水柏枝有效部位、其制備方法及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及到水柏枝有效部位、其制備方法及其在治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的用途。經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該有效部位能夠抑制巴豆油致小鼠耳腫脹和大鼠佐劑性或膠原性關(guān)節(jié)炎，可用于預(yù)防和/或治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的用途。
【專利說(shuō)明】
水柏枝有效部位、其制備方法及其用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及從傳統(tǒng)藏藥水柏枝提取的有效部位，包括該有效部位的制備方法，含 有這種有效部位的藥物組合物，以及含有這種有效部位和其藥物組合物在治療風(fēng)濕、類風(fēng) 濕性關(guān)節(jié)炎的藥物中的用途，本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthri ti s，RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的慢性自 身免疫疾病，常伴有炎癥細(xì)胞(T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)侵襲、浸潤(rùn)、微血管增生、關(guān) 節(jié)滑膜細(xì)胞增生、滑膜下層滑膜增厚形成絨毛狀突起以及骨與軟骨損傷等病理變化。這種 炎癥會(huì)造成關(guān)節(jié)變形直至殘廢，并會(huì)因關(guān)節(jié)痛楚及磨損而失去部分的活動(dòng)能力。RA的特征 是手、足小關(guān)節(jié)的多關(guān)節(jié)、對(duì)稱性、侵襲性關(guān)節(jié)炎癥，經(jīng)常伴有關(guān)節(jié)外器官受累及血清類風(fēng) 濕因子陽(yáng)性，可以導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、疲勞、骨傷，最終出現(xiàn)畸形及功能喪失 [1]ΑΑ在世界 范圍內(nèi)普遍存在，據(jù)統(tǒng)計(jì)全世界患病率約為1~2%，我國(guó)患病率約為0.5%，該病若未及時(shí) 治療，由于軟骨和骨組織的破壞，70 %的RA患者2年后可致殘，嚴(yán)重影響健康和生活質(zhì) 量[2,3]。
[0003] 目前臨床上治療RA的藥物主要有三類，即留體類抗炎藥、非留體類抗炎藥和改善 病情抗風(fēng)濕藥。但留體類抗炎藥長(zhǎng)期使用可引起類腎上腺皮質(zhì)功能亢進(jìn)綜合癥、消化系統(tǒng) 并發(fā)癥、心血管系統(tǒng)疾病以及骨質(zhì)疏松、大關(guān)節(jié)無(wú)菌性壞死、感染等不良反應(yīng)等;非留體類 抗炎藥能控制RA患者的癥狀，但對(duì)疾病本身影響小，不影響RA的病程，不能阻止關(guān)節(jié)破壞和 器官損害進(jìn)展，長(zhǎng)期使用會(huì)帶來(lái)胃腸道、腎毒性等副反應(yīng)，對(duì)關(guān)節(jié)軟骨也有損傷;改善病情 抗風(fēng)濕藥只能改善病情，緩解癥狀，達(dá)不到治療的效果 [3,4]。盡管上述這些藥物可抑制炎癥 的發(fā)生，緩解RA的癥狀，但長(zhǎng)期使用這些藥物都可出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)。因此發(fā)現(xiàn)、研制和 開(kāi)發(fā)更安全、更有效的治療RA藥物具有重要應(yīng)用價(jià)值。
[0004] 水柏枝為常用藏藥，其來(lái)源為檉柳科水柏枝屬植物水柏枝M y r i c a r i a germanicaL.Desv及同屬多種植物的嫩枝，廣泛分布于我國(guó)西藏、青海、甘肅、內(nèi)蒙古等西部 地區(qū)。藏藥名"溫布"，其性平，味甘咸、辛甘溫，具有疏風(fēng)解表、祛風(fēng)通絡(luò)、透疹、止咳、清熱解 毒之功效 [5,6]。水柏枝作為傳統(tǒng)藏藥主要用于治療風(fēng)濕痹痛，麻疹不透，瘟病時(shí)疫，臟腑毒 熱，咽喉腫痛，中毒癥，黃水病，血熱病等癥 [7]，目前水柏枝在臨床上主要用于治療風(fēng)濕，主 治風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等[8]。同時(shí)，水柏枝也是多種復(fù)方 藏藥的主要藥物，如五味甘露藥浴散、奇正消痛貼等。