常規(guī)抗體的Fab、F(ab) '2、Fv和scFv片段是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。IgNAR綜述于 Dooley H.等人，2006，Dev Comp Immunol · JOjS-SGaNanofitin(如affitin)綜述于 Mouratou B.等人，2007，Proc Natl Acad Sci U.S.A. ,104:17983-8 JARPin 綜述于 Binz H.K.等人，2003, J .Mol .Biol. ,332:489-503 jnticalin 綜述于 Skerra A，2008，F(xiàn)EBS J.， 275 :2677-83 c^Affibody 綜述于 Nord K.等人，1997，Nature Biotechnol.，15: 772-777〇 Affil in 綜述于 Ebersbach H.等人，2007, J .Mol .Biol ·，372:172-185 Jvimer 綜述于 Silverman J.等人，2005，Nature Biotechnol ·，23:1556-1561。單體（或adnectin)綜述于 Koide A.等人，1998，J.Mol.Biol. ,284:1141-51。庫尼茨結(jié)構(gòu)域綜述于Lehmann A.，2008， Expert opinion on biological therapy，8:1187-99。
[0084] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，P'是VHH，比如根據(jù)本發(fā)明的VHH。
[0085] 式P-C-Z的寡肽的氨基酸肽P在其C端具有1至10個(gè)氨基酸的間隔序列Y，優(yōu)選地，1 至10個(gè)中性的或者帶負(fù)電的氨基酸的間隔序列，其中所述氨基酸間隔序列Y的氨基酸殘基 是相同的或不同的，并且其中所述氨基酸間隔序列Y不含半胱氨酸殘基。
[0086]式Z-C-P的寡肽的氨基酸肽P在其N端具有1至10個(gè)氨基酸的間隔序列Y，優(yōu)選地，1 至10個(gè)中性的或者帶負(fù)電的氨基酸的間隔序列，其中所述氨基酸間隔序列Y的氨基酸殘基 是相同的或不同的，并且其中所述氨基酸間隔序列Y不含半胱氨酸殘基。
[0087] 有利的是，氨基酸間隔序列Y的氨基酸殘基選自丙氨酸、纈氨酸、絲氨酸、亮氨酸、 異亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺，優(yōu)選丙氨酸、 纈氨酸、絲氨酸和甘氨酸。
[0088] 優(yōu)選，氨基酸間隔序列Y代表4個(gè)中性氨基酸的間隔序列，比如氨基酸序列G-G-G-S (SEQ ID N0.11)。
[0089] 式P-C-Z的寡肽的氨基酸肽P還在其N端具有1至50個(gè)氨基酸的序列X，其中所述氨 基酸序列X的氨基酸殘基是相同的或不同的，并且其中所述氨基酸序列X不包含半胱氨酸殘 基。
[0090] 式Z-C-P的寡肽的氨基酸肽P還在其C端具有1至50個(gè)氨基酸的序列X，其中所述氨 基酸序列X的氨基酸殘基是相同的或不同的，并且其中所述氨基酸序列X不包含半胱氨酸殘 基。
[0091] 氨基酸序列X包含標(biāo)簽和酶切位點(diǎn)，所述標(biāo)簽比如6XHis標(biāo)簽(SEQ ID N0.9)，所 述酶切位點(diǎn)比如氨基酸序列LVPRGS(SEQIDN0.10)所示的凝血酶切位點(diǎn)。
[0092] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的寡肽具有式？'-^、？'-￥-(：-2、乂-?'-(：-Z、X-P ' -Y-C-Z、Z-C-P '、Z-C-Y-P '、Z-C-P ' -X或者Z-C-Y-P ' -X，其中P ' 優(yōu)選是VHH，比如根據(jù) 本發(fā)明的VHH。
[0093]本發(fā)明還提供一種分離的式P-C-Z或者Z-C-P的寡肽，優(yōu)選地如上述所限定的P-C-Z，其中：
[0094] -P是8至800個(gè)氨基酸的肽，所述P不含有還原的半胱氨酸殘基，
[0095] -C是半胱氨酸殘基，
[0096] -Z代表1至10個(gè)氨基酸的間隔序列，優(yōu)選1至10個(gè)中性的或帶負(fù)電的氨基酸的間隔 序列，其中Z的氨基酸殘基是相同的或不同的，并且其中Z不含半胱氨酸殘基。
[0097]本發(fā)明還提供一種VHH衍生物，其由包含根據(jù)本發(fā)明的VHH的多肽組成，只要包含 在所述多肽之中的所述VHH能夠結(jié)合淀粉樣蛋白邱勺纖維狀形式。
[0098]在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述VHH衍生物從N端至C端包含氨基酸標(biāo)簽比如6 X His標(biāo)簽、酶切位點(diǎn)比如凝血酶切位點(diǎn)、VHH、氨基酸間隔序列、半胱氨酸和第二氨基酸間隔 序列。這種VHH衍生物對(duì)應(yīng)著具有式X-P ' -Y-C-Z的根據(jù)本發(fā)明的寡肽，其中P '是VHH。
[0099]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述VHH衍生物具有氨基酸序列SEQ ID N0.8(R3VQ-SH)〇
[0100]本發(fā)明還提供一種分離的多核苷酸，其編碼根據(jù)本發(fā)明的寡肽、VHH或者VHH衍生 物。
[0101] 編碼根據(jù)本發(fā)明的VHH衍生物的多核苷酸的示例是序列SEQ ID N0:17(編碼R3VQ-SH的核苷酸序列）。
[0102] -種根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸，其是通過重組DNA技術(shù)和/或化學(xué)DNA合成的公知方 法獲得的。
[0103] 本發(fā)明還提供一種重組表達(dá)盒，其包含在轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子控制下的根據(jù)本發(fā)明的多核 苷酸，轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子允許在宿主細(xì)胞中調(diào)節(jié)所述多核苷酸的轉(zhuǎn)錄。所述多核苷酸還可以連接 至適當(dāng)?shù)目刂菩蛄校刂菩蛄性试S在宿主細(xì)胞中調(diào)節(jié)其翻譯。
[0104] 本發(fā)明還提供一種重組載體(例如，重組表達(dá)載體），其包含根據(jù)本發(fā)明的多核苷 酸。有利的是，所述重組載體是包含根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒的重組表達(dá)載體。
[0105]如此處所用，術(shù)語"載體"涉及能夠擴(kuò)增與其連接的另一核酸的核酸分子。術(shù)語包 括作為自我復(fù)制的核酸結(jié)構(gòu)的載體，以及并入宿主細(xì)胞基因組的載體，其中所述載體引入 所述宿主細(xì)胞中。某些載體能夠指導(dǎo)與其可操作連接的核酸的表達(dá)。這種載體此處被稱為 "表達(dá)載體"。
[0106] 本發(fā)明還提供一種宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)本發(fā)明的重組表達(dá)盒或重組載體。宿主 細(xì)胞是原核或真核宿主細(xì)胞。
[0107] 術(shù)語"宿主細(xì)胞"涉及在其中引入有外源性核酸的細(xì)胞，包括這些細(xì)胞的后代。宿 主細(xì)胞包括"轉(zhuǎn)化體"和"轉(zhuǎn)化細(xì)胞"，其包括初始的轉(zhuǎn)化細(xì)胞及其衍生后代，而不考慮傳代 次數(shù)。在核酸含量方面，后代可能不完全和母細(xì)胞相同，但可能包含突變。在原始轉(zhuǎn)化的細(xì) 胞中篩選或選擇的具有相同功能或者生物活性的突變后代也包括在此處。
[0108] 一種表達(dá)氨基酸序列SEQ ID No.4所示的VHH R3VQ的原核宿主細(xì)胞，其于2013年 11月12日以1-4818的編號(hào)保藏在法國巴黎郵編15，Dr Roux街75724的國家培養(yǎng)物和微生物 保藏中心(CNCM)。
[0109] 一種表達(dá)氨基酸序列SEQIDNo.8所示的VHHR3VQ-SH的原核宿主細(xì)胞，其于2013 年11月12日以1-4819的編號(hào)保藏在法國巴黎郵編15，Dr Roux街75724的國家培養(yǎng)物和微生 物保藏中心(CNCM)。
[0110] 本發(fā)明還提供一種用于在如上述所限定的宿主細(xì)胞中生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的式P-C-Z 或Z-C-P所示寡肽的方法，包括步驟：
[0111] -提供含有根據(jù)本發(fā)明的重組表達(dá)盒或重組載體的宿主細(xì)胞，
[0112] -培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，
[0113] -以及，任選地，純化式P-C-Z或Z-C-P所示寡肽。
[0114] 用于純化寡肽的方法是本領(lǐng)域公知的，比如色譜(如離子交換色譜、凝膠滲透色譜 和反相色譜）。
[0115] 本發(fā)明還提供了一種診斷或者治療劑，其包含直接或者間接、共價(jià)或非共價(jià)連接 至感興趣的物質(zhì)的根據(jù)本發(fā)明的VHH、VHH衍生物或寡肽。
[0116] 根據(jù)本發(fā)明的感興趣的物質(zhì)能夠或不能穿透哺乳動(dòng)物或者人類血腦屏障。如果感 興趣的物質(zhì)穿透所述血腦屏障，則利用根據(jù)本發(fā)明的VHH、VHH衍生物或寡肽可以允許增強(qiáng) 所述感興趣的物質(zhì)穿過血腦屏障的遞送。
[0117] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述感興趣的物質(zhì)是診斷或者治療化合物。
[0118] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述感興趣的物質(zhì)是包含診斷或者治療化合物的脂質(zhì)體或 者聚合實(shí)體(A.J.L.Villaraza等人，Chem Rev.2010，110,2921-2959)〇
[0119] 有利的是，所述診斷化合物選自：
[0120] -酶，比如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸酶或者β-半乳糖苷酶；
[0121] -熒光團(tuán)，比如綠色熒光蛋白（GFP)、在光譜紫外(UV)部分的波長處激發(fā)的藍(lán)色熒 光染料(例如AMCA(7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸）；Al eXaFlu〇r?350)、在藍(lán)光處激發(fā)的綠 色熒光染料(如FITC、Cy2、Ale XaFluor?488)、在綠光處激發(fā)的紅色熒光染料(例如羅丹明、 德克薩斯紅、073)161 &「丨11〇戍染料546、564和594)、或者遠(yuǎn)紅光激發(fā)的染料(如075)，通過 電子探測(cè)器(CCD相機(jī)、光電倍增管)進(jìn)行可視化；
[0122] -放射性同位素，如可用于PET成像的 18F、nC、13N、150、68Ga、 82Rb、44Sc、64Cu、86Y、89Zr 、124工、152Tb，或者可以用于spECT/^爍掃描研究的 2<3111、155113、1951^，或者可用于放射自顯影或原位雜交的 14(：、3!1、355、3￥、1251，或者可用于標(biāo) 記化合物的 211At-、212Bi-、75Br-、76Br-、 131I-、mIn、177Lu-、212Pb-、 186Re-、188Re-、153Sm-、90Y;
[0123] -NMR或者M(jìn)RI造影劑，比如順磁劑釓(Gd)、鏑(Dy)和錳(Mn)，以及基于鐵氧化物的 超順磁劑(如MI0N、SPI0或者USPI0)或基于鉑鐵的超順磁劑（SIPP)，以及X-核比如 18F、13C、 23Na、170、15N;
[0124] -納米顆粒，比如金納米顆粒(B.Van de Broek等人，ACSNano,卷5，1'1〇.6,4319-4328，2011)或者量子點(diǎn)（A. Sukhanova 等人，Nanomedicine ,8(2012)516-525)。
[0125] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述診斷化合物是MRI造影劑，更優(yōu)選地釓。
[0126] 當(dāng)診斷劑用于檢測(cè)，它可以包括用于閃爍掃描研究的放射性原子，例如99Tc或者 1231，或者用于核磁共振(匪1〇成像(還稱為1?1)的自旋標(biāo)記，比如 13(：、平心、6(1、1231、111111、 Mn、15N 或者 70。
[0127] 有利的是，所述治療化合物選自：肽、酶、核酸、病毒和化學(xué)實(shí)體。它可以是止痛化 合物、抗炎化合物、抗抑郁化合物、抗驚厥化合物、細(xì)胞毒性化合物或者抗神經(jīng)退行性化合 物。
[0128] 如上述所限定的感興趣的物質(zhì)可以直接且共價(jià)地或者非共價(jià)地連接至根據(jù)本發(fā) 明的VHH、VHH衍生物或者寡肽，或者連接至所述VHH、VHH衍生物或者寡肽的末端之一 (N或者 C端），或者連接至所述VHH、VHH衍生物或者寡肽的氨基酸之一的側(cè)鏈。感興趣的物質(zhì)還可以 通過間隔序列的方式間接且共價(jià)地或者非共價(jià)地連接至所述VHH或VHH衍生物，或者連接至 所述VHH或VHH衍生物的末端之一，或者連接至所述VHH或VHH衍生物的氨基酸之一的側(cè)鏈。 傳統(tǒng)的將感興趣的物質(zhì)連接至肽尤其是抗體的方法，是本領(lǐng)域中已知的（比如，參見 TERNYNCK and AVRAMEAS，1987, "Techniques immunoenzymatiques''Ed.INSERM，Paris或者 G. T. Hermanson, Biocon jugate Techniques，2010，Academic 出版社）。
[0129] 許多化學(xué)交聯(lián)方法是本領(lǐng)域已知的。交聯(lián)劑可能是同雙功能的（即，有兩個(gè)官能團(tuán) 進(jìn)行相同的反應(yīng))或異雙功能的（即，有兩個(gè)不同的官能團(tuán)）。大量的交聯(lián)劑是市售可獲得 的。它們使用的詳細(xì)說明很容易從商業(yè)供應(yīng)商獲得。多肽的交聯(lián)和綴合物制備的一般參考 是：WONG，Chemistry of protein conjugation and cross_linking，CRC Press(1991)〇
[0130] 使用本領(lǐng)域公知的常規(guī)的有機(jī)化學(xué)技術(shù)，根據(jù)本發(fā)明的VHH、VHH衍生物或者寡肽 可標(biāo)記有特異性的放射性同位素或者NMR或MRI造影劑或熒光團(tuán)或納米顆粒或酶，參見例如 March，J.ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY:REACTI0NS，MECHANISMS，AND STRUCTURE(第三版， 1985)或者G · T · Hermanson，Biocon jugate Techniques，2010，Academic 出版社。
[0131 ]此外，通過本領(lǐng)域公知的多種方法，直接通過重氮碘對(duì)重氮化的氨基衍生物進(jìn)行 碘化（參見Greenbaum，1936，F(xiàn).Am. J.Pharm.，108:17)、或者通過將不穩(wěn)定的重氮化胺轉(zhuǎn)換 成穩(wěn)定的三氮烯、或者通過將非放射性鹵代前體轉(zhuǎn)換成穩(wěn)定的三烷基錫衍生物，隨后三烷 基錫衍生物轉(zhuǎn)化成碘代化合物，根據(jù)本發(fā)明的VHH、VHH或者寡肽衍生物還可以標(biāo)記有任何 合適的放射性碘同位素，例如但不限于 1311、1251、或者1231。參見Satyamurthy和Barrio， 1983，J.Org.Chem.，48:4394;Goodman等人，1984, J.Org.Chem.，49:2322，以及Mathis等人， 1994，J.Label 1 .Comp.and Radiopharm.，905;Chumpradit等人，1991，J.Med.Chem.，34: 877 ; Zhuang等人，1994，J · Med · Chem. 37 :1406; Chumpradit等人，1994，J .Med · Chem. 37 : 4245 〇