五味甘露藥浴散是藏醫(yī)獨(dú)具特色的洗 浴制劑 [9]，現(xiàn)已收載于國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)，該復(fù)方由水柏枝、圓柏葉、烈香杜鵑、大籽蒿、麻黃等 藥味組成，具有祛風(fēng)通絡(luò)，發(fā)汗止癢，增強(qiáng)自身免疫等功效，對(duì)風(fēng)濕性、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾 病有特殊療效 [1(W2]。奇正消痛貼膏由獨(dú)一味、水柏枝等六味藏藥組成，具有活血化淤、消腫 止痛功效，其方中具有抗炎功效的主要藥物為水柏枝 [13]。經(jīng)系統(tǒng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)外對(duì) 水柏枝化學(xué)成分研究主要集中在黃酮、沒(méi)食子酸和三萜類化合物，此外還有留醇、長(zhǎng)鏈脂肪 醇等類。對(duì)水柏枝屬植物藥理活性研究表明其提取物具有抗菌作用 [14]，抗炎作用[15，16]，鎮(zhèn) 痛作用[17]，免疫調(diào)節(jié)[18]和細(xì)胞免疫作用[19]，抗疲勞 [2°]和抗氧化[21]等多種藥理活性。盡管 有研究報(bào)道水柏枝(翁布)水提取物和醇提物對(duì)SD大鼠 FCA誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎具有抑制活性[16]， 其總黃酮對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠具有免疫調(diào)節(jié)作用[18]。以上研究報(bào)道雖然證實(shí)了水柏枝在 治療關(guān)節(jié)炎方面的活性，但所確定的活性部位僅是粗提物，有效成分并不明確，本專利在前 期研究工作基礎(chǔ)上，進(jìn)一步確證了水柏枝在治療關(guān)節(jié)炎方面的有效部位和有效成分，迄今 為止，未見(jiàn)到該方面的研究報(bào)道和專利。
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0027] 本發(fā)明要解決技術(shù)問(wèn)題是，提供一類水柏枝有效部位、其制備方法、藥物組合物以 及其在制備預(yù)防和/或治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。
[0028] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：
[0029] 本發(fā)明技術(shù)方案的第一方面是提供一種水柏枝有效部位的制備方法。
[0030] 本發(fā)明中的水柏枝，植物來(lái)源為檉柳科水柏枝屬植物的干燥嫩枝。其有效部位的 制備方法如下：
[0031] 步驟1).提取方法:將原料藥材(水柏枝)經(jīng)干燥后，適當(dāng)粉碎，然后用溶劑提取，提 取的溶劑包括水、醇類、丙酮或水與醇類或丙酮的混合溶劑。其中醇類溶劑優(yōu)選：甲醇、乙 醇、丙醇或丁醇中的一種或幾種的混合溶劑。水與醇的混合物，為40-95% (體積比）的醇溶 液;提取方法包括:滲漉、浸提或加熱回流提取;提取時(shí)溶劑用量為藥材重量的5-20倍，提取 可以在動(dòng)態(tài)或靜態(tài)下進(jìn)行，為提高提取效率還可選用超聲波提取;提取的溫度可以從室溫 到溶劑回流的溫度范圍內(nèi)；提取可以連續(xù)進(jìn)行或間歇進(jìn)行，提取次數(shù)1-4次。提取液可以選 用常壓或減壓濃縮得浸膏或無(wú)醇的濃縮液。
[0032]步驟2).分離方法：
[0033] (1)將上述濃縮液加適量水使浸膏分散溶解，用石油醚(沸點(diǎn)為60-90°C )和醋酸乙 酯依次進(jìn)行萃取，分別得到石油醚部位、醋酸乙酯部位和水部位。
[0034] (2)將上述水部位經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂層析，分別用水，30 %乙醇，50%乙醇和95%乙 醇洗脫，各洗脫部位經(jīng)冷凍干燥得到水柏枝有效部位，優(yōu)選30 %乙醇洗脫得到的水柏枝有 效部位;其中，大孔吸附樹(shù)脂包括D101，HPD-100，HP-20等。
[0035] 本發(fā)明技術(shù)方案的第二方面是是提供一種水柏枝有效部位，所述的有效部位按照 本發(fā)明第一方面所述的制備方法制備得到。
[0036] 進(jìn)一步的，上述的水柏枝有效部位的有效成分是可水解鞣質(zhì)類化合物。其中，可水 解鞣質(zhì)類化合物包括如下所述的12個(gè)化合物：



[0041] 本發(fā)明技術(shù)方案的第三個(gè)方面是提供一種藥物組合物，所述的藥物組合物包括有 效劑量的第二方面所述的水柏枝有效部位和藥學(xué)上可接受的載體。
[0042] 該藥物組合物可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法制備?？赏ㄟ^(guò)將水柏枝有效部位與一種 或多種藥學(xué)上可以接受的固體或液體賦形劑和/或輔料結(jié)合，制成適用于人使用的任何劑 型。水柏枝有效部位在其藥物組合物中的含量通常為1_95%(重量比）。
[0043] 此外，如果需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、抗氧化劑、防腐劑、香料、矯味 劑、甜味劑或其他材料。
[0044] 為達(dá)到用藥目的，增強(qiáng)治療效果，本發(fā)明的藥物或藥物組合物可用任何公知的給 藥方法給藥。
[0045] 本發(fā)明化合物、藥物組合物的給藥劑量取決于許多因素，例如所要預(yù)防或治療疾 病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，患者或動(dòng)物的年齡、性別、體重、性格及個(gè)體反應(yīng)，給藥途徑、給藥次 數(shù)、治療目的，因此本發(fā)明的治療劑量可以有大范圍的變化。一般來(lái)講，本發(fā)明中藥學(xué)成分 的使用劑量是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的?？筛鶕?jù)本發(fā)明化合物組合物中最后的制劑中所含 有的實(shí)際藥物數(shù)量，加以適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，以達(dá)到其治療有效量的要求，完成本發(fā)明的預(yù)防或治 療目的。
[0046] 本發(fā)明的水柏枝有效部位或組合物可以單獨(dú)使用，或與其它治療藥物或?qū)ΠY藥物 合并使用。
[0047] 本發(fā)明技術(shù)方案的第四個(gè)方面是提供了水柏枝有效部位在制備預(yù)防和/或治療風(fēng) 濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物中的用途。
[0048]有益技術(shù)效果：
[0049]經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明的水柏枝有效部位能明顯抑制巴豆油致小鼠耳腫脹和大 鼠佐劑性或膠原性關(guān)節(jié)炎引起的足腫脹。該有效部位具有預(yù)防和/或治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎的用途。
【附圖說(shuō)明】
[0050]圖1寬苞水柏枝有效部位的制備流程圖。
[0051 ]圖2寬苞水柏枝有效部位中水解鞣質(zhì)類化合物的UV光譜。
[0052]圖3寬苞水柏枝有效部位中水解鞣質(zhì)類化合物的高效液相色譜檢視圖。
[0053]圖4寬苞水柏枝有效部位對(duì)佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠足腫脹的作用(注:與模型組相比**p〈 0·01)〇
[0054] 圖5膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠體重變化情況。
【具體實(shí)施方式】
[0055] 下面的實(shí)例用來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但是這并不意味著本發(fā)明的任何限制。
[0056]水柏枝有效部位
[0057]實(shí)施例1:寬苞水柏枝有效部位的制備
[0058] 選用寬荀水柏枝(Myricaria bracteata)的干燥嫩枝15kg，用6倍量乙醇加熱回流 提取3次，每次2小時(shí)，提取液減壓回收乙醇并濃縮得到浸膏。加適量水使浸膏分散溶解，用 石油醚和醋酸乙酯依次進(jìn)行萃取，分別得到石油醚部位、醋酸乙酯部位和水部位。水部位過(guò) 濾，濾液經(jīng)處理的大孔吸附樹(shù)脂HP-20分離，分別用8倍量的水，30%乙醇，50%乙醇和95% 乙醇洗脫，減壓回收30%乙醇洗脫部位，經(jīng)冷凍干燥即得有效部位141. lg。（見(jiàn)圖1)
[0059] 實(shí)施例2:寬苞水柏枝有效部位的成分分析
[0060] 水柏枝有效部位中的有效成分是可水解鞣質(zhì)類化合物，該類化合物由葡萄糖和沒(méi) 食子酸以酯鍵或苷鍵連接而成。
[0061 ] 可水解鞣質(zhì)類化合物的紫外(UV)光譜一般在205-224和260-283nm范圍內(nèi)顯示2個(gè) UV的特征吸收峰。（見(jiàn)圖2)
[0062] 水柏枝有效部位中的有效成分可水解鞣質(zhì)類化合物的檢識(shí)方法采用，高效液相色 譜。高效液相色譜測(cè)定方法為采用二元高壓梯度洗脫方式，分析色譜柱為⑶SM0SIL5C 18-PAQ Waters(4.6i.d. X250mm)型，流動(dòng)相為A(含有2%醋酸的水)和B(乙腈），洗脫梯度為0_ 111^11，5%8，1-5111丨11，5%-15%8,5-4〇111丨11，15%-20%8，柱溫為25°(：，檢測(cè)波長(zhǎng)為28〇11111。高效 液相色譜圖見(jiàn)圖3。
[0063] 寬苞水柏枝有效部位中的有效成分可水解鞣質(zhì)類化合物對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)式如下：