[0132] 尤其是，通過任意的本領(lǐng)域公知的多種技術(shù)，根據(jù)本發(fā)明的VHH、VHH衍生物或者寡 肽可以標(biāo)記有123I以便用于SPECT。參見，例如Kulkarni，1991，Int·J·Rad·Appl·&Inst· (Part B)18：647〇
[0133] 根據(jù)本發(fā)明的VHH或VHH衍生物還可以被放射標(biāo)記有已知的金屬放射性標(biāo)記，比如 锝99m(99mTc)。修飾取代基從而引入結(jié)合這種金屬離子的配體，這可以由放射標(biāo)記領(lǐng)域的普 通技術(shù)人員實(shí)現(xiàn)，而無需過度實(shí)驗(yàn)。根據(jù)本發(fā)明的金屬標(biāo)記的VHH或者VHH衍生物，然后可以 用于檢測(cè)淀粉樣蛋白β沉積。制備 99mTc放射性標(biāo)記的衍生物是本領(lǐng)域公知的。參見例如 Zhuang等人，1999，Nuclear Medicine&Biology，26 : 21 7-24; Oya等人，1998,Nuclear Medicine&Biology，25:135-40;Horn等人，1997，Nuclear Medicine&Biology，24:485-98〇
[0134] 本發(fā)明還涉及用于獲得直接或者間接偶聯(lián)有感興趣的物質(zhì)的根據(jù)本發(fā)明的VHH或 者VHH衍生物(功能性綴合物)的偶聯(lián)方法。
[0135] 根據(jù)第一種策略，通過使用非位點(diǎn)特異性方法，將根據(jù)本發(fā)明的VHH或者VHH衍生 物綴合至感興趣的物質(zhì)。所述非位點(diǎn)特異性方法包括將感興趣的物質(zhì)和根據(jù)本發(fā)明的VHH 或者VHH衍生物進(jìn)行綴合的步驟。
[0136] 當(dāng)感興趣的物質(zhì)是金屬時(shí)，如NMR或者M(jìn)RI造影劑（例如，順磁劑釓(Gd)、鏑(Dy)和 錳(Μη)，以及基于鐵氧化物或者鉑鐵的超順磁劑，以及X-核，比如 比如金屬放射性同位素(例如，，、〃^嚴(yán)⑶^^^^^批^啪^非位點(diǎn)特異性的方 法采用螯合劑，并包括以下步驟：
[0137] (i)將以酯或酸酐形式激活的螯合劑，優(yōu)選以酯形式激活的螯合劑，和根據(jù)本發(fā)明 的VHH或者VHH衍生物的賴氨酸殘基進(jìn)行綴合，以及
[0138] (ii)將步驟(i)的配體和感興趣的物質(zhì)進(jìn)行螯合。
[0139] 替代采用螯合劑的非位點(diǎn)特異性方法的方法，是這樣一種方法，在其中感興趣的 物質(zhì)用螯合劑進(jìn)行"預(yù)螯合"，這種方法包括以下步驟：
[0140] (η將感興趣的物質(zhì)和以酯或酸酐形式激活的螯合劑，優(yōu)選以酯的形式激活的螯 合劑，進(jìn)行螯合，以及
[0141] (ii'）將步驟(η的預(yù)螯合的感興趣的物質(zhì)和根據(jù)本發(fā)明的VHH或者VHH衍生物的 賴氨酸殘基進(jìn)行綴合。
[0142] 步驟（i)或（ii'）的綴合期間，溫度可以從1變化到40°C，并且優(yōu)選從4至20°C。溶液 可以攪拌1至6小時(shí)。優(yōu)選地，步驟⑴或（i i '）綴合期間的pH保持在7至8.5。
[0143] 在有咪唑或者沒有咪唑的PBS/NaCl中進(jìn)行綴合步驟(i)或（ii'），優(yōu)選存在咪唑。
[0144] 綴合步驟（i)或（ii'）期間，以酯或酸酐形式激活的螯合劑可以溶解在緩沖液中， 如磷酸鹽緩沖(PBS)溶液。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，以酯或酸酐形式激活的螯合劑和VHH 或者VHH衍生物的賴氨酸殘基的氨基官能團(tuán)之間的摩爾比范圍從1至10，優(yōu)選是4。
[0145] 綴合步驟（i)和螯合步驟（ii)之間、或者螯合步驟（i'）和綴合步驟（ii'）之間，可 以有通過滲透過濾或者透析進(jìn)行的緩沖液交換步驟。有利的是，溶液是滲透過濾的，例如采 用Vivaspin?裝置。這種緩沖液交換步驟期間，在范圍從1至5°C的溫度冷卻介質(zhì)。這種緩沖 液交換步驟期間，例如用醋酸鈉溶液交換緩沖溶液，優(yōu)選攪拌〇至6個(gè)小時(shí)，更優(yōu)選2至3小 時(shí)。
[0146] 螯合步驟(ii)或（i'）期間，溶液攪拌1至4小時(shí)，優(yōu)選2至3小時(shí)。優(yōu)選，在1至60°C進(jìn) 行螯合步驟，更優(yōu)選在4°C。
[0147] 然后，可以有通過滲透過濾或者透析進(jìn)行的第二緩沖液交換步驟。有利的是，溶液 是滲透過濾的，例如采用Vivaspin?裝置。此第二緩沖液交換步驟期間，在范圍從1至5°C的 溫度冷卻介質(zhì)。第二滲透過濾步驟期間，例如用混合物PBS/NaCl交換緩沖溶液，并且通過相 同的方法進(jìn)行濃縮(滲透過濾）。
[0148] 根據(jù)賴氨酸的數(shù)量，每VHH或者VHH衍生物的感興趣的物質(zhì)平均密度可以從0至賴 氨酸的數(shù)目+1之間變化。優(yōu)選，每VHH或者VHH衍生物的感興趣的物質(zhì)平均密度可以從0至5 之間變化。
[0149] 根據(jù)本發(fā)明的非位點(diǎn)特異性方法適用于根據(jù)本發(fā)明的VHH或者VHH衍生物，并且可 以擴(kuò)展至其它VHH。
[0150] 根據(jù)第二策略，通過位點(diǎn)特異性方法將根據(jù)本發(fā)明的寡肽，優(yōu)選地包括根據(jù)本發(fā) 明的VHH衍生物，綴合至感興趣的物質(zhì)。位點(diǎn)特異性方法有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0151]-標(biāo)記的寡肽是化學(xué)上明確的，因?yàn)檫@種方法提供明確的綴合物，這是針對(duì)人類使 用的一個(gè)基本特征(質(zhì)量控制、安全性…），
[0152]-方法簡(jiǎn)便且標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)橛酶信d趣的物質(zhì)來標(biāo)記寡肽可以在單一步驟中進(jìn)行，反應(yīng) 時(shí)間短且程序簡(jiǎn)單。無需在線監(jiān)測(cè)，并且在標(biāo)記程度和結(jié)合性能之間不用實(shí)現(xiàn)權(quán)衡。對(duì)于進(jìn) 一步的優(yōu)化、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性和生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大有關(guān)鍵的優(yōu)勢(shì)，
[0153] -該方法不影響寡肽的關(guān)鍵性質(zhì)：例如，當(dāng)P包含VHH或由VHH組成，在最終樣本中綴 合物的pi維持在8.5以上，從而應(yīng)當(dāng)允許穿過BBB。此外，不存在可能和綴合物競(jìng)爭(zhēng)靶標(biāo)的剩 余未標(biāo)記寡肽;反應(yīng)時(shí)間短且處于生理性pH的溫和條件防止寡肽免于潛在的降解和/或活 性損失，
[0154] -該方法具有通用性，因?yàn)樗试S靈活且模塊化的方法，在其中可分別制備各種寡 肽和造影劑、或其它感興趣的分子，然后在單一步驟中進(jìn)行組合。因此，輕易獲得一組綴合 物用于優(yōu)化以及通過IHC和MRI進(jìn)行的下游評(píng)價(jià)，以及上述所有，
[0155] -該方法允許提高總產(chǎn)率，同時(shí)降低反應(yīng)步驟數(shù)，在VHH的賴氨酸或組氨酸上沒有 副反應(yīng)，并且整體維持VHH的功能與三維結(jié)構(gòu)。
[0156] 根據(jù)本發(fā)明的位點(diǎn)特異性方法包括根據(jù)本發(fā)明的寡肽和感興趣的物質(zhì)之間的綴 合步驟，其中感興趣的物質(zhì)帶有疏基反應(yīng)官能團(tuán)，比如上述限定的帶有感興趣的物質(zhì)的式 (I)或（Γ)的馬來酰亞胺化合物。
[0157] 可以在范圍從0至20°C的溫度，優(yōu)選4°C，例如從2至4小時(shí)，進(jìn)行寡肽的半胱氨酸和 巰基反應(yīng)性化合物之間的硫代加成，其中巰基反應(yīng)性化合物比如式（I)或（Γ)的馬來酰亞 胺化合物。
[0158] 優(yōu)選在范圍從4至7.5,更優(yōu)選在6.8的pH，實(shí)現(xiàn)寡肽的半胱氨酸和巰基反應(yīng)性化合 物之間的硫代加成，其中巰基反應(yīng)性化合物比如式(I)或（Γ)的馬來酰亞胺化合物。低于pH =4反應(yīng)不工作，而超過7.5則反應(yīng)不是特異性的(在賴氨酸上反應(yīng)）。為了調(diào)節(jié)pH，綴合步驟 (i)或（ii'）可以在有或沒有咪唑的TOS/NaCl中進(jìn)行，優(yōu)選存在咪唑。鑒定馬來酰亞胺化合 物對(duì)蛋白的硫代加成的特定條件是出乎意料的，因?yàn)槠湓试S節(jié)省步驟并提高過程的總產(chǎn) 率，其中蛋白直接洗脫自純化柱。
[0159] 然后，可以有通過滲透過濾或者透析進(jìn)行緩沖液交換步驟。有利的是，溶液是滲透 過濾的，例如采用Vivaspin?裝置。然后，通過相同的方法濃縮溶液(滲透過濾）。
[0160] 然而，當(dāng)綴合步驟（i)或（ii'）在有咪唑的PBS/NaCl中進(jìn)行時(shí)，優(yōu)選不進(jìn)行隨后的 滲透過濾或者透析步驟(為了不除去咪唑）。
[0161]無論是對(duì)于非特異性的方法還是特異性的方法，感興趣的物質(zhì)如上述所限定的。
[0162] 根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，感興趣的物質(zhì)是上述所限定的治療或者診斷化合物， 優(yōu)選診斷化合物選自：上述所限定的熒光團(tuán)、放射性同位素、和NMR或MRI造影劑。
[0163] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)感興趣的物質(zhì)是匪R或MRI造影劑時(shí)，合成的綴合物保留了未標(biāo) 記的VHH的關(guān)鍵功能特性。
[0164] 根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，感興趣的物質(zhì)是NMR或MRI造影劑，比如順磁劑釓(Gd)、鏑 (Dy)和錳(Μη)，以及基于鐵氧化物的超順磁劑(如MI0N、SPI0或者USPI0)或基于鉑鐵的超順 磁劑(SIPP)，以及X-核比如 1￥、13(：、23似、170、1力，以及更優(yōu)選感興趣的物質(zhì)是匪1?或1?1造影 劑，其選自順磁劑釓(Gd)、鏑(Dy)和錳(Μη)。
[0165] 螯合劑選自：1，4,7，10_四氮雜環(huán)十二烷-1，4,7，10-四乙酸(D0TA)、二乙三胺五乙 酸(DTPA)、1，4,7-三(羧甲基氮雜）環(huán)十二烷-10-氮雜乙酰胺(D03A)、次氮基三乙酸(ΝΤΑ) (Chong等人，2008，19，1439)、D-青霉胺(Pen)、2，3-二巰基丁二酸(DMSA)、2，3-二巰基-1-丙 磺酸（DMPS)(0.Andersen，Chem.Rev.，1999，99，ρρ· 2683-2710)、2,3-二巰基丙醇（BAL)、三 乙稀四胺（Trien)、四硫代鉬酸銨（TTM)陰離子（G. J.Brewer，F(xiàn).K.Askari，J.Hepatol ·， 2005，42，ρρ· S13-S21)、乙二胺四乙酸(EDTA)、2-(p-異硫氰酰芐基)-6-甲基-二乙三胺五乙 酸（IB4M) (Nwe等人，J. Inorg·Biochem，2011，105，722)、羥基吡啶酮（HOPO) (Villaraza等 人，Chem.Rev.，2010，110,2921)〇
[0166] 當(dāng)感興趣的物質(zhì)是釓時(shí)，優(yōu)選D0TA是螯合劑。
[0167] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是根據(jù)本發(fā)明所限定的帶有半胱氨酸殘基的寡肽，其中半胱 氨酸殘基通過馬來酰亞胺化合物連接至至少一種感興趣的物質(zhì)，所述寡肽是根據(jù)本發(fā)明的 位點(diǎn)特異性方法獲得的。
[0168] 本發(fā)明還提供通過本發(fā)明的非位點(diǎn)特異性方法獲得的綴合至感興趣物質(zhì)的VHH或 者VHH衍生物，以及綴合至巰基反應(yīng)性化合物的VHH，其中巰基反應(yīng)性化合物比如根據(jù)本發(fā) 明的位點(diǎn)特異性方法獲得的攜帶感興趣的物質(zhì)的式(I)的馬來酰亞胺化合物。
[0169] 如果感興趣的物質(zhì)是肽，可以通過遺傳工程將根據(jù)本發(fā)明的VHH或者VHH衍生物以 及所述感興趣的物質(zhì)制備成融合多肽，其包含根據(jù)本發(fā)明的VHH或者VHH衍生物以及合適的 肽。可方便地在已知的合適宿主細(xì)胞中表達(dá)這種融合多肽。
[0170] 通過注射，比如靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)（通過脊髓液）、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)或者皮下注 射、或通過滴鼻，將根據(jù)本發(fā)明的VHH、VHH衍生物、寡肽、治療或診斷劑可施用至受試者(哺 乳動(dòng)物或人）。
[0171] 當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的VHH施用至人受試者時(shí)，那么可以進(jìn)行人源化以便降低在人中的 免疫原性。用于生產(chǎn)人源化抗體或其片段的方法是本領(lǐng)域公知的(Vincke C.等人，2009，J Biol Chem.，284,3273-84)。
[0172] 在診斷或者監(jiān)測(cè)淀粉樣蛋白β沉積介導(dǎo)的疾病中，如阿爾茨海默氏病(AD)和唐氏 綜合征，根據(jù)本發(fā)明的診斷劑可用于腦成像。
[0173]本發(fā)明還提供一種試劑盒，其包含根據(jù)本發(fā)明的VHH、VHH衍生物或者寡肽以及上 述所限定的感興趣的物質(zhì)。
[0174]特別是，本發(fā)明還提供用于腦成像、或用于診斷或者監(jiān)測(cè)淀粉樣蛋白β沉積介導(dǎo)的 疾病如阿爾茨海默氏病和唐氏綜合征的試劑盒，其至少包含上述所限定的VHH或VHH衍生物 和診斷劑。
[0175]本發(fā)明還提供根據(jù)本發(fā)明的診斷劑用于診斷或者監(jiān)測(cè)受試者中由淀粉樣蛋白β沉 積介導(dǎo)的疾病如阿爾茨海默氏病和唐氏綜合征的用途。
[0176]如此處所用，"受試者"是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人，最優(yōu)選疑似患有淀粉樣蛋白β沉積介 導(dǎo)的疾病如阿爾茨海默氏病和唐氏綜合征的人。
[0177] 本發(fā)明還提供在受試者中體外或者離體診斷淀粉樣蛋白β沉積介導(dǎo)的疾病如阿爾 茨海默氏病和唐氏綜合征的方法，包括步驟：
[0178] a)用根據(jù)本發(fā)明的診斷劑體外接觸來自所述受試者的適當(dāng)生物樣本，以及
[0179] b)在所述生物樣本中，確定淀粉樣蛋白β沉積比如淀粉樣蛋白斑塊的存在或者不 存在，
[0180] 所述淀粉樣蛋白β沉積的存在表明所述受試者患有淀粉樣蛋白β沉積介導(dǎo)的疾病， 如阿爾茨海默氏病和唐氏綜合征。
[0181]可以通過確定VHH抗原復(fù)合物（即，針對(duì)淀粉樣蛋白β的纖維狀形式的VHH)的存在 或者不存在，來進(jìn)行步驟b)。
[0182] 本發(fā)明還提供在受試者中體外或者離體監(jiān)測(cè)淀粉樣蛋白β沉積介導(dǎo)的疾病如阿爾 茨海默氏病和唐氏綜合征的進(jìn)展或消退(regress ion)方法，包括步驟：
[0183] a)用根據(jù)本發(fā)明的診斷劑體外接觸來自所述受試者的適當(dāng)生物樣本，
[0184] b)在所述生物樣本中，確定淀粉樣蛋白邱勺纖維狀形式的量，以及
[0185] c)將步驟b)確定的量和所述受試者先前獲得的淀粉樣蛋白邱勺纖維狀形式的量進(jìn) 行比較，
[0186] 淀粉樣蛋白邱勺纖維狀形式的量顯著增加，構(gòu)成了淀粉樣蛋白β沉積介導(dǎo)的所述疾 病的進(jìn)展的標(biāo)志，淀粉樣蛋白邱勺纖維狀形式的顯著降低構(gòu)成了淀粉樣蛋白β沉積介導(dǎo)的所 述疾病的消退的標(biāo)志。
[0187] 如此處所用，術(shù)語"顯著增加"和"顯著降低"分別指的是，相較于來自所述受試者 適當(dāng)生物樣本中所先前確定的并用作參考量的淀粉樣蛋白β的纖維狀形式的量，在適當(dāng)?shù)?生物樣本中淀粉樣蛋白邱勺纖維狀形式的量更高或量更低。
[0188] 還可以通過確定VHH抗原復(fù)合物的存在或不存在來進(jìn)行步驟b)。
[0189] 所述適當(dāng)?shù)纳飿颖究梢允悄X活檢或者尸腦組織。
[0190] 根據(jù)本發(fā)明的方面，其涉及在腦活檢或尸檢腦組織中檢測(cè)淀粉樣蛋白β沉積的方 法，所述方法可包括用根據(jù)本發(fā)明的診斷劑溶液孵育福爾馬林固定的組織。孵育后，診斷化 合物標(biāo)記組織中的淀粉樣蛋白β沉積，通過任何標(biāo)準(zhǔn)的方法可以檢測(cè)或觀察染色的或標(biāo)記 的淀粉樣蛋白β沉積。這樣的檢測(cè)手段包括顯微技術(shù)，比如明場(chǎng)、熒光、激光共聚焦和交叉極 化顯微鏡。定量活檢或尸組織中的淀粉樣蛋白β的量的方法，涉及例如根據(jù)本發(fā)明的診斷 劑、或其水溶性、無毒的鹽和活檢或者尸組織勻漿進(jìn)行孵育。由本領(lǐng)域公知的方法獲得組合 并進(jìn)行勻漿。盡管其它診斷化合物比如酶、熒光團(tuán)或者NMR或MRI造影劑也可以使用，有利 地，診斷化合物是放射性同位素標(biāo)記的化合物。
[0191] 本發(fā)明還提供一種在受試者體內(nèi)成像淀粉樣蛋白β沉積的方法，包括步驟：
[0192] a)在受試者中施用可檢出量的根據(jù)本發(fā)明的診斷劑，受試者優(yōu)選是人，以及
[0193] b)通過成像方法，檢測(cè)所述受試者中的診斷劑。
[0194] 根據(jù)本發(fā)明的這種方法允許確定受試者腦中淀粉樣蛋白沉積的存在和位置，受試 者優(yōu)選是人。
[0195] 如此處所用，"可檢出量"指的是所施用的診斷劑的量足以能夠檢測(cè)診斷劑對(duì)淀粉 樣蛋白邱勺結(jié)合。
[0196] 如此處所用，"成像有效量"指的是所施用的診斷劑的量足以能夠成像所述診斷劑 對(duì)淀粉樣蛋白邱勺結(jié)合。
[0197] 用于檢測(cè)體內(nèi)淀粉樣蛋白β沉積的成像方法包括非侵入性神經(jīng)影像學(xué)技術(shù)，比如 磁共振波譜(MRS)或成像(MRI)、或者伽馬成像比如正電子發(fā)射斷層掃描(PET)或單光子發(fā) 射計(jì)算機(jī)斷層掃描(SPECT)。
[0198] 出于體內(nèi)成像的目的，可用的檢測(cè)儀器的類型是選擇給定標(biāo)記的主要因素。例如， 基于釓、鐵或者錳的造影劑，可以用來通過磁共振波譜(MRS)或成像(MRI)來檢測(cè)連接至所 述感興趣的物質(zhì)的根據(jù)本發(fā)明的VHH或VHH衍生物。放射性同位素比如 19F還特別適合本發(fā)明 方法中的體內(nèi)成像。所使用的儀器的類型將指導(dǎo)對(duì)感興趣的物質(zhì)的選擇。例如，所選的放射 性核素必須具有能夠被給定類型儀器檢測(cè)到的衰變類型。另一個(gè)考慮涉及造影劑的或者放 射性核素的半衰期。對(duì)于放射性同位素，半衰期應(yīng)該足夠長，從而在腦的最大攝取時(shí)它仍然 能夠被檢測(cè)到，但是也要足夠短從而受試者不維持有害的輻射。可以使用伽馬成像檢測(cè)根 據(jù)本發(fā)明的放射性標(biāo)記的VHH或者VHH衍生物，其中檢測(cè)發(fā)射的適當(dāng)波長的伽馬輻射。伽馬 成像方法包括，但不限于，SPECT和PET。優(yōu)選的是，對(duì)于SPECT檢測(cè)，所選擇的放射性同位素 將缺乏顆粒發(fā)射，但將產(chǎn)生140至200keV范圍的大量光子。對(duì)于PET檢測(cè)，放射性標(biāo)記將是正 電子發(fā)射的放射性核素，比如 19F，其湮滅而形成兩個(gè)511keV的伽馬射線，伽馬射線被PET相 機(jī)檢測(cè)到。
[0199] 通常，可檢測(cè)的診斷劑的劑量將取決于以下考慮的不同而不同，比如患者年齡、條 件、性別和疾病程度、禁忌癥、如果有，伴隨的治療和其它變量，由本領(lǐng)域的技術(shù)人員調(diào)整。 對(duì)受試者的施用可以是局部的或者系統(tǒng)性的，并通過靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)（通過脊髓液)等 實(shí)施。根據(jù)檢查的身體部位，施用還可以是皮內(nèi)或者腔內(nèi)。足夠的時(shí)間過去之后，以便于化 合物與淀粉樣蛋白β結(jié)合，例如30分鐘至48小時(shí)，通過常規(guī)成像技術(shù)比如MRS/MRI、SPECT、平 面閃爍成像、PET、和任何新興的成像技術(shù)等來檢查所研究的受試者區(qū)域。具體的規(guī)程將有 必要地取決于如上所述的患者特定因素，并且取決于所檢查的身體部位、所用的施用方法 和標(biāo)記類型;具體程序的確定對(duì)于技術(shù)人員而言是常規(guī)的。
[0200] 本發(fā)明還提供作為診斷劑的連接至診斷化合物的根據(jù)本發(fā)明的寡肽。
[0201] 本發(fā)明還提供一種藥物組合物，其包含上述所限定的治療劑和藥學(xué)上可接受的載 體。
[0202]如此處所用，"藥學(xué)上可接受的載體"旨在包含與藥學(xué)施用兼容的任何和所有溶 劑、分散介質(zhì)、涂料、抗菌和抗真菌劑、等滲和吸收延緩劑等。合適的載體描述于最新版本的 Remington's Pharmaceutical Sciences中，這是本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的參考文本。這些載體或者稀 釋劑的優(yōu)選示例包括，但不限于，水、鹽水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5%人血清白蛋白。還 可使用脂質(zhì)體、陽離子脂質(zhì)體和非水載體比如固定油。用于藥物活性物質(zhì)的這種介質(zhì)和試 劑的使用是本領(lǐng)域公知的。除非任何傳統(tǒng)介質(zhì)或試劑和上述限定的治療劑不兼容，其在本 發(fā)明組合物中的使用就可以考慮。
[0203] 本發(fā)明還提供根據(jù)本發(fā)明的VHH、VHH衍生物、治療劑或者藥物組合物作為藥物，特 別是用于治療由淀粉樣蛋白β沉積介導(dǎo)的疾病，比如阿爾茨海默氏病和唐氏綜合征。
[0204] 本發(fā)明還提供預(yù)防或治療由淀粉樣蛋白β沉積介導(dǎo)的疾病比如阿爾茨海默氏病和 唐氏綜合征的方法，包括向有需求的受試者施用根據(jù)本發(fā)明的治療劑或藥物組合物。
[0205] 如此處所用，術(shù)語"治療"包括出于治療、治愈、緩解、減輕、改變、彌補(bǔ)、改善、提高 或者影響疾病、疾病癥狀或者患病傾向的目的，向患者施用根據(jù)本發(fā)明的VHH、VHH衍生物、 治療劑或藥物組合物，其中所述患者患有疾病、疾病癥狀或者患病傾向。
[0206] 術(shù)語"預(yù)防"是指由淀粉樣蛋白β沉積介導(dǎo)的疾病比如阿爾茨海默氏病的進(jìn)展得以 降低和/或消除，或者由淀粉樣蛋白β沉積介導(dǎo)的疾病比如阿爾茨海默氏病的發(fā)作得以延遲 或消除。
[0207] 另一方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的VHH或VHH衍生物用于制備將上述限定的感興 趣物質(zhì)遞送穿過哺乳動(dòng)物血腦屏障的肽載體的用途，所述哺乳動(dòng)物血腦屏障優(yōu)選是人血腦 屏障。
[0208] 本發(fā)明還提供作為治療劑的根據(jù)本發(fā)明的連接至治療化合物的寡肽。
[0209] 除了前述特征，本發(fā)明還包括其它特征，將通過以下描述得以顯現(xiàn)，這涉及用于說 明本發(fā)明的實(shí)施例以及附圖。
【附圖說明】
[0210] 圖1顯示使用VHH R3VQ在人石蠟切片上進(jìn)行的淀粉樣蛋白斑塊的免疫組織化學(xué)染 色。6F3D(Akiyama H.等人，1996，Neurosci lett.，206:169-72)用作參考抗Αβ抗體。
[0211] 圖2顯示使用VHH R3VQ在新鮮人AD腦組織上進(jìn)行的淀粉樣蛋白β斑塊的免疫組織 化學(xué)染色以和8)。468(町311丨6￥81^1\等人，1996,8.8丨〇(*6111夂，313:575-80)用作參考抗八 β抗體(C和D)。
[0212]圖3顯示使用VHH R3VQ在新鮮腦轉(zhuǎn)基因 TauPS2APP小鼠組織上進(jìn)行的淀粉樣蛋白 斑塊的免疫組織化學(xué)染色(A)。468用作參考抗Αβ抗體(B)。
[0213] 圖4顯示在人腦提取物上以及在Αβ42上進(jìn)行的Western印記，以VHH R3VQ顯色（無 酚紅的Ham's F12介質(zhì)(Gibco)或者含有蛋白酶抑制劑[200μg/ml PMSF、2μg/ml胃酶抑素 A、 4μg/ml亮抑酶肽、30μg/ml芐脒鹽酸鹽]的緩沖液A[roS，pH 7·4、0·32Μ蔗糖、50mM Hepes、 25mM MgC12、0.5mM DTT])。
[0214] 圖5A顯示立體定向注射VHH R3VQ之后，在轉(zhuǎn)基因 TauPS2APP小鼠石蠟包埋的切片 中淀粉樣蛋白β斑塊的免疫組織化學(xué)染色。
[0215] 圖5Β顯示圖5Α插圖的放大。
[0216] 圖6Α顯示立體定向注射R3VQ-N-(DOTA/Gd)!-2 2e之后，在轉(zhuǎn)基因 TauPS2APP小鼠石 蠟包埋的切片中淀粉樣蛋白β斑塊的免疫組織化學(xué)染色。
[0217] 圖6Β顯示圖6Α插圖的放大。
[0218] 圖6C顯示遠(yuǎn)離注射部位之處，存在于丘腦中的淀粉樣蛋白β斑塊的標(biāo)記。
[0219] 圖6D顯示圖6C插圖的放大。
[0220]圖6Ε顯示在相同小鼠上用4G8抗體標(biāo)記淀粉樣蛋白斑塊而進(jìn)行的對(duì)照。
[0221 ]圖 7Α:將轉(zhuǎn)基因 TauPS2APP小鼠的腦浸入抗ΑβνΗΗ-Gd 2e (R3VQ-N- (DOTA/Gd)卜2造 影劑(0.02mg/ml，相當(dāng)于0.0ImM Gd)溶液之后，體外MR圖像顯示低信號(hào)的點(diǎn)（白色箭頭）。
[0222] 圖7B顯示在相同小鼠上淀粉樣蛋白斑塊的MRI檢測(cè)，通過Gd染色進(jìn)行顯色。
[0223] 圖7B顯示在相同小鼠上淀粉樣蛋白斑塊的MRI共定位，通過Gd染色進(jìn)行顯色(箭頭）。
[0224] 圖7C顯示相同小鼠上淀粉樣蛋白β斑塊的免疫組織化學(xué)染色(箭頭）。
[0225] 圖7D是轉(zhuǎn)基因 TauPS2APP小鼠的腦浸入采用RSVQ-MDOTA/Gdh-2 2e相同濃度的 釓溶液(O.OlmM)的對(duì)照。
[0226] 圖8A:腦室內(nèi)注射之后，抗ΑβνΗΗ-Gd 2e(R3VQ-N-(D0TA/Gd)!-2;以 lyg/μL的 ΙμL/ 偵U顯示海馬中離體MR圖像上低信號(hào)的點(diǎn)（白箭頭）。
[0227] 圖8B顯示在相同小鼠上進(jìn)行的淀粉樣蛋白斑塊的MRI共定位，通過Gd染色進(jìn)行顯 色(箭頭）。
[0228] 圖8C顯示在相同小鼠上進(jìn)行的淀粉樣蛋白β斑塊的免疫組織化學(xué)染色(箭頭）。
[0229] 圖8D是轉(zhuǎn)基因 TauPS2APP小鼠注射采用imQ-rHDOTA/Gdh-2相同濃度的釓溶液 (O.lmM)的對(duì)照。
[0230] 圖9顯示通過非位點(diǎn)特異性方法（A)和位點(diǎn)特異性方法（B)進(jìn)行的標(biāo)記的VHH (R3 VQ)的合成。VHH 1和3在roS/NaCl /咪唑緩沖液中洗脫自親和柱。通過非位點(diǎn)特異性方法 在緩沖液交換之后進(jìn)行1的綴合(A)，以及，有緩沖液交換(方法1)或者沒有緩沖液交換(方 法2)時(shí)通過位點(diǎn)特異性方法進(jìn)行3的綴合(B)。連接位點(diǎn)顯示在蛋白上。標(biāo)記分別產(chǎn)生多分 散混合物（2f顯示為示例，以及2e)和化學(xué)上明確的綴合物（5顯示為示例）。11'=每VHH的 DOTA/Gd的平均量（隨機(jī)分布在不同位置）。111 =每VHH的DOTA/Gd的精確量(位于單個(gè)位點(diǎn)）。 總產(chǎn)率(括號(hào)里顯示的)包括從親和柱洗脫緩沖液中的蛋白開始的所有步驟(凈肽含量）。馬 來酰亞胺_(D0TA/Gd) 3化合物4(C)的固相合成描述于圖9(C)。通過傳統(tǒng)的固相肽方法采用 Fmoc化學(xué)和HATU/DIEA作為偶聯(lián)劑制備4?？偖a(chǎn)率表示在括號(hào)中。D0TA結(jié)構(gòu)式顯示在插圖中。
[0231] 圖 10顯示(A)抗ΑβνΗΗ A7、B10、R3VE、R3VQ和F12的氨基酸序列比對(duì)；CDR1、CDR2、 CDR3下劃線顯示，（B)R3VQ-SH 3的氨基酸序列，（C)R3VE-SH的氨基酸序列。
[0232] 圖11顯示VHH R3VQ-S-(D0TA/Gd)3的性質(zhì)分析和評(píng)價(jià)(化合物5圖9)，其是通過位 點(diǎn)特異性綴合獲得的。(A)HPLC/MS。（B)IEF。（C) iv注射之后，在腦中通過IHC檢測(cè)評(píng)價(jià)VHH的 BBB的穿過。和未綴合的蛋白R(shí)3VQ-SH的比較顯示在A、B中。
[0233] 圖12顯示用R3VQ-S-(D0TA/Gd)3體外孵育之后淀粉樣蛋白斑塊的MRI檢測(cè)。然而， 在陰性對(duì)照PS2APP小鼠腦中沒有檢測(cè)到對(duì)比異常（A)，用R3VQ-S-(D0TA/Gd) 3體外孵育 PS2APP小鼠腦之后，顯示若干低信號(hào)的點(diǎn)（B，白色箭頭）。這些低的信號(hào)和淀粉樣蛋白斑塊 共定位，其中淀粉樣蛋白斑塊通過Gd染色程序所突出顯示，對(duì)于通過MRI檢測(cè)淀粉樣蛋白斑 塊而言Gd染色程序是金標(biāo)準(zhǔn)陽性對(duì)照(C，白色箭頭）。在7T光譜儀上實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)。
[0234] 圖13顯示iv注射R3VQ-S-(D0TA/Gd)3之后淀粉樣蛋白斑塊的離體MRI檢測(cè)。用roS (陰性對(duì)照，A-B)或者R3 VQ-S- (DOTA/Gd) 3 以 20mg/kg (C)或 50mg/kg (D) i v注射小鼠，5小時(shí)后 處死。在提取的固定的腦中于11.7T時(shí)獲得MR圖像。相較于注射的腦而言(C和D，白色箭頭）， 陰性對(duì)照不顯示強(qiáng)烈的對(duì)比異常(A和B)。相較于20mg/kg而言，50mg/kg時(shí)這些低信號(hào)的點(diǎn) 更強(qiáng)且更多。這些低信號(hào)的點(diǎn)和淀粉樣蛋白斑塊共定位，其中淀粉樣蛋白斑塊通過陽性對(duì) 照程序進(jìn)行顯色(E和F，白色箭頭）。
[0235] 圖14顯示通過位點(diǎn)特異性綴合獲得的VHH R3VQ-S-AF488的性質(zhì)的體外分析和評(píng) 價(jià)。淀粉樣蛋白斑塊上的(A)HPLC/MS。（B) SDS-PAGE。（C) IEF。（D) IHC。和未綴合的蛋白R(shí)3VQ-SH的比較顯示于A、B、C。
[0236] 圖15顯示在2歲的PS2APP小鼠皮質(zhì)表面局部腦輸注R3VQ-S-AF488之后，淀粉樣蛋 白斑塊和CAA的體內(nèi)成像。箭頭表示CAA的標(biāo)記。標(biāo)尺=50μηι。
[0237] 圖16顯示使用雙光子顯微鏡的R3VQ-S-AF 488體內(nèi)成像。（Α)在2歲的PS2APP小鼠 中i ν注射R3VQ-S-AF488之后的腦中體內(nèi)成像，其中采用距離皮質(zhì)表面360μπι深的投影體積 進(jìn)行最大強(qiáng)度投影(ΜΙΡ)重建。Τ0代表iv注射前的基線成像。標(biāo)尺為50μπι?？占^顯示血管A β，實(shí)箭頭表示實(shí)質(zhì)的Αβ沉積。（B)在2歲的PS2APP小鼠中iv注射R3VQ-S-AF488之后，注射后 3.5小時(shí)的腦體內(nèi)成像。空箭頭顯示血管Αβ，實(shí)箭頭表示實(shí)質(zhì)的Αβ沉積。（C)在接受了iv注射 R3VQ-S-AF488的PS2APP小鼠中，采用抗His mAb進(jìn)行的淀粉樣蛋白斑塊的免疫組織化學(xué)染 色。在整個(gè)腦觀察到由R3VQ的淀粉樣蛋白斑塊的免疫染色。（D)PS2APP小鼠中i v 10mg/kg和 iv 50mg/kg的R3VQ-S-AF488之間淀粉樣蛋白斑塊的免疫染色的比較，顯示對(duì)IHC信號(hào)的劑 量依賴效應(yīng)。