[0069] 藥理活性試驗(yàn)：
[0070] 實(shí)驗(yàn)例1:寬苞水柏枝有效部位(SBZ組)抑制巴豆油致小鼠耳腫脹的試驗(yàn)。
[0071] 將昆明種小鼠隨機(jī)分為模型組，空白對(duì)照組，SBZ組，每組7只。各給藥組均灌胃 (ig)給予相應(yīng)藥物1次，給藥量l〇〇mg/kg，模型組給予等體積0.1 %聚山梨酯-80溶液。lh后， 各組小鼠左耳兩面均勻涂抹2%巴豆油致敏，致敏4h后處死，剪下左右耳廓，用直徑8mm的不 銹鋼打孔器制成大小相同的耳片，分別稱質(zhì)量，以兩耳質(zhì)量差值作為腫脹度。
[0072]巴豆油致小鼠耳腫脹的試驗(yàn)結(jié)果為：有效部位的抑制率為65.2%，且未見(jiàn)動(dòng)物死 亡。提示有效部位有非常顯著的抗炎活性。
[0073]結(jié)論:巴豆油致小鼠耳炎是能夠模擬炎癥反應(yīng)的模型，本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)， 寬苞水柏枝提取活性部位有顯著抑制小鼠耳腫脹作用，可用于制備抗炎藥物。
[0074]實(shí)驗(yàn)例2:寬苞水柏枝有效部位(SBZ組)對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的作用
[0075] 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:Wistar大鼠（180± 10)g，SPF級(jí)，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合 格證號(hào) SCXK(軍）2007-004。
[0076]受試藥物：SBZ組分;地塞米松磷酸鈉注射液(Dex)，國(guó)藥集團(tuán)容生制藥有限公司 (國(guó)藥準(zhǔn)字H41020036)。
[0077] 實(shí)驗(yàn)方法:將Wistar大鼠隨機(jī)分為模型(Model)組，Dex組和SBZ組，每組分別為10 只，10只，8只。將卡介苗置于57°C水浴滅活45min，溶解于石蠟與羊毛脂按2 :1混合的溶液 中，乳化制成卡介苗質(zhì)量濃度為l〇mg/ml的乳劑。2周后，大鼠分為模型組，地塞米松(0.2mg/ kg)組，SBZ(20mg/kg)組，各組大鼠兩側(cè)足周長(zhǎng)及體質(zhì)量均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。分組當(dāng)日各組開(kāi) 始皮下給予相應(yīng)藥物l〇ml/kg，對(duì)照組、模型組給予相同體積0.1%聚山梨酯-80溶液，連續(xù) 給藥15d，每天1次。于給藥第5、9、12、15天測(cè)量大鼠兩后足周長(zhǎng)，按5級(jí)評(píng)分法對(duì)全身各個(gè)關(guān) 節(jié)進(jìn)行評(píng)價(jià)，即〇分，無(wú)紅腫；1分，趾關(guān)節(jié)紅腫；2分，趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹;3分，踝關(guān)節(jié)以下的 足爪腫脹;4分，包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹。
[0078]根據(jù)評(píng)分結(jié)果計(jì)算多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI，AI =四肢關(guān)節(jié)評(píng)分之和）。給藥末處死 動(dòng)物，大鼠取脾臟、胸腺稱重，計(jì)算脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)。每組取注射側(cè)踝關(guān)節(jié)，10%福爾馬 林溶液浸泡后以8%硝酸溶液脫鈣，經(jīng)脫水、浸蠟、包埋、切片等處理，HE染色，光鏡下（X 100)觀察。
[0079] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:見(jiàn)表1，表2,圖4。
[0080]表1寬苞水柏枝有效部位對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響
[0082] 注：與空白組相比###p〈0 · 001，與模型組相比*p〈0 · 05 · IR:抑制率
[0083]表2寬苞水柏枝有效部位對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠體重的影響 [0084]
[0085] 注：與模型組相比*ρ〈0·05。
[0086]寬苞水柏枝有效部位20mg/kg在給藥12d可以抑制佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠繼發(fā)性足腫 脹，抑制率為4.53% (P〈0.05)(Dex同時(shí)間點(diǎn)抑制率為11.4%)，在給藥15d可以抑制佐劑性 關(guān)節(jié)炎胸腺指數(shù)，但對(duì)脾臟指數(shù)沒(méi)有影響。SBZ在給藥期間對(duì)大鼠體重沒(méi)有明顯的抑制作 用。