[0238] 圖17顯示使用雙光子顯微鏡的R3VE體內(nèi)成像:堿性pi對(duì)于VHH穿過BBB是關(guān)鍵的。 (A)R3VQ和R3VE化合物的IEF分析。對(duì)于VHH和綴合物而言，R3VE都比R3VQ堿性弱(對(duì)于R3VE-S-AF488而言，pi在7.5左右）。（B)相較于接受R3VQ-S-AF488的小鼠，只在接受靜脈注射劑量 l〇mg/kg的R3VE-S-AF488的小鼠中觀察到腦淀粉樣蛋白血管病。（C)在iv注射有R3VQ-S-AF488 10mg/kg和R3VE-S-AF488 10mg/Kg的小鼠中，采用抗His mAb的組織學(xué)染色的比較。
[0239] 圖18顯示在2歲的PS2APP小鼠中iv注射mAb 4G8-AF488(10mg/Kg)之后腦的體內(nèi)成 像。僅在血管中觀察到mAb 4G8的存在。血管外信號(hào)是人為的，因?yàn)樵趨⒖纪ǖ乐幸灿^察到 了（紅色）。
【具體實(shí)施方式】
[0240] 實(shí)施例1:產(chǎn)生偶聯(lián)至釓造影劑的抗-AI3VHH及其體外/體內(nèi)評(píng)價(jià) [0241 ]材料和方法
[0242] 1. VHH R3VQ的生產(chǎn)、選擇和純化
[0243] 抗原的制備以及在羊駝內(nèi)體液免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)
[0244] AM2肽(AM2)(lmg Bachem)溶解在900yL H20中并渦旋。添加 100yL PBS 10X，在 使用之前將混合物在室溫孵育一個(gè)月。250yL混合物和250yL弗氏完全佐劑混合用于首次免 疫，和250yL弗氏不完全佐劑用于隨后的免疫。一只年輕的成年雄性羊盤(Lama pacos)在第 0、21和35天用250yg免疫原進(jìn)行免疫。在第50天，取血清樣本，通過ELISA使用AM2作為抗原 監(jiān)測(cè)免疫反應(yīng)。
[0245] 文庫構(gòu)建與篩選
[0246] 在第50天收集250ml免疫動(dòng)物的血液，通過在Ficoll(Pharmacia)不連續(xù)梯度上離 心來分離外周血淋巴細(xì)胞，并保存于-80°C直至進(jìn)一步使用。按照之前在Lafaye P.等人 (1995，Res Immunol ·，146 : 373-382)中描述的獲得總RNA和cDNA，并且使用CH2F0RTA4和 VHBACKA6引物通過PCR擴(kuò)增編碼VHH結(jié)構(gòu)域的DNA片段，所述引物分別退火至VH基因的3'和 5'側(cè)翼區(qū)域。使用特異于長鉸鏈同二聚抗體的引物VHBACKA4和VHF0R36或者引物VHBACKA4 和GGACTAGTTGCGGCCGCTGGTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG-3' ) (SEQ ID N0.13)，擴(kuò)增的產(chǎn) 物用作第二輪PCR的模板。引物互補(bǔ)于擴(kuò)增產(chǎn)物的5'和3'端，以及在VHH基因的末端并入 Sfil和Notl限制性位點(diǎn)。消化PCR產(chǎn)物并連接至噬菌體表達(dá)載體pHENl。獲得的文庫包含兩 個(gè)子文庫，一個(gè)源自沒有鉸鏈的VHH DNA編碼基因，另一個(gè)來自長鉸鏈抗體基因。使用兩個(gè) 子文庫生產(chǎn)和分離菌體，并隨后合并。
[0247] 按照先前描述的（Lafaye P.等人，2009，Mol Immunol · 46:695-704)，平行地用生 物素化的Αβ1-42、Αβ1_40或者Αβ1-16肽針對(duì)反應(yīng)性進(jìn)行文庫篩選。通過與各生物素化的肽 在37 °C下輕微攪動(dòng)孵育1小時(shí)、然后在37 °C下用鏈霉親和素珠和混合物孵育15 '，進(jìn)行文庫 (1013轉(zhuǎn)導(dǎo)單位)篩選。在三輪篩選中的每一輪分別使用不同的阻斷劑:2%脫脂乳、1:4稀釋 的Licor、以及4%BSA。在每輪篩選降低所用的生物素化肽的濃度，分別用100nM、50nM和 1〇ηΜ。使用HRP/抗M13單克隆抗體綴合物(GE Healthcare)通過標(biāo)準(zhǔn)的ELISA程序篩選噬菌 體克隆用于檢測(cè)(見下面）。
[0248] VHH 表達(dá)
[0249] 使用Ncol和Notl限制性位點(diǎn)，在載體pHENl中所選納米抗體的編碼序列亞克隆至 含有6-組氨酸標(biāo)簽的修飾細(xì)菌表達(dá)載體pET23。用IPTG(0.5mM)在16°C過夜誘導(dǎo)后，轉(zhuǎn)化的 大腸桿菌BL21(DE3)LysS細(xì)胞在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)VHH。根據(jù)制造商的說明，通過MAC從細(xì)胞質(zhì) 提取物使用帶有Ni 2 +的HiTrap粗提柱（GE Healthcare)分離純化的VHH，隨后是配有 Superdex 75柱的尺寸排阻色譜（GE Healthcare)。在50mM磷酸鈉緩沖液、300mM NaCl和 500mM咪唑緩沖液中洗脫VHH(特別是R3VQ(Hi s) -NH2;化合物1，在圖9中）。
[0250] 2.VHH R3VQ生化性質(zhì)的描述
[0251] 免疫印跡
[0252] AM2肽重懸于含有8M尿素的NuPAGESLDS樣本緩沖液（Invitrogen)中。用NuPAGE Novex 4-12%Bis-tris凝膠（Invitrogen)通過聚丙稀酰胺凝膠電泳(PAGE)分離之后，半干 轉(zhuǎn)移到Hybond-C(Amersham)上，使用Xcel 1 II 印記模塊（Invi trogen)進(jìn)行 Western印記。免 疫化學(xué)反應(yīng)之前，在4%脫脂乳溶液中封閉膜。用VHH進(jìn)行膜的免疫印跡，用兔抗His標(biāo)簽 (eBioscience)多克隆抗體隨后是過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白（Abeam)顯色。最 后，使用化學(xué)發(fā)光試劑盒(GE Hea 1 thcare)對(duì)過氧化物酶活性進(jìn)行可視化。
[0253] ELISA
[0254] 在4°C通過用稀釋于PBS中的lμg/ml生物素化的Α-β40或者A-M2(優(yōu)選地Α-β40)孵 育過夜，來包被鏈霉親和素包被的微滴定板(Thermo Scientific，丹麥）。用roS中的0.1 % Tween 20緩沖液洗板。VHH R3VQ稀釋于roS中的緩沖液0.5%明膠0.1%Tween 20。37°(：孵育 2h之后，分別在添加兔抗His標(biāo)簽多克隆抗體(eBiosciences)以及隨后的過氧化物酶標(biāo)記 的羊抗兔免疫球蛋白（Abeam)之前再次洗板，最后根據(jù)制造商規(guī)程用0PD(〇-鄰苯二胺鹽酸 鹽，Dako)顯色。
[0255] 通過ELISA確定解離常數(shù)
[0256] 按照之前描述的（Friguet B.等人，1985，Immunol Methods，77:305-19)，確定VHH 的結(jié)合親和性。簡(jiǎn)言之，在4°C在溶液中，將各種濃度的Αβ肽(Αβ片段l-16、10-20、15-25、22-35和29-40)和已知量的VHH過夜孵育，直至到達(dá)平衡。通過初始ELISA校準(zhǔn)確定所用VHH濃 度。各混合物（1〇〇μ1)轉(zhuǎn)移至之前包被有抗原的微滴定板的孔，在4°C孵育20分鐘。用PBS中 0.1 %Tween20的緩沖液洗板，通過添加 β-半乳糖苷酶-綴合的羊抗兔Ig(Biosys，Compig gne，法國）和4-甲基傘形酮(methylumbelliferyl)a-D半乳糖苷(Sigma)檢測(cè)結(jié)合的VHH。在 355nm激發(fā)之后，在460nm讀取焚光(Fluoroskan，Labsystem，芬蘭）。通過回歸曲線的斜率估 計(jì)KD，其中回歸曲線是通過結(jié)合抗體的分?jǐn)?shù)倒數(shù)相對(duì)于抗原摩爾濃度的倒數(shù)作圖而獲得 的。
[0257] 序列分析
[0258] 通過GATC Biotech測(cè)序VHH的編碼DNA，用DNA strider處理序列。
[0259] 確定 pi
[0260] 通過等電聚焦使用IEF 2-9凝膠(Invitrogen)確定VHH的pi。使用在正極施加樣品 的NEPGHE(非平衡pH梯度凝膠電泳），因?yàn)槠湓试S在包括pH 8.5至10.5的堿性凝膠范圍進(jìn)行 最佳蛋白分析。規(guī)程詳見SERVAGel IEF 3-10說明手冊(cè)。
[0261] 3.VHH R3VQ偶聯(lián)至MRI造影劑以及合成造影劑的MRI性質(zhì)的描述
[0262] 用1，4,7，10_四氮雜環(huán)十二烷-1，4,7，10-四乙酸(D0TA)(螯合劑)將VHH R3VQ綴合 至釓(MRI造影劑）。采用基于非位點(diǎn)特異性和位點(diǎn)特異性偶聯(lián)的兩個(gè)策略：
[0263] -第一策略包括步驟：（i)將螯合劑D0TA綴合至VHH(R3VQ_NH2 1)的賴氨酸殘基，和 (ii)隨后與MRI造影劑即釓(Gd)進(jìn)行螯合（參見圖9A)。如反相高效液相色譜/質(zhì)譜（RP-HPLC/MS)所示，其產(chǎn)生綴合物R3VQ-N-(D0TA/Gd) n 2的復(fù)合多分散混合物，其中Gd和Gd:VHH 化學(xué)計(jì)量范圍的分布隨機(jī)。通過改變D0TA綴合步驟的條件，用不同的DOTA/Gd密度制備多種 綴合物（總產(chǎn)率60-67 % )。通過IHC和MRI進(jìn)行體內(nèi)評(píng)價(jià)時(shí)，在腦室內(nèi)注射之后R3VQ-N-(DOTA/GcOJ^合物能夠識(shí)別小鼠中的淀粉樣蛋白斑塊。
[0264] -第二策略采用位點(diǎn)特異性方法，其涉及用馬來酰亞胺化合物標(biāo)記VHH R3VQ(參見 圖9B)。Cys-工程化的R3VQ(R3VQ-SH 3)從N至C端含有6-組氨酸標(biāo)簽、凝血酶切位點(diǎn)、R3VQ VHH序列隨后是G3S間隔序列和三個(gè)額外的氨基酸CSA，Cys-工程化的R3VQ(R3VQ-SH 3)克隆 至載體PET23,從而允許高水平的表達(dá)。通過SDS-PAGE和RP-HPLC/MS顯示單結(jié)構(gòu)域產(chǎn)物純化 至同質(zhì)(homogene i ty)。R3VQ-SH的pI值在8 · 5-9的范圍。使用9-荷甲氧羰基(Fmoc)化學(xué)通過 固相肽合成來制備馬來酰亞胺_(D0TA/Gd)3化合物4。當(dāng)通過硫代加成綴合至馬來酰亞胺-(DOTA/Gd) 3化合物，RP-HPLC/MS顯示R3VQ-SH完全轉(zhuǎn)化成明確的化合物R3VQ-S-(DOTA/Gd) 3 5,其中產(chǎn)率是70%。相較于未標(biāo)記的R3VQ-SH之一，R3VQ-S-(D0TA/Gd)3的pi略降低。在競(jìng)爭(zhēng) 性抑制實(shí)驗(yàn)中，確定R3VQ-SH和R3VQ-S-(D0TA/Gd) 3的結(jié)合特性，實(shí)驗(yàn)涉及結(jié)合至ELISA板的 ΑΜ0和可溶的ΑΜ0。對(duì)于R3VQ-SH和R3VQ-S-(D0TA/Gd) 3給出50 %結(jié)合抑制的ΑΜ0濃度計(jì)算 得lμg/ml，表明添加 DOTA/Gd不影響VHH結(jié)合特性。此外，根據(jù)轉(zhuǎn)基因 B6PS2APP小鼠中VHH-特 異性免疫反應(yīng)性的分布，抗原修復(fù)(retrieval)預(yù)處理之后R3VQ-SH在小鼠石蠟切片中顯示 良好的免疫檢測(cè)Αβ斑塊的能力。
[0265] 3.1常規(guī)合成方法
[0266] 除非另有指明，氨基酸衍生物和試劑分別購自Novabiochem和Sigma-Aldrich。用 6N HC1在110°C水解化合物20小時(shí)之后，通過定量氨基酸分析(AAA)使用Beckman 6300分析 儀確定肽和VHH溶液(凈蛋白含量）的濃度。在連接有UV檢測(cè)器2487 (220nm)和Q-Tofmicro? 光譜儀(Micromass)且?guī)в须妵婌F離子(正模式)源(Waters)的Alliance 2695系統(tǒng)上進(jìn)行 RP-HPLC/MS分析。在自動(dòng)上樣器上樣本冷卻至4°C。用乙腈+0.025%甲酸(A)/水+0.04%TFA +0.05%甲酸(B)進(jìn)行線性梯度，持續(xù)10或者20min。所用的柱是XBridge? BH1300C18(3.5y 111，2.11100111111)(1&七6^)(梯度10-100%厶）。源溫度維持在120°(：，去溶劑化溫度為400°(：。錐 電壓是40V。在添加有Β的各自緩沖液中以0.4-lmg/ml的濃度注射樣本。預(yù)期的Mr值對(duì)應(yīng)著Ν 端缺失Met和一個(gè)二硫鍵的蛋白平均質(zhì)量。在相同光譜儀上以正模式通過直接注入(源溫度 和去溶劑化溫度分別維持在80 °C和250 °C )來記錄Mr分析。以5μΜ的濃度，樣本溶解在含 0.1%甲酸的水/乙腈（1/1)中。使用帶有UV檢測(cè)器的Agilent 1200栗系統(tǒng)在220nm分析4的 純度。所用的柱是Kromasil C18(l〇〇 人，5以111，4.6125〇111111)以11')，用乙腈(￥11〇(〇/水+0.1% TFA(VWR) (D)進(jìn)行梯度 20min。
[0267] 3.2.非位點(diǎn)特異性方法
[0268] 指明相對(duì)于反應(yīng)基團(tuán)的所有試劑的摩爾當(dāng)量(5NH2每R3VQ和平均1的D0TA/R3VQ綴 合物）?？偖a(chǎn)率(參見下表2)包括從親和柱洗脫緩沖液中的蛋白1開始的所有合成步驟。通過 終產(chǎn)物2a_f的實(shí)際量除以預(yù)期的量(凈蛋白含量)來計(jì)算它們。
[0269] 洗脫自親和柱的1?3￥〇(把8)-順2￥冊(cè)1在含有30〇111]\1恥(：1的？85緩沖液(？85/^(：1) 中透析。溶于PBS/NaCl(120yl)中的1，4,7，10_四氮雜十二烷-1，4,7，10-四乙酸單(N-羥基 琥珀酰亞胺酯）（DOTA-NHS) (274yg，相對(duì)于氨基而言4eq)添加至1 (480μ1，0.60mg/ml)，在室 溫?cái)嚢枞芤?。?5min取得等份（10μ1)，用100mM Tris緩沖液pH 7.3(90μ1)稀釋，通過HPLC/ MS分析來監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。3h之后，溶液冷卻至4°C，使用Vivaspin 500離心過濾裝置（3， 000MWC0 PES)(Sartorius)，將緩沖液交換為0.4M乙酸Na緩沖液pH 5。在相同緩沖液(5μ1) 中的GdCl3(149yg，相對(duì)于平均D0TA基團(tuán)而言45eq)添加至獲得的D0TA-VHH綴合物(480μ1)。 在室溫?cái)嚢枞芤?.5小時(shí)。采用上述相同的Vivaspin裝置，在4°C將緩沖液交換為PBS/NaCl， 濃縮溶液以提供R3VQ(His)-N-(DOTA/Gd)〇- 2綴合物2f (105μ1，1.48mg/ml)?？偖a(chǎn)率是67%。 [0270] 使用相同規(guī)程獲得綴合物2e，除了D0TA-NHS是分批（portionwise)添加至1以外 (每45min 0.5eq，相對(duì)于氨基而言總共5.5eq)。在室溫?cái)嚢枞芤?hl5?？偖a(chǎn)率是60%。
[0271] R3VQ(His)-NH2l
[0272] AAA：Ala 15.8(16),Arg 9.1(9),Asp+Asn 13.4(13),Glu+Gln 16.0(15),Gly 13.4(14),His 5.7(7),lie 3.1(3),Leu 8.4(8),Lys 4.1(4),Phe 4(4),Pro 6.1(7),Ser 11.3(13),Thr 10.0(ll),Tyr 4.8(5),Val 11.1(11).
[0273] MS:15753.0996(C68iHi〇53N2〇9〇2i6S4calcd 15752.3949)
[0274] R3VQ (Hi s) -N- (DOTA/Gd) o-22f
[0275] AAA:Ala 16.0(16)，Arg 10.0(9)，Asp+Asn 12.8(13)，Glu+Gln 15.0(15)，Gly 13.8(14),His 6.7(7),lie 3.0(3),Leu 8.2(8),Lys 4.5(4),Phe 4(4),Pro 8.5(7),Ser 10.5(13),Thr 10.1(11),Tyr4.8(5),Val 11.1(11).