[0087]實(shí)驗(yàn)例3:寬苞水柏枝有效部位(SBZ組)對(duì)大鼠膠原型關(guān)節(jié)炎的作用評(píng)價(jià) [0088] 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:Wistar大鼠，雄性，110-130g，SPF級(jí)，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提 供，合格證號(hào)SCXK(軍)2007-004。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按體重隨機(jī)分為5組，分別為空白組（11只）、模型 組（12只）、SBZ組（12只）、和Dex組（12只）。
[0089]受試藥物：SBZ組分;地塞米松磷酸鈉注射液(Dex)，國(guó)藥集團(tuán)容生制藥有限公司 (國(guó)藥準(zhǔn)字H41020036)。
[0090] 實(shí)驗(yàn)方法：
[0091] 1.造模配制膠原乳劑，膠原溶于0.1M的冰醋酸使成4mg/ml，4°C過(guò)夜，加入同等體 積的弗氏完全佐劑進(jìn)行乳化，制備終濃度為2mg/ml的膠原乳劑。除空白組外，每只大鼠在0d 左后足跖皮內(nèi)注射膠原乳劑0.1ml進(jìn)行初次免疫，7d尾根部皮內(nèi)注射膠原乳劑0.1ml進(jìn)行加 強(qiáng)免疫。
[0092] 2.分組給藥加強(qiáng)免疫后觀察大鼠后肢足爪關(guān)節(jié)腫脹情況，出現(xiàn)明顯腫脹后根據(jù)踝 關(guān)節(jié)周長(zhǎng)隨機(jī)平均分組。造模14d開(kāi)始給藥，連續(xù)給藥20d。
[0093] 藥物分組及給藥：對(duì)照組（不作處理），模型組（給予溶媒），DeX(0.2mg/kg)，SBZ (200mg/kg)，各給藥組均為口服給藥。
[0094] 3.藥物對(duì)關(guān)節(jié)炎癥的治療作用
[0095]每天觀察左、右后腳爪的腫脹度，體重變化，毛色、進(jìn)食及精神狀態(tài)。
[0096] 致炎16(1、20(1、23(1、26(1、29(1、32(1、34(1用特制的尺測(cè)量注射側(cè)和注射對(duì)側(cè)踝關(guān)節(jié)周 長(zhǎng)，并按公式計(jì)算藥物抑制率：
[0098] 4.胸腺脾臟指數(shù)測(cè)定:34d處死所有動(dòng)物，取胸腺、脾臟，稱重，
[0099] 計(jì)算胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)，臟器指數(shù)計(jì)算為每10g體重相應(yīng)的臟器mg數(shù)。
[0100] 5.病理檢查：大鼠處死后，每組隨機(jī)取4只留取病理樣本。分別取下注射側(cè)和注射 對(duì)側(cè)大鼠踝關(guān)節(jié)，福爾馬林固定，5%硝酸脫鈣，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡檢查踝關(guān)節(jié)病 變情況，并進(jìn)行評(píng)分。
[0101] 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：
[0102] 1)關(guān)節(jié)周圍軟組織：
[0103] 0分:未見(jiàn)異常；
[0104] 1分:局部軟組織輕度炎性改變:關(guān)節(jié)周圍局部軟組織水腫，可見(jiàn)少量中性粒細(xì)胞、 淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；
[0105] 2分:局部軟組織炎性改變明顯：關(guān)節(jié)周圍軟組織明顯水腫，小血管充血，大量中性 粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，局部可見(jiàn)炎性肉芽組織形成；
[0106] 3分:局部軟組織炎性改變顯著：關(guān)節(jié)周圍軟組織顯著水腫，小血管充血，大量中性 粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，局部炎性肉芽組織增生，大量肉芽腫及膿腫形成；
[0107] 2)滑膜組織
[0108] 0分:未見(jiàn)異常；
[0109] 1分:局部滑膜組織輕度炎性改變:軟骨周圍滑膜組織輕度水腫，滑膜細(xì)胞腫脹、單 層排列，周圍可見(jiàn)少量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；
[0110] 2分:局部滑膜組織炎性改變明顯:軟骨周圍滑膜組織明顯水腫，滑膜細(xì)胞腫脹、增 生明顯、呈多層排列，滑膜組織周圍散在中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；
[0111] 3分:局部滑膜組織炎性改變顯著:軟骨周圍滑膜組織顯著增生，炎性反應(yīng)顯著，滑 膜周圍大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)血管增生，局部可見(jiàn)炎性肉芽腫形成；
[0112] 3)軟骨
[0113] 0分:未見(jiàn)異常；
[0114] 1分:關(guān)節(jié)面軟骨組織輕度受損，可見(jiàn)軟骨內(nèi)血管翳形成，關(guān)節(jié)面基本完整；
[0115] 2分:關(guān)節(jié)軟骨破壞明顯，局部關(guān)節(jié)面軟骨可見(jiàn)缺損，缺損部位炎性纖維組織增生， 中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；
[0116] 3分:炎癥累積整個(gè)關(guān)節(jié)腔，關(guān)節(jié)軟骨破壞顯著，關(guān)節(jié)面軟骨嚴(yán)重缺損，缺損部位被 炎性纖維組織替代，局部大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；
[0117] 4)骨組織、骨髓腔
[0118] 0分:未見(jiàn)異常；
[0119] 1分:局部可見(jiàn)個(gè)別骨小梁斷裂，骨髓腔融合，未見(jiàn)骨髓腔內(nèi)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)；
[0120] 2分:骨組織受損明顯，受損處炎性纖維組織增生，大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸 潤(rùn)，局部骨小梁斷裂明顯，骨髓腔融合，骨髓腔內(nèi)可見(jiàn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(或骨髓細(xì)胞增生活 躍），但未見(jiàn)骨髓腔內(nèi)炎性組織增生；
[0121] 3分:骨組織受炎性組織侵蝕嚴(yán)重，炎癥累及骨髓腔，局部可見(jiàn)骨髓腔內(nèi)大量炎性 纖維組織增生，骨髓為組織為炎性纖維組織所替代；
[0122] 5)總分
[0123] 由于從關(guān)節(jié)周圍軟組織呈現(xiàn)炎性表現(xiàn)，病程迀延，滑膜組織、軟骨、骨組織和骨髓 腔呈現(xiàn)炎性反應(yīng)是一個(gè)病程逐漸加重的過(guò)程，在對(duì)每個(gè)樣品在上述四個(gè)方面的病理表現(xiàn)進(jìn) 行綜合評(píng)定時(shí)使用加權(quán)平均數(shù)(關(guān)節(jié)周圍組織計(jì)權(quán)數(shù)為1，滑膜組織計(jì)權(quán)數(shù)為2,軟骨計(jì)權(quán)數(shù) 為3，骨組織及骨髓腔計(jì)權(quán)數(shù)為4)。
[0124] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:模型組較對(duì)照組明顯腫脹，顯示造模成功;造模后動(dòng)物足爪腫脹，活動(dòng) 不便，毛色、精神狀態(tài)及進(jìn)食無(wú)明顯變化，地塞米松組動(dòng)物較模型組及對(duì)照組精神活躍，SBZ 組較模型組未見(jiàn)明顯變化；
[0125] 1)各實(shí)驗(yàn)組體重變化情況。
[0126] 造模后，動(dòng)物較對(duì)照組隨腫脹程度增加體重差加大，陽(yáng)性對(duì)照藥地塞米松(Dex)與 模型組相比，體重顯著下降，SBZ對(duì)體重?zé)o明顯影響（見(jiàn)圖5);如圖5所示，給藥后，模型組與 對(duì)照組相比，體重差隨腫脹程度加重增加，造模后動(dòng)物體重增長(zhǎng)減緩，除行走不便，模型組 進(jìn)食、毛色、精神狀態(tài)無(wú)明顯變化;DEX可顯著降低動(dòng)物體重，且精神旺盛；SBZ給藥后，動(dòng)物 體重?zé)o明顯變化，提示給藥劑量在給藥期間無(wú)明顯毒副作用。
[0127] 2)藥物對(duì)大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎足爪腫脹的影響。
[0128] 造模后，陽(yáng)性對(duì)照藥Dex顯著抑制膠原型關(guān)節(jié)炎大鼠注射側(cè)及對(duì)側(cè)腫脹（p〈 0.001)，SBZ組對(duì)足爪腫脹未見(jiàn)明顯抑制作用（見(jiàn)表3及表4);致炎14d后，動(dòng)物后肢注射側(cè)及 對(duì)側(cè)明顯腫脹(P〈〇.〇〇1)，Dex給藥2d即顯示顯著性差異，至給藥20d對(duì)注射側(cè)及對(duì)側(cè)腫脹抑 制率分別為26.3%、11.4%，SBZ對(duì)足爪腫脹無(wú)明顯抑制作用。