[0276] MS:16293.1328((D0TA/Gd)i:C697Hi〇76N2i3〇223S4Gd calcd 16293.0263)
[0277] 16833 · 5586( (D0TA/Gd)2: C7i3Hi〇99N2i7〇23〇S4Gd2calcd 16833 · 6576)
[0278] 3.3位點(diǎn)特異性方法
[0279] R3VQ-SH3 的生產(chǎn)
[0280] 用Ncol和Xhol限制性位點(diǎn)，將Cys的工程化VHH(R3VQ-SH 3)編碼序列克隆至修飾 細(xì)菌表達(dá)載體PET23。用IPTG(0.5mM)在16°C過夜誘導(dǎo)后，轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)pLysS 細(xì)胞在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)3。根據(jù)制造商的說明，通過IMAC從細(xì)胞質(zhì)提取物使用帶有Ni2 +的 HiTrap粗提柱(GE Healthcare)分離純化的VHH。在含有500mM咪唑的roS/NaCl緩沖液中洗 脫3。
[0281] AAA：Ala 16.1(16),Arg 10.2(10),Asp+Asn 13.6(13),Glu+Gln 11.9(ll),Gly 19.1(20),His 6.0(7),lie 3.1(3),Leu 8.5(8),Lys 2.2(2),Phe 4(4),Pro 4.3(4),Ser 15.5(18),Thr 9.5(10),Tyr4.8(5),Val 12.9(12).
[0282] MS： 15723.4268(C67iHi〇4iN2i3〇2i7S5calcd 15724.2820).
[0283] 馬來酰亞胺-(DOTA/Gd)3 4的合成
[0284]在固相上，分步從?111〇(3-617-131^樹脂進(jìn)行4的合成（14311^，0.0931]1111〇1)。使用2-(1H-9-氮雜苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽(HATU)(分別1.06和2.9eq)/二 異丙基乙胺（DIEA)(分別2.2和6eq)作為偶聯(lián)劑，以及二甲基甲酰胺（DMF) (Applied Biosystems)作為溶劑，人工并入構(gòu)建塊1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7-三-叔丁基-乙 酸-1〇-0-〇-卩111〇。4-￡-乙酰胺-1-賴氨酸）[卩1110。-1^8(00丁厶（(^811)3))-011](1.169) (]\^(：1'〇〇5^1;^8)和6-馬來酰亞胺己酸（369)。用0]\07中的01(](369)并入?1]1〇(3-617-0!1(369)。 通過Kaiser測(cè)試(E.Kaiser等人（1980)Anal ·Biochem. 34,595-598)監(jiān)測(cè)用Lys、Gly和馬來 酰亞胺衍生物進(jìn)行的偶聯(lián)步驟，分別在3h、2h和lh內(nèi)完成。用DMF中的20%哌啶除去Fmoc保 護(hù)。第三賴氨酸衍生物之后，最后和6-馬來酰亞胺己酸的偶聯(lián)在四分之三的產(chǎn)物 (0.07mmol)上進(jìn)行。在4°C肽-樹脂懸浮于10ml TFA(Applied 13;[085^丨61118)/水/三異丙基娃 烷(95/2.5/2.5v/v/v)中，在RT攪拌4h。樹脂過濾后，濃縮溶液，用二乙醚沉淀粗產(chǎn)物。離心 之后，沉淀物溶于水，凍干至119mg粗D0TA-肽的產(chǎn)率，這是通過NMR、MS和RP-HPLC(梯度10-40 % C，保留時(shí)間9.2min)分析的。
[0285] 咕匪1?(〇2〇):36.69(8,2!1，01]\^11)，4.18(111，2!1，20^)，4.08(111，1!1，0^)，3.87-3.78(m，6H，CH 2Gly)，3.74-3.48(b，24H，CH2C0 DOTA)，3.34(t，2H，CH26-Mal，J5,6 = 0， 017Hz)，3.30-2.99(b，48H，CH2CH2N D0TA)，3.06(b，6H，CH2e)，2.14(m，2H，CH22-Mal)，1.74-1.53(m，6H，CH2fi)，1.49-1.34(m，10H，CH2s，CH23-Mal，CH 25-Mal)，1.29-1.18(m，6H，CH2Y)， 1.16-1.06(m，2H，CH24-Mal).
[0286] 13C 匪R(D2〇)Jl77.11(lC，⑶NH Mal)，175.15，174.63，174.36(3C，TOLys)， 173.26(2C，C0 Mal)，172.93(lC，C00H Gly)，171.48，171.21(2C，C0 Gly)，163.04-162.68 (4C,C0NH DOTA),134.22(2C,CH Mai) ,120.59,117.69,114.79,111.90(TFA),55.20-53.10 (12C，CH2CO DOTA)，54 · 04，53 · 80，53 · 47(3C，CHa)，52 · 20-46 · 80(24C，CH2CH2NDOTA)，42 · 38， 41.00(3C，CH2Gly)，39.10(3C，CH2e)，37.37(lC，CH26-Mal)，35.04(lC，CH22-Mal)，30.48， 30.24,30.23(3C，CH2fs)，27.67,27.33,24.67(3C，CH23-Mal，CH25-Mal，CH2s)，25.43(1C， CH24-Mal)，22·43，22·33，22·15(3C，CH2y) ·
[0287] MS:[M+H] + 1925.9888，[M+K] + 1963.9391 (C82Hi36N22〇3icalcd[M+H] + 1927.1195，[M+ K]+1965.2098).
[0288] DOTA-肽中間體（99mg)溶于0.4M乙酸Na緩沖液pH 5(41ml)，添加 Gd(0Ac)3.xH20 (123mg，相對(duì)于DOTA而言2eq)。在95 °C攪拌25min之后，冷卻溶液并加載至C18反相柱(2g，直 徑1.5cm)。用4體積的水洗柱，用三體積的水/乙腈1/1洗脫產(chǎn)物，凍干后獲得79mg產(chǎn)物。通過 反相快速色譜（30x200mm)純化粗D0TA/Gd肽，使用梯度為乙腈+0.1%TFA/緩沖液D持續(xù) 40min，從5/95至35/65 (20ml/min，保留時(shí)間18min)。主餾分凍干后，獲得6lmg的4，總產(chǎn)率 44% (總產(chǎn)率包括所有合成步驟，在基于加載在樹脂上的第一Gly殘基分離的產(chǎn)物4的凈肽 含量上進(jìn)行計(jì)算）。通過MS和RP-HPLC(梯度5-35%C，保留時(shí)間12.2min，純度>90%)分析4。
[0289] MS:2388.8889(C82Hi27N22〇3iGd3calcd 2388.7901)。
[0290] R3VQ-S-(D0TA/Gd)3 5的合成
[0291] 洗脫自親和柱的R3VQ-SH VHH 3在含有300mM NaCl的roS緩沖液(PBS/NaCl)中透 析。在水溶液（135μ1)中的4(1.35mg，相對(duì)于每VHH的1巰基而言3eq)添加至3(1.5ml，roS/ NaCl pH 6.8中2mg/ml)，溶液在4°C攪拌3h。然后，使用Vivaspin 2000離心過濾裝置（3， 000MW⑶PES)(Sartorius)滲透溶液。用緩沖液Β(20μ1)稀釋3和5的等份（20μ1)用于RP-HPLC/MS分析。此外，3和5的等份（10μ1)稀釋于100mM Tris緩沖液pH 7.3(90μ1)用于ELISA 分析。以70%的產(chǎn)率獲得lml的5(2.36mg/ml)。通過終產(chǎn)物5的實(shí)際量除以其預(yù)期的量(凈蛋 白含量)來計(jì)算。
[0292] 還在親和柱洗脫緩沖液(含有500mM咪唑的PBS/NaCl)中直接進(jìn)行相同反應(yīng)，得到 83%的總產(chǎn)率。因此，當(dāng)綴合物直接在親和柱洗脫緩沖液(PBS/NaCl/咪唑）中進(jìn)行時(shí)，改善 用于獲得R3VQ/Gd綴合物的過程：i)步數(shù)降低至2,以及ii)總產(chǎn)率提高直至83%。這種過程 改善還用另一 VHH進(jìn)行了驗(yàn)證(數(shù)據(jù)未顯示）。
[0293] AAA：Ala 14.9(16),Arg 10.2(10),Asp+Asn 12.2(13),Glu+Gln ll.l(ll),Gly 24.6(23)，His*(7)，Ilc 3.1(3)，Leu 8.5(8)，Lys 11.7*(5)，Phe 4(4)，Pro 4.8(4)，Ser 14.9(18)，Thr 9.1(10)，Tyr 5.0(5)，Val 12.6(12)。[*不能確定His，因?yàn)楹弯@共洗脫。因 為在分析條件下和馬來酰亞胺衍生物共洗脫，而高估了 Lys]。
[0294] MS: 18113.7383(C753Hii68N235〇248S5Gd3calcd 18113.0720)。
[0295] SDS-PAGE 電泳
[0296] 使用NuPAGE Novex 4-12%Bis_Tris凝膠（Invitrogen)根據(jù)制造商說明進(jìn)行聚丙 烯酰氨凝膠電泳(PAGE)。
[0297] pi的確定
[0298] 通過等電聚焦使用IEF 2-9凝膠(Invitrogen)確定VHH的pi。使用在正極施用樣品 的NEPGHE(非平衡pH梯度凝膠電泳），因?yàn)槠湓试S在包括pH 8.5至10.5的堿性凝膠范圍進(jìn)行 最佳蛋白分析。規(guī)程詳見SERVAGel IEF 3-10說明手冊(cè)。
[0299] ELISA
[0300] 在4°C通過用稀釋于PBS中的lμg/ml生物素化的Α-β40或者A-M2(優(yōu)選地Α-β40)孵 育過夜，來包被鏈霉親和素包被的微滴定板(Thermo Scientific，丹麥）。用roS中的0.1 % Tween 20緩沖液洗板。對(duì)于非位點(diǎn)特異性策略，RSVQ-MfeURSVQ-MDOTA/Gdh-2 2e稀釋于 0.5 %明膠0.1 % Tween 20的roS緩沖液中。37 °C孵育2h之后，分別在添加兔抗Hi s標(biāo)簽多克 隆抗體(eBiosciences)以及隨后的過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白（Abeam)之前再次 洗板，最后根據(jù)制造商規(guī)程用〇PD(o_鄰苯二胺鹽酸鹽，Dako)顯色。對(duì)于位點(diǎn)特異性策略， R3VQ-SH 3和R3VQ-S-(D0TA/Gd)3 5稀釋于前述相同的緩沖液中，和生物素化Α-Μ0或者Α-β 42(優(yōu)選地Α-Μ0)孵育之后，加入單克隆抗His標(biāo)簽抗體(H1029-Sigma)，隨后是過氧化物酶 標(biāo)記的羊抗鼠抗體(ab97265-Abcam)，以及通過相同底物顯色。
[0301 ] 親和性確定
[0302] 通過測(cè)量能夠?qū)潭ɑ摩?Μ0或者A-M2 (優(yōu)選地Α-Μ0)識(shí)別給出50 %抑制的可 溶A-M0或者Α-β42(優(yōu)選地A-M0)肽的量，來確定3和5的結(jié)合性質(zhì)。簡(jiǎn)言之，在4°C，將各種 濃度的Α-Μ0或者A-M2(優(yōu)選地Α-Μ0)和確定量的3或5過夜孵育，直至到達(dá)平衡。通過初始 ELISA校準(zhǔn)推定所用VHH的濃度。各混合物（100μ1)轉(zhuǎn)移至之前包被有抗原的微滴定板的孔， 在4°C孵育15分鐘。用含有0.1%Tween 20的PBS洗板后，通過添加抗His mAb(H1029-Sigma) 隨后是β-半乳糖苷酶羊抗鼠 Ig和4-甲基傘形酮β-D半乳糖苷檢測(cè)未結(jié)合的VHH。在355nm激 發(fā)之后，在460nm讀取焚光(Fluoroskan，Labsystem，芬蘭）。
[0303] 免疫組織化學(xué)
[0304]在石蠟冠狀腦切片（5微米厚)上進(jìn)行免疫組織化學(xué)，所述切片獲自淀粉樣變性的 轉(zhuǎn)基因小鼠模型(PS2APP小鼠）。用薄片切片機(jī)(Microm HM340E)制備切片。在二甲苯中對(duì)切 片脫石蠟(5分鐘，3次），通過乙醇（100% X2,90和70% ;5分鐘/步)再水化和接觸水。然后， 用98 %甲酸預(yù)處理5分鐘，最后浸在水中5分鐘。用3 %過氧化氫和20 %甲醇中和內(nèi)源的過氧 化物酶，以及用TBS-0.5%tween pH8BSA 2%對(duì)非特異性結(jié)合位點(diǎn)封閉30min。在下面的步 驟中，步驟之間將切片用TBS-tween漂洗3次，5min/次。然后，切片和稀釋于TBS-tween中2μ g/ml的一抗R3VQ-SH在4°C孵育過夜。然后，在室溫用小鼠單克隆抗His標(biāo)簽抗體(Η1029- Sigma)處理切片2小時(shí)，最后根據(jù)制造商規(guī)程用Dako REALTM系統(tǒng)Peroxidase/DAB試劑盒 (Glostrup，丹麥）顯色。水洗后，用Harri s蘇木精復(fù)染切片，并在水中再漂洗。封片 (mounting)之前，在分級(jí)的乙醇溶液中（70、90和100%)進(jìn)行切片脫水，在二甲苯中清洗。 [0305] 3.4合成造影劑的MRI性質(zhì)
[0306] 在配有運(yùn)行控制臺(tái)（console running)VnmrJ 2.3界面的7T-光譜儀（Agilent， USA)上評(píng)價(jià)造影劑的MRI性質(zhì)。光譜儀配有700mT/m的嗤齒動(dòng)物梯度插件(rodent gradient insert)。鳥籠式正交線圈（直徑：23mm)用于發(fā)射和接收。對(duì)于濃度0.2、0.15、0.1、0.05、 0.025、0.01和0臟〇1/1而言，根據(jù)1?1(8卩1/1'1)和1?2(8卩1/^2)作為造影劑濃度的函數(shù)的線性 擬合，通過用如下等式來確定縱和橫向弛豫rl和r2 (每單位濃度試劑的弛豫速率的變化，表 示作為1即造影劑的"有效性"）：1?1(〇=1?1(0)+^1(：，其中1?1(〇是含有濃度(：的造影劑的 管中的Rl，R1 (0)是沒有造影劑的管中的R1，以及C是造影劑的濃度。R2(C) = R2(0) +r2x C用 于計(jì)算r2。在血細(xì)胞比容管中進(jìn)行樣本成像。
[0307] T1計(jì)算基于七個(gè)連續(xù)的2D多-片旋轉(zhuǎn)回聲圖像，其中采用了二十個(gè)TR值（TR = 0·021、0·04、0·06、0·08、0·1、0·15、0·2、0·3、0·4、0·5、0·6、0·7、0·8、0·9、1、1·5、2、3、4、 5sec)，TE = 14ms，Nex = 4，F(xiàn)0V = 10xl0mm2，Mtx = 64x64，1切片，切片的厚度= 3mm，帶寬= 50kHz)。根據(jù)指數(shù)回歸曲線(S=l-exp(-TR/Tl))計(jì)算馳豫時(shí)間的參數(shù)圖譜，其中S是信號(hào)強(qiáng) 度，TR是重復(fù)時(shí)間和T1是縱向的馳豫時(shí)間（ImageJ，MRI分析計(jì)算器，Karl Schmidt)。
[0308] 通過使用 16個(gè)回聲時(shí)間（TE = 10至160msec); TR = 3300ms ;Nex = 2;帶寬=100kHz， F0V= 10xl0mm2，Mtx = 64x64,1切片，切片厚度= 3mm，T2計(jì)算基于2D多-回聲多-切片旋轉(zhuǎn)回 聲圖像。根據(jù)指數(shù)回歸曲線（S = exp(-TE/T2))計(jì)算馳豫時(shí)間的參數(shù)圖譜，其中S是信號(hào)強(qiáng) 度，TE是回聲時(shí)間和T2是縱向的馳豫時(shí)間（ImageJ，MRI分析計(jì)算器，Karl Schmidt)。
[0309] 4.通過免疫組織化學(xué)、生物化學(xué)和體外MRI體外描述VHHR3VQ和VHH R3VQ綴合物
[0310] 受試者
[0311] 來自AD患者(Braak V和VI期）的人皮質(zhì)腦組織獲自NeuroCEB腦庫。該庫和腦捐獻(xiàn) 計(jì)劃有關(guān)，由患者協(xié)會(huì)財(cái)團(tuán)（consortium of patients associations)(包括法國阿爾茨海 默氏病協(xié)會(huì))運(yùn)行，并根據(jù)法國法律的要求由研究和大學(xué)部(Ministry of Research and Universities)宣布。根據(jù)法國生物倫理法，對(duì)腦捐獻(xiàn)獲得明確的書面同意。
[0312] 在B6TgPS2APP(Richards J.G.，2003，J Neurosci.,23:8989-9003)和APP/PSldE9 (Garcia-Alloza M.，2006，Neurobiol Dis.，24:516-24)轉(zhuǎn)基因小鼠上進(jìn)行臨床前實(shí)驗(yàn)。嚴(yán) 格按照EEC(86/609/EEC)和法國國立委員會(huì)(法令87/848)針對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用的推薦 進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)規(guī)程。使用高劑量戊巴比妥鈉（l〇〇mg/kg)處死動(dòng)物，然后用10%緩沖的福爾 馬林灌注固定。而后，摘除其腦，浸入福爾馬林至少24小時(shí)，并儲(chǔ)存在4°C。
[0313] 組織提取物
[0314] 根據(jù)Gong，Y.等人（2003，Proc Natl Acad Sci U S A，100:10417-10422)進(jìn)行組 織提取。在20體積無酚紅的他111'8?12介質(zhì)(6丨1^〇)或含有蛋白酶抑制劑(20(^8/1111?10^、2 μg/ml胃酶抑素 A，4μg/ml亮抑酶肽、30μg/ml芐脒鹽酸鹽）的緩沖液A(PBS，pH 7.4、0.32M蔗 糖、50mM Hepes、25mM MgC12、0.5mM DTT)中勻漿來自AD腦的額皮質(zhì)（0.2g)，以 100,000x g 離心1 h。沉淀在10體積的無酸紅的Ham ' s F12介質(zhì)中或緩沖液A加蛋白酶抑制劑中再勾楽；， 并再離心。確定組合上清的蛋白濃度。然后，使用Centr icon-10濃縮儀將蛋白的等份濃縮至 60μ1或更小的體積。
[0315] 免疫印跡
[0316] 腦提取物或者Α-Μ2肽重懸于含有8Μ尿素的:NuPAGE?:LDS樣本緩沖液 (Invitrogen)中。用NuPAGE Novex 4-12%13丨8-1：1^8凝膠（111￥；[1：1'08611)通過聚丙稀酰胺凝 膠電泳（PAGE)分離之后，半干轉(zhuǎn)移到Hybond-C(Amersham)上，使用Xcell II印記模塊 (Invitrogen)進(jìn)行Western印記。免疫化學(xué)反應(yīng)之前，在4%脫脂乳溶液中封閉膜。用\^!1進(jìn) 行膜的免疫印跡，用兔抗His標(biāo)簽(eBioscience)多克隆抗體隨后是過氧化物酶標(biāo)記的羊抗 兔免疫球蛋白（Abeam)顯色。最后，使用化學(xué)發(fā)光試劑盒(GE Healthcare)對(duì)過氧化物酶活 性進(jìn)行可視化。
[0317] 免疫組織化學(xué)
[0318] 在固定的組織（石蠟包埋的或者冷凍切片）上、或者在未固定的新鮮組織(冷凍切 片)上進(jìn)行免疫組織化學(xué)。采用標(biāo)準(zhǔn)IHC規(guī)程并根據(jù)各組織條件進(jìn)行調(diào)整。因?yàn)榇蠖嗝庖呷?色實(shí)驗(yàn)是使用石蠟切片進(jìn)行的，此處給出石蠟包埋材料的詳細(xì)規(guī)程。腦組織的免疫染色在4 Μ厚的石錯(cuò)切片上進(jìn)行。使用人和小鼠組織（人AD患者，TauPS2APP小鼠 [Grueninger F.等 人，2010，Neurobiol Dis.，37 :294-306]和PS2APP轉(zhuǎn)基因小鼠[Richards，J.G.，等人2003， Journal of neuroscience 23,8989_9003])。二甲苯中對(duì)切片進(jìn)行脫石錯(cuò)，通過乙醇 (100 %，90 %和70 % )進(jìn)行再水化，各個(gè)溶液5min，最后帶至流動(dòng)的自來水中進(jìn)行10min。然 后，在98%甲酸中孵育5分鐘，在流動(dòng)的自來水下再次洗滌，對(duì)于內(nèi)源的過氧化物酶采用3% 過氧化氫和20 %甲醇進(jìn)行淬滅，最后在水中洗滌。在TBS+0.5 % tween中2 %牛血清白蛋白中 對(duì)切片孵育30min來封閉非特異性結(jié)合。然后應(yīng)用適當(dāng)稀釋的一抗(5-10μg/ml的VHH His或 者Strep標(biāo)簽），在室溫在潮濕室中過夜孵育切片。用TBS-Tween洗滌切片，并在室溫與TBS-Tween中的1/1000二抗兔抗His標(biāo)簽或者自制的生物素化抗strep mAb C23-21孵育1小時(shí)。 然后，根據(jù)制造商說明用Dako REALTM檢測(cè)系統(tǒng)Peroxidase/DAB的試劑進(jìn)行切片的孵育。進(jìn) 行發(fā)色(DAB)顯示，直至獲得良好信噪比（大約5min)。用TBS-Tween洗滌后，切片用蘇木精復(fù) 染。為了標(biāo)記斑塊，將生物素化的4G8(Wisniewski T等人，1996，B.Biochem J.，313:575-80)mAb( 1/10000)或 6F/3D(Akiyama H.等人，1996，Neurosci let.，206 :169-72)mAb(l/ 200)用作平行的陽性對(duì)照。
[0319] 體外 MRI
[0320] 在B6TgPS2APP(Richards J.G.，2003，J Neurosci.,23:8989-9003)和APP/PSldE9 (Garcia-Alloza M.，2006，Neurobiol Dis.，24:516_24)轉(zhuǎn)基因小鼠 （n = 2,雌性）的腦上進(jìn) 行MRI。在配有運(yùn)行控制臺(tái)VnmrJ 2.3界面的7T-光譜儀(Agi 1 ent，USA)上記錄MRI。光譜儀配 有700mT/m的嚙齒動(dòng)物梯度插件。鳥籠式線圈（RapidBi〇med，GmbH，德國）和小鼠的腦表面線 圈(RapidBiomed GmbH，德國）分別用于發(fā)射和接收。
[0321] 膜在Triton 0.2%的roS溶液中透化4小時(shí)后，腦樣本和待測(cè)試造影劑浸在磷酸鹽 緩沖液(PBS)溶液中，成像之前在4°C儲(chǔ)存至少24小時(shí)。針對(duì)掃描，腦置于裝有Fluodnert? (3M，Cergy-P 〇nt〇iSe，法國）的緊閉塑料管中，其中Fiuori nertK是一種提供MR圖像黑色背景 的基于全氟碳化物的質(zhì)子流體。
[0322] MR圖像基于3D梯度-回聲序列，其用于（FLASH)獲取T2*w圖像（TR = 40ms，TE = 15ms，F(xiàn)A = 20。，Bw = 50kHz，Nex = 16,矩陣= 512x512x128，F(xiàn)0V= 13x13x13mm2，對(duì)于 1 lh 39min的總Tacq而言產(chǎn)生25χ25χ100μπι3的分辨率）。
[0323] Gd染色方法:淀粉樣蛋白斑塊檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)方法
[0324] 這種方法用于在體外過程之后產(chǎn)生MR圖像上所見低信號(hào)點(diǎn)之間的共定位，其是一 種顯示淀粉樣蛋白斑塊的金標(biāo)準(zhǔn)方法(Petiet A.等人，2012，Neurobiol Aging，33:1533-44)。簡(jiǎn)言之，體外實(shí)驗(yàn)之后，樣本浸入1:200稀釋的PBS和0.5MIL特酸葡甲胺的溶液(2.5mM) 中，在成像之前在4°C儲(chǔ)存至少24小時(shí)。在和體外實(shí)驗(yàn)所用的相同條件下獲得MR圖像。
[0325] 5.VHH R3VQ和VHH R3VQ綴合物的體內(nèi)評(píng)價(jià)
[0326] 受試者
[0327] 在之前描述的授權(quán)之下，VHH R3VQ和VHH R3VQ綴合物的體內(nèi)評(píng)價(jià)在TauPS2APP (Grueninger F.等人，2010，Neurobiol Dis.，37:294_306)轉(zhuǎn)基因小鼠上進(jìn)行。
[0328] VHH的體內(nèi)立體定位注射
[0329] 采用每注射2μ1的VHH以0.5μ1/π?η的速率，在TauPS2APP(n = 2雌性)轉(zhuǎn)基因麻醉小 鼠上進(jìn)行立體定位注射。用異氟烷（1-2%)和空氣（lL/min)混合物麻醉小鼠。將其置于立體 定位框架中，用Dremel頭顏雙側(cè)穿孔。Blunt Hamilton注射器用于注射MR造影劑。各個(gè)小鼠 在各半球額皮質(zhì)和海馬中接收4次注射。額皮質(zhì)的立體定位坐標(biāo)是距離前囪前+0.86mm，距 離中線橫向±1.5mm，距離硬腦膜垂直-0.65mm。海馬中的立體定位坐標(biāo)是距離前囪后-2.18mm，距離中線橫向± 1 · 5mm，距離硬腦膜垂直-1.8mm。注射后的2或24小時(shí)，麻醉小鼠，心 臟內(nèi)灌注PBS中的4%多聚甲醛(pH 7.6)。摘除腦，然后按照相同的固定方式(fixative)在4 °C進(jìn)行過夜固定。制備4μπι厚的石蠟切片。使用上述標(biāo)準(zhǔn)的免疫組織化學(xué)方法的任一檢測(cè)腦 組織中VHH的存在。
[0330] 淀粉樣變性小鼠模型中VHH的頸動(dòng)脈內(nèi)灌注
[0331] 在麻醉的TauPS2APP小鼠 （η = 2，雌性）中進(jìn)行頸動(dòng)脈內(nèi)的VHH施用。通過腹腔內(nèi)一 次性注射鹽酸氯胺酮（Imalgen，1/10稀釋的溶液50μ1)和二甲苯(Rompun，1/40稀釋的溶液 50μ1)的混合物來進(jìn)行麻醉。暴露頸總動(dòng)脈，并用細(xì)的硅膠管（PP25_100FT;P 〇rteX， Ashford，UK)進(jìn)行插管。使用懦動(dòng)栗（型號(hào)PHD 2000;Harvard Apparatus，Boston，MA，USA) 以恒定的速率將VHH輸注至頸動(dòng)脈中。
[0332] 側(cè)尾靜脈(lateral tail vein)注身才
[0333] 將小鼠放在適當(dāng)?shù)牡箍蹮?，留有孔以供尾穿出。注射前保溫?dòng)物，尾浸入溫水 以便引起靜脈的血管舒張。在動(dòng)物尾靜脈中插入導(dǎo)管(27G，Microflex，Vygon，法國）之后， 進(jìn)行MR圖像前的注射，以便確保造影劑的施用適當(dāng)。溶于200μ1 PBS的2mg VHH、VHH R3VQ-D0TA或者VHH R3VQ-S-(D0TA/Gd)3注射至側(cè)尾靜脈。
[0334] 體內(nèi) MRI
[0335] 如前所述（參見體外MRI章節(jié)），在配有運(yùn)行控制臺(tái)VnmrJ 2.3界面的71'-光譜儀 (八8丨161^，1^4)上進(jìn)行體內(nèi)1?1。1?1試驗(yàn)期間，用異氟烷(0.75-1.5%)和卡波金(95%02-5 %⑶2)混合物麻醉動(dòng)物，監(jiān)測(cè)動(dòng)物呼吸率?？úń鹩糜诮档蛠碜匝h(huán)血液的信號(hào)(Thomas 等人，2003)。
[0336] 使用高分辨率3D-梯度回聲序列記錄MR圖像（29*29*117μπι3，F(xiàn)0V: 15* 15* 15mm3，Mtx = 512*512*128，TR = 30ms，TE= 15ms，翻轉(zhuǎn)角= 20°，Nex = l，帶寬= 25kHz，獲取時(shí)間：32min (Petiet，Α·等人，2012，Neurobiol Aging，33:1533-44) 〇
[0337] T1計(jì)算基于七個(gè)連續(xù)的2D多-切片旋轉(zhuǎn)回聲圖像，其中采用了5個(gè)TR值(TR = 0.4、 0·75、l·5、2·5和5s，TE=14ms，Nex = l，F(xiàn)0V = 25x25mm2，Mtx = 128xl28,6切片，切片的厚度 =1mm，帶寬=50kHz)。根據(jù)指數(shù)回歸曲線(S = 1 -exp (-TR/T1))計(jì)算馳豫時(shí)間的參數(shù)圖譜， 其中S是信號(hào)強(qiáng)度，TR是重復(fù)時(shí)間和T1是縱向的馳豫時(shí)間（ImageJ，MRI分析計(jì)算器，Karl Schmidt)。根據(jù)腦的額部分中皮質(zhì)區(qū)測(cè)量馳豫時(shí)間。
[0338] 離體 MRI
[0339] 體內(nèi)腦室注射VHH-S-(DOTA/Gd)3(lyg/側(cè))6h之后，灌注小鼠 （PFA 4%)，進(jìn)行離體 MR圖像之前提取其腦。針對(duì)各步驟，通過使用等同的Gd溶液(即O.lmM)進(jìn)行對(duì)照。
[0340] 結(jié)果
[0341] 1.特異性抗AI3VHH的文庫構(gòu)建、和選擇
[0342] 通過PCR擴(kuò)增VHH，并克隆至載體pHENl。后續(xù)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生約108克隆的文庫。采用生 物素化的Αβ1-42、Αβ1_40或者Αβ1-16肽經(jīng)過3次篩選循環(huán)，通過噬菌體展示選擇顯示最佳親 和性的VHH。通過ELISA，從ΑΜ2篩選中測(cè)試了46個(gè)獨(dú)立的克隆，從ΑΜ0中測(cè)試了 192個(gè)克隆 以及從如16中測(cè)試了192個(gè)克隆。從邠42^04〇和六016篩選中分別發(fā)現(xiàn)46/46、11〇/192和 163/192的陽性。測(cè)序這些陽性克隆，分別鑒定45、65和118VHH序列。最后，選擇VHH的3個(gè)家 族(A7/B10、F12和R3VQ)(參見下表1)。分別對(duì)生物素化Αβ1-42、Αβ1-40或Αβ1-16進(jìn)行篩選 后，A7/B10VHH發(fā)現(xiàn)了ll、64和117次。對(duì)生物素化Am-42和Am-40篩選后，VHHR3VE/Q分別 發(fā)現(xiàn)34和1次，而Αβ16篩選后VHH F12發(fā)現(xiàn)了 一次。
[0343] 這些VHH亞克隆至載體ρΕΤ23或者載體pASK ΙΒΑ2以便允許VHH分別和His-標(biāo)簽或 者Streptavidin-標(biāo)簽進(jìn)行高水平表達(dá)。獲得細(xì)菌培養(yǎng)物的l-2mg/l產(chǎn)率。通過SDS-PAGE顯 示單結(jié)構(gòu)域產(chǎn)物純化至同質(zhì)（數(shù)據(jù)未顯示）；其pi值在8.5以上。隨后用兩種造影劑進(jìn)行實(shí) 驗(yàn)。
[0344] R3VQ保存在4°C或者用甘油長期保存在_20°C。沒有甘油時(shí)的冷凍不穩(wěn)定。
[0345] DLS實(shí)驗(yàn)顯示R3VQ在純化之后是單聚體的并且不聚集。
[0346] 抗ΑβνΗΗ A7、B10、R3VE、R3VQ和F12的氨基酸序列比對(duì)顯示在圖10。
[0347] 2.VHH R3VQ識(shí)別淀粉樣蛋白斑塊
[0348] VHH R3VQ對(duì)Αβ和淀粉樣蛋白損傷的免疫反應(yīng)
[0349] 檢驗(yàn)了人AD腦和轉(zhuǎn)基因 TauPS2APP小鼠中VHH特異性免疫反應(yīng)性的分布?？乖迯?fù) 預(yù)處理之后，R3VQ顯示出良好的對(duì)人石蠟切片中Αβ斑塊和腦淀粉樣蛋白血管病(CAA)的免 疫檢測(cè)能力（圖1)。用野生型小鼠沒有觀察到標(biāo)記。比較石蠟包埋的組織上的結(jié)果，顯示在 自由活動(dòng)式的振動(dòng)切片機(jī)上，以及更重要的是在來自AD人腦和來自小鼠腦切片的新鮮組織 上而無需任何抗原恢復(fù)預(yù)處理，可以輕易實(shí)現(xiàn)用R3VQ進(jìn)行的Αβ免疫檢測(cè)(數(shù)據(jù)未顯示）（圖 2-3)。顯著地，采用冷凍切片機(jī)上獲得的自由活動(dòng)式切片觀察到強(qiáng)的背景信號(hào)和低的信/噪 比，對(duì)于R3VQ IHC排除了采用這種材料。對(duì)于VHH Α7/Β10和F12沒有檢測(cè)到淀粉樣蛋白斑塊 的免疫標(biāo)記，不再用這些VHH進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0350] 為了確認(rèn)腦組織上VHH R3VQ的免疫反應(yīng)性，在獲自AD患者的腦提取物上進(jìn)行 western-印記免疫分析。用VHH R3VQ免疫檢測(cè)到四條主要的帶，對(duì)應(yīng)著40至55kDa的Αβ寡聚 物。平行地，用ΑΜ2肽，R3VQ識(shí)別6至17kDa的三條帶，對(duì)應(yīng)著單體、二聚體和三聚體(圖4)。
[0351] R3VQ識(shí)別AM2的中間區(qū)域