[0129] 表3寬苞水柏枝有效部位對(duì)大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎左后肢腫脹的作用(注射側(cè)）
[0130]
[0131] 1 ·#ρ〈0·05，##ρ〈0·01，###ρ〈0·001與對(duì)照組比較；*Ρ〈0·05，**Ρ〈0·01，***Ρ〈 0.001，與模型組比較；
[0132] 2.給藥組關(guān)節(jié)腫脹度后數(shù)值為踝關(guān)節(jié)腫脹抑制率（％ )。
[0133] 表4寬苞水柏枝有效部位對(duì)大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎右后肢腫脹的作用(注射對(duì)側(cè)）
[0135] 1 ·#ρ〈0·05，##ρ〈0·01，###ρ〈0·001與對(duì)照組比較；*Ρ〈0·05，**Ρ〈0·01，***Ρ〈
0.001，與模型組比較；
[0136] 2.給藥組關(guān)節(jié)腫脹度后數(shù)值為踝關(guān)節(jié)腫脹抑制率（％ )。
[0137] 3)藥物對(duì)脾臟、胸腺指數(shù)的影響
[0138] 造模后，脾臟指數(shù)顯著升高(ρ〈0.001)，Dex顯著降低脾臟指數(shù)(ρ〈0.001)，SBZ組脾 臟指數(shù)稍有降低，但無(wú)顯著性差異;造模后，胸腺指數(shù)稍有降低，無(wú)顯著性差異，Dex顯著降 低脾臟指數(shù)(P〈〇. 001)，SBZ組胸腺指數(shù)降低(p〈0.05)(見(jiàn)表5)。
[0139] 表5寬苞水柏枝有效部位對(duì)大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎脾臟、胸腺指數(shù)的影響
[0141] *臟器指數(shù)計(jì)算為每10g體重相應(yīng)的臟器mg數(shù);模型組與對(duì)照組比較p值，各給藥組 與模型組比較，分析統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
[0142] 脾臟和胸腺是主要的免疫器官，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。造模后脾臟 指數(shù)顯著升高(p〈〇.001)，胸腺指數(shù)稍有降低，無(wú)顯著性差異，提示免疫系統(tǒng)活化，參與炎癥 反應(yīng);DEX顯著降低脾臟和胸腺指數(shù)(p〈0.001)，具有明顯的免疫調(diào)節(jié)活性;給予SBZ后脾臟 指數(shù)稍有降低，但無(wú)顯著性差異，胸腺指數(shù)降低，其中SBZ組有顯著性差異(p〈0.05)，提示藥 物可能有一定的免疫調(diào)節(jié)活性，但作用不強(qiáng)。
[0143] 4.藥物對(duì)膠原性關(guān)節(jié)炎踝關(guān)節(jié)病理評(píng)分的影響
[0144] 模型組與對(duì)照組相比，病理評(píng)分顯著升高(p〈0.001)，Dex顯著降低注射側(cè)及對(duì)側(cè) 病理評(píng)分(P〈〇. 05); SBZ顯著降低注射側(cè)病理評(píng)分(p〈0.05)，但對(duì)對(duì)側(cè)的病理評(píng)分未見(jiàn)顯著 性影響（見(jiàn)表6及表7)。
[0145] 表6藥物對(duì)大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎踝關(guān)節(jié)作用病理評(píng)分表(注射側(cè)）
[0147] 1 · #p〈〇 · 05，##p〈0 · 01，###p〈0 · 001與對(duì)照組比較；*P〈0 · 05，**P〈0 · 01，***P〈 0.001，與模型組比較；
[0148] 2.給藥組關(guān)節(jié)腫脹度后數(shù)值為與模型組相比對(duì)應(yīng)的抑制率（％ )。
[0149] 表7藥物對(duì)大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎踝關(guān)節(jié)作用病理評(píng)分表(注射對(duì)側(cè)）
[0150]
[0151] 1 · #p〈0 · 05，##p〈0 · 01，###p〈0 · 001與對(duì)照組比較；*P〈0 · 05，**P〈0 · 01，***P〈 0.001，與模型組比較；
[0152] 2.給藥組關(guān)節(jié)腫脹度后數(shù)值為與模型組相比對(duì)應(yīng)的抑制率（％ )。
[0153] 模型組與對(duì)照組相比，注射側(cè)及對(duì)側(cè)病理評(píng)分顯著升高（p〈0.001)，關(guān)節(jié)周圍組 織、滑膜組織增生、軟骨破壞、骨組織及骨髓腔破壞均較為嚴(yán)重;DEX顯著抑制炎癥破壞，總 分抑制率分別為注射側(cè)46.6% (p〈0.001)、對(duì)側(cè)46.8% (p〈0.01); SBZ對(duì)注射側(cè)軟骨、骨組織 及骨髓腔破壞表現(xiàn)出一定的抑制作用，對(duì)對(duì)側(cè)病理評(píng)分無(wú)明顯抑制作用，總分抑制率分別 為 21·4%(ρ〈0·05)、8·8%。