[0352] 在采用Αβ42的抑制分析中，顯示VHH R3VQ特異于纖維狀的合成Αβ42肽。VHH R3VQ 的KD為17nM。為了進(jìn)一步確定VHH R3VQ識(shí)別的表位，針對(duì)AMO和對(duì)應(yīng)著不同Αβ片段的肽（1_ 16、10-20、15-25、22-35和29-40)確定了50%抑制（扣50)所需濃度。￥冊(cè)1?3￥0不識(shí)別片段1-16也不識(shí)別29-40。VHH R3VQ對(duì)Αβ?6-35的IC50是16ηΜ，表明VHH R3VQ識(shí)別位于ΑΜ2中央部 分的表位。使用Roche提供的Η4穩(wěn)定克隆通過流式細(xì)胞術(shù)，R3VQ不識(shí)別ΑΡΡ(數(shù)據(jù)未顯示）。
[0353] 立體定位注射之后，VHH R3VQ體內(nèi)標(biāo)記淀粉樣蛋白斑塊
[0354] 將2yg的VHH R3VQ立體定位注射至小鼠腦左半球的海馬或皮質(zhì)內(nèi)（2只小鼠）。注射 后2h或者24h之后，處死動(dòng)物，收集腦切片。觀察到淀粉樣蛋白斑塊的免疫染色，表明VHH R3VQ在體內(nèi)標(biāo)記纖維狀Αβ。此外，注意到皮質(zhì)中的棕色圈，這表明VHH R3VQ擴(kuò)散至腦組織 (圖 5Α 和 5Β)。
[0355] VHH R3VQ體內(nèi)穿過ΒΒΒ
[0356] 體內(nèi)測(cè)試VHH R3VQ穿過ΒΒΒ的能力。通過左頸動(dòng)脈注射4mg的VHH，持續(xù)60分鐘。注 射后，在麻醉小鼠并灌注固定的1小時(shí)之前，允許將VHH輸注至腦組織。在皮質(zhì)、海馬和丘腦 觀察到淀粉樣蛋白斑塊的免疫染色。在注射的皮質(zhì)對(duì)側(cè)的右半球這種染色微弱。
[0357]實(shí)驗(yàn)顯示未標(biāo)記的R3VQ: 1)在緩慢的頸動(dòng)脈輸注之后能夠穿過BBB，2)體內(nèi)特異性 識(shí)別淀粉樣蛋白斑塊，以及3)對(duì)于MRI研究而言是良好的候選。
[0358] VHH R3VQ和已知VHH針對(duì)淀粉樣蛋白β之間的比較
[0359] 下表1總結(jié)了通過用肽AM2、偶聯(lián)至卵清蛋白的肽ΑβΙ-lO或者纖維狀形式的AM2 免疫羊駝獲得的VHH對(duì)淀粉樣蛋白β的標(biāo)記。除VHH R1.3、R1.5和R3.3通過核糖體展示進(jìn)行 選擇之外，通過菌體展示進(jìn)行VHH的選擇。
[0360] 產(chǎn)1:通過用肽AM2、偶聯(lián)至卵清蛋白的肽ΑβΙ-lO或者纖維狀形式的AM2免疫羊駝 獲得的VHH對(duì)淀粉樣蛋白β的標(biāo)記。VHH 1^-3丄35、61-3、￥31-1公開在1^376?.等人，2009， Molecular Immunology，49:695-704中。通過以上公開的方法獲得其它VHH。
[0361]
[0362]
[0363] 結(jié)果顯示，在受試的27種VHH當(dāng)中，只有VHH R3VE/Q能夠標(biāo)記淀粉樣蛋白血管病和 淀粉樣蛋白斑塊，但是不標(biāo)記淀粉樣蛋白寡聚物。
[0364] 3.偶聯(lián)至MRI造影劑的抗體
[0365] 非位點(diǎn)特異性方法:
[0366] 用NHS-激活的D0TA綴合至VHH賴氨酸殘基。用Gd進(jìn)行隨后的螯合，從而在蛋白上產(chǎn) 生具有各種D〇TA/Gd比例的綴合物(表2)。通過HPLC/MS監(jiān)測(cè)兩個(gè)步驟，從而允許優(yōu)化過程。 在室溫幾乎能夠?qū)崿F(xiàn)充分的螯合。
[0367] 由于沒用甘油而在_20°C儲(chǔ)存不穩(wěn)定，兩種起始綴合物(2a和b)沒有顯示Α?3結(jié)合活 性。通過改變實(shí)驗(yàn)條件，在0.5-lmg的規(guī)模制備了 4種新綴合物，回收良好(64-74%)。相較于 第二系列（2e和f)，第一系列（2c和d)具有更高的DOTA/Gd密度。相較于ELISA中原始VHH ΙΑβ 的識(shí)別，2c和2d的結(jié)合低（~10%)，而2e和2f的結(jié)合幾乎不受影響（50至100%)。這種差異 可能是由于DOTA/Gd的整體密度更低和/或VHH的固有穩(wěn)定性。
[0368] 表2:R3VQ (Hi s) _N_ (DOTA/Gd)綴合物的描述
[0369]
[0370]
[0371] a在室溫進(jìn)行反應(yīng)。
[0372] b通過MS確定的。括號(hào)中是微量化合物。
[0373] 位點(diǎn)特異性方法:
[0374] 這種策略涉及用馬來酰亞胺_(D0TA/Gd)3化合物4標(biāo)記Cys-工程化的R3VQ VHH (R3VQ-SH 3)(SEQ ID N0 8)(參見圖9B)。
[0375] D0TA表示為單酰半簇(moiety)?？偖a(chǎn)率表示在括號(hào)內(nèi)。
[0376] 當(dāng)通過硫代加成綴合4時(shí)，RP-HPLC/MS顯示3完全轉(zhuǎn)化成明確的化合物R3VQ-S-(D0TA/Gd)3 5,其中產(chǎn)率是79%。相較于未標(biāo)記的R3VQ-SH之一，5的pi略微降低。在競(jìng)爭(zhēng)抑 制實(shí)驗(yàn)中確定R3VQ-SH和R3VQ-S-(D0TA/Gd) 3的結(jié)合特性，實(shí)驗(yàn)涉及結(jié)合至ELISA板的ΑΜ0 和可溶的AM0。對(duì)于R3VQ-SH和R3VQ-S-(D0TA/Gd) 3給出50 %結(jié)合抑制的AM0濃度計(jì)算得1μ g/ml，表明添加 DOTA/Gd不影響VHH結(jié)合特性。此外，根據(jù)轉(zhuǎn)基因 Β6. PS2APP小鼠中VHH-特異 性免疫反應(yīng)性的分布，抗原修復(fù)預(yù)處理之后R3VQ-SH在小鼠石蠟切片中顯示良好的免疫檢 測(cè)Αβ斑塊的能力。
[0377] 用C端Cys殘基構(gòu)建R3VQ-SH，用于偶聯(lián)至馬來酰亞胺-DOTA/Gd(圖9)。每L培養(yǎng)物表 達(dá)15mg的純化蛋白。然而，此前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了多種構(gòu)建體，并總結(jié)在以下：
[0378] -Strep-R3VQSSfree-Cys-Thr-His從C端至N端含有strep標(biāo)簽、VHH R3VQ其中Cys 突變?yōu)閂al和Ser、Cys、凝血酶切位點(diǎn)和his標(biāo)簽。這種蛋白以很低的產(chǎn)率表達(dá)(yg蛋白/1)。
[0379] -Tag-R3VQSSfree_Cys 和 His 標(biāo)簽-R3VQSSfree_Cys 從 C端至 N端含有標(biāo)簽（Strep 或 者His標(biāo)簽）、VHH R3VQ其中Cys突變?yōu)閂al和Ser、以及Cys;兩種蛋白以很低的產(chǎn)率表達(dá)(yg 蛋白/1)。
[0380] -Tag_R3VQSSfree-Cys-Ser-Ala從C端至N端含有標(biāo)簽（Strep或者His標(biāo)簽）、VHH R3VQ其中Cys突變?yōu)閂al和5虹、0 78、5虹、以及厶1&。這些蛋白以很低的產(chǎn)率表達(dá)化8蛋白/1)。
[0381] -Tag-Thr R3VQSSfree-Cys-Ser-Ala從C端至N端含有標(biāo)簽（Strep或者His標(biāo)簽）、 凝血酶切位點(diǎn)、VHH R3VQ其中Cys突變?yōu)閂al和Ser、CyS、Ser以及Ala。這些蛋白以很低的產(chǎn) 率表達(dá)(yg蛋白/1)。
[0382] 4.用綴合有Gd造影劑的VHH R3VQ檢測(cè)淀粉樣蛋白斑塊
[0383] 立體定位注射之后R3VQ-N-(D0TA/Gd)(i-2)體內(nèi)標(biāo)記淀粉樣蛋白斑塊
[0384] 將2yg的VHH imQ-rHDOTA/GcOuUe)立體定位注射至小鼠腦左半球的海馬或皮 質(zhì)（2只小鼠）。注射后4h，處死動(dòng)物，收集腦切片。觀察到淀粉樣蛋白斑塊的免疫染色，表明 R3VQ-N-(DOTA/Gd) n在體內(nèi)標(biāo)記纖維狀Αβ (圖6A和6B)。圖6C和6D顯示標(biāo)記存在于丘腦淀粉 樣蛋白β斑塊，其遠(yuǎn)離注射位點(diǎn)。在相同小鼠上用4G8抗體標(biāo)記淀粉樣蛋白斑塊來進(jìn)行對(duì)照 (圖 6Ε)。
[0385] 體外成像
[0386] 浸入RSVQ-MDOTA/Gdh-2溶液（2e造影劑的終濃度為0.02mg/ml，相當(dāng)于O.OlmM Gd)的TauPS2APP小鼠的腦成像，顯示多個(gè)低信號(hào)的點(diǎn)（n = 2;圖7A，箭頭），而這在相同條件 中的對(duì)照小鼠腦的圖像中不能被檢測(cè)到(數(shù)據(jù)未顯示），低信號(hào)的點(diǎn)和Gd染色方法所顯示的 淀粉樣蛋白斑塊共定位（圖7B，箭頭）。即便石蠟程序中所導(dǎo)致的失真不允許MRI和IHC之間 點(diǎn)對(duì)點(diǎn)的配準(zhǔn)（point-to-point registration)，IHC仍證實(shí)了VHH-DOTA/Gd的大規(guī)模擴(kuò)散 以及在相同區(qū)域中標(biāo)記淀粉樣蛋白斑塊（圖7C，箭頭）。此外，在相同條件中的對(duì)照小鼠腦的 圖像中（n = 2;數(shù)據(jù)未顯示)或在浸入相同濃度釓溶液的TauPS2APP小鼠腦中（即O.OlmM;圖 7D)沒有檢測(cè)到低信號(hào)的點(diǎn)。
[0387] 腦內(nèi)、頸動(dòng)脈內(nèi)或者IV注射之后的離體成像
[0388] 腦室內(nèi)注射后，在海馬中抗A0VHH-Gd SeUSVQ-MDOTA/Gdh-2)在離體圖像上顯 示低信號(hào)的點(diǎn)（圖8A，箭頭），這對(duì)應(yīng)著淀粉樣蛋白斑塊，正如通過Gd染色在相同小鼠上所確 定的（圖8B，箭頭）。即便石蠟程序中所導(dǎo)致的失真不允許MRI和IHC之間點(diǎn)對(duì)點(diǎn)的配準(zhǔn)，IHC 證實(shí)了相同區(qū)域內(nèi)淀粉樣蛋白斑塊的標(biāo)記（圖8C，箭頭）。此外，在和R3VQ-N-(DOTA/Gd) 1-2所 用的相同濃度(〇. ImM)釓溶液注射的轉(zhuǎn)基因 TauPS2APP小鼠中沒有檢測(cè)到低信號(hào)的點(diǎn)。
[0389] 通過體外 MRI 評(píng)價(jià) R3VQ-S-(D0TA/Gd)3
[0390] 通過上述的位點(diǎn)特異性方法合成R3VQ-S-(D0TA/Gd)3<3HPLC/MS、pI和IHC分析證實(shí) 了 R3VQ-S-(D0TA/Gd) 3的生化特性（即，通過HPLC/MS進(jìn)行的純度、pI以及對(duì)Αβ的IHC反應(yīng)性） (參見圖11)。
[0391] 如上述，用0. lmg/ml的R3VQ-S-(D0TA/Gd)3體外孵育來自PS2APP小鼠的腦之后，評(píng) 價(jià)R3VQ-S_(D0TA/Gd)3誘導(dǎo)MR造影改變（contrast modification)的能力（Richards，J·G·， 等人，2003 Journal of neuroscience：official journal of Society for Neuroscience 23,8989-9003)(n = 2)。相較于陰性對(duì)照條件下的PS2APP小鼠的腦，7T獲取 的圖像顯示皮質(zhì)中低信號(hào)的點(diǎn)（圖12A和B)。為了證實(shí)這些低信號(hào)的點(diǎn)作為淀粉樣蛋白斑塊 的性質(zhì)，腦進(jìn)行Gd染色方法，其中Gd染色用作MRI檢測(cè)淀粉樣蛋白斑塊的金標(biāo)準(zhǔn)方法（圖 12C)。分析Gd染色方法之后獲得的圖像，允許將Gd染色所檢測(cè)的淀粉樣蛋白斑塊和R3VQ-S-(D0TA/Gd) 3所顯示的低信號(hào)的點(diǎn)進(jìn)行共配準(zhǔn)（co-registration)(圖12,白箭頭）。這些結(jié)果 表明R3VQ-S-(D0TA/Gd) 3被動(dòng)地?cái)U(kuò)散至尸檢組織中并靶向淀粉樣蛋白沉積，從而允許通過 MRI進(jìn)行體外檢測(cè)。
[0392] 外周(靜脈)注射之后通過離體MRI評(píng)價(jià)R3VQ-S-(D0TA/Gd)3
[0393] 如上述，18月齡的PS2APP小鼠尾靜脈中靜脈注射（20mg/kg和50mg/kg)之后，然后 研究R3VQ-S-(D0TA/Gd) 3通過MRI顯示淀粉樣蛋白斑塊的能力。在注射后5小時(shí)腦提取之后， 獲得靜脈注射R3VQ-S-(D0TA/Gd) 3的PS2APP小鼠在11.7T時(shí)取得的MR圖像。不同于對(duì)照條件 的MR圖像（用PBS注射的PS2APP小鼠）（圖13A和B)，接受靜脈注射R3VQ-S-(D0TA/Gd) 3的離體 腦上獲得的圖像顯示了多個(gè)低信號(hào)的點(diǎn)（圖13C和D)。這些低信號(hào)的點(diǎn)和對(duì)比異常配準(zhǔn)，其 中對(duì)比異常對(duì)應(yīng)著金標(biāo)準(zhǔn)Gd染色方法所檢測(cè)的淀粉樣蛋白斑塊（圖13E和F)。根據(jù)雙光子結(jié) 果，50mg/kg劑量時(shí)的這些點(diǎn)更強(qiáng)，表明R3VQ的腦穿透及其標(biāo)記腦Αβ?lián)p傷的能力是劑量依賴 性的。
[0394] 實(shí)施例2:偶聯(lián)至熒光團(tuán)試劑的抗AI3VHH的產(chǎn)生及其體外/體內(nèi)評(píng)價(jià)
[0395] 1.材料和方法
[0396] 此處除非另有指明，材料和方法和實(shí)施例1中所述相同。
[0397] 2.體內(nèi)靶向Αβ-陽性損傷
[0398] 用AF488熒光團(tuán)綴合R3VQ-SH
[0399]為了實(shí)現(xiàn)R3VQ VHH和熒光團(tuán)之間的偶聯(lián)，如前所述進(jìn)行位點(diǎn)特異性綴合。簡(jiǎn)言之， 額外的半胱氨酸殘基插入R3VQ序列的C端部分(稱為R3VQ-SH)，從而允許馬來酰亞胺-Alexa FIuoi.?488 (AF488)的C端硫代加成。由此，獲得明確的綴合物，稱為R3VQ-S-AF488，在VHH上 帶有單個(gè)的AF488(圖14)。
[0400] SDS-PAGE和HPLC/MS分析顯示預(yù)期的分子量(698Da的增加），其對(duì)應(yīng)著分子上添加 AF488。這些數(shù)據(jù)證實(shí)綴合物的標(biāo)記和純度（圖14A和B)。
[0401 ]使用 IEF 3-10 凝膠通過 NEPHGE 分析 R3VQ-SH 和 R3VQ-S-AF488 的等電點(diǎn)（pi)。和 R3VQ的pi相似，R3VQ-SH的pi在8.5至9.5(圖14C) AF488添加至R3VQ-SH稍稍降低了其pi，在 8 · 3附近。然而，仍然是堿性的（圖14C)。通過DLS測(cè)量R3VQ-SH和R3VQ-S-AF488的水力半徑 (拖）。尺寸隨著時(shí)間的分布顯示對(duì)于1?3￥0-3!1的平均拖為2.66±0.078811111，以及對(duì)于1?3￥0-3-AF488的平均Rh為2.34 ± 0.106nm，表明二者在溶液中是單聚的形式。使用來自PS2APP小鼠 腦的切片，通過IHC體外證實(shí)了通過R3VQ-S-AF488進(jìn)行的淀粉樣蛋白斑塊的免疫染色（圖 14D)〇
[0402] 局部腦輸注之后的R3VQ-S-AF488擴(kuò)散(雙光子成像)
[0403]在PS2APP小鼠上進(jìn)行穿顱術(shù)，以獲得右后皮質(zhì)上的顱窗。剝離硬腦膜后，將15yg (10μ1)的R3VQ-S-AF488直接施加至暴露的腦。通過雙光子顯微術(shù)跟蹤R3VQ-S-AF488擴(kuò)散約 2小時(shí)。腦實(shí)質(zhì)中檢測(cè)到淀粉樣蛋白斑塊和CAA的典型特異性染色，表明皮質(zhì)周輸注之后 R3VQ-S-AF488能夠擴(kuò)散并體內(nèi)檢測(cè)細(xì)胞外和血管Α即日性損傷（圖15)。
[0404] 靜脈注射之后R3VQ-S-AF488的擴(kuò)散(雙光子成像)
[0405]首先通過MRI檢測(cè)受試小鼠血腦屏障（BBB)的完整性(參見以下的對(duì)照實(shí)驗(yàn)）以確 保沒有可能會(huì)人為地提高靜脈注射(iv)的VHH腦滲透的滲漏（leakage)。
[0406] 50-mg/kg劑量的R3VQ-S-AF488注射至一只小鼠的尾靜脈。注射之后，使用雙光子 顯微術(shù)在腦窗持續(xù)記錄3.5小時(shí)的腦中綴合物的溢出和染色（z =距離表面達(dá)360μπι深）。圖 16Α顯示相同區(qū)域內(nèi)R3VQ-S-AF488在長達(dá)30min之內(nèi)隨著時(shí)間的體內(nèi)成像重構(gòu)(最大強(qiáng)度投 影-MIP)。在iv注射后幾秒，觀察到樹枝狀管的強(qiáng)染色，20min后劇烈降低，只有少數(shù)毛細(xì)管 仍保留染色。這表明綴合的VHH在循環(huán)中半衰期短（10-20min)。注射后立即形成綠色熒光 "云"，并擴(kuò)散至實(shí)質(zhì)空間，表明和R3VQ立體定位注射之后所觀察到的球面擴(kuò)散的相似性(參 見以上）。在iv注射后30min，開始顯示淀粉樣蛋白斑塊。還觀察到血管AKCAA)。紅色通道中 沒有信號(hào)，表明熒光信號(hào)是特異性的(數(shù)據(jù)未顯示），并不是因?yàn)槌Ｒ?guī)的自發(fā)熒光。進(jìn)一步的 成像顯示注射后斑塊中Αβ沉積的體內(nèi)染色以及管的維持長達(dá)3.5小時(shí)（圖16B)，表明R3VQ-S-AF488的腦半衰期擴(kuò)展至數(shù)小時(shí)。靜脈注射R3VQ-S-AF488后4小時(shí)，收集腦，制備5μπι厚的 石蠟切片。然后，用抗His mAb進(jìn)行IHC以便確認(rèn)R3VQ-S-AF488的擴(kuò)散和淀粉樣蛋白斑塊標(biāo) 記。整個(gè)腦觀察到R3VQ-S-AF488的淀粉樣蛋白斑塊的免疫染色，其伴有棕色背景，這可以對(duì) 應(yīng)著VHH的擴(kuò)散圈（圖16C)。用更低劑量的R3VQ-S-AF488( 10mg/kg)進(jìn)行其它實(shí)驗(yàn)，觀察到了 Αβ沉積的體內(nèi)檢測(cè)，但是強(qiáng)度降低。這些結(jié)果表示R3VQ的腦滲透及其標(biāo)記腦Αβ?lián)p傷的能力 是劑量依賴性的，其被IHC證實(shí)了（圖16D)。
[0407] VHH的堿性pi是其迀移穿過BBB能力的關(guān)鍵因素
[0408] 還制備了馬來酰亞胺-AF488綴合的R3VE，其pi是7.5左右（圖17A和B) (VHH R3VE如 上述）。將10mg/kg劑量的R3VE-S-AF488靜脈注射至PS2APP小鼠。注射后45分鐘，只觀察到腦 淀粉樣蛋白血管病，而沒有標(biāo)記淀粉樣蛋白斑塊（圖17C) A3VE-S-AF488靜脈注射后4小時(shí)， 收集腦，制備5mi厚的石蠟切片。然后，用抗His mAb進(jìn)行IHC以便檢測(cè)腦中固有R3VE-S-AF488的存在（圖17D)。相較于采用相同劑量的R3VQ-S-AF488獲得的結(jié)果(參見上述以及圖 16D)，在整個(gè)腦只觀察到非常有限的淀粉樣蛋白斑塊標(biāo)記，表明VHH表面存在的正電荷發(fā)揮 這些抗體穿過BBB的腦滲透作用。
[0409] 對(duì)照實(shí)驗(yàn)
[0410] 在無淀粉樣蛋白的小鼠中的評(píng)價(jià)
[0411] R3VQ-S-AF488靜脈注射至野生型無淀粉樣蛋白的C57BL/6小鼠。使用雙光子顯微 術(shù)分析，腦實(shí)質(zhì)中沒有觀察到特異性體內(nèi)染色(數(shù)據(jù)未顯示）。
[0412] 和常規(guī)IgG抗體的比較
[0413] PS2APP小鼠中iv注射mAb 4G8-AF488僅允許通過雙光子成像檢測(cè)CAA，而不能檢測(cè) 淀粉樣蛋白斑塊，這表明這種標(biāo)準(zhǔn)抗Αβ免疫球蛋白沒有顯著的溢出（圖18)。
[0414]用于雙光子成像的在小鼠中血腦屏障完整性的評(píng)價(jià)
[0415] 使用DOTAREM iv注射(0.2ml Gd 500mM)測(cè)試用于雙光子實(shí)驗(yàn)的PS2APP小鼠（2歲） 的BBB滲透。這種MRI造影劑不能穿過BBB，除非病理情況導(dǎo)致局部的屏障滲漏。這種MRI檢驗(yàn) 也用于人類，在BBB破裂的區(qū)域顯示信號(hào)的提高（V.M.Runge等人，American Journal of Roentgenology 1994，162，431_435 ;Μ· A. Ibrahim等人，Investigative radiology，1998， 33,153-162)。測(cè)試小鼠中信號(hào)變化的缺失表明它們BBB的完整性。另兩只年齡配對(duì)的 PS2APP小鼠用相同方法也進(jìn)行MRI-評(píng)價(jià)，沒有觀察到BBB的破裂(數(shù)據(jù)未顯示）。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種寡肽，其式為P-C-Z或者z-c-p，其中： P是8至800個(gè)氨基酸的肽，所述P不含有還原的半胱氨酸殘基， C是半胱氨酸殘基， Z代表1至10個(gè)氨基酸的間隔序列，優(yōu)選1至10個(gè)中性的或帶負(fù)電的氨基酸的間隔序列， 其中Z的所述氨基酸殘基是相同的或不同的，并且其中Z不含半胱氨酸殘基， 特征在于所述半胱氨酸殘基C通過帶有所述感興趣的物質(zhì)的式（I)所示的馬來酰亞胺 化合物連接至感興趣的物質(zhì)：其中： -83'1、8'2和礦是相同的或不同的，其各自獨(dú)立地是選自以下的單鍵或間隔序列：多元 醇，比如聚乙二醇(PEG)，其優(yōu)選具有2至12個(gè)氧乙烯(OE)單元;聚烯烴，其優(yōu)選具有2至12個(gè) 芳香環(huán);聚烷基，其優(yōu)選具有2至12個(gè)碳原子；乙烯基聚合物，比如聚（甲基丙烯酸烷基酯）， 其優(yōu)選具有2至12個(gè)甲基丙烯酸基團(tuán)；聚醛，其優(yōu)選具有2至12個(gè)羰基;聚酸酯，其優(yōu)選具有2 至12個(gè)酯基， -D、D'和D"是相同的或不同的，其各自獨(dú)立地是選自胺、酰胺、氨基醇、尿素、硫脲、氨基 甲酸酯、碳酸酯、酯、醚、硫醚、芳基、雜芳基如三唑、肟基， -A是單鍵或者螯合劑， -SI是感興趣的物質(zhì)， -X'是酸、胺、酰胺、酯、醚、烷基、烯基、炔基、芳基或者雜芳基官能團(tuán)，以及 -]1=1至100，優(yōu)選地11=1、2或者3。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的寡肽，其特征在于Z由2個(gè)氨基酸的序列組成，優(yōu)選由氨基酸序 列S_A或者S_V組成。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的寡肽，其特征在于P包含肽P'，所述肽P'選自：駱 駱駝科重鏈抗體的可變結(jié)構(gòu)域(VHH)、常規(guī)抗體的Fab、F(ab) ' 2、Fv或者scFv片段、免疫球蛋 白新抗原受體（IgNAR)、nanof :11:;[11、041^;[11、&111:;[。&1;[11、親合體、&€;1^1;[11、&￥；[11161'、單體和庫 尼茨結(jié)構(gòu)域。4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的寡肽，其特征在于式P-C-Z所示寡肽的所述氨基酸 肽P在其C端有1至10個(gè)氨基酸的間隔序列Y，或者式Z-C-P所示寡肽的所述氨基酸肽P在其N 端有1至10個(gè)氨基酸的間隔序列Y，其中所述氨基酸間隔序列Y的氨基酸殘基是相同的或是 不同的，以及其中所述氨基酸間隔序列Y不含半胱氨酸殘基。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的寡肽，其特征在于Y代表4個(gè)中性氨基酸的間隔序列，比如氨基 酸序列G-G-G-S(SEQ ID NO.ll)。6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的寡肽，其特征在于式P-C-Z所示寡肽的所述氨基酸 肽P在其N端有1至50個(gè)氨基酸的序列X，或者式z-c-ρ所示寡肽的所述氨基酸肽P在其C端有1 至50個(gè)氨基酸的序列X，其中所述氨基酸序列X的氨基酸殘基是相同的或是不同的，以及其 中所述氨基酸序列X不含半胱氨酸殘基。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的寡肽，其特征在于X包含標(biāo)簽和酶切位點(diǎn)，所述標(biāo)簽比如6 X His標(biāo)簽(SEQIDN0.9)，所述酶切位點(diǎn)比如氨基酸序列LVPRGS(SEQIDN0.10)所示的凝血 酶切位點(diǎn)。8. 根據(jù)權(quán)利要求3至7任一項(xiàng)所述的寡肽，其特征在于所述肽P '是VHH，以及所述寡肽的 式是 VHH-C-Z、VHH-Y-C-Z、X-VHH-C-Z、X-VHH-Y-C-Z、Z-C-VHH、Z-C-Y-VHH、Z-C-VHH-X 或者 Z-C-Y-VHH-X〇9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的寡肽，其特征在于所述感興趣的物質(zhì)是診斷化合 物，優(yōu)選所述診斷化合物選自：酶、熒光團(tuán)、NMR或者M(jìn)RI造影劑、放射性同位素和納米顆粒。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的寡肽，其特征在于所述診斷化合物是NMR或者M(jìn)RI造影劑，所 述NMR或者M(jìn)RI造影劑選自：順磁劑釓(Gd)、鏑(Dy)和錳(Mn)、以及基于鐵氧化物或鉑鐵的超 順磁劑、以及X-核比如 18F、13C、23Na、170、15N。11. 根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的寡肽，其特征在于所述感興趣的物質(zhì)是治療化合 物，所述治療化合物選自：肽、酶、核酸、病毒和化學(xué)實(shí)體。12. 根據(jù)權(quán)利要求1至11任一項(xiàng)所述的寡肽，其特征在于式（I)所示馬來酰亞胺化合物 中的A是螯合劑，以及所述感興趣的物質(zhì)SI是NMR或者M(jìn)RI造影劑。13. 根據(jù)權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)所述的寡肽，其特征在于式（I)所示馬來酰亞胺化合物 的所述螯合劑A選自：1，4,7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4,7，10-四乙酸(0(/^)、二乙三胺五乙 酸(DTPA)、1，4,7-三(羧甲基氮雜)環(huán)十二烷-10-氮雜乙酰胺(D03A)、次氮基三乙酸(NTA)、 D-青霉胺(Pen)、2,3-二巰基丁二酸(DMSA)、2,3-二巰基-1-丙磺酸(DMPS)、2,3-二巰基丙醇 (BAL)、三乙烯四胺(Trien)、四硫代鉬酸銨(TTM)陰離子、乙二胺四乙酸(EDTA)、2-(p-異硫 氰酰芐基)-6_甲基-二乙三胺五乙酸（IB4M)或羥基吡啶酮(Η0Ρ0)。14. 根據(jù)權(quán)利要求1至13任一項(xiàng)所述的寡肽，其特征在于所述感興趣的物質(zhì)SI是釓 (Gd)，以及所述螯合劑A是D0TA。15. 根據(jù)權(quán)利要求1至14任一項(xiàng)所述的寡肽，其特征在于所述馬來酰亞胺化合物是式 0-)所示：其中，8』'13'2、8"丄51以及11是權(quán)利要求1和9至14中所限定的。16. -種馬來酰亞胺化合物，其特征在于是式0- )所示：其中，8』'13'2、8"丄51以及11是權(quán)利要求1和9至14中所限定的。17. 權(quán)利要求9或10所述的寡肽作為診斷劑的用途。18. 權(quán)利要求11所述的寡肽作為治療劑的用途。19. 位點(diǎn)特異性方法，所述方法用于偶聯(lián)感興趣的物質(zhì)與式P-C-Z或Z-C-P所示的寡肽， 其中： P是8至800個(gè)氨基酸的肽，所述P不含有還原的半胱氨酸殘基， C是半胱氨酸殘基， Z代表1至10個(gè)氨基酸的間隔序列，優(yōu)選1至10個(gè)中性的或帶負(fù)電的氨基酸的間隔序列， 其中Z的氨基酸殘基是相同的或不同的，并且其中Z不含半胱氨酸殘基， 特征在于，所述方法包括權(quán)利要求1和9至16中所限定的寡肽和式（I)所示馬來酰亞胺 化合物之間的綴合步驟。20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的位點(diǎn)特異性方法，其特征在于所述的綴合步驟是在范圍4至 7.5的pH下進(jìn)行的，優(yōu)選在PBS/NaCl/咪唑緩沖液中進(jìn)行。21. 根據(jù)權(quán)利要求19或20所述的位點(diǎn)特異性方法，其特征在于Z由2個(gè)氨基酸的序列組 成，優(yōu)選由氨基酸序列S-A或者S-V組成。22. 根據(jù)權(quán)利要求19至21所述的位點(diǎn)特異性方法，其特征在于P包含肽P'，所述肽P'選 自：駱駱駝科重鏈抗體的可變結(jié)構(gòu)域(VHH)、常規(guī)抗體的Fab、F(ab) ' 2、Fv或者scFv片段、免 疫球蛋白新抗原受體（IgNAR)、nanof :11:;[11、041^;[11、&111:;^&1;[11、親合體、&€;1^1;[11、&￥；[11161'、單 體和庫尼茨結(jié)構(gòu)域。23. 根據(jù)權(quán)利要求19至22任一項(xiàng)所述的位點(diǎn)特異性方法，其特征在于式P-C-Z所示寡肽 的所述氨基酸肽P在其C端有1至10個(gè)氨基酸的間隔序列Y，或者式Z-C-P所示寡肽的所述氨 基酸肽P在其N端有1至10個(gè)氨基酸的間隔序列Y，其中所述氨基酸間隔序列Y的氨基酸殘基 是相同的或是不同的，以及其中所述氨基酸間隔序列Y不含半胱氨酸殘基。24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的位點(diǎn)特異性方法，其特征在于Y代表4個(gè)中性氨基酸的間隔 序列，比如氛基酸序列G-G_G_S(SEQ ID NO.ll)。25. 根據(jù)權(quán)利要求19至24任一項(xiàng)所述的位點(diǎn)特異性方法，其特征在于式P-C-Z所示寡肽 的所述氨基酸肽P在其N端有1至50個(gè)氨基酸的序列X，或者式Z-C-P所示寡肽的所述氨基酸 肽P在其C端有1至50個(gè)氨基酸的序列X，其中所述氨基酸序列X的氨基酸殘基是相同的或是 不同的，以及其中所述氨基酸序列X不含半胱氨酸殘基。26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的位點(diǎn)特異性方法，其特征在于X包含標(biāo)簽和酶切位點(diǎn)，所述 標(biāo)簽比如6XHis標(biāo)簽（SEQIDN0.9)，所述酶切位點(diǎn)比如氨基酸序列LVPRGS(SEQID NO. 10)所示的凝血酶切位點(diǎn)。27. 根據(jù)權(quán)利要求19至26任一項(xiàng)所述的位點(diǎn)特異性方法，其特征在于所述肽P'是VHH， 以及所述寡肽的式是 VHH-C-Z、VHH-Y-C-Z、X-VHH-C-Z、X-VHH-Y-C-Z、Z-C-VHH、Z-C-Y-VHH、 Z-C-VHH-X 或者 Z-C-Y-VHH-X 〇28. 根據(jù)權(quán)利要求19至27所述的位點(diǎn)特異性方法，其特征在于所述感興趣的物質(zhì)SI是 權(quán)利要求9至11中所限定的。29. -種帶有半胱氨酸殘基的寡肽，所述半胱氨酸殘基通過式（I)所示的馬來酰亞胺化 合物連接至感興趣的物質(zhì)，其特征在于所述寡肽是根據(jù)權(quán)利要求19至28任一項(xiàng)所述的位點(diǎn) 特異性方法獲得的。30. -種分離的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1至15所限定的寡肽。31. -種重組表達(dá)盒，其包含在轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的控制下的權(quán)利要求30所述的多核苷酸，所 述轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子允許在宿主細(xì)胞中調(diào)節(jié)所述多核苷酸的轉(zhuǎn)錄。32. -種重組載體，其包含權(quán)利要求30所述的多核苷酸或者權(quán)利要求31所述的重組表 達(dá)盒。33. -種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求31所述的重組表達(dá)盒或者權(quán)利要求32所述的重組 載體。34. -種試劑盒，其包含權(quán)利要求1至15所限定的寡肽以及感興趣的物質(zhì)。
【文檔編號(hào)】A61K47/48GK106061508SQ201480063450
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2014年11月13日
【發(fā)明人】P·拉費(fèi), S·貝, B·德拉圖爾, M·德南, C·迪克阿爾特, T·李, M·范德斯庫樂, C·切赫, F·格呂寧格爾
【申請(qǐng)人】豪夫邁－羅氏公司, 巴斯德研究所, 國家科學(xué)研究中心, 原子能和能源替代品委員會(huì)