[0154] 結(jié)論：以上結(jié)果顯示，寬苞水柏枝有效部位對(duì)膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠足爪腫脹抑制活 性未見(jiàn)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;對(duì)某些關(guān)鍵指標(biāo)，如脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)，踝關(guān)節(jié)病理評(píng)分表現(xiàn)出 一定的抑制作用，顯示化合物對(duì)緩解和抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎局部炎癥的進(jìn)展，具有潛在的調(diào) 節(jié)抑制活性，預(yù)防和治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的用途。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 水柏枝有效部位的制備方法，其特征在于，包括下面步驟： (1) 將水柏枝Myricaria germanica L.Desv及同屬植物的嫩枝，適當(dāng)粉碎，然后用溶劑 滲漉、浸提或加熱回流提取，提取液常壓或減壓濃縮得浸膏； (2) 此浸膏經(jīng)分離方法精制、純化得到水柏枝有效部位。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于，步驟（1)中所述的水柏枝及其同屬植物為 寬苞水柏枝、水柏枝。3. 根據(jù)權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于，步驟（1)中所述的提取溶劑為水、醇類、丙 酮、或水與醇類或丙酮的混合溶劑;其中所述的醇類包括：甲醇、乙醇、丙醇或丁醇中的一種 或幾種的混合溶劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述的分離方法為萃取后層析； 其中所述的層析方法包括大孔吸附樹(shù)脂層析、MCI樹(shù)脂層析、葡聚糖凝膠Sephadex LH-20層 析、Toyoperal凝膠層析或反相硅膠層析、或上述層析方法的組合。5. 根據(jù)權(quán)利要求4的制備方法，其特征在于，所述的萃取所使用的溶劑為石油醚、甲苯、 乙醚、三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、異丙醇、丙酮、乙醇、甲醇、水中的一種或數(shù)種 混合溶劑;所述的層析所用的溶劑為石油醚、甲苯、乙醚、三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正 丁醇、異丙醇、丙酮、乙醇、甲醇、水中的一種或數(shù)種混合溶劑。6. 根據(jù)權(quán)利要求5的制備方法，其特征在于，所述的混合溶劑選自水和乙醇的混合溶 劑，其中乙醇的百分比為30%-50%。7. -種水柏枝有效部位，其特征在于，所述的有效部位按照權(quán)利要求2-6中任一所述的 制備方法制備得到。8. 根據(jù)權(quán)利要求7的水柏枝有效部位，其特征在于，所述的有效部位的有效成分是可水 解鞣質(zhì)類化合物。9. 一種藥物組合物，其特征在于，含有有效劑量的權(quán)利要求7-8的水柏枝有效部位及藥 學(xué)上可接受的載體。10. 根據(jù)權(quán)利要求9中的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物包括注射液、片 劑、膠囊、丸劑、口服液、貼劑、湯劑、顆粒或滴丸劑型。11. 權(quán)利要求7-8任一所述的水柏枝有效部位或權(quán)利要求9-10任一所述的藥物組合物 在制備預(yù)防和/或治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的用途。
【文檔編號(hào)】A61K31/7024GK106063802SQ201610262319
【公開(kāi)日】2016年11月2日
【申請(qǐng)日】2016年4月25日 公開(kāi)號(hào)201610262319.0, CN 106063802 A, CN 106063802A, CN 201610262319, CN-A-106063802, CN106063802 A, CN106063802A, CN201610262319, CN201610262319.0
【發(fā)明人】李帥, 侯琦, 劉佳寶, 袁紹鵬, 白金葉, 張瑛
【申請(qǐng)人】中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所